«Αλληλεπιδράσεις μικροοργανισμών απομονωμένων από ελληνικά παραδοσιακά γαλακτοκομικά προϊόντα»

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ& ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ & ΥΓΙΕΙΝΗΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ «Αλληλεπιδράσεις μικροοργανισμών απομονωμένων από ελληνικά παραδοσιακά γαλακτοκομικά προϊόντα» Υπεύθυνος καθηγητής: Τζανετάκης Νικόλαος Μεταπτυχιακή φοιτήτρια:βούλγαρη Κωνσταντίνα Θεσσαλονίκη 2007

2 Περίληψη Στην εργασία αυτή μελετήθηκε η ικανότητα επιλεγμένων στελεχών γαλακτικών βακτηρίων να παράγουν αντιμυκητιακές και αντιβακτηριακές ουσίες, ικανές να αναχαιτίσουν τόσο την ανάπτυξη ζυμών και μυκήτων που απαντώνται σε παραδοσιακά ελληνικά γαλακτοκομικά προϊόντα, όσο και την ανάπτυξη παθογόνων και άλλων μικροοργανισμών. Βρέθηκε ότι η πλειοψηφία των στελεχών παρουσίασε ευρύ φάσμα δράσης αναχαιτίζοντας τόσο ζύμες και μύκητες, όσο και παθογόνους μικροοργανισμούς και μικροοργανισμούςδείκτες. Ενδιαφέροντα στελέχη αναταξινομήθηκαν με βάση τη ζύμωση των σακχάρων και την SDSPAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου και βρέθηκε ότι ανήκουν στα είδη Lb.plantarum, Lb.paraplantarum, Lb.rhamnosus, Lb.pentosus και Lb.paracasei subsp.paracasei. Τα στελέχη ετεροζυμωτικών γαλακτικών βακτηρίων ταξινομήθηκαν με βάση τη ζύμωση των σακχάρων στα είδη Lb.brevis, Lb.fermentum, Lb.confusus και Lb.buchneri. Η φαινοτυπική ταξινόμηση επιβεβαιώθηκε για τρία στελέχη με την SDSPAGE, ενώ τα υπόλοιπα ομαδοποιούνται μεταξύ τους με μεγάλο συντελεστή ομολογίας, όχι όμως και με κάποιο από τα πρότυπα στελέχη. Οχτώ στελέχη παρήγαγαν αντιμυκητιακές ουσίες που αναχαίτιζαν τη ζύμη αναφοράς D.hansenii, καθώς και ένα πενικίλλιο και από τον έλεγχο της φύσης τους φαίνεται ότι πρόκειται για βακτηριοσίνες. Ποσοστό 90% των στελεχών παρήγαγε μεθανοθειόλη από μεθειονίνη που σημαίνει ότι συνεισφέρουν στο άρωμα των τυριών.

3 Abstract The ability of chosen LAB strains to produce antifungal and antibacterial substances capable to inhibit the growth of fungi and yeasts present in greek dairy products and the growth of pathogens and other microorganisms, was studied. The majority of the strains had a wide inhibition specrum, inhibiting fungi, yeasts and pathogen microorganisms. Strains of interest characterized based on sugar fermentation patterns and SDS PAGE of whole cell protein, were found to belong to spieces Lb.plantarum, Lb.paraplantarum, Lb.rhamnosus, Lb.pentosus and Lb.paracasei subsp.paracasei. Srains of heterofermentative LAB characterized based on sugar fermentation patterns were found to belong to spieces Lb.brevis, Lb.fermentum, Lb.confusus and Lb.buchneri. The phenotypic characteristics of the strains were confirmed by the SDSPAGE for three strains, while the other strains group together with high correlation level but not with the reference strains. Eight strains produced antifungal substances which inhibit the yeast D.hansenii, as well as one penicillium whereas based on their nature they were supposed to be bacteriocins. 90% percent of the strains produced methanothiol from methionine, which conrtibutes to the perfume of the cheeses.

4 Ευχαριστίες Ευχαριστώ θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή κ. Τζανετάκη Νικόλαο για τις πολύτιμες οδηγίες του σε όλητη διάρκεια της εργασίας και τις διορθώσεις του κειμένου. Ευχαριστώ θερμά την καθηγήτρια κ.ευανθία Λιτοπούλου Τζανετάκη για τις συμβουλές κατά την εκπόνηση της διατριβής και τις διορθώσεις του κειμένου. Επίσης ευχαριστώ τον επίκουρο καθηγητή κ. Κουτσουμανή Κωνσταντίνο για τη συμμετοχή του στη τριμελή επιτροπή και τις εύστοχες παρατηρήσεις του. Θερμές ευχαριστίες στην κ. Μαγδαληνή Χατζηκαμάρη και στην κ. Ευγενία Χαριτονίδου Μυροβάλη για τη βοήθειά τους στη διεξαγωγή του πειραματικού μέρους.

5 Κατάλογος περιεχομένων ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΒΑΚΤΗΡΙΟΣΙΝΕΣ ΒακτηριοσίνεςΑντιβιοτικά Ταξινόμηση αντιβιοτικών Πεπτιδιακά αντιβιοτικά Ορισμός βακτηριοσινών κατά TAGG Ταξινόμηση βακτηριοσινών κατά KLAENHAMMER ΦΥΣΙΚΕΣ, ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΚΑΙ ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΟΣΙΝΩΝ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΣΙΝΩΝ Σχηματισμός του ''πρεπεπτιδίου'' Μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις του πρεπεπτιδίου Μετακίνηση του προπεπτιδίου προς την κυτταρική μεμβράνη και αποκοπή του οδηγού πεπτιδιακής ακλουθίας ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΟΣΙΝΩΝ Αλληλεπιδράσεις βακτηριοσινών με το κυτταρικό τοίχωμα Μηχανισμός αντιμικροβιακής δράσης των λαντιβιοτικών Μηχανισμός αντιμικροβιακής δράσης των μη λαντιβιοτικών Ανοσία Μηχανισμός της ανοσίας Μηχανισμοί ανθεκτικότητας ορισμένων στελεχών Μηχανισμοί άμυνας των μη ευαίσθητων στελεχών Μέτρα αντιμετώπισης ανθεκτικών στελεχών ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΒΑΚΤΗΡΙΟΣΙΝΟΓΟΝΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΚΑΙ ΒΑΚΤΗΡΙΟΣΙΝΩΝ Εντοπισμός της αντιμικροβιακής δράσης Μέθοδοι ανίχνευσης βακτηριοσινογόνων στελεχών Βιοδοκιμαστικές τεχνικές για την ανίχνευση βακτηριοσινογόνων στελεχών Άμεσες και έμμεσες βιοδοκιμαστικές τεχνικές ανίχνευσης βακτηριοσινογόνων στελεχών Τεχνικές ανίχνευσης βακτηριοσινογόνων στελεχών σε στερεά μέσα ανάπτυξης α Τεχνικές διάχυσης σε άγαρ Τεχνικές ανίχνευσης βακτηριοσινογόνων στελεχών σε υγρά μέσα ανάπτυξης...29 Η τεχνική των ''τρυβλίων πολαπλών βοθρίων'' Αιτίες λανθασμένης εκτίμησης των αποτελεσμάτων των τεχνικών ανίχνευσης βακτηριοσινογόνων στελεχών ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΕΣ ΟΥΣΙΕΣ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΙ ΑΠΟ ΤΑ ΓΑΛΑΚΤΙΚΑ ΒΑΚΤΗΡΙΑ Προϊόντα ζύμωσης Οργανικά οξέα α Υπεροξείδιο του υδρογόνου β Διοξείδιο του άνθρακα γ Αρωματικές ουσίες Ουσίες χαμηλού μοριακού βάρους Λιπαρά οξέα Ουσίες πρωτεϊνικής φύσης Κυκλικά διπεπτίδια και άλλες χαμηλού ΜΒ αναχαιτιστικές ουσίες Περίληψη των μέχρι τώρα γνωστών αντιμυκητιακών ουσιών που παράγονται από γαλακτικά βακτήρια Γενικά για τη συντήρηση των τροφίμων

