ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΟΡΓΑΝΙΔΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΤΡΟΠΗΣ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ: ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΧΛΩΡΟΠΛΑΣΤΕΣ

Transcript

1 ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΑ ΟΡΓΑΝΙΔΙΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΤΡΟΠΗΣ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ: ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΧΛΩΡΟΠΛΑΣΤΕΣ Μαριάννα Χ. Αντωνέλου, Ph.D. Λέκτορας Τμήματος Βιολογίας, Πανεπιστημίου Αθηνών 2014

2 ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ Μορφολογία Δομή-Σύσταση Τοπολογία Προέλευση Λειτουργία (οξειδωτική φωσφορυλίωση κ.ά.) Σχέση Δομής και Λειτουργίας Κυτταρικός θάνατος

3 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ενέργεια: Διατήρηση ζωής σύνθεση μακρομορίων κίνηση σύσπαση μυϊκών κυττάρων πολυμερισμός ινιδίων κυτταρικού σκελετού ενεργή μεταφορά ενδοκύτωση και έκκριση ενζυμική κατάλυση. Mit: Δεσμεύουν ενέργεια από τις τροφές Σταθμοί παραγωγής ενέργειας

4 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ενέργεια: Εξελικτική διαδικασία (παραγωγή/χρήση): ΑΤΡ ADP + P + 34 Kj (ενέργεια) ATP + H 2 O Τριφωσφορική αδενοσίνη ΑΤΡ: Κυτταρικό «καύσιμο», βραχυπρόθεσμη βιολογική «μπαταρία», ενεργειακό «νόμισμα»

5 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Aναπνοή: 1. Φυσιολογική λειτουργία πνευμόνων 2. Φυσιολογική λειτουργία κυττάρων, οξείδωση των τροφών για την παραγωγή ενέργειας Αερόβια αναπνοή: Δημιουργία ΑΤΡ παρουσία Ο 2 Αναερόβια αναπνοή: Δέκτες e - άλλα μόρια, εκτός Ο 2 (πχ. Fumarate) ΛΙΓΟΤΕΡΟ ΑΠΟΔΟΤΙΚΗ ΕΝΕΡΓΕΙΑΚΑ Αερόβια αναπνοή: Ξεκινά στο cyt (glycolysis) Ολοκληρώνεται στο mit Αναερόβια αναπνοή: Ξεκινά στο cyt (glycolysis) Ολοκληρώνεται στο cyt

6 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Αερόβια αναπνοή, κύκλος Krebs, οξειδωτική φωσφορυλίωση: θεμελιακές κυτταρικές λειτουργίες και διεξάγονται στο μιτοχόνδριο

7 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Although mitochondria are present in every cell, they are found in high concentrations in the muscle cells that require more energy. 2. Ιmportant to maintain proper concentration of calcium ions within the various compartments of the cell 3. They play an important role in the process of programmed cell death. ΤΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΡΑΤΟΥΝ ΤΑ ΜΥΣΤΙΚΑ ΤΗΣ ΖΩΗΣ (παραγωγή ΑΤΡ) ΚΑΙ ΤΟΥ ΘΑΝΑΤΟΥ (εμπλέκονται στην ΑΠΟΠΤΩΣΗ)

8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Φυτικά κύτταρα Αναπνοή + Φωτοσύνθεση: CO2 + ATP γλυκόζη Χλωροπλάστες: ηλιακή ενέργεια για την παραγωγή ΑΤΡ και NADPH και ταυτόχρονα φωτόλυση του νερού. το CO 2 αφομοιώνεται και παράγεται γλυκόζη: κύκλος του Calvin. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP + )

9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ιστορική διαδρομή: 1886, Altmann, συστατικά του κυττάρου (πράσινο του Janus, φωτονικό μικροσκόπιο) 1898, Benda, «μιτοχόνδριο» 1904, Meves, μιτοχόνδρια στα φυτικά κύτταρα 1934, Bensley και Hoerr, απομόνωση με υπερφυγοκέντρηση Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο 1952,G. Ρalade (ΟsO4), Κ.R. Ρorter, F. Sjostrand, κατανόηση βιοχημικών μηχανισμών, συσχέτιση δομής και λειτουργίας. PALADE George. The fine structure of mitochondria. Anat Rec Nov; 114(3):

10 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ 18-20% του συνολικού κυτταροπλασματικού όγκου του ευκαρυωτικού κυττάρου Aριθμός: στο συκώτι στη γιγάντια αμοιβάδα Chaοs chaοs στα ωοκύτταρα αμφιβίων 22% 11% 1% 66% νερό πρωτείνες λιπίδια νουκλεοτίδια και ιόντα

11 ΠΟΣΟΤΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ 40% περίπου του cyt των μυϊκών κυττάρων της καρδιάς στον άνθρωπο

