Functional classification of proteins using mass spectrometry data and exploration of their frequency of identification in proteomic analysis.

Transcript

1 UNIVERSITY OF PATRAS SCHOOL OF HEALTH SCIENCES FACULTY OF MEDICINE SCHOOL OF NATURAL SCIENCES DEPARTMENT OF PHYSICS INTERDEPARTMENTAL POSTGRADUATE COURSE IN MEDICAL PHYSICS PhD Thesis: Functional classification of proteins using mass spectrometry data and exploration of their frequency of identification in proteomic analysis. BOUGIOUKOS PANAGIOTIS B.Sc. in Medical Instruments Technology M.Sc. in Medical Physics Patras, May 2009, Hellas

2 2

3 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΥΣΙΚΗΣ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΦΥΣΙΚΗ Διδακτορική Διατριβή: Λειτουργική ταξινόμηση πρωτεϊνών με δεδομένα φασματογραφίας μάζας και διερεύνηση της συχνότητας ταυτοποίησής τους σε πρωτεομική ανάλυση. ΜΠΟΥΓΙΟΥΚΟΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ B.Sc Τεχνολογία Ιατρικών Οργάνων M.Sc. Ιατρική Φυσική Πάτρα Μάιος

4 SUPERVISING COMMITTEE 1. George Nikiforidis, Professor, Department of Medical Physics, University of Patras (Supervisor), Greece. 2. Anastasios Bezerianos, Professor, Department of Medical Physics, University of Patras (Supervisor), Greece. 3. Dionisis Cavouras, Professor, Department of Medical Instruments Technology, Technological Educational Institute of Athens, Greece. EXAMINING COMMITTEE 1. George Nikiforidis, Professor, Department of Medical Physics, University of Patras (Supervisor), Greece. 2. Anastasios Bezerianos, Professor, Department of Medical Physics, University of Patras (Supervisor), Greece. 3. Dionisis Cavouras, Professor, Department of Medical Instruments Technology, Technological Educational Institute of Athens, Greece. 4. Michael Vrahatis, Professor, Department of Mathematics, University of Patras, Greece. 5. Spiros Fotopoulos, Professor, Department of Physics, University of Patras, Greece 6. George Sakellaropoulos, Assistant Professor, Department of Medical Physics, University of Patras, Greece 7. Vangelis Liatsikos, Assistant Professor, Department of Medicine, University of Patras, Greece 4

5 5

6 6 To my family and especially my mother

7 7

8 ACKNOWLEDGMENTS The accomplishment of the present thesis would be impossible without the valuable assistant of my professors and worthy colleagues to whom I would like to acknowledge. Initially, I would like to acknowledge my supervisors Professor G. Nikiforidis and A. Bezerianos fist of all for giving me the opportunity to conduct and accomplish my PhD thesis. I also like to thank, Professor G. Nikiforidis for the constitutive conversations we had during the work out of my thesis that guided me to scientific paths and also thanks to his feisty spirit he led me to explore new methodological directions. Also I would like to express my thankfulness to Professor A. Bezerianos for his financial assistance accepting me in his PENED project. His help didn t restricted in finding financial means but he facilitated my research effort these three and half years by introducing me to very important people that assisted me in understanding many unknown issues concerning proteomics. The debates we had enlightened many difficulties that were coming up during the PhD research process. Gratitude is not a strong word for expressing the valuable assistance that Professor D. Cavouras provided to me. Although he was my Professor in postgraduate courses I never had the opportunity to cooperate with him. However I was fortuned to be a PhD candidate under his guidance. I would like to thank him for his confidence and also for believing in me. He was my mentor who taught me computer programming and pattern recognition. I would also like to thank him for the endless hours that he spent with me in reviewing scientific articles. During these three and half years he proved to be a very good friend that provided me with psychological support when things seemed to go down. I would like to thank from the bottom of my heart Dr A. Daskalakis firstly for his companionship from the first year of the M.Sc. in medical physics until the completion of his PhD thesis. Our endless conversation and arguments helped me to become open minded in many fields concerning my PhD thesis. He was the first who taught me computer programming and together we have spend endless hours in programming, in writing scientific articles and searching as well as testing new methodologies in proteomics. 8

9 Special thanks must be ascribed to Dr. D. Glotsos who taught me and assisted me in writing scientific articles. His peaceful spirit eliminated the stress that existed after the uncountable hours in the MIPA lab. Dimitris also helped me in my very first computer programming steps with useful programming tips. I am also thankful to Dr S. Kostopoulos who helped me to test and verify the correct functioning of the pattern recognition algorithms that I have implemented. In addition the conversation that we had using pattern recognition terminology helped me in better understanding pattern recognition. Additionally I would like to thank Dr I. Kalatzis for his help during the implementation of pattern recognition algorithms. He always offered to assist me in complex issues regarding signal processing. I would also like to thank all my colleagues at the MEDISP (Athens) and the MIPA (Patras) laboratories as well as at the IΙBEAA. Finally I would like to thank my family that have always been supportive, encouraging and giving me strength to carry on from my postgraduate years as a student until now as a PhD candidate. 9

10 Table of contents ACKNOWLEDGMENTS 8 Περίληψη 12 Chapter 1 29 Introduction 29 Aims and contribution of the thesis 30 Organization of the thesis 31 Research Funding 31 PART I: BASIC THEORY 33 Chapter Proteins, proteome, and proteomics DE based proteomics Sample preparation Sample fractionation Purification of protein mixtures Protein s separation techniques MS based proteomics Matrix assisted laser desorption / ionization and Surface enhanced laser desorption / ionization Clinical Prostate Cancer - Diagnosis Methods Digital Rectal Examination (DRE) Prostate Specific Antigen (PSA) Use of total serum PSA and DRE for prostate cancer early detection Age and PSA ranges Transrectal ultrasound-guided prostate biopsy Clinical Ovarian Cancer - Diagnosis Methods Ovarian cancer background Ovarian tumor markers Screening Methods and Diagnostic Difficulties in Ovarian Tumors Treatment and Prognosis of Ovarian Tumors 49 Chapter MS based proteomic analysis Preprocessing Baseline estimation - subtraction Normalization High frequency noise reduction - smoothing Feature extraction Feature selection Filter methods Wrapper methods Embedded methods Classification Unsupervised classification methods Reinforcement classification methods Supervised classification methods System evaluation 66 Chapter Proteomic datasets Ovarian dataset Proteomic preparation analysis 70 10

11 The employed ovarian dataset (8-7-02) Ciphergen s ProteinChip technology The Weak Cation Exchange (WCX) Array Prostate dataset The employed prostate dataset (7-3-02) The H4 Reverse Phase Array 78 PART II: EXPERIMENTAL RESEARCH 81 Chapter Introduction Review of the literature Proposed scheme for prostate proteomic analysis Materials and Methods Data partition-system evaluation design Normalization Smoothing Feature extraction Generation of intensity zones Peak alignment Classification Results Discussion 98 Chapter Introduction Review of the literature Proposed scheme for ovarian proteomic analysis Materials and methods Data partition-system evaluation design Baseline subtraction Normalization Smoothing Feature extraction Peak intensity regions generation Peak alignment Classification Results Discussion 112 Chapter Summary Future directions 116 References 118 Appendix Ι 129 List of publications as result of the research work performed for the purposes of the present thesis 129 Appendix II 131 Abbreviations 131 Appendix ΙII 132 List Of Figures 132 Appendix IV 133 List Of Tables