6 8.2 Εφαρμογές βακτηριοσινών σε γαλακτοκομικά προϊόντα Τυριά και γαλακτοκομικά προϊόντα Επεξεργασμένα και μαλακά τυριά Γιαούρτη Γάλα Εφαρμογές βακτηριοσινών σε προϊόντα κρέατος Αλληλεπιδράσεις βακτηριοσινών με συστατικά των τροφίμων ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ ΣΕ ΓΑΛΑΚΤΟΚΟΜΙΚΑ ΠΡΟΙΟΝΤΑ...55 Γενικά για τα οικοσυστήματα των τυριών Μικροοργανισμοί και τυριά Μύκητες Σφάλματα από μύκητες Ζύμες Σφάλματα από ζύμες Βακτήρια αρνητικά κατά Gram Μικροβιακές αλληλεπιδράσεις σε φρέσκο και παστεριωμένο γάλα Μικροβιακές αλληλεπιδράσεις σε ζυμούμενα γαλακτοκομικά προϊόντα Μικροβιακές αλληλεπιδράσεις σε τυριά Έλεγχος των μικροβιακών αλληλεπιδράσεων: Χρήση βακτηριοσινών Οι βακτηριοσίνες στον έλεγχο των αλλοιωγόνων μικροοργανισμών Oι βακτηροσίνες ως παράγοντας λύσις του κυττάρου ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Στελέχη γαλακτικών βακτηρίων Μικροοργανισμοί δείκτες Μελέτη του φάσματος της αντιμυκητιακής δράσης γαλακτικών βακτηρίων Μελέτη του φάσματος της αντιβακτηριακής δράσης των γαλακτικών βακτηρίων Μελέτη της αντιβακτηριακής δράσης επιλεγμένων στελεχών γαλακτικών βακτηρίων Επιλεγμένα στελέχη Ταυτοποίηση επιλεγμένων στελεχών...72 Ταυτοποίηση με βιοχημικές δοκιμές (Ζύμωση σακχάρων)...72 Ταυτοποίηση με την SDS PAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου Ανίχνευση αντιμικροβιακών ουσιών από τα επιλεγμένα στελέχη...73 Μέθοδος δίσκων χάρτου Διαπίστωση της φύσης της αντιμικροβιακής ουσίας...75 Επίδραση πρωτεολυτικών ενζύμων στη δραστικότητα των αντιμικροβιακών ουσιών...75 Επίδραση του υπεροξειδίου του υδρογόνου στη δραστικότητα των αντιμικροβιακών ουσιών Έλεγχος παραγωγής μεθανοθειόλης ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Αντιμυκητιακή δράση γαλακτικών βακτηρίων Αντιβακτηριακή δράση ετεροζυμωτικών λακτοβακίλλων και Lb.plantarum Αναταξινόμηση στελεχών Lb.pantarum και ταξινόμηση στελεχών ετεροζυμωτικών λακτοβακίλλων με βάση τη ζύμωση των σακχάρων και την SDS PAGE των πρωτεϊνών του όλου κυττάρου Μελέτη της φύσης των ουσιών με αντιμυκητιακή και αντιβακτηριακή δράση που παράγονται από επιλεγμένα στελέχη γαλακτικών βακτηρίων ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

7 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα γαλακτικά βακτήρια χρησιμοποιούνταν σε διαδικασίες ζύμωσης των τροφίμων πριν ακόμη από τη γνώση της ύπαρξης βακτηρίων. Είναι αδύνατο να βρούμε πότε ακριβώς ξεκίνησε αυτή η διαδικασία, αλλά σε τοιχογραφίες των αρχαίων Αιγυπτίων φαίνεται η ζύμωση σαν μια μέθοδος συντήρησης τροφίμων καθώς επίσης και παραγωγής ζωοτροφών. Η χρήση των ζυμώσεων έχει αυξηθεί με την πάροδο του χρόνου και πραγματοποιείται σε πολλά είδη τροφίμων και ποτών. Παρόλα αυτά, μόλις τον προηγούμενο αιώνα άρχισε να γίνεται κατανοητή η μεταβολική διαδικασία που κρύβεται πίσω από τη συντηρητική δράση που ασκούν τα γαλακτικά βακτήρια. Τον προηγούμενο αιώνα έγινε κατανοητό ότι τα γαλακτικά βακτήρια είναι υπεύθυνα για τις ζυμώσεις και ασκούν βιοπροστατευτική δράση σε πολλά τρόφιμα (Ross et al., 2002). Η βιοπροστασία αναφέρεται στην επιμήκυνση της διάρκειας ζωής και της ασφάλειας των τροφίμων, η οποία εξασφαλίζεται τόσο από τη φυσική μικροχλωρίδα, όσο και από την προστιθέμενη καθώς και τα προϊόντα αυτής (Kao and Frazier., 1966). Τα βακτήρια αναπτύσσονται σε πολύπλοκα οικοσυστήματα όπου οι διαρκώς εναλλασσόμενοι κύκλοι μικροβιακής ζωής και θανάτου δεν είναι απόλυτα διακριτοί. Οικοσυστήματα, όπως τρόφιμα, πλούσια σε θρεπτικά στοιχεία ευνοούν την ανάπτυξη πολλών μικροοργανισμών μεταξύ των οποίων επικρατούν τα οξυγαλακτικά βακτήρια. Η ικανότητα των μικροοργανισμών να ανταγωνίζονται και να επιβιώνουν σε ένα οικοσύστημα εξαρτάται από ένα σύνολο ενδογενών και εξωγενών παραγόντων, από τους οποίους ο σημαντικότερος είναι η παραγωγή αντιμικροβιακών ουσιών. Τα γαλακτικά βακτήρια βρίσκονται σε πολλά πλούσια οικοσυστήματα καθώς επίσης και σε πολλά προϊόντα τροφίμων, όπως γαλακτοκομικά, προϊόντα κρέατος και λαχανικά. Παραδοσιακά θεωρούνται φυσικός, φιλικός προς τον καταναλωτή και το περιβάλλον τρόπος συντήρησης των τροφίμων. Η συντηρητική δράση τους οφείλεται κυρίως στη μείωση του ph, που αποτελεί συνέπεια της παραγωγής γαλακτικού οξέος. Εκτός από το γαλακτικό οξύ πολλές άλλες αντιμικροβιακές ουσίες παράγονται κατά την ανάπτυξη των γαλακτικών βακτηρίων, οι οποίες αναχαιτίζουν την ανταγωνιστική μικροχλωρίδα που περιλαμβάνει αλλοιωγόνους και παθογόνους μικροοργανισμούς, ενώ σε εξαιρετικά δυσμενείς συνθήκες περιβάλλοντος παράγονται και εξωπολυσακχαρίτες (EPSs)(Yang., 2000). O συνδυασμός της αύξησης της αντοχής τόσο στα αντιβιοτικά, όσο και στις χημικές ουσίες, των αλλοιωγόνων και παθογόνων μικροοργανισμών, και η γενική επαγρύπνηση για την 3

8 ικανοποίηση των αναγκών του καταναλωτή οδηγούν στην ανεύρεση εναλλακτικών μέτρων για τη συντήρηση των τροφίμων. Εξάλλου οι σύγχρονες τάσεις και το καταναλωτικό κοινό απαιτούν: Μείωση της χρήσης πρόσθετων στα τρόφιμα. Υψηλή ποιότητα. Ασφαλή και ελάχιστα επεξεργασμένα τρόφιμα με μεγάλη διάρκεια ζωής. Τρόφιμα απαλλαγμένα από συντηρητικά. Επιπρόσθετα η νομοθεσία περιορίζει τη χρήση γνωστών μέχρι σήμερα συντηρητικών (Magnusson., 2003). Έτσι κρίνεται επιτακτική η ανάγκη για καινοτόμους μεθόδους συντήρησης που θα έχουν την ικανότητα αναστολής των ανεπιθύμητων μικροοργανισμών. Επειδή τα γαλακτικά βακτήρια εμφανίζονται στα τρόφιμα είτε φυσικά είτε προστίθενται ως καθαρές καλλιέργειες, θεωρούνται ότι είναι ακίνδυνα ή ότι παρουσιάζουν κάποια πλεονεκτήματα για την υγεία του ανθρώπου (προβιοτικά). Τα γαλακτικά βακτήρια έχουν βεβαίωση GRAS (generally recognised as safe) και παραδοσιακά θεωρούνται ασφαλής τόσο για τον καταναλωτή όσο και για το περιβάλλον, μέθοδος συντήρησης των τροφίμων. Επίσης, είναι ευρέος γνωστά για τη χρήση τους ως καλλιέργειες εκκίνησης κατά την παραγωγή γαλακτοκομικών προϊόντων, όπως τυριά, γιαούρτι, τυρί cottage, σκληρά τυριά (Cheddar, Edam) καθώς και μαλακά τυρία (Brie, Camembert). Τα γαλακτικά βακτήρια που χρησιμοποιούνται στις ζυμώσεις γάλακτος ειδικά τα στελέχη Lactococcus lactis, είναι τα είδη που έχουν χαρακτηριστεί και μελετηθεί περισσότερο από όλα, όπως επίσης και τα είδη Lactobacillus και Leuconostoc. 4

9 1. ΒΑΚΤΗΡΙΟΣΙΝΕΣ Πίνακας 1. Παραδείγματα βακτηριοσινών που απομονώθηκαν από τρόφιμα (Cleveland et al., 2001) Πηγή Εμπορικό προβιοτικό προϊόν Κίτρινο τυρί Βουλγαρίας Στέλεχος Sreptococcus sp.cncm I841 Lb.delbruecki sp Λαχανικά Enterococcus mundtii Δραστηριότητα Clostridium sp.,l.monocytogenes L.monocytogenes, S.aureus, Ent. faecalis, E.coli, Yersinia enterocolitica, Y. pseudotuberculosis. L. monocytogenes, C. botulinum Αναφορές Gomez et al., 1997 Miteva et al., 1998 Bennik et al., 1998 Ραπανάκια Lb. lactis supsp. cremoris Clostridium, Bennik et al., 1998 R Staphylococcus, Žyildirim and Johnson, Listeria, and Leuconostoc spp. Μαλακό γαλλικό τυρί με Carnobacterium piscicola Carnobacterium, Listeria, Herbin et al., 1997 μύκητα CP5 and Enterococcus spp. Βλαστός φασολιού Lb. lactis subsp. Lactis NisZ. Lb. plantarum WHE92 PedAcH. C. piscicola JG126 L. monocytogenes Scott A Cai et al., Παραδοσιακό γαλλικό τυρί Λουκάνικο Κόκκοι κεφίρ Lb. lactis DPC3147 Τυρόγαλα Γίδινο γάλα Λάχανο τουρσί Ent. faecalis 226 L. monocytogenes Leu. mesenteroides Y105 L. monocytogenes Lb. lactis subsp. L. monocytogenes lactis(nis). Τυρί Munster Χειρομέρι L. monocytogenes Ennahar et al., 1996 L. monocytogenes Jack et al., 1996 Ent. faecalis EFS2 L. inocua MaisnierPatin et al., Lactob. plantarum UG1 L. monocytogenes, Bacillus cereus, C. perfringens, C. sporogenes Enan et al., 1996 Clostridium, Ryan et al., 1996 Enterococcus, Listeria, Leuconostoc spp. Ζυμούμενα λουκάνικα Lb. plantarum SA6 Lactobacillus spp. Rodriguez et al., 1995 Κόκκινο αλειφώμενο τυρί Brevibacterium lines M18 Listeria and Rekhif et al., 1995 Corinebacterium spp. Κρέας Leuconostoc carnosum L. monocytogenes Felix et al., 1994 Ta11A LeuA. Ζύμη L. BaΥaricus bava. L. monocytogenes Larsen et al., 1993 Villani et al., 1993 Hechard et al., 1992 Hechard et al., 1992 Τα βακτήρια αποτελούν πηγή αντιμικροβιακών πεπτιδίων, τα οποία έχουν εξεταστεί όσον αφορά την εφαρμογή τους για τη μικροβιολογική ασφάλεια των τροφίμων. Οι βακτηριοσίνες αρχικά χαρακτηρίστηκαν ως Gram αρνητικά βακτήρια. Οι κολισίνες που παράγονται από στελέχη 5