12 ΚΑΤΑΝΟΜΗ Πολλά και μεγάλα σε κύτταρα που καταναλώνουν μεγάλα ποσά ενέργειας Σε θέσεις έντονης μεταβολικής δραστηριότητας Ακολουθούν την κατανομή των μικροσωληνίσκων Ομοιόμορφη ή όχι κατανομή Αλλάζουν σχήμα και θέση Συνδέονται με άλλα κυτταρικά οργανίδια Σε κύτταρα με έντονη πρωτεϊνοσύνθεση περιβάλλονται από ΕΔ

13 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ Κύτταρα Θηλαστικών: Το σχήμα τους δεν είναι σταθερό (συνήθως είναι επίμηκες αλλαντοειδές ή σκωληκόμορφο) και οι διαστάσεις τους είναι 0,3-1 μm σε διάμετρο με 1-10 μm σε μήκος. (Σφαιρικό, ελικοειδές, αστεροειδές κλπ) διαρκής κίνηση και αλλαγή σχήματος στο αξόνημα των μαστιγίων των σπερματοζωαρίων και έχουν κυλινδρική μορφή.

14 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ

15 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΣΥΣΤΑΣΗ ΚΑΙ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ Εξωτερική μεμβράνη: διαπερατή στα περισσότερα μικρά μόρια και ιόντα οξειδωτικά ένζυμα «πρωτεΐνες μεταφοράς» πορίνες ένζυμα μετατροπής λιπιδικών μορίων που χρησιμοποιούνται στο mit χυμό. Εσωτερική μεμβράνη: ΜΟΝΟ ΕΠΙΛΕΚΤΙΚΗ ΜΕΤΑΚΙΝΗΣΗ ΜΟΡΙΩΝ Υψηλού βαθμού εκλεκτική διαπερατότητα: ελεύθερα μόνο μόρια νερού (O2, CO2) και μερικά μόρια λιπαρών οξέων αντίθετα, NADH, ADΡ, AΤΡ, Κ +, Na +, Cl ΝΟ 3, σάκχαρα, NAD + NADΡ + μόνο με τη βοήθεια πρωτεϊνών αντίθετης μεταφοράς Αρκετά ένζυμα του κύκλου του Κrebs, της αναπνευστικής αλυσίδας και της σύνθεσης ΑΤΡ

16 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ Εξωτερική μεμβράνη Α. Μετά από απομόνωση και αρνητική χρώση. Κρυσταλλική δομή συστατικών (αμυδρά). Β. Επανασυγκρότηση με Η.Υ: κατανομή και μέγεθος μορίων Γ. Περίθλαση με ακτίνες Laser της δομής της Εικ. Α: ύπαρξη κρυσταλικότητας (συμμετρικές κηλίδες/βέλη)

17 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ Εσωτερική μεμβράνη Αρνητική χρώση. Μισχωτά σφαιρίδια διαμέτρου 90A (βέλος) X Ένζυμα σύνθεσης ΑΤΡ Πρωτόζωα: σχηματίζει σωληνίσκους Κύτταρα ανώτερων ζώων: επιμηκυσμένα κυστίδια Μοιάζει με τη σύσταση της πλασματικής μεμβράνης βακτηρίων

18 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ Μιτοχονδριακός χυμός ή μήτρα -MATRIX κοκκιώδης περιοχή που περικλείεται από τις πτυχώσεις εσωτερικής μεμβράνης Κοκκία ασβεστίου Ένζυμα DNA RNA ριβοσώματα

19 Γενετικό υλικό mit Μεταλλαγές σε ένζυμα οξειδωτικής φωσφορυλίωσης Σύνδρομο MELAS*.μυς Σύνδρομο MERRF*..εγκεφαλική αταξία, μυοπάθεια Σύνδρομο Leigh*..εγκεφαλοπάθεια, μυοπάθεια Χρόνια εξωτερική οφθαλμοπληγία του Leber (LHON)..μεγάλης έκτασης έλλειψη στο mtdna..πτώση βλεφάρων, εγκεφαλική αταξία, καρδιακή ανεπάρκεια, αμφιβληστροειδοπάθεια Κληρονομική οπτική νευροπάθεια* Ρευματικά αυτοάνοσα νοσήματα

20 Πρωτεΐνες mit Μιτοχονδριακές πρωτεΐνες Οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες των mit συντίθενται από ριβοσώματα της εσωτερικής mit μεμβράνης και ενσωματώνονται εκεί συν-μτφρ Η μεταφορά πρωτεϊνών από το cyt στο mit γίνεται μετα-μτφρ Holt et al. Plant Methods :8

21 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Διάσπαση των τροφών σε μακρομόρια και ακολούθως σε απλά μόρια Όλα τα κύτταρα χρειάζονται συνεχώς παροχή γλυκόζης (ειδικά ο νευρικός ιστός). Αcyl-CoA εισαγωγή στο μιτοχόνδριο Μιτοχ. χυμός