12 Περίληψη Πρωτεομική (proteomics) είναι η μεγάλης κλίμακας ανάλυση δειγμάτων πρωτεϊνών και ειδικότερα των αλλαγών τους, που είναι αποτέλεσμα διαφόρων ασθενειών ή της επίδρασης εξωτερικών παραγόντων, όπως τοξικών ουσιών. Έχει ως σκοπό την ανίχνευση νέων φαρμακευτικών στόχων τη μελέτη και χρήση νέων διαγνωστικών δεικτών και την έρευνα διαφόρων βιολογικών διαδικασιών. Η πρωτεομική έχει αναπτυχθεί τα τελευταία έτη και η σημαντική διαφορά της από τις προηγουμένως υπάρχουσες πρωτεϊνικές αναλυτικές τεχνικές είναι ότι δεν αναλύει τις πρωτεΐνες μία-μία, αλλά με έναν αυτοματοποιημένο, μεγάλης κλίμακας τρόπο. Η πρωτεομική μπορεί να συγκριθεί με τη γενωμική ανάλυση που παρέχει αποτελέσματα για τα επίπεδα των mrna. Εντούτοις, η γνώση των επιπέδων mrna δεν μας ενημερώνει απαραιτήτως και για τα πρωτεϊνικά επίπεδα ή τον αριθμό των τροποποιημένων πρωτεϊνικών μορφών. Αυτές οι πληροφορίες μπορούν να μας παρασχεθούν μόνο από την πρωτεομική ανάλυση. Η ζωή είναι μια δυναμική διαδικασία και δεν εκφράζονται όλες οι πιθανές πρωτεΐνες σε μία χρονική στιγμή. Επιπλέον, το πρότυπο της πρωτεϊνικής έκφρασης επηρεάζεται από διάφορους παράγοντες όπως το στάδιο ανάπτυξης ενός οργανισμού και η φυσιολογική του κατάσταση. Φαίνεται ότι όσο πιο πολύπλοκο είναι το γονιδίωμα, τόσο λιγότερος είναι ο συνολικός αριθμός των πιθανών πρωτεϊνών που θα εκφραστεί σε κάποια χρονική στιγμή. Η πρωτεομική, συμπληρώνει την γενωμική με στοιχεία όσον αφορά ποια γονιδιακά προϊόντα εκφράζονται, σε ποιο τύπο κυττάρων, σε ποια ποσά και υπό ποιους όρους και πώς τα πρωτεϊνικά επίπεδα και οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των πρωτεϊνών αλλάζουν ως αποτέλεσμα συγκεκριμένων ασθενειών ή εξωτερικών παραγόντων. Τα δεδομένα πρωτεομικής τα οποία εξάγονται από φασματογράφο μάζας έχουν ως αποτέλεσμα την δημιουργία ενός μονοδιάστατου σήματος το οποίο στον οριζόντιο άξονα έχει τιμές μάζας/φορτίο και στον κατακόρυφο άξονα έχει τις αντίστοιχες τιμές έντασης. Οι τιμές στον οριζόντιο άξονα (μάζα/φορτίο) οι οποίες αντιπροσωπεύουν πεπτίδια ή πρωτεΐνες έχουν ένα εύρος από 0 έως δεκάδες χιλιάδες. Επομένως τα πρωτεομικά φάσματα θεωρούνται ιδιαίτερα πολύπλοκα. Η διαχείριση της πληροφορίας των πρωτεομικών φασμάτων καθώς και η εξαγωγή διαγνωστικών συμπερασμάτων είναι ένα πεδίο ανοιχτό προς έρευνα. Η ανάπτυξη συστημάτων 12

13 υπολογιστικής νοημοσύνης καθιστά εφικτή την επεξεργασία και ανάλυση των πρωτεομικών φασμάτων. Συγκεκριμένα τα πρωτεομικά φάσματα υπόκεινται σε προεπξεργασία, όπως διόρθωση της βασικής γραμμής (Baseline correction), εξομάλυνση για την μείωση των αιχμών οι οποίες δεν αποτελούν κορυφές και κανονικοποίηση ώστε μεταξύ τους να είναι συγκρίσιμα. Το επόμενο βήμα μετά την προεπεξεργασία των φασμάτων είναι η εξαγωγή χαρακτηριστικών από τα πρωτεομικά σήματα (φάσματα) που αποσκοπεί στην μείωση της διάστασης των δεδομένων, καθώς και στην διευκόλυνση της ερμηνείας των δεδομένων καθορίζοντας αριθμητικές μεταβλητές οι οποίες είναι γνωστές ως χαρακτηριστικά. Ακολούθως μετά το βήμα της εξαγωγής χαρακτηριστικών είναι απαραίτητη η επιλογή των χαρακτηριστικών. Στόχος της επιλογής αυτής είναι ο καθορισμός εκείνων των χαρακτηριστικών τα οποία διαχωρίζουν, με όσο το δυνατόν υψηλότερη ακρίβεια, τις ομάδες που έχουν επιλεγεί προς διαχωρισμό (π.χ. υγιείς καρκινοπαθείς). Επομένως έχοντας επιλέξει τα χαρακτηριστικά τα οποία θα αντιπροσωπεύουν κάθε πρωτεομικό φάσμα μπορούμε να εκπαιδεύσουμε διάφορους ταξινομητές. Τέλος ιδιαίτερη έμφαση θα πρέπει να δοθεί στην επιλογή του πειραματικού σχεδιασμού (π.χ. διαχωρισμός δεδομένων) καθώς και στα κριτήρια αποτίμησης για να εξασφαλίσουμε την ακρίβεια και την αξιοπιστία. Η παρούσα διατριβή διαπραγματεύεται τον σχεδιασμό, ανάπτυξη και υλοποίηση μεθόδων για την επεξεργασία και ανάλυση πρωτεομικών φασμάτων. Στόχος είναι να προταθούν πιθανοί βιοδείκτες για την υποβοήθηση στη διάγνωση των ασθενειών του καρκίνου του προστάτη και των ωοθηκών. Παράλληλα η ανάπτυξη και ο σχεδιασμός ενός συστήματος αναγνώρισης προτύπων για την αυτόματη διάγνωση των υγειών από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη και ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών από τους αντίστοιχους υγιείς, χρησιμοποιώντας δεδομένα από πρωτεομικά φάσματα προερχόμενα από μεθόδους φασματομετρίας μάζας. Θεωρητικό Μέρος Εισαγωγή Καρκίνος του προστάτη. 13

14 Ο καρκίνος του προστάτη αποτελεί την δεύτερη πιο σημαντική αιτία θανάτου στην Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής και τον Καναδά [1]. Η θνησιμότητα που οφείλεται στον καρκίνο του προστάτη μπορεί να μειωθεί από την έγκαιρη πρόγνωσή του. Όσο ποιο έγκαιρη είναι η πρόγνωσή του τόσο ποιο αποτελεσματική είναι η θεραπεία του. Ο προστάτης είναι ένας αδένας που βρίσκεται στο εσωτερικό του σώματος, κάτω από την ουροδόχο κύστη του άνδρα και περιβάλλει την ουρήθρα. Τον αδένα αυτό τον έχει ένας άνδρας ήδη από την στιγμή που γεννιέται. Με την λειτουργία του συμβάλει, στον έλεγχο της ούρησης, το οποίο το πετυχαίνει λόγω της ανατομικής του θέσης, στον εμπλουτισμό του σπέρματος με χρήσιμα και απαραίτητα συστατικά και στη λειτουργία της εκσπερμάτισης [2]. Ο καρκίνος του προστάτη είναι η ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων στον αδένα αυτόν. Τα καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται πολύ πιο γρήγορα από τα φυσιολογικά κύτταρα, και έτσι, η ολοένα αυξανόμενη συγκέντρωσή τους δημιουργεί όγκους. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα έχουν την δυνατότητα να μεταφέρονται σε άλλα σημεία του σώματος (κάνουν μετάσταση) και να καταστρέφουν τα υγιή κύτταρα. Η αιτία του καρκίνου του προστάτη είναι άγνωστη, αλλά η ηλικία, το οικογενειακό ιστορικό, η διατροφή και η φυλή είναι οι ισχυρότεροι παράγοντες επικινδυνότητας. 1/Ηλικία: Ο επιπολασμός (ποσοστό των νέων διαγνώσεων καρκίνου) του καρκίνου του προστάτη αυξάνεται με την αύξηση της ηλικίας, περισσότερο από οποιαδήποτε άλλη μορφή καρκίνου [3]. 2/Οικογενειακό ιστορικό: Η ύπαρξη ιστορικού καρκίνου του προστάτη στην οικογένεια καθώς και η έναρξή του σε ηλικία κάτω των 55 ετών σε άτομα της οικογένειας, αυξάνει τις πιθανότητες στον άνδρα να εμφανίσει το νόσημα αυτό. 3/Φυλή: Αυξημένη πιθανότητα εμφανίζει η μαύρη φυλή 4/Ο ρόλος άλλων παραγόντων όπως είναι οι ανδρικές ορμόνες, το διατροφικό ζωικό λίπος και οι περιβαλλοντικές τοξίνες, δεν είναι ξεκάθαρος. Στα πρώτα στάδια του καρκίνου του προστάτη συχνά δεν παρουσιάζονται εμφανή συμπτώματα. Για τον λόγω αυτό πολλές περιπτώσεις καρκίνου εντοπίζονται όταν έχουν πλέον εξαπλωθεί σε σημεία του σώματος και πέραν του προστάτη. Τα συμπτώματα που εμφανίζονται συνήθως είναι: 1/ Συχνή ή επιτακτική ανάγκη ούρησης, διακοπτόμενη ή καθυστερημένη ροή των ούρων 2/ Πόνος κατά την ούρηση 3/ Αίμα στα ούρα 14