10 της E.coli είναι εκείνες που έχουν μελετηθεί περισσότερο (Lazdunski.,1988). Οι κολισίνες συνθέτουν διάφορες ομάδες αντιμικροβιακών πρωτεϊνών, οι οποίες θανατώνουν συγγενή φυλογενετικά βακτήρια με διάφορους μηχανισμούς, όπως αναστέλλοντας τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος, καθιστώντας διαπερατή τη μεμβράνη του κυτταρικού τοιχώματος του βακτηρίου στόχος, ή αναστέλλοντας τη δραστηριότητα της RNAασης DNAασης. Ανάμεσα στα Gram θετικά βακτήρια, τα γαλακτικά βακτήρια είναι εκείνα που έχουν διερευνηθεί περισσότερο ως απόθεμα αντιμικροβιακών πεπτιδίων για εφαρμογές στα τρόφιμα (πίνακας 1). Όπως αναφέρθηκε οι αντιμικροβιακές πρωτεΐνες ή τα πεπτίδια που παράγονται από βακτήρια, χαρακτηρίζονται ως βακτηριοσίνες. Συντίθενται ριβοσωμικά και σκοτώνουν συγγενή φυλογενετικά στελέχη (Klaenhammer., 1993). Καθώς οι βακτηριοσίνες απομονώνονται από τρόφιμα, όπως κρέας και γαλακτοκομικά προϊόντα, τα οποία συνήθως περιέχουν γαλακτικά βακτήρια, τα συγκεκριμένα καταναλωνόταν εδώ και χρόνια χωρίς ακόμη να είναι γνωστές οι ιδιότητές τους. Μια μελέτη πάνω σε 40 άγριους τύπους στελεχών του Lactococcus lactis έδειξε ότι τα 35 παρήγαγαν νιζίνη (Hurst.,1981). Η χρήση της νιζίνης επιτρέπεται σε 40 χώρες και χρησιμοποιείται ως συντηρητικό τροφίμων για πάνω από 50 χρόνια. Παρόλα αυτά δεν θεωρείται ''φυσικό'' συντηρητικό, όταν εφαρμόζεται σε συγκεντρώσεις οι οποίες ξεπερνούν την ποσότητα που συνήθως βρίσκεται στα ''φυσικώς ζυμούμενα τρόφιμα που παράγονται με καλλιέργεια εκκίνησης η οποία παράγει νιζίνη. Ο όρος φυσική επίσης δεν χρησιμοποιείται όταν η βακτηριοσίνη παράγεται από γενετικά τροποποιημένα βακτήρια. Παρόλο που η νιζίνη είναι η μόνη βακτηριοσίνη εγκεκριμένη για χρήση στις Ηνωμένες πολιτείες, πολλές βακτηριοσίνες που παράγονται από στελέχη γαλακτικών βακτηρίων έχουν δυνητική χρήση σε τρόφιμα (Cleveland et al., 2001). 6

11 Πίνακας 2.Παραδείγματα πατενταρισμένων εφαρμογών βακτηριοσίνων στα τρόφιμα(cleveland et al., 2001) Συγγραφέας Τίτλος πατέντας Χρήση Vandenbergh et al. Μέθοδος αναστολής βακτηρίων με τη χρήση λακτοκοκκινής βακτηριοσίνης Μια μέθοδος για την αναστολή Gram θετικών βακτηρίων στα τρόφιμα χρησιμοποιώντας μια νέα βακτηριοσίνη που παράγεται από τοστέλεχος L. lactis NRRLB18535 Blackburn et al. Χρήση της νιζίνης για Συνδυασμός νιζίνης,ενός παράγοντα δέσμευσης ενίσχυση ιόντων και ενός απολυμαντικού για την αναστολή βακτηριοκτόνου δράσης Gram θετικών και αρνητικών βακτηρίων, σε κρέας, γαλακτοκομικά, αυγά και ψάρια. Wilhoit Επιφανειακή μεταχείριση τροφίμων με αντιμικροβιακούς παράγοντες Χρήση βακτηρισινών προερχόμενων από στελέχη πεδιοκόκκων ή στρεπτοκόκκων, σε συνδυασμό με δεσμευτές ιόντων για την προστασία τροφίμων από τη Listeria Vedamuthu Μέθοδος παραγωγής προϊόντος γιαουρτιού που περιέχει τη βακτηριοσίνη PA1 Προιόν γιαουρτιού με αυξημένο χρόνο συντήρησης που περιέχει βακτηριοσίνη από το στέλεχος P. acidilactici Boudreaux et al. Σύνθεση για την παράταση του χρόνου ζωής επεξεργασμένου κρέατος Χρήση βακτηριοσίνης από το στέλεχος P. acidilactici και προπιονικών αλάτων για την αναστολή βακτηριακής ανάπτυξης ωμού και επεξεργασμένου κρέατος Hutkins et al. Μέθοδοι αναστολής παθογόνων και αλλοιωγόνων μικροοργανισμών στα τρόφιμα Χρήση γαλακτικών βακτηρίων που παράγουν βακτηριοσίνες για την αναστολή ανάπτυξης παθογόνων στα τρόφιμα Collison et al. Χρήση λαντιβιοτικών για τον έλεγχο της επιμόλυνσης μετά την επεξεργασία κρέατος Αναστολή επιμόλυνσης επεξεργασμένου κρέατος από παθογόνους και αλλοιωγόνους μικροογανισμούς με την επιφανειακή μεταχείριση αυτών με λαντιβιοτικά Vandenbergh et al. Μέθοδος για την αναστολή της L. Monocytogenes με τη χρήση βακτηριοσινών Αναστολή της L. monocytogenes με βακτηριοσίνη που παράγεται από στέλεχος P. acidilactici Gonzalez Μέθοδος αναστολής Αναστολή αλλοιωγόνων μικροοργανισμών σε βακτηριακής ανάπτυξης σαλάτες από στέλεχος του P. acidilactici και τελική σύνθεση προιόντος Matrozza et al. Μέθοδος αναστολής Αναστολή βακτηριακής ανάπτυξης σε τυρί ψυχρότροφων Cottage με βακτηριοσίνη που παράγεται από βακτηρίων σε προιόντα κύτταρα του P. pentosaceus με βάση το γάλα ή την κρέμα με τη χρήση πεδιοκόκκων 7

12 1.1 ΒακτηριοσίνεςΑντιβιοτικά Συχνά οι βακτηριοσίνες στη βιβλιογραφία συγχέονται με τα αντιβιοτικά (Hansen et al., 1993), κάτι που πολλές φορές περιορίζει νομικά την εφαρμογή τους στα τρόφιμα. Eίναι σημαντικό να γίνεται διάκριση μεταξύ βακτηριοσινών και αντιβιοτικών. Οι βακτηριοσίνες που διαχωρίζονται σαφώς από τα κλινικά αντιβιοτικά, πρέπει να είναι ασφαλείς και αποτελεσματικές όταν χρησιμοποιούνται στα τρόφιμα για τον έλεγχο της ανάπτυξης των παθογόνων μικροοργανισμών. Έτσι ο Hurst και οι συνεργάτες του(1986), αναγνωρίζοντας τη διαφορετικότητα των βακτηριοσινών από τα αντιβιοτικά, πρότειναν τον όρο ''βιολογικά συντηρητικά τροφίμων'', καθώς οι βακτηριοσίνες σε αντίθεση με τα αντιβιοτικά δεν χρησιμοποιούνται για κλινικούς σκοπούς (Cleveland et al., 2001). Ως αντιβιοτικά καλούνται οι χημικές ουσίες που παράγονται από μικροοργανισμούς και έχουν την ικανότητα να αναστέλλουν την ανάπτυξη άλλων μικροοργανισμών ή να προκαλούν το θάνατό τους (Κοντελές., 2000). 1.2 Ταξινόμηση αντιβιοτικών Το σχήμα κατάταξης των αντιβιοτικών που χρησιμοποιείται περισσότερο βασίζεται στο μηχανισμό μέσω του οποίου εκδηλώνουν την αντιμικροβιακή τους δράση. Με βάση το κριτήριο αυτό τα αντιβιοτικά διακρίνονται σε: 1. Αντιβιοτικά που προκαλούν είτε τη διακοπή της σύνθεσης του βακτηριακού τοιχώματος, είτε τη διάνοιξή του οδηγώντας στη λύση του κυττάρου. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν οι πενικιλίνες και οι κεφαλοσπορίνες. 2. Αντιβιοτικά που επιδρούν στην κυτταρική μεμβράνη ως τασιενεργές ουσίες, προκαλώντας την αποδιοργάνωση της, με τελική κατάληξη την έξοδο εσωκυτταρικών στοιχείων στο εξωκυτταρικό περιβάλλον. Αντιπρόσωποι της ομάδας αυτής είναι η πολιμιξίνη και η νυστατίνη. 3. Αντιβιοτικά που επηρεάζουν τη λειτουργία των ριβοσωμάτων προκαλώντας την αναστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης. Στην ομάδα αυτή ανήκουν η χλωραμφενικόλη καθώς και οι τετρακυκλίνες, όπως η ερυθρομυκίνη. 8