22 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ πυροσταφυλικό Αcyl-CoA mit 2. Σχηματισμός ενδιάμεσων καταβολισμού στα κύτταρα (ακετυλο-συνένζυμο Α, ΑΤΡ, NADH) 3. Οξείδωση ακετυλο-συνένζυμου Α και σχηματισμός ΑΤΡ μέσω της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων

23 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Παραγωγή ενέργειας με το μηχανισμό της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης: 1. Σχηματισμός ακετυλο-συνένζυμου A (acetyl-cοa) από οξείδωση λιπαρών οξέων ή από μετατροπή πυροσταφυλικού. 2. Εισαγωγή του ακετυλο-cοa στον κύκλο του Krebs: σχηματισμός 3x NADH, 1x FADH 2 και 1x GΤΡ. 3. Μεταφορά των ηλεκτρονίων που φέρνουν τα μόρια NADH και FADH 2 στα κυτοχρώματα της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης και τελικά στο Ο2, με ταυτόχρονη έξοδο πρωτονίων από το μιτοχονδριακό χυμό προς τον ενδιάμεσο χώρο μεταξύ εσωτερικής και εξωτερικής μεμβράνης (χημειώσμωση). 4. Φωσφορυλίωση, παραγωγή AΤΡ από ADΡ και Ρi με είσοδο πρωτονίων στο μιτοχονδριακό χυμό διαμέσου της ΑΤΡ-συνθετάσης

24 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Κύριες μεταβολικές διεργασίες που επιτελούνται στα mit: Κύκλος του Krebs Mεταφορά e- Oξειδωτική φωσφορυλίωση ΜΗΤΡΑ ΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗ Οι μεταβολικές διεργασίες δε γίνονται τυχαία μέσα στο mit αλλά σε καθορισμένους χώρους: φυσική και λειτουργική διαμερισματοποίηση

25 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ 1. Σχηματισμός ακετυλο-συνένζυμου A (acetyl-cοa) από (1 α ) τη γλυκόλυση, (1β) την οξείδωση λιπαρών οξέων (1γ) το μεταβολισμό των πρωτεϊνών πυροσταφυλική αφυδρογονάση: βρίσκεται στον μιτοχονδριακό χυμό ακετυλο-συνένζυμο Α: προέρχεται από μεταβολισμό γλυκόζης, λιπών, πρωτεϊνών

26 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ 1β. Οξείδωση λιπαρών οξέων Ο μεταβολισμός των λιπαρών οξέων ξεκινάει με το σχηματισμό ακυλο-συνενζύμου Α*. Μεταφορά στο μιτοχόνδριο μέσω της βιοχημικής οδού της ακυλο-καρνιτίνης διάσπαση σε ακετυλο-συνένζυμο Α με διαδοχικούς κύκλους β-οξείδωσης στο χυμό του μιτοχονδρίου

27 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ β-οξείδωση λιπαρών οξέων Γίνεται στο μιτοχονδριακό χυμό η είσοδος από το κυτταρόπλασμα διευκολύνεται με ειδικά διαμεμβρανικά μόρια της εσωτερικής και εξωτερικής μεμβράνης σε κάθε κύκλο αποικοδομούνται 2 άτομα άνθρακα με ταυτόχρονη παραγωγή ακετυλοσυνένζυμου A, ενός μορίου NADH και FADH 2

28 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ (Λιπαρά οξέα και παραγωγή ενέργειας στα μιτοχόνδρια) 1. Η οξείδωση των λιπαρών οξέων δημιουργεί πολλή περισσότερη ενέργεια από ότι ίση ποσότητα γλυκόζης 2. Υπάρχουν καλύτερες αποθήκες λιπών σε σχέση με αποθήκες γλυκόζης 3. η οξείδωση ενός μορίου παλμιτικού οξέος, με 16 άτομα άνθρακα, παράγει στο μιτοχόνδριο 131 μόρια ΑΤΡ.

29 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ (1γ) οι πρωτεΐνες και τα ελεύθερα αα μετατρέπονται με τρανσαμίνωση, οξειδωτική απαμίνωση κά μεταβολικές οδούς σε acetyl CoA Το παραγόμενο acetyl CoA από τη β-οξείδωση, τη γλυκόλυση και το μεταβολισμό των πρωτεϊνών χρησιμοποιείται στη συνέχεια για τον κύκλο του Κrebs Κύκλος του Krebs: μεταβολική οδός στην οποία συγκλίνουν όλες οι κύριες καταβολικές οδοί του κυττάρου

30 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ 2. Εισαγωγή του ακετυλο-cοa στον κύκλο του Krebs και σχηματισμός CO2, 3 μορίων NADH, 1 μορίου FADH 2 και 1 μορίου GΤΡ Γίνεται στο μιτοχονδριακό χυμό CH 3 CΟΟH (ως ακετυλο-συνένζυμο Α) + 2H 2 Ο + 3NAD+ + FAD 2CΟ 2 + 3NADH + FADH 2 1. οξείδωση των ακετυλομάδων σε CΟ 2 2. ένα μόριο GΤΡ 3. μόρια NADH και FADH 2 : Ανηγμένα συνένζυμα: φορείς υδρογονοκατιόντων Η+ και ηλεκτρονίων υψηλής ενέργειας, τα οποία μεταφέρονται στην αναπνευστική αλυσίδα.