15 4/ Πόνος κατά την εκσπερμάτιση ή αίμα στο σπέρμα 5/ Στυτική δυσλειτουργία 6/ Πόνος στην περιοχή της πυέλου (λεκάνη) ή στο κάτω μέρος της πλάτης Η πρόληψη συνίσταται ώστε σε κάθε περίπτωση ο καρκίνος να μην φτάνει στα τελευταία στάδια Οι άνδρες πάνω από τα 50 θα πρέπει να υποβάλλονται τακτικά (κάθε χρόνο) σε δακτυλική εξέταση του προστάτη, καθώς και μετρήσεις του PSA (ένας δείκτης που μπορεί να μετρηθεί δίνοντας αίμα) για να μπορεί να γίνει η έγκαιρη ανίχνευση και θεραπεία [3]. Οι άνδρες που πληρούν παράγοντες επικινδυνότητας θα πρέπει να κάνουν εξετάσεις ήδη από την ηλικία 40 με 45 ετών. Κατά την δακτυλική εξέταση του προστάτη γίνεται ψηλάφηση του προστάτη για να διαπιστωθεί αν υπάρχουν ανωμαλίες στο μέγεθος, στο σχήμα και στην υφή του. Στην περίπτωση που διαπιστωθεί κάποιο πρόβλημα, ίσως χρειαστούν περαιτέρω εξετάσεις [2]. Το ειδικό αντιγόνο του προστάτη (PSA) είναι η πιο χρήσιμη εξέταση αίματος για την έγκαιρη ανίχνευση. Το PSA είναι ένζυμο που παράγεται από τα κύτταρα του προστάτη και ο ρόλος του είναι να ρευστοποιεί το σπέρμα μετά την εκσπερμάτιση. Συνήθως, μικρή μόνο ποσότητα του PSA βρίσκεται στο αίμα, αλλά όταν υπάρχει καρκίνος του προστάτη, η ποσότητα αυτή είναι αυξημένη. Ωστόσο, επειδή η αύξηση του PSA μπορεί να οφείλεται και σε άλλα προβλήματα όπως υπερπλασία του προστάτη (δηλαδή διόγκωσή του) και προστατίτιδα, χρειάζεται να γίνουν περαιτέρω εξετάσεις για να επιβεβαιωθεί η διάγνωση [3]. Κατά την ανάλυση ούρων δείγμα ούρων αναλύεται προκειμένου να διαπιστωθούν τυχόν προβλήματα. Η ανάλυση αυτή δεν δείχνει αν υπάρχει καρκίνος, αλλά βοηθάει στο να αποκλειστούν άλλες παθήσεις που έχουν όμως παρόμοια συμπτώματα και πιθανόν να προκαλέσουν ανησυχία [2]. Με την βιοψία του προστάτη, μικρά δείγματα ιστού του προστάτη αποσπώνται με μια βελόνα, που διεισδύει στον προστάτη μέσα από το ορθό (παχύ έντερο). Πολλαπλές βιοψίες του προστάτη είναι απαραίτητες για την επιβεβαίωση της διάγνωσης [4]. Το διορθικό υπερηχογράφημα είναι απαραίτητο ώστε να μπορούν να τοποθετηθούν με ακρίβεια οι βελόνες που θα πάρουν ιστό (κύτταρα) για βιοψία. Η πρωτεομική με την εφαρμογή της φασματογραφίας μάζας έχει βοηθήσει σημαντικά στην πρόγνωση του καρκίνου του προστάτη και στην ανακάλυψη γνωστών βιοδεικτών του καρκίνου του προστάτη όπως είναι το ειδικό αντιγόνο του 15

16 προστάτη (PSA), η προστατική όξινη φωσφατάση (PAP), το ειδικό πεπτίδιο του προστάτη (PSP) και το ειδικό αντιγόνο μεμβράνης του προστάτη (PSMA) [5]. Καρκίνος των ωοθηκών. Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι μια συνήθεις γυναικολογική κακοήθεια με ποικίλα ιστολογικά χαρακτηριστικά [6]. Είναι η κύρια αιτία θανάτου από καρκίνου ανάμεσα σε όλες τις γυναικολογικές κακοήθειες, καθώς και ο πέμπτος πιο συχνός τύπος καρκίνου μεταξύ γυναικών του δυτικού κόσμου [7, 8]. Η πλειοψηφία των κακοηθών όγκων των ωοθηκών εμφανίζεται σε γυναίκες ηλικίας άνω των 65 χρόνων [9], ενώ οι καλοήθεις όγκοι είναι συνηθέστεροι σε νεότερης ηλικίας γυναίκες μεταξύ 25 και 45 χρόνων [10]. Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι μια ύπουλη και επιθετική ασθένεια διότι συνήθως δεν εμφανίζει συμπτώματα και καθότι δεν υπάρχει μέθοδος διάγνωσης με μεγάλη ευαισθησία. Επομένως δεν υπάρχει σύμπτωμα που να δηλώνει κάποια αλλοίωση και έτσι η ασθένεια εκδηλώνεται σε προχωρημένο στάδιο. Τα αίτια του καρκίνου των ωοθηκών δεν έχουν βρεθεί, αλλά ορισμένες μελέτες έχουν δείξει ότι ορισμένες γυναίκες έχουν περισσότερες πιθανότητες, λόγω κάποιον παραγόντων υψηλής επικινδυνότητας να εμφανίσουν καρκίνο, σε σχέση με άλλες. Υψηλού κινδύνου παράγοντες για την ανάπτυξη καρκίνου των ωοθηκών είναι, η ηλικία, η εμμηνόπαυση, το οικογενειακό ιστορικό όσον αφορά στο καρκίνο των ωοθηκών καθώς και το προσωπικό ιστορικό του ασθενούς όσον αφορά στο καρκίνο του μαστού και του εντέρου, ή στο καρκίνο του ενδομήτριου [11]. Πρόσφατα, αναλύσεις που οφείλονται στην ανάπτυξη της γενετικής επιστήμης οδήγησαν στην ανακάλυψη δυο γονιδίων του BRCA1 και BRCA2. Οι γυναίκες οι οποίες παρουσιάζουν μετάλλαξη στα γονίδια, BRCA1 και BRCA2, ίσως εμφανίσουν μεγαλύτερο κίνδυνο στην ανάπτυξη καρκίνου των ωοθηκών [12]. Μεταλλάξεις στο γονίδιο BRCA2 οδηγούν σε μικρότερο ποσοστό εμφάνισης καρκίνου από 10-20% σε σχέση με τις μεταλλάξεις του BRCA1 γονιδίου το οποίο έχει ποσοστό επικινδυνότητας για εμφάνιση καρκίνου περίπου 40-60% [13]. Ανοσοϊστοχημεικές αναλύσεις ορμονικών υποδοχέων, προτεάσες καθώς και δείκτες αγγειογένεσης χρησιμοποιούνται στην κλινική ρουτίνα για διάγνωση του καρκίνου. Λόγω της πολυπαραγοντικής φύσης του καρκίνου, είναι πολύ πιθανό, μια ομάδα βιοδεικτών να είναι πιο ενδεικτικοί για την πρόβλεψη της βιολογικής συμπεριφοράς διαφόρων όγκων, από την χρήση ενός μόνο 16