13 4. Αντιβιοτικά τα οποία συνδέονται στη ριβοσωμική υπομονάδα 30S, αλλοιώνοντας την πρωτεϊνοσύνθεση οδηγώντας τελικά το κύτταρο στο θάνατο. Αντιπρόσωπος της ομάδας είναι τα αμινογλυκοσίδια. 5. Αντιβιοτικά που ο τρόπος δράσης τους εμπλέκεται στο μεταβολισμό των νουκλεϊκών οξέων. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν οι ριφαμυκίνες. 6. Συνθετικά αντιβιοτικά όπως τα σουλφοναμίδια. Τα αντιβιοτικά αυτά είναι γνωστά με τον όρο αντιμεταβολίτες και η δράση τους εντοπίζεται στην αναστολή βασικών μεταβολικών δρόμων του κυττάρου(denain., 1984) Πεπτιδιακά αντιβιοτικά Τα πεπτιδιακά αντιβιοτικά αποτελούνται από αμινοξέα. Με βάση τον μηχανισμό βιοσύνθεσής τους μπορούν να διακριθούν σε δύο μεγάλες κατηγορίες(kleinkauf et al., 1986): 1. Πεπτιδιακά αντιβιοτικά που σχηματίζονται στα ριβοσώματα (ριβοσωμικής προέλευσης πεπτιδιακά αντιβιοτικά). 2. Πεπτιδιακά αντιβιοτικά που συνθέτονται στο κυτταρόπλασμα μέσω διαδοχικών ενζυματικών αντιδράσεων (μη ριβοσωμικής προέλευσης πεπτιδιακά αντιβιοτικά). Οι βασικές διαφορές μεταξύ βακτηριοσινών και αντιβιοτικών συνοψίζονται στον πίνακα 3 (Cleveland et al., 2001). Πίνακας 3. Βακτηριοσίνες αντιβιοτικά Χαρακτηριστικά Βακτηριοσίνες Αντιβιοτικά Εφαρμογή Τρόφιμα Κλινική Σύνθεση Ριβοσωμική Δευτερεύοντες μεταβολίτες Δραστηριότητα Στενό φάσμα Ποικίλο φάσμα Ανοσία του κυττάρου ξενιστή Ναι Όχι Μηχανισμός αντοχής ή ανοσίας του κυττάρου στόχου Συνήθως προσαρμογή που επηρεάζει τη σύνθεση της κυτταρικής μεμβράνης Συνήθως ένας γενετικά μεταφερόμενος προσδιοριστικός παράγοντας που επηρεάζει διαφορετικές περιοχές ανάλογα με τον τρόπο δράσης Απαιτήσεις αλληλεπίδρασης Μερικές φορές λιμνάζοντα μόρια Ειδικός στόχος Τρόπος δράσης Σχηματισμός πόρων, βιοσύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος Κυτταρική μεμβράνη ή ενδοκυτταρικοί στόχοι Τοξικότητα/παρενέργειες Καμία γνωστή Ναι 9

14 1.3 Ορισμός βακτηριοσινών κατά TAGG Ο Τagg και οι συνεργάτες του, 1976 έκαναν μια προσπάθεια να δώσουν τον ορισμό των βακτηριοσινών και να ορίσουν τα κριτήρια προκειμένου να χαρακτηριστεί έτσι μια αντιμικροβιακή ουσία. Σύμφωνα με τους παραπάνω ερευνητές οι βακτηριοσίνες είναι ανταγωνιστικές ουσίες πρωτεϊνώδους φύσης, που παράγονται από Gram θετικά βακτήρια και παρουσιάζουν βακτηριοκτόνο δράση απέναντι σε ένα περιορισμένου εύρους φάσμα μικροοργανισμών, οι περισσότεροι από τους οποίους είναι φυλογενετικά κοντά στο στέλεχος που παράγει τη βακτηρισίνη. Τα κριτήρια που πρέπει να τηρούνται προκειμένου να χαρακτηριστεί μα ουσία ως βακτηριοσίνη είναι τα εξής (Tagg et al., 1976): Οι βακτηριοσίνες πρέπει να είναι πρωτεΐνες. Είναι μια από τις αναγκαίες συνθήκες προκειμένου να χαρακτηριστεί μια αντιμικροβιακή ουσία ως βακτηριοσίνη. Συγκεκριμένα η αδρανοποίηση μιας αντιμικροβιακής ουσίας από πρωτεολυτικά ένζυμα, θεωρείται σημαντική ένδειξη της πρωτεϊνώδους φύσεώς της (Parwin et al., 1997). Η δράση των βακτηριοσινών πρέπει να είναι βακτηριοκτόνος και όχι μόνο βακτηριοστατική. Επειδή πολλές βακτηριοσίνες \παρουσιάζουν βακτηριοκτόνο δράση, ενώ κατά την εφαρμογή τους στα τρόφιμα παρουσιάζουν βακτηριοστατική (Nielsen et al., 1990), φαίνεται ότι η δράση μιας βακτηριοσίνης είναι βακτηριοστατική ή βακτηριοκτόνος ανάλογα με τις συνθήκες κάτω από τις οποίες δρα. Για να δράσει μια βακτηριοσίνη απαιτεί την ύπαρξη κατάλληλων υποδοχέων στην επιφάνεια των κυττάρωνστόχων. Η προϋπόθεση αυτή διαφοροποιεί τις βακηριοσίνες από τα κλασσικά αντιβιοτικά, προϋπόθεση δράσης των οποίων δεν είναι η παρουσία υποδοχέων. Η γενετική κωδικοποίηση των βακτηριοσινών είναι πλασμιδιακής φύσης. Εξαιτίας της αρχικής σύνδεσης των βακτηριοσινών με τις κολισίνες, θεωρείτο ότι ο σχηματισμός των πρώτων κατευθυνόταν από πλασμίδια. Από την άλλη ο Joerger και Klaenhammer 1986, αναφέρουν ότι το γόνίδιο της βακτηριοσίνης ελβετισίνη J του Lactobacllus helveticus είναι χρωμοσωμικό. Η σύνθεση των βακτηριοσινών ακολουθείται από θανάτωση του βακτηριοσινογόνου κυττάρου. Όμως όλες οι βακτηριοσίνες που έχουν απομονωθεί μέχρι τώρα παράγονται χωρίς παράλληλα να προκαλείται λύση του κυττάρου που τις συνθέτει. Έτσι για να 10

15 χαρακτηριστεί ένα αντιβιοτικό ως βακτηριοσίνη δεν θα πρέπει να προκαλεί το θάνατο του κυττάρου που το παράγει. Το φάσμα δράσης των βακτηριοσινών περιορίζεται σε στελέχη που είναι φυλογενετικά κοντά στο στέλεχος που παράγει τη βακτηριοσίνη. Αυτό όμως δεν είναι απόλυτο καθώς υπάρχουν περιπτώσεις βακτηριοσινών που το φάσμα δράσης τους είναι ευρύτατο και περιλαμβάνει ακόμη και στελέχη που ανήκουν σε διαφορετικό γένος. 1.4 Ταξινόμηση βακτηριοσινών κατά KLAENHAMMER Σήμερα το σύστημα ταξινόμησης των βακτηριοσινών που ισχύει περισσότερο είναι εκείνο που προτάθηκε από τον Klaenhammer το 1993 (πίνακας 4). Η ταξινόμηση αυτή αφορά κυρίως τις βακτηριοσίνες των γαλακτικών βακτηρίων, αλλά μπορεί να χρησιμοποιηθεί για όλες τις βακτηριοσίνες. Το σύστημα αυτό ταξινόμησης διακρίνει τις βακτηριοσίνες σε τέσσερις βασικές κατηγορίες με βάση το μοριακό τους βάρος, την ύπαρξη ή όχι της λανθειονίνης στην πρωτοταγή δομή τους καθώς και αν είναι αποκλειστικά πεπτιδιακής φύσης ή όχι. I. Λαντιβιοτικά της ομάδας Ι. Η ομάδα Ι υποδιαιρείται στις υποομάδες Ια και Ιβ. Γενικά τα πεπτίδια της ομάδας αυτής έχουν από 19 μέχρι και πάνω από 50 αμινοξέα. Οι βακτηριοσίνες χαρακτηρίζονται από τα ασυνήθιστα αμινοξέα που περιέχουν, όπως λανθειονίνη, μεθυλολανθειονίνη, δευδροβουτυρίνη και δευδροαλανίνη. Οι βακτηριοσίνες της υποομάδας Ια στις οποίες περιλαμβάνεται και η νιζίνη, αποτελούνται από κατιονικά και υδρόφοβα πεπτίδια που σχηματίζουν πόρους στις μεμβράνες των κυττάρων στόχων, και έχουν πιο εύκαμπτη δομή σε σχέση με την πιο άκαμπτη της υποομάδας Ιβ. Οι βακτηριοσίνες της υποομάδας Ιβ είναι σφαιρικά πεπτίδια και δεν έχουν καθαρό θετικό ή αρνητικό φορτίο (Altena et al., 2000). II. Μικρά μη λαντιβιοτικά πεπτίδια. Η υποομάδα αυτή περιλαμβάνει μικρά θερμοάντοχα μη λαντιβιοτικά πεπτίδια και μπορεί να υποδιαιρεθεί περαιτέρω. Έτσι η υποομάδα ΙΙα περιλαμβάνει βακτηριοσίνες με αντιλιστεριακή δράση και η πρωτοταγής τους δομή περιλαμβάνει την αμινοτελική ακολουθία TyrGlyAsnGlyVal καθώς και δύο υπολείμματα κυστεϊνης που σχηματίζουν δισουλφιδικές γέφυρες στο αμινοτελικό άκρο του πεπτιδίου. Βακτηριοσίνες που η αντιμικροβιακή δράση τους είναι αποτέλεσμα συνεργιστικής δράσης δύο πεπτιδίων ανήκουν στη υποομάδα ΙΙβ. Στις βακτηριοσίνες αυτές είναι απαραίτητα και τα δύο πεπτίδια ώστε να είναι ολοκληρωτικά ενεργές. Η πρωτοταγής δομή των πεπτιδίων αυτών είναι 11