31 Krebs reactions transfer energy from the progressive oxidation of ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ substrates to two types of energy carriers, NAD and FAD 2. Εισαγωγή του ακετυλο-cοa στον κύκλο του Krebs και σχηματισμός 3 μορίων NADH, 1 μορίου FADH 2 και 1 μορίου GΤΡ οξαλοξικό κιτρική συνθετάση κιτρικό ακονιτάση ισοκιτρικό α-κετογλουταρικό ηλεκτρυλο CoA αποακυλίωση ηλεκτρικό οξυ ηλεκτρική αφυδρογονάση φουμαρικό φουμαράση μαλεϊκό μαλεϊκή αφυδρογονάση οξαλοξικό NADH, FADH 2 : δίνουν τα e - τους στην αναπνευστική αλυσίδα Αναγωγή Ο 2 σε Η 2 Ο Διαφορά [Η+] Ενεργοποίηση ΑΤΡάσης F 0 F 1 Παραγωγή ΑΤΡ

32 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ

33 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ

34 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ 3. Μεταφορά των ηλεκτρονίων e- που φέρνουν τα μόρια NADH και FADH 2 στα κυτοχρώματα της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης με ταυτόχρονη έξοδο πρωτονίων από το μιτοχονδριακό χυμό προς τον ενδιάμεσο χώρο μεταξύ εσωτερικής και εξωτερικής μεμβράνης (χημειώσμωση).

35 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ ΕΣΩΤΕΡΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ CoQ: ΜΒ daltons (ουμπικινόνη) Κυτόχρωμα C ΜΒ 13kDa (περιφερική πρωτεΐνη) Ι: υπομονάδες ΜΒ 10 6 daltons ΙΙ: 4 υπομονάδες ΜΒ 132kDa ΙΙΙ: 9-11 υπομονάδες ΜΒ 560kDa ΙV: υπομονάδες ΜΒ 200kDa Αίμη, Fe, Cu

36 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ Τα συστατικά της αναπνευστικής αλυσίδας εμφανίζουν διάχυση στο επίπεδο της μεμβράνης Τα ένζυμα μπορούν να μεταβιβάζουν ηλεκτρόνια με ρυθμό ~1 ηλεκτρόνιο/20 msec

37 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ ενδιάμεσος χώρος Μιτοχ. χυμός Μεταφορά των ηλεκτρονίων που φέρνουν τα μόρια NADH και FADH 2 στα κυτοχρώματα της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης με ταυτόχρονη έξοδο πρωτονίων από το μιτοχονδριακό χυμό προς τον ενδιάμεσο χώρο μεταξύ εσωτερικής και εξωτερικής μεμβράνης (χημειώσμωση).

38 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ Ροή ηλεκτρονίων εγκαθίδρυση ηλεκτροχημικής διαβάθμισης μεταξύ μιτοχονδριακού χυμού και ενδιάμεσου χώρου ενδιάμεσος χώρος Μιτοχ. χυμός Αναπνευστική αλυσίδα: σύστημα συζευγμένων οξειδοαναγωγικών αντιδράσεων: μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας ικανή για σύνθεση αρκετών μορίων ΑΤΡ. Η αποθήκευση ενέργειας, κατά τη μεταφορά των ηλεκτρονίων από το ΝΑDH/NAD + στο Ο 2 /Η 2 Ο, αποτελεί περίπου το 40% της συνολικής μεταβολής της ελεύθερης ενέργειας.