17 βιοδείκτη. Το CA-125 είναι ένας δείκτης ο οποίος χρησιμοποιείται για την διάγνωσης και συγκεκριμένα στην πρόγνωση του καρκίνου των ωοθηκών. Η επιβεβαίωση του και αξιοπιστία του βιοδείκτη CA-125 οδήγησε στην ευρέως χρήση του, ως βιοδείκτης για τον καρκίνο των ωοθηκών, καθώς και στην κλινική διάγνωση της ανταπόκρισης του ασθενούς κατά την θεραπεία του καρκίνου. Πρόσφατες προσπάθειες επικεντρώθηκαν στην βελτίωση της διαγνωστικής ακρίβειας του CA-125, είτε χρησιμοποιώντας μόνο τον συγκεκριμένο βιοδείκτη (CA-125), είτε χρησιμοποιώντας τον με νέους βιοδείκτες που έχουν συσχετιστεί με τον καρκίνο των ωοθηκών [14,15]. Ο βιοδείκτης CA-125 βρίσκεται στο μητρικό γάλα και στο αμνιακό υγρό στις υγιείς γυναίκες. Παρόλα αυτά υπάρχει επίσης σε γυναίκες με γυναικολογικά προβλήματα όπως μητρικό λειομύωμα και ενδομητρίωση μειώνοντας έτσι την ειδικότητα του βιοδείκτη. Τα επίπεδα του CA-125 μπορούν να ποικίλουν με την ηλικία. Ως προεγχειρητικός δείκτης το CA-125 βρέθηκε να διαχωρίζει καλύτερα τους καλοήθεις από τους κακοήθεις όγκους ωοθηκών στις γυναίκες μετά την εμμηνόπαυση [16, 17]. Επιπροσθέτως άλλοι βιοδείκτες οι οποίοι έχουν βρεθεί είναι οι prostasin, OVX1, CA- 15.3, CA-72.4, και inhibin [18, 19]. Η διάγνωση του καρκίνου των ωοθηκών συνήθως περιλαμβάνει κάποια εξέταση από τις ακόλουθες ή και όλες αν κριθεί απαραίτητο. Οι εξετάσεις αυτές περιλαμβάνουν, γυναικολογική εξέταση, διακολπικό υπέρηχο, αξονική τομογραφία κοιλίας, εξέταση αίματος για το βιοδείκτη CA-125, και ερευνητική λαπαροτομία (χειρουργική διαδικασία που εξετάζει την κοιλιακή κοιλότητα) [20, 21]. Η θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών περιλαμβάνει, χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία. Ασθενείς σε προχωρημένο στάδιο του καρκίνου υπόκεινται χειρουργική επέμβαση η οποία συνδυάζεται με χημειοθεραπεία [22]. Οι καλοήθεις όγκοι καθώς και ασθενείς που βρίσκονται σε πρώιμα στάδια του καρκίνου συνήθως θεραπεύονται με χειρουργική αφαίρεση του όγκου. Τέλος η καθυστέρηση της έγκαιρης διάγνωσης του καρκίνου των ωοθηκών έχει σαν αποτέλεσμα 30% ποσοστό επιβίωσης [23]. Στόχοι της παρούσας διατριβής και βιβλιογραφική ανασκόπηση Οι ερευνητικές μελέτες που αφορούν στην πρωτεομική με χρήση δεδομένων από φασματογράφο μάζας στοχεύουν κυρίως: 17

18 1/ Στο κατάλληλο συνδυασμό των βημάτων, προεπεξεργασίας, εξαγωγής χαρακτηριστικών, επιλογής χαρακτηριστικών και επιλογής ταξινομητή ώστε η διάγνωση να είναι ακριβέστερη από τις υπάρχουσες μεθόδους. 2/ Στο να προταθούν βιοδείκτες (biomarkers) και συγκεκριμένα τιμές φάσματος (μάζας/φορτίου) οι οποίες ενδεχομένως να σχετίζονται με τις ασθένειες προς μελέτη (Καρκίνου του προστάτη και των ωοθηκών). Οι περισσότερες μελέτες που αφορούν στην επεξεργασία και ανάλυση πρωτεομικών φασμάτων έχουν χρησιμοποιήσει έναν μεγάλο αριθμό διαφόρων τεχνικών για την πραγματοποίηση των βημάτων προεπεξεργασίας, εξαγωγής χαρακτηριστικών, επιλογής χαρακτηριστικών. Επίσης έχει χρησιμοποιηθεί και ένας μεγάλος αριθμός ταξινομητών. Προεπεξεργασία πρωτεομικών φασμάτων. Η προεπεξεργασία περιλμβάνει τον υπολογισμό της βασικής γραμμής (baseline) καθώς και την αφαίρεσή της από το φάσμα. Διάφοροι μέθοδοι έχουν εφαρμοστεί για την επίτευξη αυτού του στόχου οι οποίες μπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες: Τις ευρετικές (heuristic) και τις μεθόδους που βασίζονται στην μοντελοποίηση (model based). Συγκεκριμένα οι ευρετικές μέθοδοι υπολογίζουν την βασική γραμμή, πραγματοποιώντας μη παραμετρική αποτίμηση της (βασικής γραμμής) από ένα πλήθος πρωτεομικών φασμάτων [24-29]. Οι μέθοδοι μοντελοποίησης βασίζονται στην κατασκευή ενός μαθηματικού μοντέλου της βασικής γραμμής βασισμένο στους φυσικούς νόμους οι οποίοι διέπουν την φασματομετρία μάζας. Έτσι, οι παράμετροι του μαθηματικού μοντέλου υπολογίζονται από ένα πλήθος πρωτεομικών φασμάτων [30]. Η βασική γραμμή η οποία υπολογίζεται είτε με την πρώτη είτε με την δεύτερη μέθοδο ακολούθως αφαιρείται από το αρχικό φάσμα. Ένα άλλο σημαντικό βήμα της προεπεξεργασίας το οποίο εφαρμόζεται σε πολλές μελέτες αφορά στην καταστολή του θορύβου υψηλής συχνότητας. Τα πρωτεομικά φάσματα παρουσιάζουν θόρυβο υψηλής συχνότητα. Αυτός ο θόρυβος καθιστά περίπλοκη και πολλές φορές αδύνατη την εφαρμογή, τόσο των μαθηματικών μοντέλων (αλγόριθμους), όσο και την παρατήρησή από ανθρώπινο παρατηρητή ώστε να βρεθούν πρότυπα από τα οποία να μπορεί να διεξαχθεί κάποιο χρήσιμο 18

19 βιολογικό συμπέρασμα. Ένα πλήθος μελετών έχουν εφαρμόσει διάφορες μεθόδους ώστε να αντιμετωπίσουν την μείωση του θορύβου υψηλής συχνότητας. Οι μέθοδοι αυτοί αφορούν κυρίως, στα φίλτρα εξομάλυνσης [31, 32] και τον μετασχηματισμό κυματιδίων (wavelet transform) [33-35]. Το τελευταίο βήμα προεπεξεργασίας που συνήθως εφαρμόζεται στα πρωτεομικά φάσματα είναι το βήμα της κανονικοποίησης. Το βήμα αυτό εφαρμόζεται ώστε να μειωθούν οι αυξομειώσεις στις εντάσεις των πρωτεομικών φασμάτων [36]. Διάφοροι μέθοδοι έχουν εφαρμοστεί για την κανονικοποίηση των φασμάτων. Όπως: 1/ κανονικοποίηση ως προς το ολικό φορτίο (total ion current). Συγκεκριμένα οι εντάσεις των κορυφών (peaks) διαιρούντα από το άθροισμα όλων των εντάσεων των κορυφών του φάσματος [24, 37-46]. 2/ Κανονικοποίηση ως προς την υψηλότερη κορυφή [29, 47] ή γραμμική κλιμάκωση (linear scaling) χρησιμοποιώντας τις εντάσεις της υψηλότερης και χαμηλότερης κορυφής του φάσματος [48-51]. Εξαγωγή χαρακτηριστικών Μετά την προεπεξεργασία το επόμενο βήμα που συνήθως εφαρμόζεται από τις περισσότερες μελέτες πρωτεομικής αφορά στην εξαγωγή χαρακτηριστικών από τα προεπεξεργασμένα σήματα. Στην πρωτεομική, η εξαγωγή χαρακτηριστικών μπορεί να οριστεί ως η διαδικασία εξαγωγής πληροφορίας, από τα προεπεξεργασμένα σήματα, η οποία εκφράζει την παθολογική κατάσταση των σημάτων και κατ επέκταση των ατόμων από τα οποία προέρχονται τα σήματα αυτά. Μια μέθοδος ώστε να εξαχθούν χαρακτηριστικά από πρωτεομικά σήματα είναι να χρησιμοποιηθούν όλες οι εντάσεις των αντίστοιχων τιμών μάζας/φορτίου (m/z values) ενός φάσματος [32, 50-55]. Η συγκεκριμένη μέθοδος είναι η πιο απλή αλλά έχει το μειονέκτημα ότι χρησιμοποιείται μεγάλος αριθμός χαρακτηριστικών (>15.000) καθιστώντας έτσι την διαδικασία της επιλογής χαρακτηριστικών δύσκολη. Επιπροσθέτως, στις πρωτεομικές μελέτες ο αριθμός των πρωτεομικών σημάτων ο οποίος είναι διαθέσιμός συνήθως δεν είναι πολύ μεγάλος και επομένως ο αριθμός των χαρακτηριστικών που θα πρέπει να επιλεγούν θα πρέπει να είναι σημαντικά μικρότερος από Μια μέθοδος η οποία εφαρμόζεται για την εξαγωγή χαρακτηριστικών είναι η διαδικασία ομαδοποίησης τιμών μάζας/φορτίου binning [24, 48, 49, 56, 57]. Με αυτή την διαδικασία ένας προκαθορισμένος αριθμός τιμών μάζας/φορτίου αποτελούν μια ομάδα bin και επομένως ένα χαρακτηριστικό 19