16 διαφορετική και καθώς το καθένα από αυτά κωδικοποιείται από το δικό του γονίδιο, είναι απαραίτητο μόνο το γονίδιο της ανοσοποίησης. Στην υποομάδα αυτή ανήκουν η λακτοκοκκίνη Μ, Λακτασίνη F κ.α. Η υποομάδα ΙΙγ είχε αρχικά προταθεί να περιέχει βακτηριοσίνες που προερχόταν από το γενικό σύστημα έκκρισης (Nes et al., 1996). Από τότε όμως έχει αποδειχθεί ότι οι βακτηριοσίνες που ανήκουν στην υποομάδα ΙΙα χρησιμοποιούν αυτό το σύστημα έκκρισης,από το οποίο έτσι θα πρέπει να αποκλειστούν οι βακτηριοσίνες της υποομάδας Ιιγ (Cintas et al., 1997). Έτσι η υποομάδα αυτή περιλαμβάνει βακτηριοσίνες που προϋπόθεση εκδήλωσης της αντιμικροβιακής τους δράσης είναι η ύπαρξη του αμινοξέος κυστεϊνη στο μόριό τους σε ανηγμένη μορφή. III. Βακτηριοσίνες μεγάλου μοριακού βάρους. Στην ομάδα αυτή ανήκουν βακτηριοσίνες που το μοριακό τους βάρος είναι πάνω από 30kDa και συνεπώς δεν θεωρούνται πεπτίδια αλλά πρωτεΐνες. Χαρακτηρίζονται ως θερμικά ασταθείς και χαρακτηριστικοί αντιπρόσωποι της ομάδας είναι η λακτασίνη Α και η λακτασίνη Β. IV. Σύμπλοκες βακτηριοσίνες. Οι βακτηριοσίνες αυτές σχηματίζουν σύμπλοκα με άλλα μακρομόρια (Klaenhame.r, 1993). Παρόλα αυτά μέχρι σήμερα δεν έχει απομονωθεί και καθαριστεί καμία τέτοια βακτηριοσίνη και έτσι πιστεύεται ότι αυτός ο τύπος της βακτηριοσίνης είναι ένα τεχνούργημα που οφείλεται στις κατιονικές και υδρόφοβες ιδιότητες των βακτηριοσινών, που έχουν ως αποτέλεσμα το σχηματισμό συμπλόκων με άλλα μακρομόρια, υδατανθρακούχα ή λιπιδικά. Το φαινόμενο αυτό έχει αποδειχθεί στην περίπτωση της πλανταρισίνης S. Στην αρχή θεωρήθηκε ότι ήταν ένα μεγάλο σύμπλοκο μόριο αλλά αργότερα με τον καθαρισμό του αποδείχθηκε ότι πρόκειται για μικρό πεπτίδιο και το σύμπλοκο διαχωριζόταν ενώ παρέμενε η δραστηριότητα (JimenezDiaz et al., 1995). Πίνακας 4.Ταξινόμηση βακτηριοσινών κατά Klaenhammer, 1993 Ομάδα Χαρακτηριστικά Χαρακτηριστική βακτηριοσίνη (α) Λαντιβιοτικά της ομάδας Α.περιέχουν το μη πρωτεϊνικό αμινοξύ λανθειονίνη και τα παράγωγά του Νισίνη, λακτοσίνη S, λακτισίνη 481 (β) Μικρά μη λαντιβιοτικά πεπτίδια (β1) Βακτηριοσίνες με αντιλιστεριακή δράση (β2) Βακτηριοσίνες που η αντιμικροβιακή δράση Λακτοκοκκίνη M, πλανταρισίνη είναι αποτέλεσμα συνεργιστικής δράσης δύο EF, GF πεπτιδίων (β3) Βακτηριοσίνες με το αμινοξύ κυστείνη στο μόριό τους Λακτοκοκκίνη G (γ) Βακτηριοσίνες μεγάλου ΜΒ ευαίσθητες στη θερμική επεξεργασία Λακτασίνη Α, λακτασίνη Β (δ) Σύμπλοκες βακτηριοσίνες Λακτοσίνη 2 12 Λευκοσίνη Α, σακασίνη Α

17 2. ΦΥΣΙΚΕΣ, ΒΙΟΧΗΜΙΚΕΣ ΚΑΙ ΒΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΟΣΙΝΩΝ 1. Ευαισθησία σε πρωτεολυτικά ένζυμα. Αφού οι βακτηριοσίνες έχουν πρωτεϊνώδη φύση είναι φυσικό να είναι ευαίσθητες σε ορισμένα πρωτεολυτικά ένζυμα ευρέως φάσματος δράσης, όπως τρυψίνη, αχυμοτρυψίνη, πεψίνη, πρωτεινάση Κ. Επίσης πολλές από τις βακτηριοσίνες που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα, αναστέλλονται από τα ένζυμα του γαστρεντερικού συστήματος. Παράδειγμα αποτελούν οι βακτηριοσίνες νιζίνη καθώς και πλανταρισίνη B και C που αναστέλλονται από το ένζυμο του γαστρεντερικού συστήματος αχυμοτρυψίνη (Bhunia et al., 1988). Το γεγονός αυτό είναι εξαιρετικά σημαντικό διότι κατά την εφαρμογή των βακτηριοσινών στα τρόφιμα, η αναστολή τους από τα ένζυμα του γαστρεντερικού συστήματος αποτρέπει τόσο τη φυσική διατάραξη της μικροχλωρίδας του εντέρου, όσο και κάποιες πιθανές αλλεργικές αντιδράσεις, εάν το μόριο της βακτηριοσίνης εισέλθει αυτούσιο στην κυκλοφορία του αίματος. 2. Ευαισθησία σε γλυκολυτικά και λιπολυτικά ένζυμα. Ορισμένες βακτηριοσίνες εκτός από την ευαισθησία που παρουσιάζουν σε κάποια πρωτεολυτικά ένζυμα, εμφανίζουν και κάποια ευαισθησία σε γλυκολυτικά και λιπολυτικά ένζυμα. Τέτοιο παράδειγμα αποτελεί η πλανταρισίνη που υδρολύεται από τη λιπάση και την ααμυλάση (West et al., 1988). Αυτό σημαίνει ότι ο μηχανισμός δράσης των βακτηριοσινών αυτών είναι άμεσα συσδεδεμένος με την παρουσία μη πρωτεϊνικών τμημάτων στο μόριό τους και πρόκειται για τις σύμπλοκες πρωτείνες. 3. Μοριακά βάρη βακτηριοσινών. Οι περισσότερες από τις βακτηριοσίνες που έχουν μέχρι σήμερα μελετηθεί έχουν μοριακά βάρη από 1,5KDa, η λακτισίνη 481, εώς 37KDa της ελβετισίνης που είναι μια από τις βακτηριοσίνες με το μεγαλύτερο μοριακό βάρος. Ενώ πολλές βακτηριοσίνες αρχικά θεωρούνταν υψηλού μοριακού βάρους πρωτεϊνικά συσσωματώματα, αποδείχθηκε με τεχνικές καθαρισμού ότι ήταν μικρά πεπτίδια πολύ υψηλής υδροφοβικότητας, η οποία ήταν η αιτία που οδηγούσε στη σύνδεση των πεπτιδίων με πλήθος άλλων ενώσεων (Sahl et al., 1994). 4. Δραστικότητα βακτηριοσινών σε διαφορετικές τιμές ph. Από τις βακτηριοσίνες που έχουν μέχρι σήμερα απομονωθεί οι περισσότερες αποτελούνται από υδρόφοβα κατιονικά πεπτίδια με υψηλό ισοηλεκτρικό σημείο (Jack et al., 1995). Οι περισσότερες παρουσιάζουν σταθερότητα σε όξινο και ουδέτερο περιβάλλον ενώ σε αλκαλικές συνθήκες η δράση τους 13