39 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ ενδιάμεσος χώρος Μιτοχ. χυμός NADH αφυδρογονάση: το ιόν υδριδίου (Η: ) αποβάλλεται από το NADH και αποδίδει ένα πρωτόνιο και δύο ηλεκτρόνια. ομάδα φλαβίνης κέντρα σιδήρου-θείου ουμπικινόνη FADH 2 και σύμπλοκο ΙΙ της ηλεκτρικής αφυδρογονάσης Σύμπλοκο κυτοχρωμάτων b-c1 (φορέας ηλεκτρονίων το άτομο του σιδήρου της αίμης) κυτόχρωμα κυτοχρωμική οξειδάση

40 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ ενδιάμεσος χώρος Μιτοχ. χυμός Τέσσερα ηλεκτρόνια από το κυτόχρωμα c και τέσσερα πρωτόνια που λαμβάνονται από το υδάτινο περιβάλλον μεταφέρονται σε ένα μόριο Ο 2 σχηματίζοντας δύο μόρια νερού. Κατά τη διαδικασία αυτή προκαλούνται αλλοστερικές μεταβολές στη στερεοδιάταξη του ενζύμου με αποτέλεσμα από μια πλευρική ιμιδαζολική ομάδα της επιφάνειας της οξειδάσης, να αντλούνται 4 πρωτόνια από το μιτοχονδριακό χυμό προς το διαμεμβρανικό χώρο δημιουργώντας την ηλεκτροχημική διαβάθμιση των πρωτονίων.

41 Κυτοχρωμική οξειδάση ΙV: υπομονάδες ΜΒ 200kDa Αίμη, Fe, Cu Η υπομονάδα Ι του ενεργού κέντρου του ενζύμου: μόριο αίμης α, μόριο αίμης α 3, ιόν χαλκού Η υπομονάδα ΙΙ: ιόν χαλκού- δέχεται τα ηλεκτρόνια από το μόριο της αίμης του κυτοχρώματος c.

42 Κυτοχρωμική οξειδάση Περισσότερο από 95% του Ο2 που αναπνέουμε υφίσταται αναγωγή σε νερό, σε μία αντίδραση που καταλύεται από την κυτοχρωμική οξειδάση του συμπλέγματος IV της ΑΑ: O 2 + 4e - + 4H + 2H 2 O Η κυτοχρωμική οξειδάση είναι ο τελικός αποδέκτης e- στην ΑΑ. ουσίες που αναστέλλουν τη δράση της είναι πολύ τοξικές O κύριος ρόλος του Ο2 για όλους τους αερόβιους οργανισμούς είναι η λειτουργία του ως συλλέκτης/αποθήκη e-

43 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ 10 πρωτόνια μεταφέρονται διαμέσου της εσωτερικής μεμβράνης για κάθε ζευγάρι e- που μεταφέρεται από το NADH στο Ο 2 6 πρωτόνια μεταφέρονται διαμέσου της εσωτερικής μεμβράνης για κάθε ζευγάρι e- που μεταφέρεται από το FADH 2 στο Ο 2 1. διαβάθμιση ph: ph μιτοχονδριακού χυμού = 8.0 ph του διαμεμβρανικού χώρου = διαμεμβρανικό δυναμικό στις δύο πλευρές της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης: συσσώρευση q- στη μια πλευρά και q+ στην άλλη

44 ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ

45 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΕΣΩΤΕΡΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ Τα e- της αναπνευστικής αλυσίδας προκαλούν με την ενέργειά τους την έξοδο πρωτονίων, τα οποία με τη σειρά τους οδηγούν την F 0 F 1 AΤΡάση σε παραγωγή AΤΡ. Για κάθε ζευγάρι ηλεκτρονίων του NADH παράγονται 3 μόρια AΤΡ, ενώ δύο τέτοια μόρια παράγονται από το ζευγάρι ηλεκτρονίων του FADH 2.

46 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ Τόσο τα μιτοχόνδρια, όσο και οι χλωροπλάστες αλλά και τα βακτήρια, χρησιμοποιούν χημειώσμωση

47 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΗ ΑΛΥΣΙΔΑ Electron Transport Chain

48 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΕΣΩΤΕΡΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ Παραγωγή ενέργειας με το μηχανισμό της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης: 4. Φωσφορυλίωση, δηλαδή παραγωγή AΤΡ από ADΡ και Ρi με είσοδο πρωτονίων στο μιτοχονδριακό χυμό διαμέσου της ΑΤΡ-συνθετάσης (ή F 0 F 1 ΑΤΡάσης).

49

50 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΤΡάση ΕΣΩΤΕΡΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ Parsons Fernadez-Moran, 1963 μικρά σφαιρίδια διαμέτρου 90 Α κολλημένα σε θραύσματα μιτοχονδριακών μεμβρανών Α. αρνητική χρώση εσωτερικής μεμβράνης- «μισχωτά σφαιρίδια» 90 Α Β. Απομονωμένα κυστίδια εσ.μιτοχ.μεμβρανών με «μισχωτά σφαιρίδια» (Racker, υπέρηχοι) ικανότητα για: μεταφορά e- και φωσφορυλίωση Γ. Απομόνωση σφαιριδίων με θρυψίνη/κλάσμα μεμβρανών Ικανότητα για: μεταφορά e- αλλά όχι φωσφορυλίωση (Fo) Υπόλοιπο κλάσμα: ένζυμα : συντελεστής καθίζησης F1 (υδρόλυση ΑΤΡ)