20 προέρχεται από τον υπολογισμό της μέσης τιμής [49] ή της μέγιστης τιμής [24]. Μια άλλη μέθοδος ώστε να εξαχθούν χαρακτηριστικά από τα πρωτεομικά φάσματα βασίζεται στις ιδιότητες των κορυφών peaks οι οποίες σχηματίζονται από πολλές τιμές μάζας/φορτίου. Με αυτή την διαδικασία η εξαγωγή χαρακτηριστικών χωρίζεται σε τρία βασικά βήματα: 1/ εντοπισμός των κορυφών [26, 41, 58, 59], 2/ ευθυγράμμιση των κορυφών [29, 31, 38-42, 60-62], και 3/ υπολογισμός των τιμών, των χαρακτηριστικών όπως το μέγιστο ύψος των κορυφών [27, 50] καθώς και το μέσο, του ύψους της κορυφής [38, 49]. Επιλογή χαρακτηριστικών Το επόμενο βήμα που εφαρμόζεται συνήθως μετά την εξαγωγή χαρακτηριστικών είναι η επιλογή τους. Το συγκεκριμένο βήμα είναι ιδιαίτερα κρίσιμο διότι τα χαρακτηριστικά τα οποία θα αντιπροσωπεύσουν κάθε φάσμα πρέπει να έχουν επιλεγεί έτσι ώστε να μπορούν να καθορίσουν την παθολογική του κατάσταση (π.χ. υγιή, καρκινικά). Ο αριθμός των χαρακτηριστικών τα οποία εξάγονται από ένα πρωτεομικό φάσμα είναι συνήθως (<1000). Ο αριθμός αυτός των χαρακτηριστικών είναι πολύ μεγάλος λαμβανομένου υπόψη ότι τα πρωτεομικά φάσματα τα οποία είναι διαθέσιμα στις περισσότερες μελέτες είναι λιγότερα (<500). Αυτή η σημαντική αριθμητική διαφορά μεταξύ του αριθμού των χαρακτηριστικών και του αριθμού των πρωτεομικών φασμάτων ενδεχομένως να οδηγήσει σε μείωση του ποσοστού επιτυχούς ταξινόμησης. Το συγκεκριμένο είναι σύνηθες φαινόμενο το οποίο οφείλεται στην υπερβολική εκπαίδευση και στην χρήση περιττών χαρακτηριστικών τα οποία δεν παρέχουν καμία πληροφορία [63-67]. Επιπροσθέτως μεγάλος αριθμός χαρακτηριστικών συνήθως οδηγεί σε αύξηση του χρόνου εκπαίδευσης του ταξινομητή. Επομένως από τη σκοπιά της βιοϊατρικής έρευνας είναι σημαντικό η εύρεση ενός μικρού αριθμού χαρακτηριστικών, τα οποία να συντελούν στην σωστή ταξινόμηση, και περαιτέρω τα χαρακτηριστικά αυτά αν μπορούν να επιβεβαιωθούν κλινικά. Από τα παραπάνω καθίσταται σαφές ότι είναι πολύ σημαντική η μείωση των χαρακτηριστικών σε ένα μικρότερο αριθμό πλούσιων πληροφοριακά χαρακτηριστικών. Η διαδικασία αυτή είναι γνωστή ως επιλογή χαρακτηριστικών. Πολύ ταξινομητές αρχικά σχεδιάστηκαν κατά τέτοιο τρόπο ώστε να μπορούν να χειρίζονται έναν μικρό αριθμό χαρακτηριστικών. Ο μεγάλος αριθμός όμως χαρακτηριστικών ο οποίος υπάρχει σε πολλές εφαρμογές [65, 68, 69] καθιστά 20

21 αναγκαία την χρήση τεχνικών επιλογής χαρακτηριστικών. Οι τεχνικές αυτές έχουν αρκετά πλεονεκτήματα όπως: 1. βελτίωση της απόδοσης του ταξινομητή 2. γρηγορότερη και αποτελεσματικότερη κατασκευή των μαθηματικών μοντέλων του ταξινομητή 3. απόκτηση βαθύτερης γνώσης σχετικά με την δημιουργία των δεδομένων. Οι τεχνικές επιλογής χαρακτηριστικών μπορούν να οργανωθούν σε τρεις κατηγορίες ανάλογα με τον τρόπο που τα μοντέλα ταξινόμησης συνδυάζονται με τις μεθόδους επιλογής χαρακτηριστικών. 1. filter methods [32, 40, 55, 70-75], 2. wrapper methods [48, 50, 56, 76], 3. embedded methods [44, 52, 77]. Ταξινόμηση Μετά την επιλογή χαρακτηριστικών από τα πρωτεομικά φάσματα το επόμενο βήμα είναι η κατασκευή του ταξινομητή ο οποίος θα χρησιμοποιήσει τα χαρακτηριστικά αυτά ως είσοδο με τελικό αποτέλεσμα τον διαχωρισμός των πρωτεομικών φασμάτων (π.χ., των υγειών φασμάτων από καρκινικά). Οι ταξινομητές που έχουν χρησιμοποιηθεί σε πρωτεομικές μελέτες αφορούν στους ταξινομητές εποπτευόμενης και μη εποπτευόμενης μάθησης. Οι ταξινομητές εποπτευόμενης μάθησης περιλαμβάνουν τους ταξινομητές κ- πλησιέστερων γειτόνων (k-nearest Neighbor - knn) [29, 32, 44, 47, 62], λογιστικής παλινδρόμησης (logistic regression) [27, 39, 40, 42, 43], τεχνητά νευρωνικά δίκτυα (Artificial Neural Networks - ANN) [44, 47, 74, 78-80], δέντρα απόφασης (decision trees) [27, 35, 37, 44, 47, 49, 60, 81], γραμμική ή δευτέρου βαθμού ανάλυση διαχωρισμού (Discirminant analysis - LDA/QDA) [24, 27, 29, 55, 58, 62, 82, 83], μηχανές διανυσμάτων στήριξης (Support Vector Machines SVM) [29, 44, 54, 55]. Ταξινομητές μη εποπτευόμενης μάθησης που έχουν χρησιμοποιηθεί σε πρωτεομικές μελέτες είναι οι αυτο-οργανωμένοι χάρτες (Self-Organizing Maps SOM) [48, 50, 56, 57, 76] καθώς και η ιεραρχική ομαδοποίηση (hierarchical clustering) [41, 45, 74]. 21