18 αναστέλλεται αντιστρεπτά. Επίσης πολλές βακτηριοσίνες παρουσιάζουν το μέγιστο της αντιμικροβιακής δραστικότητάς τους σε χαμηλές τιμές ph (ph <5) σε σχέση με ουδέτερες περιοχές (Bhunia et al.,1988).η ικανότητα σύνδεσης των βακτηριοσινών στις μεμβράνες των κυτάρων στόχων εξαρτάται από το ph. Για παράδειγμα μείωση του ph από το 7,5 στο 6 έδειξε ότι αυξάνει την ικανότητα σύνδεσης και τη διαπεραστική ικανότητα της πεδιοσίνης PA1 (Ennahar et al., 1999). 5. Ανθεκτικότητα βακτηριοσινών στη θερμική επεξεργασία. Ένα χαρακτηριστικό των βακτηριοσινών είναι η αντοχή τους στη θερμική επεξεργασία. Οι περισσότερο θερμοάντοχες διατηρούν την δραστικότητά τους ακόμη και σε θερμοκρασίες αποστείρωσης (1210C/15min) όπως η λακτασίνη και η μπρεβισίνη (Rammelsberg et al., 1990). Φαίνεται ότι η θερμοανθεκτικότητα των βακτηριοσινών οφείλεται στη δυνατότητα των μορίων τους να σχηματίζουν σφαιρικές δομές στο χώρο εξαιτίας της παρουσίας υδρόφοβων περιοχών στη δομή τους, είτε στην ύπαρξη σταθερών ενδομοριακών δεσμών, είτε τέλος σε συνδυασμό των δύο παραγόντων (Klaenhammer., 1993). Επίσης ο βαθμός διατήρησης της δραστικότητας των βακτηριοσινών μετά από τη θερμική επεξεργασία, εξαρτάται από το βαθμό της καθαρότητάς της καθώς και το ph του περιβάλλοντος. 3. ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΣΙΝΩΝ Ο Jack και οι συνεργάτες του το 1995, πρότειναν ένα γενικό μοντέλο βιοσύνθεσης των βακτηριοσινών που φαίνεται να ακολουθείται τόσο από τις λαντιβιοτικές, όσο και από τις μη λαντιβιοτικές βακτηριοσίνες. Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό υπάρχουν πέντε διακριτά στάδια βιοσύνθεσης: Σχηματισμός του ''πρεπεπτιδίου''. Μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις του ''προπεπτιδίου''. Ενδοκυτταρική μετατόπιση του ''προπεπτιδίου''. Αποκοπή του ''οδηγού πεπτιδιακής ακολουθίας''. Έξοδος στον εξωκκυτταρικό χώρο. 14

19 3.1 Σχηματισμός του ''πρεπεπτιδίου'' Ως γνωστόν οι βακτηριοσίνες είναι ριβοσωμικής προέλευσης αντιβιοτικά, που σημαίνει ότι σχηματίζονται στα ριβοσώματα μετά από μετάφραση του mrna. Το πεπτίδιο που προκύπτει διαφέρει από την τελική βακτηριοσίνη και γενικά ονομάζεται ''πρεπεπτίδιο''. Το πρεπεπτίδιο διακρίνεται σε δύο τμήματα: το πρώτο είναι ο ''οδηγός πεπτιδιακής ακολουθίας'' και το δεύτερο το ''προπεπτίδιο'', από το οποίο και προέρχεται η τελική βακτηριοσίνη. Ο διαχωρισμός των δύο περιοχών γίνεται σε ειδικό σημείο αποκοπής μέσω μιας ενδοπεπτιδάσης (Demel et al., 1996). Οι πιθανοί λειτουργικοί ρόλοι της ''οδηγού πεπτιδιακής ακολουθία'' είναι οι εξής: (α)διατηρεί τη βακτηριοσίνη ανενεργό επιτρέποντας τη διατάραξη της κυτταροπλασματικής μεμβράνης και τελικά το θάνατο του κυττάρου που την παράγει (Van de Meer et al., 1994). (β)συμμετέχει στην καθοδήγηση της βακτηριοσίνης κατά την έξοδό της στο εξωκυτταρικό περιβάλλον. (γ)διατηρεί σταθερή τη στερεοδομή του προπεπτιδίου διευκολύνοντας τις μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις που υφίσταται (Jung., 1991). 3.2 Μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις του πρεπεπτιδίου Μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις καλούνται οι χημικές μεταβολές που υφίσταται μια οποιαδήποτε πρωτεΐνη αμέσως μετά την έξοδό της από τα ριβοσώματα. Παρόλο που οι βακτηριοσίνες συντίθενται ριβοσωμικά, το αντίγραφο που παράγεται πρέπει να τροποποιηθεί πριν γίνει ενεργό. Τα γονίδια που κωδικοποιούν την παραγωγή των ενζύμων τα οποία βοηθούν στις τροποποιήσεις, βρίσκονται συνήθως σε στενή εγγύτητα με το δομικό γονίδιο. Οι λαντιβιοτικές βακτηριοσίνες υφίστανται τις πιο εκτεταμένες τροποποιήσεις. Στα λαντιβιοτικά μια μεμβρανική πρωτεΐνη, αντιγράφεται από το παραγωγό λαντιβιοτικό και τροποποιεί ενζυμικά τη βακτηριοσίνη πριν τη μεταφορά της στον εξωκυταρικό χώρο (Engelke et al., 1992). Ένα χαρακτηριστικό της σύνθεσης των λαντιβιοτικών είναι η παρουσία ενός αμινοτελικού οδηγού πεπτιδιακής ακολουθίας, το οποίο ακολουθείται από ένα καρβοξυτελικό προπεπτίδιο. Η οδηγός πεπτιδιακή ακολουθία, αρχικά θεωρήθηκε ότι λειτουργούσε ως θέση αναγνώρισης για τα ένζυμα που συμμετέχουν στις μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις. Σε πειράματα στα οποία χρησιμοποιήθηκαν μη τροποποιημένα προπεπτίδια φάνηκε ότι μπορούν να υποστούν αναγνώριση και τροποποίηση (Kupke and Gotz., 1996). 15

20 Στις εκτεταμένες μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις που υφίστανται τα λαντιβιοτικά, περιλαμβάνεται και ο σχηματισμός πολλών ασυνήθιστων αμινοξέων. Ο Ingram (1969, 1970) πρότεινε ότι η σερίνη και η θρεονίνη μετατρέπονται σε δευδροαλανίνη και δευδρομεθυλοαλανίνη αντίστοιχα και ότι αυτά τα αμινοξέα λειτουργούν ως πρόδρομοι της λανθειονίνης και της μεθυλολανθειονίνης, ο σχηματισμός των οποίων λαμβάνει χώρα με την προσθήκη θειολικών ομάδων κυστείνης. Τελικά πάνω από δώδεκα ασυνήθιστα αμινοξέα βρίσκονται στα λαντιβιοτικά. Το ''προπεπτίδιο των μη λαντιβιοτικών βακτηριοσινών επίσης υφίσταται τροποποιήσεις με την αποκοπή της αρχικής ακολουθίας (Diep et al., 1996, Ehnrman et al., 2000). Αυτές οι τροποποιήσεις είναι απαραίτητες για την έκκρισή τους και τη μεταφορά τους διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης και εντοπίζονται κυρίως στη δημιουργία δισουλφιδικών και θειοαιθερικών δεσμών. 3.3 Μετακίνηση του προπεπτιδίου προς την κυτταρική μεμβράνη και αποκοπή του οδηγού πεπτιδιακής ακλουθίας Οι περισσότερες βακτηριοσίνες των ομάδων Ι και ΙΙ μεταφέρονται έξω από τον κυτταρικό χώρο με μια οικογένεια μεταφορικών ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών τις ''ATP Binding Cassete ABC transporters'' δηλαδή μεταφορικές πρωτεΐνες ενεγοποιούμενες από ATP. Οι πρωτεΐνες αυτές σχηματίζουν κανάλια εξαγωγής στη μεμβράνη του κυττάρου και το αμινοτελικό άκρο τους είναι υδρόφοβο, κάτι που τις αναγκάζει να έχουν την τάση να κατευθύνονται από το κυτταρόπλασμα προς την κυτταρική μεμβράνη. Οι βακτηριοσίνες οι οποίες εξαρτώνται από το σύστημα πρωτεϊνών ABC μπορούν να χωριστούν σε δύο μεγάλες ομάδες:(α) βακτηριοσίνες με διπλή γλυκίνη στην ''οδηγό πεπτιδιακής ακολουθίας'' και, (β) βακτηριοσίνες με διαφορετικό οδηγό. Οι πρώτες ανήκουν κυρίως στην ομάδα ΙΙ, αλλά περιλαμβάνουν και μερικά λαντιβιοτικά (Havarstein et al., 1994, Nes et al., 1996). Αυτές οι βακτηριοσίνες εκκρίνονται από μια μοναδική μορφή της ομάδας των πρωτεϊνών ABC η οποία φέρει ένα αμινοτελικό οδηγό από περίπου 150 υπολείμματα αμινοξέων τα οποία έχουν ειδική πρωτεολυτική δράση, που διαχωρίζει τον οδηγό με τη διπλή γλυκίνη. Μετά από την έκκριση η ειδική ομάδα των πρωτεϊνών ABC διαχωρίζει την ''οδηγό πεπτιδιακής ακολουθίας'' ενεργοποιώντας έτσι τη βακτηριοσίνη. Μια συμπληρωματική πρωτεΐνη είναι επίσης απαραίτητη για την διαδικασία αυτή (Franke et al., 1996). H ειδική ομάδα των πρωτεϊνών ABC που εκκρίνει λαντιβιοτικά με διαφορετικού τύπου ''οδηγούς πεπτιδιακής ακολουθίας'', δεν κατέχει πρωτεολυτική αμινοτελική δραστηριότητα και η αποκοπή της ''οδηγού πεπτιδιακής ακολουθίας'' γίνεται με τη βοήθεια μιας πρωτεάσης όπως η NisP στη νιζίνη. 16