51 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΑΤΡάση ΕΣΩΤΕΡΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ F1: υδρόλυση ΑΤΡ Λειτουργική ΑΤΡάση: F 1 κλάσμα + μεμβράνες με F 0 κλάσμα ΑΤΡάση F 1 F 0 : ΜΒ 500kDa 15% των πρωτεϊνών εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης Παρόμοια δομή/οργάνωση σε χλωροπλάστες/βακτήρια αντίγραφα/μιτοχόνδριο ηπατικού κυττάρου σύνθεση ΑΤΡ υδρόλυση ΑΤΡ μεταφορά e-

52 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Σύμπλεγμα ΑΤΡάσης F 0 F 1 ΕΣΩΤ. ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ δύο διακριτά τμήματα: α) μεμβρανικό = F 0 από τρεις τύπους πρωτεϊνικών υπομονάδων, a, b c, σε αναλογίες 1:2:12 β) προεξέχον =F 1 τμήμα, από πέντε διαφορετικές πρωτεϊνικές υπομονάδες, α, β, γ, δ και ε σε αναλογία 3:3:1:1:1. F 0 : υπομονάδες a, b και c διαμεμβρανικός δίαυλος διαμέσου του οποίου περνούν πρωτόνια 3α + 3β σφαιρική δομή με διάμετρο 12 nm, που ενώνεται με το σύμπλεγμα της F 0, μέσω των πρωτεϊνικών υπομονάδων γ (διαπερνά όλο το σύστημα), δ και ε (στέλεχος). Καταλυτικές υπομονάδες σύνθεσης ΑΤΡ: μία σε κάθε β υπομονάδα

53 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Σύμπλεγμα ΑΤΡάσης F 0 F 1 ΕΣΩΤ. ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ. Στα βακτήρια έχει αποδειχτεί ότι 10 αντίγραφα της υπομονάδας c δημιουργούν το δίαυλο πρωτονίων, σε ένα πρωτεϊνικό σύμπλεγμα στο οποίο φαίνεται να συμμετέχει και η υπομονάδα a.

54 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Το σύμπλεγμα της ATP συνθετάσης είναι ένα μοριακός κινητήρας! Η ομάδα c/γ/ε περιστρέφεται (μοτέρ) σε σχέση με την ομάδα a/b/δ/α/β (η οποία είναι ακινητοποιημένη, στάτωρ) Ο κινητήρας τίθεται σε κίνηση από τη μεταφορά Η+ Η περιστροφή της υπομονάδας γ προκαλεί διαδοχικές αλλαγές στη στεροδιαμόρφωση του αυμπλόκου α/β με αποτέλεσμα την ενεργότητα σύνθεσης ATP (στην υπομονάδα β)

55 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Σύμπλεγμα α3β3: Τα τρία σύμπλοκα α/β μπορούν να βρίσκονται σε 3 διαφορετικές καταστάσεις στεροεδιαμόρφωσης: 1. Open / Ανοιχτή: Χαμηλή συγγένεια σύνδεσης ATP/ADP/Pi, καταλυτικά ΑΝΕΝΕΡΓΗ 2. Loose /Χαλαρή: Χαλαρή σύνδεση ATP/ADP/Pi, καταλυτικά ΑΝΕΝΕΡΓΗ 3. Tight /ΣΦΙΧΤΗ: Υψηλή συγγένεια σύνδεσης ATP/ADP/Pi, καταλυτικά ΕΝΕΡΓΗ Η στεροδιαμόρφωση των 3 συμπλόκων α/β του «στάτωρα» καθορίζονται από τις ασύμμετρες αλληλεπιδράσεις τους με το «μοτέρ» και αλλάζουν με κυκλικό, διαδοχικό τρόπο: Για να σχηματιστεί ένα μόριο ΑΤΡ απαιτείται η διέλευση 3Η+ μέσα από το δίαυλο ΑΤP synthase

56 Ηλεκτροχημική σύζευξη 1961, Ρeter Μitchell παραγωγή AΤΡ με κινητήρια δύναμη τη διαφορά ph που δημιουργείται από τη μεταφορά ηλεκτρονίων ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ

57 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Χωρίς τα μιτοχόνδρια: τα ζωικά κύτταρα θα εξαρτιόνταν από τη γλυκόλυση για να παράγουν τα απαιτούμενα ποσά AΤΡ. Η γλυκόλυση είναι πολύ λιγότερο αποδοτική ενεργειακά σε σχέση με την οξειδωτική φωσφορυλίωση 2 vs. 36 mol ATP/ mol glucose

58 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Γλυκόζη + 36ΑDΡ + 36Ρi + 36Η + + 6Ο 2 6CΟ ΑΤΡ + 42Η 2 Ο Το καθαρό ενεργειακό κέρδος είναι περίπου 30 μόρια ΑΤΡ δεδομένης της ενεργειακής απώλειας για τη μεταφορά των μορίων ΑΤΡ από το μιτοχόνδριο στο κυτταρόπλασμα