22 Πειραματικό Μέρος Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκαν πρωτεομικά δεδομένα που αφορούν στον καρκίνο των ωοθηκών και του προστάτη. Τα δεδομένα είναι διαθέσιμα στο διαδίκτυο και η συλλογή τους πραγματοποιήθηκε από το US National Cancer Institute [84]. Τα πρωτεομικά δεδομένα ωοθηκών δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας τη πρωτεϊνική μήτρα WCX2. Τα δεδομένα προήλθαν από 91 υγιείς γυναίκες και 162 γυναίκες με καρκίνο των ωοθηκών. Η ομάδα των καρκινοπαθών μπορεί περεταίρω να διαχωριστεί σε 28 ασθενείς που βρίσκονται στο στάδιο I, 20 ασθενείς στο στάδιο II, 99 ασθενείς στο στάδιο III, 12 ασθενείς στο στάδιο ΙV, και 3 ασθενείς οι οποίοι δεν κατηγοριοποιήθηκαν σε κάποιο από τα ανωτέρω στάδια. Η διαδικασία παρασκευής των δειγμάτων περιγράφεται στην εργασία [50] και η τοποθέτηση των δειγμάτων στην μήτρα πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ρομποτική συσκευή. Τα φάσματα τα οποία δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας τον φασματογράφο μάζας τύπου SELDI περιλαμβάνουν διακριτές τιμές μάζας/φορτίου με τις αντίστοιχές τιμές έντασης. Τα δεδομένα που αφορούν στο όργανο του προστάτη δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας την πρωτεϊνική μήτρα Η4. Για την παραγωγή των πρωτεομικών φασμάτων χρησιμοποιήθηκε φασματογράφος μάζας τύπου SELDI. Τα δεδομένα προστάτη περιλαμβάνουν. 63 φάσματα τα οποία αντιστοιχούν σε υγιείς με (PSA<1) και 190 φάσματα καλοήθειας με (PSA>4). Τα φάσματα αυτά αποτέλεσαν την πρώτη ομάδα δεδομένων. Η δεύτερη ομάδα δεδομένων αποτελείται από τους ασθενείς που έχουν διαγνωστεί με καρκίνο του προστάτη. Από τα 69 καρκινοπαθή φάσματα, τα 26 προήλθαν από ασθενείς που έχουν επίπεδα PSA από 4 έως 10 (PSA 4-10) και τα 43 από ασθενείς με επίπεδο PSA>10. Τα φάσματα εξήχθησαν από το φασματογράφο μάζας με αφαίρεση της βασικής γραμμής (baseline). Αποτέλεσμα αυτού είναι η εμφάνιση αρνητικών τιμών έντασης στα φάσματα. Η τοποθέτηση του δείγματος στην πρωτεϊνκή μήτρα έγινε με το χέρι χρησιμοποιώντας το πρωτόκολο που προτείνετε από την Ciphergen Biosystems. Κάθε ένα πρωτεομκό φάσμα περιέχει τιμές μάζας/φορτίου καθώς και τις αντίστοιχες τιμές έντασης. Προεπεξεργασία φασμάτων 22

23 Τα φάσματα κανονικοποιήθηκαν στην μονάδα ώστε να μειωθούν οι μεταβολές των εντάσεων μεταξύ των φασμάτων [36]. Επιπρόσθετα στα φάσματα εφαρμόστηκε το Loewss [85] φίλτρο εξομάλυνσης. Για την ανεύρεση του επιπέδου του θορύβου σε κάθε φάσμα, αναπτύχθηκε ειδικός αλγόριθμος. Συγκεκριμένα σε ένα κυλιόμενο μη επικαλυπτόμενο παράθυρο υπολογίστηκε το ιστόγραμμα των τιμών που περικλείονταν στο παράθυρο. Ο τοπικός θόρυβος για μια θέση του παραθύρου υπολογίστηκε ως το άθροισμα της μέσης τιμής και της τυπικής απόκλισης των τιμών του παραθύρου οι οποίες βρίσκονταν κάτω από το ενενηκοστό εκατοστημόριο του ιστογράμματος (του παραθύρου). Μετά την εκτίμηση του θορύβου για κάθε φάσμα με μια απλή αφαιρετική μέθοδο [33] υπολογίστηκαν οι κορυφές για κάθε φάσμα ξεχωριστά. Οι κορυφές αυτές θα χρησιμοποιηθούν στην συνέχεια για περαιτέρω ανάλυση. Για να μπορέσουμε να μελετήσουμε τις κορυφές που έχουν υψηλή μεσαία και χαμηλή ένταση αναπτύχθηκε αλγόριθμος ο οποίος είχε ως στόχο την κατάτμηση των κορυφών των φασμάτων ανάλογα με την έντασή τους. Επομένως είχαμε την δυνατότητα να διερευνήσουμε όλες τις εντάσεις των κορυφών (υψηλές μεσαίες χαμηλές) και κυρίως τις κορυφές χαμηλής έντασης στις οποίες συχνά επικεντρώνονται οι βιολόγοι με στόχο την εξαγωγή βιολογικών συμπερασμάτων [86]. Οι κορυφές των φασμάτων λόγω χημικού και ηλεκτρονικού θορύβου [87] παρουσιάζουν μια μετατόπιση ως προ τον x-άξονα. Έτσι αναπτύχθηκε αλγόριθμος για την ευθυγράμμιση των κορυφών. Επομένως οι υψηλές κορυφές για όλα τα φάσματα ευθυγραμμίστηκαν. Η ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε για τις μεσαίες αλλά και για τις χαμηλές κορυφές. Ταξινόμηση Η μεθοδολογία ταξινόμησης σχεδιάστηκε ως εξής: Σε κάθε επανάληψη (μέγιστο έως 10 φορές) της μεθόδου εξωτερικού διασταυρωμένου ελέγχου αξιοπιστίας (External Cross Validation ECV) [88], και κατά την διάρκεια διαχωρισμού των δεδομένων σε δεδομένα εκπαίδευσης (2/3 των δεδομένων) και δεδομένα ελέγχου (1/3 των δεδομένων), οι υψηλές κορυφές των δεδομένων εκπαίδευσης χρησιμοποιήθηκαν ως είσοδος στους τρεις ταξινομητές, Μηχανών Στήριξης Διανυσμάτων [89], του Πιθανοκρατικού Νευρωνικού Δικτύου (Probabilistic Neural Network - PNN) [90] και του αλγόριθμου k-πλησιέστερων γειτόνων [90]. Για κάθε ένα ταξινομητή, 23

24 καθορίστηκαν τα βέλτιστα χαρακτηριστικά που μεγιστοποιούν την απόδοση ακρίβειάς του κάνοντας χρήση της μεθόδου διαδοχικής εμπρόσθιο-επιλογής (Sequential Forward Selection SFS) [90]. Από τους τρεις ταξινομητές, αυτός ο οποίος παρείχε την μέγιστη ακρίβεια ταξινόμησης επιλέχθηκε τελικά για να διαχωρίσει, τα δεδομένα ελέγχου. Η ίδια διαδικασία πραγματοποιήθηκε για τις μεσαίες και χαμηλές κορυφές. Το αποτέλεσμα της παραπάνω διαδικασίας ήταν η επιλογή ενός ταξινομητή για κάθε ομάδα κορυφών. Οι ταξινομητές αυτοί για όλες τις ομάδες κορυφών συνδυάστηκαν με ένα πλειοψηφικό κανόνα για την ταξινόμηση υγειών από καρκινικούς. Τα τελικά αποτελέσματα ταξινόμησης μετά και την δέκατη επανάληψη της διαδικασίας υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τις μέσες τιμές τους και την τυπική τους απόκλιση. Συμπεράσματα Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η ανεύρεση πιθανών βιοδεικτών οι οποίοι θα βοηθήσουν στην έγκαιρη διάγνωση των ασθενειών του καρκίνου του προστάτη και των ωοθηκών. Παράλληλα επιτεύχθηκε η ανάπτυξη και ο σχεδιασμός ενός συστήματος αναγνώρισης προτύπων, το οποίο λαμβάνει πληροφορίες από κάθε περιοχή έντασης (υψηλή, μεσαία, χαμηλή) με σκοπό τον βέλτιστο διαχωρισμό υγειών από καρκίνο του προστάτη ή των ωοθηκών. Η ιδέα διαχωρισμού των κορυφών των πρωτεομικών φασμάτων ανάλογα με την έντασή τους βασίζεται στο γεγονός ότι οι κορυφές χαμηλής έντασης είναι οι κορυφές στις οποίες κυρίως επικεντρώνονται οι βιολόγοι [86]. Η διαδικασία ομαδοποίησης των κορυφών ανάλογα με το επίπεδο έντασής τους είχε καλή απόδοση ταξινόμησης και η απόδοση αυτή βελτιώθηκε ακόμα περισσότερο όταν συνδυάστηκε η διαδικασία ομαδοποίησης με τον πλειοψηφικό κανόνα. Προηγούμενες μελέτες [52, 91] έχουν χρησιμοποιήσει παρόμοιες μεθοδολογίες συνδυάζοντας διάφορους ταξινομητές, αλλά από διαφορετική οπτική. Σύμφωνα με αυτές τις μελέτες, η απόδοση ταξινόμησης κάθε ενός ταξινομητή συνδυάζεται αθροίζοντας την πληροφορία που εξάγεται από όλο το πρωτεομικό φάσμα. Στην περίπτωση όμως της προτεινόμενης μεθόδου η μεθοδολογία σχεδιάστηκε κατά τέτοιο τρόπο ώστε οι ταξινομητές να χρησιμοποιούν πληροφορία από ένα μέρος του πρωτεομικού φάσματος (υψηλές, μεσαίες, χαμηλές κορυφές). Ακολούθως, μόνο ένας ταξινομητής (αυτός με την μέγιστη ακρίβεια ταξινόμησης) επιλεγόταν από το σύστημα για να αντιπροσωπεύσει τις περιοχές έντασης. Έτσι οι 24