21 4. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΟΣΙΝΩΝ 4.1 Αλληλεπιδράσεις βακτηριοσινών με το κυτταρικό τοίχωμα Όλες οι βακτηριοσίνες λαντιβιοτικές και μη, μπορούν να προσκολληθούν σε όλα τα κύτταρα των Gram θετικών βακτηρίων ανεξαρτήτως της ικανότητας τους να παράγουν ή όχι βακτηριοσίνη ή ανεξάρτητα από το αν είναι ευαίσθητα ή όχι στη βακτηριοσίνη( Jack et al., 1995). Έτσι η προσκόλληση των βακτηριοσινών στο βακτηριακό κυτταρικό τοίχωμα χαρακτηρίζεται ως μη ειδική. Σχετικά με το ποιο χαρακτηριστικό κάνει τα κύτταρα ευαίσθητα σε μια βακτηριοσίνη ενώ κάποια άλλα παραμένουν ανθεκτικά, υπάρχουν δύο προσεγγίσεις: (α) είτε τα ευαίσθητα στελέχη έχουν κάποια ιδιότητα που επιτρέπει τη δράση των βακτηριοσινών, (β) είτε τα ευαίσθητα στελέχη έχουν κάποιο ιδιαίτερο χαρακτηριστικό το οποίο τα προστατεύει από τη δράση των βακτηριοσινών. Σύμφωνα με την πρώτη προσέγγιση ο μηχανισμός δράσης των βακτηριοσινών γίνεται σε δύο στάδια. Στο πρώτο οι βακτηριοσίνες συνδέονται με ειδικούς ή μη ειδικούς υποδοχείς οι οποίοι βρίσκονται στο κυτταρικό τοίχωμα των ευαίσθητων στελεχών. Κατά το δεύτερο στάδιο συμβαίνουν μη αντιστρεπτές μεταβολές στην πλασματική μεμβράνη που τελικά οδηγούν στο θάνατο του βακτηριακού κυττάρου. Πράγματι το πρώτο στάδιο προσκόλλησης των βακτηριοσινών στο κυτταρικό τοίχωμα οφείλεται σε ιοντικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ της βακτηριοσίνης και του κυτταρικού τοιχώματος. Εξαιτίας του σχετικά υψηλού περιεχομένου σε βασικά αμινοξέα, οι βακτηριοσίνες είναι πεπτίδια με θετικό φορτίο κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, κάτι που τις επιτρέπει να προσκολλώνται στην αρνητικά φορτισμένη φωσφολιπιδική στοιβάδα του κυτταρικού τοιχώματος (Ennahar et al., 1999) Η επαφή των ευαίσθητων βακτηρίων με μόρια είτε λαντιβιοτικών είτε των μη λαντιβιοτικών βακτηριοσινών οδηγεί στην έξοδο ενδοκυτταρικών συστατικών (K, Na, ATP) στο εξωκυτταρικό περιβάλλον. Έχει παρατηρηθεί ότι η διάβαση του κυτταρικού τοιχώματος από τις βακτηριοσίνες γίνεται με τη βοήθεια ''ειδικών'' ή ''μη ειδικών'' υποδοχέων. Οι ''ειδικοί'' υποδοχείς συνδέονται αποκλειστικά με συγκεκριμένες βακτηριοσίνες και βρίσκονται στην επιφάνεια των ευαίσθητων κυττάρων. Οι ''μη ειδικοί'' υποδοχείς δεν συνδέονται αποκλειστικά με τις βακτηριοσίνες, ενώ εκτός από την επιφάνεια των κυττάρων στόχων, βρίσκονται και σε άλλες ενδοκυτταρικές μεμβράνες. 17

22 Συγκεκριμένα για τη δράση της νιζίνης δεν είναι απαραίτητη η παρουσία ''ειδικών'' υποδοχέων (Abee et al., 1991), ενώ αντίθετα φαίνεται απαραίτητη η παρουσία τους για τη δράση της βακτηριοσίνης λακτοστρεψίνη 5 (Zottola et al., 1994). Εικόνα 1. Προτεινόμενο μοντέλο σχηματισμού πόρων και θανάτωσης του βακτηριακού κυττάρου.ο σχηματισμός πόρων οδηγεί στη διαρροή του κυττάρου και την εκροή ιόντων Κ, που οδηγεί στην απώλεια της μεμβράνης και την αναστολή πρόσληψης αμινοξέων. Ο θάνατος του κυττάρου τελικά επηρεάζεται από ένα κύκλο ATP και πρόσληψης απελευθέρωσης καλίου από τη βακτηριοσίνη σε συνδυασμό με αυξημένη υδρόλυση της ATP από την ATPαση (Garneau et al., 2002). Εικόνα 2. Μηχανισμός σχηματιμού πόρων κατιονικών πεπτιδίων χωρίς την παρουσία ειδικών υποδοχέων. Ο σχηματισμός ελίκων αποτελεί την κριτική αλλαγή στη διαμόρφωση που χρειάζεται για το σχηματισμό πόρων στο μοντέλο του βαρελιού. Αυτός ο μηχανισμός βασίζεται στη σταθεροποίηση των αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στα φωσφολιπίδια της κυτταρικής μεμβράνης και τα υπολείμματα κατιόντων του πεπτιδίου επιτρέποντας την εισαγωγή υδρόφοβων περιοχών στην εξωτερική επιφάνεια της μεμβράνης. Από τη στιγμή της σύνδεσής τους στην επιφάνεια της μεμβράνης, ένας αριθμός από τις διατεταγμένες βακτηριοσίνες, δυνητικά μπορούν να συσσωματωθούν. Το σύμπλεγμα των βακτηριοσινών μπορεί με αυτό τον τρόπο να ανοίξει την μεμβράνη σχηματίζοντας ένα προσωρινό πόρο(garneau et al., 2002). 18

23 4.2 Μηχανισμός δράσης βακτηριοσινών στην πλασματική μεμβράνη των εαίσθητων κυττάρων Οι βακτηριοσίνες των γαλακτικών βακτηρίων παρουσιάζουν έντονη δραστηριότητα στους πρωτοπλάστες που προέρχονται από τα κύτταρα ανθεκτικών Gram θετικών στελεχών, που σημαίνει ότι η ανθεκτικότητα κάποιων στελεχών οφείλεται στην αντοχή του κυτταρικού τους τοιχώματος(schved et al., 1994). Όσον αφορά τον τρόπο με τον οποίο οι βακτηριοσίνες διασχίζουν το κυτταρικό τοίχωμα και φτάνουν στην επιφάνεια της πλασματικής μεμβράνης των ευαίσθητων κυττάρων, έχει αποδειχθεί ότι γίνεται με το σχηματισμό πόρων στην μεμβράνη (Jack et al., 1995). Επιπλέον, η παρουσία αμφίφιλων τμημάτων στις βακτηριοσίνες, τα οποία θεωρούνται διαμεμβρανικές έλικες και η διαλυτότητά τους στο νερό και η ικανότητα σύνδεσής τους στην πλασματική μεμβράνη, υποδηλώνει ότι έχουν την ικανότητα σχηματισμού συμπλόκων πόρων που ακολουθούν ένα μοντέλο κινούμενου βαρελιού(εικόνα 2). Το αρχικό στάδιο σύνδεσης των βακτηριοσινών στην πλασματική μεμβράνη των κυττάρων στόχων πιστεύεται ότι είναι ηλεκτροστατικής φύσης και αποτελεί ενδιάμεσο στάδιο ενός μεμβρανικού αποδέκτη της πρωτεΐνης που βρίσκεται πάνω στη μεμβράνη (Venema et al., 1995). Αρχικά η συμμετοχή τέτοιων υποδοχέων για τις αλληλεπιδράσεις της πλασματικής μεμβράνης και των βακτηριοσινών της ομάδας ΙΙ θεωρήθηκε απαιτούμενη, κάτι που έρχεται σε αντίθεση με τον τρόπο δράσης των λαντιβιοτικών όπου δεν είναι απαραίτητη η παρουσία τέτοιων υποδοχέων. Παρόλα αυτά ο Maftah και οι συνεργάτες του οι οποίοι έδειξαν ότι η μεσεντερισίνη Υ105 είχε την ικανότητα να προκαλεί το σχηματισμό πόρων στις μεμβράνες των μιτοχονδρίων, υπέθεσαν ότι οι υποδοχείς που εμπλέκονταν στην αρχική σύνδεση της μεσεντερισίνης, που δεν είναι ειδικοί γιατί υπάρχουν επίσης και στα μιτοχόνδρια, μπορεί να είναι πρωτεΐνες ή ακόμη και φωσφολιπίδια. Επίσης ενδιαφέρον παρουσιάζουν έρευνες που αναφέρονται στο σχηματισμό πόρων από τις βακτηριοσίνες πάνω στα λιπιδικά κυστίδια, τα ποία στερούνται μεμβρανικών πρωτεϊνών, κάτι που σημαίνει ότι οι πρωτεϊνικοί υποδοχείς μπορεί να μην είναι απόλυτα απαραίτητοι (Chen et al., 1997). 4.3 Μηχανισμός αντιμικροβιακής δράσης των λαντιβιοτικών Δημιουργία πόρων στην πλασματική μεμβράνη. Διαρροή αμινοξέων, ιόντων Κ ATP και άλλων ενδοκυτταρικών στοιχείων μικρού μοριακού βάρους που απορροφούν στο U.V. 19