59 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΕΣΩΤΕΡΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ Τα μόρια AΤΡ διαπερνούν την εσωτερική και εξωτερική μεμβράνη με αντίστοιχη είσοδο ADΡ. πρωτεΐνες αντίθετης μεταφοράς 1. HPO4 - OH 2. Μεταφορέας ΑΤΡ-ADP: διμερής πρωτεΐνη, ΜΒ 30 kda για την κάθε υπομονάδα, 10-15% των πρωτεϊνών της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης

60 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Σύμπλεγμα ΑΤΡάσης F 0 F 1 ΕΣΩΤ. ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ σύνθεση ΑΤΡ vs. Υδρόλυση ΑΤΡ: αντλία μεταφοράς Η+ αντίθετα από το ηλεκτροχημικό δυναμικό Σε κάθε κύτταρο ενός οργανισμού κάθε μόριο AΤΡ υφίσταται αντιστρεπτή φωσφορυλίωση - υδρόλυση αρκετές χιλιάδες φορές την ημέρα.

61 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Σύμπλεγμα ΑΤΡάσης F 0 F 1 ΕΣΩΤ. ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ Σε ορισμένα βακτήρια η λειτουργία του ενζύμου εξαρτάται από την παρουσία Ο2: Έλλειψη Ο2: αντλία μεταφοράς Η+ προς τον εξωκυττάριο χώρο (εισαγωγή θρεπτικών ουσιών) Διπλή λειτουργία: αντιστρεπτή σύζευξη

62 ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ Σύμπλεγμα ΑΤΡάσης F 0 F 1 ΕΣΩΤ. ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΟΥ εκτός από τη σύνθεση ΑΤΡ: Διαβάθμιση πρωτονίων και παραγωγή θερμότητας: Μεταβολική θερμογένεση Νεογέννητα, διαχειμάζοντα ζώα κλπ κύτταρα λιπώδους ιστού με μεγάλη διαπερατότητα mit σε Η+ και θερμογενίνη (διαμεμβρανική αντλία Η+)

63 1. Reactions that remove free energy are oxidation reactions; reactions that add free energy are reduction reactions 2. Enzymes facilitate oxidation and reduction reactions at the same time, by transferring free energy from one molecule to another; some energy is always lost in such transfers 3. Locations: Krebs reactions take place in the matrix; electron transport takes place on the inner membrane; (a gradient is maintained across the inner membrane); ATP synthesis takes place in the matrix as protons cross the inner membrane from the intermembrane space 4. Krebs reactions transfer energy from the progressive oxidation of substrates to two types of energy carriers, NAD and FAD 5. Energy carriers donate electrons and free energy to the electron transport system (ETS) 6. Electron transport always proceeds as fast as energy is removed from the gradient and cannot take place without pumping protons out of the matrix 7. Oxygen consumption results from electron transport and does not require ATP synthesis 8. electron transport is driven by the proximity of reduced and oxidized carriers, facilitating exchange of electrons and free energy 9. Protons entering the matrix through ATP synthase do not reduce oxygen 10. Proton pumping produces a chemiosmotic gradient that in turn restricts the rate of electron transport. The most important process that achieves the gradient is ATP synthesis 11. ATP synthase is not part of the electron transport system (ETS) ΔΟΜΗ-ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ

64 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΟ ΔΥΝΑΜΙΚΟ Η + ΚΑΙ ΑΣΒΕΣΤΙΟ Μιτοχόνδρια: calcium sensors and regulators, storage tanks of calcium ions Κυτοσόλιο: [Ca 2+ ] <10-7 Μ Mitochondrial Ca 2+ uptake and release is central: 1. for the regulation of cellular Ca 2+ homeostasis 2. for the regulation of intramitochondrial enzymes concerned with the utilization of oxidizable substrates energy metabolism 3. excess Ca 2+ accumulation by mitochondria is a common event in the process of cell death, by both necrosis and apoptosis Το ηλεκτροχημικό δυναμικό χρησιμοποιείται για τη ρύθμιση της συγκέντρωσης του Ca 2+ στο κυτοσόλιο. Ca 2+ sequestration: άντληση Ca 2+ από το κυτταρόπλασμα στο μιτοχονδριακό χυμό

65 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΟ ΔΥΝΑΜΙΚΟ Η + ΚΑΙ ΑΣΒΕΣΤΙΟ All membrane enclosed organelles are endowed with mechanisms that allow an energydependent Ca 2+ accumulation and a release dependent on the cation concentration gradient between the organelle lumen and the cytosol. Uptake mechanism: Ca 2+ pumps (i.e. enzymes that utilize ATP hydrolysis to drive Ca 2+ accumulation into the organelle lumen) Release channels: are controlled by different second messengers and allow channel opening* and Ca 2+ efflux into the cytoplasm