25 ταξινομητές που ορίστηκαν για κάθε περιοχή έντασης συνδυάστηκαν με ένα πλειοψηφικό κανόνα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι κανόνες ταξινόμησης που προέκυψαν από την προτεινόμενη μέθοδο, χρησιμοποιώντας διάφορες περιοχές έντασης του ιδίου σήματος, δεν συσχετίζονται. Αυτό το συμπέρασμα προκύπτει και από το γεγονός ότι η χρήση του πλειοψηφικού κανόνα έδωσε σημαντικά υψηλότερο ολικό ποσοστό ακρίβειας (97.18%) σε σύγκριση με το ολικό ποσοστό ακρίβειας κάθε ενός ταξινομητή ξεχωριστά (92.94% για τους SVM και k-nn, και 89.41% για τον PNN). Είναι σημαντικό επίσης να αναφέρουμε ότι τα πρωτεομικά φάσματα μελετήθηκαν για τιμές μάζας/φορτίο μεγαλύτερες από 1500 λόγω του θορύβου που εμπεριέχουν οι τιμές του φάσματος κάτω από την τιμή αυτή. Ο θόρυβος αυτός είναι πιθανό να οδηγήσει σε λανθασμένα αποτελέσματα όπως έχει παρατηρηθεί σε συγκεκριμένη μελέτη [59]. Τα σημαντικά συμπεράσματα και η συνεισφορά της παρούσας διατριβής συνίσταται στα ακόλουθα: Στον σχεδιασμό, στην ανάπτυξη και στην υλοποίηση μεθοδολογιών με στόχο την ακριβή διάκριση των υγειών από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη [ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ: 1,2,3,5,6,7,8:APPENDIX I]. Στον σχεδιασμό στην ανάπτυξη και στην υλοποίηση μεθοδολογίας για την βελτίωση στην διάκριση υγειών από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών [ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΗ: 4 APPENDIX I]. Στο να προτείνουμε τιμές μάζας/φορτίο οι οποίες ενδεχομένως να αποτελέσουν χρήσιμους βιοδείκτες για τον καρκίνο του προστάτη [ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ: 1,2,3,5,6,7,8:APPENDIX I] και για τον καρκίνο των ωοθηκών [ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΗ: 4 APPENDIX I]. Στο σχεδιασμό στην ανάπτυξη και στην υλοποίηση μεθοδολογίας για την επιλογή χαρακτηριστικών από πρωτεομικά φάσματα του προστάτη, αντιμετωπίζοντας το πρόβλημα του μεγάλου αριθμού χαρακτηριστικών [ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ: 3,4,7 APPENDIX I]. Στον σχεδιασμό στην ανάπτυξη και στην υλοποίηση μεθοδολογίας για να μπορέσουμε να ερευνήσουμε την διαγνωστική αξία των κορυφών, των πρωτεομικών φασμάτων, με διάφορες τιμές έντασης και κυρίως των 25

26 χαμηλών, οι οποίες θεωρούνται ως πλούσιες σε πληροφορία από τους [ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ: 3,4:APPENDIX I] βιολόγους Μελλοντικές κατευθύνσεις Όπως αναφέρθηκε στο κεφάλαιο 3 τα πρωτεομικά φάσματα εμφανίζουν μια μονοτονικά φθίνουσα βασική γραμμή (baseline). Η προσέγγιση η οποία χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή είναι ευρετική (heuristic). Οι ευρετικές μέθοδοι παρά το γεγονός ότι χρησιμοποιούνται ευρέως στις περισσότερες μελέτες, δεν είναι τόσο αποδοτικές όσο οι προσεγγίσεις που βασίζονται σε μοντέλα. Επομένως, ένας πιο εύρωστος αλγόριθμος για τον υπολογισμό της βασικής γραμμής θα ήταν μια μέθοδος βασισμένη σε μαθηματικό μοντέλο, δεδομένου ότι θα λαμβάνεται υπόψη a priori γνώση, σχετικά με την οργανολογία του φασματογράφου μάζας, καθώς και για τον τρόπο δημιουργίας των δεδομένων (χημικός και βιολογικός θόρυβος). Επιπροσθέτως, η εξαγωγή χαρακτηριστικών είναι ένα πολύ κρίσιμο υπολογιστικό βήμα και η επίδρασή του σχετίζεται άμεσα με τα αποτελέσματα ταξινόμησης. Είναι σύνηθες, οι χαμηλής έντασης κορυφές να μην εξάγονται ως υποψήφια χαρακτηριστικά (features). Αυτό οφείλεται στους αλγόριθμους καταστολής θορύβου, οι οποίοι συνήθως θεωρούν τις χαμηλής έντασης κορυφές, ως θόρυβο. Στην παρούσα διατριβή, στην προσπάθειά μας να ερευνήσουμε την διαχωριστική δύναμη αυτών των κορυφών (χαμηλής έντασης), μας οδήγησε στην κατάτμηση κάθε πρωτεομικού φάσματος σε περιοχές έντασης (Κεφάλαια 5,6). Μελλοντικά θα ήταν ιδιαίτερα ενδιαφέρον να συμπεριλάβουμε στον αλγόριθμο κατάτμησης των πρωτεομικών σημάτων, έναν πιο αποδοτικό αλγόριθμο καταστολής θορύβου βασισμένο στην στατιστική ανάλυση του θορύβου. Αυτή η προσέγγιση ίσως βελτιώσει την ανίχνευση των διαφορών μεταξύ των υγειών και καρκινικών πρωτεομικών φασμάτων. Ως μελλοντική κατεύθυνση η διαδικασία αυτή ίσως αποδειχτεί να είναι η βάση για την μοντελοποίηση του θορύβου με στόχο την βέλτιστη καταστολή του και την πιο αξιόπιστη εξαγωγή χαρακτηριστικών. Επιπρόσθετα η διαδικασία εξαγωγής χαρακτηριστικών περιλαμβάνει τα βήματα της ανίχνευσης των κορυφών καθώς και της ευθυγράμμισής τους. Στην ανάπτυξη του αλγορίθμου που αφορά στην ευθυγράμμιση των κορυφών λάβαμε υπόψη τη ανάλυση του φασματογράφου μάζας. Η δημιουργία κάποιου μαθηματικού μοντέλου που να περιλαμβάνει και άλλες 26

27 ιδιότητες, τόσο του φασματογράφου μάζας, όσο και των πρωτεομικών φασμάτων, πιθανόν να οδηγούσε στην εξαγωγή πιο πλούσιων σε πληροφορία χαρακτηριστικών. Μετά την εξαγωγή των χαρακτηριστικών η διαδικασία επιλογής τους λαμβάνει χώρα κατά την οποία στόχος είναι η ανεύρεση της μικρότερης ομάδας χαρακτηριστικών που παρέχουν παράλληλα την μέγιστη ακρίβεια ταξινόμησης. Η επιλογή χαρακτηριστικών δύναται να βοηθήσει την μείωση του υπολογιστικού χρόνου καθώς και την υπερβολική εκπαίδευση εφόσον με την χρήση της κατάλληλης μεθόδου επιλογής χαρακτηριστικών βρεθεί η ομάδα εκείνων των χαρακτηριστικών που δεν σχετίζονται μεταξύ τους και έχουν την μεγαλύτερη διαχωριστική αξία. Δυστυχώς όμως η διαδικασία επιλογής χαρακτηριστικών δεν εγγυάται την βελτίωση στην ακρίβεια ταξινόμησης. Επομένως, τα χαρακτηριστικά τα οποία έχουν επιλεγεί ως πλούσια σε πληροφορία από την διαδικασία εκπαίδευσης του συστήματος θα πρέπει μελλοντικά να επιβεβαιωθούν βιολογικά. Επίσης η επιλογή της τεχνικής για την επιλογή χαρακτηριστικών και του ταξινομητή που θα χρησιμοποιηθεί, πρέπει να είναι ιδιαίτερα προσεκτική. Ο στόχος μιας επιτυχούς ταξινόμησης είναι η κατασκευή ενός αξιόπιστου συστήματος, το οποίο έχει την δυνατότητα να ταξινομεί άγνωστης παθολογίας πρωτεομικά φάσματα εντός ενός εύρους το οποίο κυμαίνεται μέσα σε δεσμευμένα λογικά όρια. Επιπροσθέτως είναι αδύνατον να βρεθεί ταξινομητής ανώτερος όλων για όλες τις μεθόδους επιλογής χαρακτηριστικών διότι κάθε αλγόριθμος ταξινόμησης έχει την δική του στατιστική απόκλιση μάθησης (learning bias) [92, 93]. Η απόδοση ενός αλγόριθμου ταξινόμησης μπορεί να ποικίλει με την χρήση διαφόρων μεθόδων επιλογής χαρκατηριστικών. Επομένως ο συνδυασμός των μεθόδων επιλογής χαρακτηριστικών και αλγορίθμων ταξινόμησης πρέπει να ερευνηθεί περαιτέρω σε μελλοντικές μελέτες για την ανεύρεση του καλύτερου συνδυασμού με τα προς ταξινόμηση δεδομένα. Φορείς χρηματοδότησης Η παρούσα διατριβή είναι μέρος του 03ΕΔ013 ερευνητικού έργου «ΜΕΤΑΓΕΝΟΜΙΚΑ ΣΗΜΑΤΑ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ» το οποίο υλοποιήθηκε στο πλαίσιο του προγράμματος ενίσχυσης ερευνητικού δυναμικού (ΠΕΝΕΔ) Human research Manpower (PENED) και συγχρηματοδοτήθηκε κατά: 27