24 Διατάραξη της ηλεκτροχημικής ισορροπίας μεταξύ των δύο πλευρών της πλασματικής μεμβράνης. Αναστολή λειτουργίας του δυναμικού κίνησης των ηλεκτρονίων. Διακοπή ζωτικών λειτουργιών του κυττάρου στόχου που οδηγούν τελικά στο θάνατό του Βέβαια απαραίτητη προυπόθεση για το σχηματισμό πόρων στην πλασματική μεμβράνη από τις λαντιβιοτικές βακτηριοσίνες, είναι η κυτταροπλασματική μεμβράνη να είναι φορτισμένη πριν την επίδραση της βακτηριοσίνης. Σε ορισμένες όμως περιπτώσεις παρατηρείται σχηματισμός πόρων ακόμη και με μηδενικό μεμβρανικό δυναμκό. Αυτό εξαρτάται από:(α) τη συγκέντρωση των μορίων της βακτηριοσίνης, (β) το ph του εξωκυτταρικού περιβάλοντος και (γ) τη σύσταση της λιπιδικής μεμβράνης(slijpers., 1989). 4.4 Μηχανισμός αντιμικροβιακής δράσης των μη λαντιβιοτικών Όπως οι λαντιβιοτικές βακτηριοσίνες, έτσι και οι μη λαντιβιοτικές δρουν προκαλώντας διακοπή της συνέχειας της κυτταρικής μεμβράνης μέσω της δημιουργίας υδρόφιλων καναλιών στην πλασματική μεμβράνη του κυττάρου στόχου. Στη συνέχεια προκαλείται διαρροή εσωκυτταρικών ιόντων στο εξωκυτταρικό περιβάλλον και έτσι διαταράσσεται η ηλεκτροχημική ισορροπία μεταξύ των δύο πλευρών της μεμβράνης, αναστέλλοντας το δυναμικό κίνησης των πρωτονίων, στερώντας έτσι το κύτταρο από ενέργεια που είναι απαραίτητη για την επιβίωσή του. Η κυριότερη διαφορά που εντοπίζεται στο μηχανισμό αντιμικροβιακής δράσης των λαντιβιοτικών και μη λαντιβιοτικών βακτηριοσινών είναι ότι οι τελευταίες μπορούν να δράσουν ακόμη και όταν η πλασματική μεμβράνη δεν είναι ενεργοποιημένη. 5. ΑΝΟΣΙΑ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΟΣΙΝΟΓΟΝΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ Σύμφωνα με τον ορισμό των βακτηριοσινών και με όσα αναφέρθηκαν παραπάνω, είναι σαφές ότι τα βακτηριοσινογόνα στελέχη παρουσιάζουν ανοσία, απέναντι στη βακτηριοσίνη που τα ίδια παράγουν. Επίσης αντοχή ή ανθεκτικότητα στις βακτηριοσίνες παρουσιάζουν και κάποια είδη βακτηρίων, πληθυσμών που πολλές φορές είναι ευαίσθητοι στην βακτηριοσίνη. 20

25 Το ερώτημα που τίθεται είναι ποιες είναι οι αιτίες της αντοχής των βακτηριοσινογόνων και των ευαίσθητων στελεχών στην βακτηριοσίνη, γιατί δηλαδή ένας ορισμένος αριθμός κυττάρων επιβιώνει μετά από την έκθεσή του στη δράση της βακτηριοσίνης. Ανοσία είναι η αντοχή του στελέχους που παράγει τη βακτηριοσίνη, απέναντι στην βακτηριοσίνη που το ίδιο συνθέτει. Ανθεκτικότητα είναι η αντοχή ενός ευαίσθητου πληθυσμού βακτηρίων, στην βακτηριοσίνη, ενώ μη ευαισθησία είναι η αντοχή ορισμένων ειδών η ακόμη και γενών βακτηρίων απέναντι σε μια βακτηριοσίνη. 5.1 Ανοσία Το φαινόμενο της ανοσίας μπορεί να προσεγγιστεί από δύο διαφορετικές πλευρές. Η μια πλευρά αφορά την γενετική κωδικοποίησή της βακτηριοσίνης και η άλλη τον τρόπο έκφρασής της σε κυτταρικό επίπεδο. Ανεξάρτητα του είδους της βακτηριοσίνης, το φαινόμενο της ανοσίας είναι χαρακτηριστικό όλων των βακτηρισινογόνων στελεχών, γεγονός που αποδεικνύεται από το ότι όταν από βακτήρια που παρήγαγαν βακτηριοσίνη αφαιρέθηκε το γονίδιο σύνθεσης αυτής, τότε έπαψε τόσο η σύνθεση της βακτηριοσίνης όσο και η ανοσία αυτής(ersfeld et al.,1989). Το γεγονός αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η παραγωγή της βακτηριοσίνης και η ανοσία της συνδέονται σε γενετικό επίπεδο. Πράγματι για ορισμένες βακτηριοσίνες, μετά από μελέτες εντοπίσθηκαν γονίδια που είναι υπεύθυνα για την ανοσία. Όσον αφορά τη νιζίνη το γονίδιο της ανοσίας της φαίνεται να είναι το NisI. Πρόκειται για μια υδρόφιλη πρωτεΐνη με μια τυπική λιποπρωτεϊνική ακολουθία με ένα υπόλειμμα κυστείνης στη θέση 1.Ο ρόλος αυτής της πρωτεΐνης είναι να συνδέεται με τα λιπίδια και στην συνέχεια να οδηγείται στην εξωκυτταρική πλευρά της πλασματικής μεμβράνης (Saris et al., 1996). Σύμφωνα με τις μέχρι τώρα μελέτες για το λαντιβοτικό pep5 ως γονίδιο ανοσίας αυτού έχει χαρακτηριστεί το pepi και βρίσκεται δίπλα από το δομικό γονίδιο pepa. Η πρωτεΐνη ανοσίας αυτού του γονιδίου αποτελείται από 69 αμινοξέα. Το πεπτίδιο της ανοσίας pepi χαρακτηρίζεται για την εντυπωσιακή διανομή φορτίου που παρουσιάζει. Αποτελείται από μια αμινοτελική υδρόφοβη περιοχή 20 αμινοξέων, η οποία ακολουθείται από μια υδρόφοβη καρβοξυτελική περιοχή με θετικό φορτίο. Πειράματα έχουν δείξει ότι το γονίδιο pepi συνδέεται ασθενώς με την κυτοπλασματική μεμβράνη, και αυτή η ασθενής σύνδεσή του φαίνεται να οφείλεται στο υδρόφοβο αμινοτελικό άκρο του πεπτιδίου. Πιστεύεται ότι η pepi βρίσκεται στην εξωτερική επιφάνεια της κυτταρικής 21

26 μεμβράνης γιατί παρατηρείται μείωση του επιπέδου της pepi με την επίδραση εξωκυτταρικά προστιθέμενης πρωτεάσης (Saris et al., 1996). Κοινό χαρακτηριστικό των γονιδίων ανοσίας nisi και pepi είναι ότι η πλήρης δράση τους εκφράζεται μόνο παρουσία των αντίστοιχων δομικών γονιδίων nisa και pepa. Επίσης για την νισίνη που παράγεται από το στέλεχος Lactococcus lactis 6F3, έχει παρατηρηθεί ότι η απουσία μεταφορικών πρωτεινών NisE, NisF, NisG προκάλεσε μείωση της ανοσίας του (Saris et al., 1996). Αυτό σημαίνει ότι οι πρωτείνες μεταφοράς ABC συμμετέχουν στους μηχανσμούς ανοσίας Μηχανισμός της ανοσίας Η αναστολή της βακτηριοσινογόνου δράσης των λαντιβιοτικών μπορεί να επιτευχθεί με διάφορους τρόπους. 1. Η προσρόφηση των λαντιβιοτικών στη μεμβράνη μπορεί να ανασταλεί. 2. Οι βακτηριοσίνες που προσκολλώνται είναι δυνατόν να μεταφερθούν στο κυτόπλασμα όπου διασπώνται ή μεταφέρονται.3. Πολλά μόρια ενός λαντιβιοτικού είναι απαραίτητα προκειμένου να σχηματίσουν έναν πόρο. Αυτή η διαδικασία της συνάθροισης των μορίων είναι δυνατόν να παρεμποδιστεί με ειδικές αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνών ανοσίας που συνδέονται με τη μεμβράνη. Ο σχηματιζόμενος πόρος είναι δυνατόν να αποσταθεροποιηθεί ή να καλυφθεί από πεπτίδιο. Τα παραπάνω έχουν παρατηρηθεί τόσο για την νιζίνη, όσο και για την pep5 (Saris et al., 1996). 5.2 Μηχανισμοί ανθεκτικότητας ορισμένων στελεχών Από τη στιγμή που ένα συντηρητικό αποδυκνείεται ότι είναι ασφαλές και αποτελεσματικό, είναι κρίσιμο να εξασφαλιστεί η μακροβιότητα της χρήσης του με την παρεμπόδιση του πολλαπλασιασμού ανθεκτικών κυττάρων. Ήδη πολλά κύτταρα επιδυκνείουν αντοχή σε πολλά αντιβιοτικά και έχει αναφερθεί επίσης μεταφορά της ανθεκτικότητας μεταξύ των οργανισμών. Παρόλο που οι βακτηριοσίνες δεν είναι αντιβιοτικά, υπάρχει η ανησυχία ότι η έκθεση σε αυτές θα έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία κυττάρων πιο ανθεκτικών στα αντιβιοτικά. Καθώς τα αντιβιοτικά και η νιζίνη έχουν διαφορετικό τρόπο δράσης, έχει αποδειχθεί ότι η έκθεση στη νισίνη δεν έχει καμιά επίδραση στην συχνότητα αντοχής της L.monocytogenes Scott A στην αμφικιλλίνη 22