66 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΟ ΔΥΝΑΜΙΚΟ Η + ΚΑΙ ΑΣΒΕΣΤΙΟ Mitochondrial Ca 2+ accumulation and release: 1. do not need ATP for uptake 2. they utilize gated channels for Ca 2+ uptake and exchangers (Na + or H + /Ca 2+ exchangers) for release The exchangers use the concentration gradient of Ca 2+, H + and Na + across the inner membrane to cause the release of Ca 2+ back into the cytosol maintenance of a low matrix Ca 2+ concentration ([Ca 2+ ]) in resting cells and a rapid Ca 2+ accumulation by the organelle when cytosolic Ca 2+ is elevated during activation. Εισαγωγή Ca 2+ στο κυτοσόλιο παραγωγής ΑΤΡ (Putney and Thomas Curr Biol 16:R812, 2006)

67 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΧΗΜΙΚΟ ΔΥΝΑΜΙΚΟ Η + ΚΑΙ ΑΣΒΕΣΤΙΟ Components of the mitochondrial Ca 2+ homeostatic machinery MCU (mit Ca uptake), gated, Ca 2+ selective, ion channel, uniporter, 40kDa mncx (Na + /Ca 2+ exchanger) mhcx (H + /Ca 2+ ) exchanger the electron transport chain complex, building up the electrical driving force for accumulation Patron et al., Journal of Biological Chemistry 288:10750, 2013 Main features of the MCU to De Stefani et al (A, Nature 476:336, 2011) and Baughman et al (B Nature 476:341

68 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ Apoptosis (programmed cell death, PCD): Φυσιολογικός μηχανισμός ανάπτυξης και λειτουργίας ιστών Γενετικά και αναπτυξιακά καθορισμένη, εξελικτικά συντηρημένη διαδικασία, απαιτεί κατανάλωση ATP προστασία παρακείμενων ιστών, κυττάρων από φλεγμονή και άλλες καταστροφικές αλλοιώσεις Ανάπτυξη, εξωγενή ερεθίσματα, φυσιολογικές βλάβες σε κύτταρα, περίσσειες, ιικές προσβολές, χημειοθεραπεία κλπ Κρίσιμο ρόλο σε: ανάπτυξη, καρκίνο, φυσιολογική γήρανση και ασθένειες γήρατος πχ. Alzheimer s disease Στα mit βρίσκονται όλα τα απαραίτητα συστατικά για την έναρξη της απόπτωσης Συμμετέχουν στον κυτταρικό θάνατο

69 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ γενικά χαρακτηριστικά Κυτταρική συρρίκνωση Blebbing κυτταρικής μεμβράνης Εξωτερίκευση PS Συμπύκνωση πυρήνα Θραύση DNA/συμπύκνωση χρωματίνης Αποπόλωση μιτοχονδρίων Ενεργοποίηση κασπασών Αναδιοργάνωση κυτταροσκελετού Αποπτωτικά σωμάτια

70 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ 1. εσωτερικό μονοπάτι-μιτοχονδριακό 2. Ενεργοποίηση υποδοχέων-θανάτου (εξωτερικό μονοπάτι-μεμβρανικό) 1,2: Ενεργοποίηση κασπασών Λανθάνουσα φάση Εκτελεστική φάση Αποπτωτικές Αντι-αποπτωτικές ενεργότητες PS και «πέψη» αποπτωτικών κυττάρων από γειτονικά κύτταρα ή φαγοκύτταρα

71 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ κασπάσες Ενεργοποίηση: με πρωτεολυτική θραύση Εναρκτήριες κασπάσες Κασπάσες τελεστές Πρωτεόλυση λαμινών, επιδιορθωτικά ένζυμα DNA κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες Θραύση DNA Ρύθμιση ενεργότητας κασπασών από: ενδογενείς αναστολείς (πχ. members of the Inhibitor of Apoptosis Protein (IAP) family)

72 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ Αύξηση διαπερατότητας της εξωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης 1. Απώλεια κλίσης Η+ 2. Είσοδος νερού στο μιτοχονδριακό χυμό 3. Ελευθέρωση αποπτωτικών πρωτεινών στο κυτοσόλιο 4. Cytochrome C + APAF-1 (apoptosis protease activating factor) + pro-caspase-9 = Apoptosome 1. Caspase-9 activation 2. Ενεργοποίηση κασπασών τελεστών 3. Εκτέλεση αποπτωτικού προγράμματος

73 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ Voltage- Dependent Anion Channel Mitochondrial Apoptosis Channel mitochondrial Permeability Transition Pore

74 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΘΑΝΑΤΟΣ Apoptosis animation