28 80% της Δημόσιας Δαπάνης από την Ευρωπαϊκή Ενωση Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο 20% της Δημόσιας Δαπάνης από το Ελληνικό Δημόσιο Υπουργείο Ανάπτυξης Γενική Γραμματεία Ερευνας και Τεχνολογίας και από τον Ιδιωτικό Τομέα, στο πλαίσιο του Μέτρου 8.3 του Ε.Π. Ανταγωνιστικότητα Γ Κοινοτικό Πλαίσιο Στήριξης. 28

29 Chapter 1 Introduction Prostate cancer is a significant public health concern due to its high incidence and mortality, and that no consensus exists regarding the best form of treatment for any stage of the disease. Prostate cancer mortality can be reduced by the early prostate cancer detection. The earlier the detection the more effective the treatment would be. Prostate cancer screening or early detection has been accomplished applying the digital rectal examination (DRE), the measurement of serum the prostate specific antigen (PSA), transrectal ultrasonography and combinations of these tests. MS based proteomics and particularly MS-SEDLI-TOF technology have assisted in discovering prostate cancer biomarkers [5]. On the other hand, a major cause of mortality for women is the ovarian cancer. Malignant ovarian tumors are heterogeneous in their biological and clinical behaviour and a greater understanding of how they develop and progress is a prerequisite to successful early detection, screening programs, and treatment modalities. Molecular analytical tools are now available that can be applied to clinical materials, increasing the potential in order to relate molecular alterations to clinical behaviour and response to therapy. There are, however, several problems in evaluating the results of such analyses. The main problem is the lack of detailed understanding of the biological behaviour of cancer parameters such as metastatic propensity. Another problem is tumor heterogeneity, as most solid tumors are heterogeneous with respect to proliferative activity and different cell types. Unpredictable biological behaviour is today a major challenge in early diagnosis and management of ovarian malignancies. The benign and less aggressive tumors of low malignant potential show a very favorable prognosis with more than 95% with a 5- year survival rate. By contrast, biologically aggressive ovarian cancers are frequently diagnosed at a well-advanced stage and often rapidly lead to mortality; less than 35% of the patients live longer than 5 years [94]. New analytical tools in proteomics are emerging that give new insights into biological processes and may speed up the discovery of potential biomarkers. In recent years, MS-TOF instrumentation has been introduced for the rapid profiling of 29

30 serum proteins. This approach has the potential to be adapted for use in the screening and classification of ovarian cancer patients [10, 55]. Aims and contribution of the thesis The aims of the present thesis are: 1. To develop a reliable pattern recognition system for the discrimination of healthy from patients with prostate cancer as well as controls from patients with ovarian cancer. 2. To develop efficient algorithms in order to handle the large number of features that are extracted from proteomic spectra 3. To develop a methodology to facilitate the investigation of the low intensity peaks which are the peaks in which biologists are mostly interested in. 4. To propose potential biomarkers for discriminating healthy from prostate cancer cases and healthy from ovarian cancer cases. To cope with the above issues and in search of efficient methods for handling proteomic spectra a novel multi classifier pattern recognition methodology has been designed, developed and implemented, for the analysis of prostate and ovarian proteomic data. Furthermore, a novel method for splitting and grouping peaks according to their intensities has been developed to be consistent with biologist interest in investigating low intensity peaks. The contributions of the present thesis may be summarized into the following: To design, implement and develop a pattern recognition system in order to reliably discriminate healthy individuals from patients with prostate cancer [APPENDIX I: 1,2,3,5,6,7,8]. To design implement and develop a pattern recognition system for discriminating controls from patients with ovarian [APPENDIX I; 4]. To propose mass/charge (m/z) values that potentially will comprise [APPENDIX I: 1,2,3,5,6,7,8] diagnostically useful biomarkers for prostate cancer and ovarian cancer [APPENDIX I: 4]. 30

31 To design, develop and implement methodology, for choosing information rich features from proteomic spectra and thus dealing with the large [APPENDIX I: number of features that can be extracted from proteomic spectra 3,4,7]. To investigate the discriminating power of the low intensity peaks in classifying healthy from prostate cancer individuals as well as healthy from ovarian cancer patients [APPENDIX I: 3,4]. Organization of the thesis The thesis is divided into two main parts: Part I, consist of chapters 2-4, which describes the basic theory of proteomics, prostate and ovarian cancer, and the principles of proteomic analysis workflow. Part II comprises chapters 5-7 presenting detailed analysis and results of the methods applied for developing prostate cancer and ovarian cancer recognition systems. Chapter 2 contains the introduction to Proteomics and the bibliography review of the prostate cancer and the ovarian cancer. Chapter 3 describes the mass spectrometry based proteomic analysis and the principles of pattern recognition. In, Chapter 4 are described the instrumentation and the clinical material (generation of the proteomic data). Chapter 5 and 6 depict the implementation of the proposed pattern recognition strategy in discriminating controls from patients having prostate cancer and controls from ovarian cancer patients. Finally, in Chapter 7 conclusions and future perspectives are summarized Appendix I includes the list of publications resulted for the purposed of the present thesis. Appendix II, III, IV includes the Abbreviations, List of Figures and List of Tables respectively Research Funding The current thesis is the 03ΕΔ013 research project, implemented within the framework of the" Reinforcement Programme of Human Research Manpower" (PENED) and co-financed by National and Community Funds (20% from the Greek 31

32 Ministry of Development-General Secretariat of Research and Technology and 80% from E.U.-European Social Fund). 32

33 Part I: Basic Theory 33

34 34

35 Chapter Proteins, proteome, and proteomics Molecular biology is the study of biology at a molecular level. Molecular biology chiefly concerns itself with understanding the interactions between the various systems of a cell including the interactions between DNA, RNA and protein biosynthesis and learning how these interactions are regulated. Proteins are organic molecules, which are composed of amino acids arranged in a linear chain and joined together by peptide bonds. The sequence of amino acids in a protein is defined by the genetic code. The genetic information is stored in DNA, except some viruses, which is stored as RNA. In protein synthesis, DNA is first transcribed to a messenger-rna transcript, which is further translated to a protein by transfer-rna in ribosome. The term proteome was abbreviated from PROTEin complement of the genome meaning the complete set of proteins expressed by the cell and was coined by Marc Wilkins [95]. Thus, while the genome denotes what is possible, the proteome denotes what is functionally present. This fact implies that proteins are able to regulate the health state of a cell [96]. Proteins are the active agents in the cells, tissues, and organisms and have an essential role in determining the phenotype of an organism. Even if all the organisms have one unique genome, the proteome of the organism can vary and create different phenotypes for the organism. As a classical example a caterpillar and a butterfly are often shown representing a common genome but different proteomes. Similarly, the phenotypes of many diseases are consequences of abnormalities in the proteome, even if they have genetic background. Human genome consists of ~ 2.85 billion nucleotides divided into 24 chromosomes. It is estimated to contain genes coding for proteins [97-99]. However, mrna transcripts can be alternatively spliced and translated proteins can be cleaved or chemically modified in the cell. At least 200 different post-translational modifications of the proteins have been documented so far, creating a complex milieu of proteins in the cell [100]. 35