Study of defense genes expression profile pattern of wheat in response to infection by Mycosphaerella graminicola

Transcript

1 4 Iranian Journal of Plant Biology, 8 th Year, No. 30, Winter 2016 Study of defense genes expression profile pattern of wheat in response to infection by Mycosphaerella graminicola Jalal Gholamnezhad 1 *, Forough Sanjarian 2, Ebrahim Mohammadi Goltapeh 3, Naser Safaei 3 and Khadijeh Razavi 2 1 Faculty of Agriculture and Natural Resources, Ardakan University, Ardakan, Iran 2 Agriculture Biotechnology Institute, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran 3 Department of Plant Pathology, Tarbiat Modarres University, Tehran, Iran Abstract The aim of this study was to examine the effect of salicylic acid on the gene expression pattern of four enzymes; Phenylalanine ammonialyase, Polyphenol oxidase, Peroxidase and Catalase in wheat-mycosphaerella graminicola pathosystem. For this reason, Salicylic Acid (2mm) were sprayed on wheat in two-leaf stage before inoculation with the fungal pathogen. Sampling of the plants was done at five time points (0, 3, 6, 12 and 24 h) after inoculation. The scanning of genes expression pattern of encoding enzymes were carried out by reverse northern dot blotting method. The results showed that within 24 hours post inoculation the gene expression of these enzymes significantly increased in this tolerant cultivar. SA enhanced the expression of Phenylalanine ammonialyase and Peroxidase genes in all time points. The expression of Polyphenol oxidase was increased by SA after 12h. On the other hand, increasing the expression level of these genes directly increases the activity of the enzymes which indicates direct role of these gens in plant defense system. SA caused a rapid rise in expression of Catalase gene, but this effect was not continued for 24h. Keywords: Antioxidant enzymes, Gene expression pattern, Mycosphaerella graminicola, Salicylic Acid * Corresponding Author: jalal.gholamnejad@modares.ac.ir Copyright 2016, University of Isfahan. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License ( which permits others to download this work and share it with others as long as they credit it, but they cannot change it in any way or use it commercially.

2 زيستشناسي گياهي ايران سال هشتم شماره سيام زمستان 1395 صفحه تاريخ دريافت مقاله: 1394/12/22 تاريخ بررسي مجدد: 1395/07/07 تاريخ پذيرش نهايي: 1395/10/13 بررسی تغییرات بیان ژنه یا دفاعی گیاه گندم در پاسخ به آلودگی به Mycosphaerella graminicola 2 جالل غالمنژاد * 1 فروغ سنجريان 2 ابراهيم محمدی گلتپه 3 ناصر صفايي 3 و خديجه رضوی 1 گروه محيطزيست دانشکدۀ کشاورزی و منابع طبيعي دانشگاه اردکان اردکان ايران 2 پژوهشکدۀ بيوتکنولوژی کشاورزی پژوهشگاه ملي مهندسي ژنتيک و زيستفناوری تهران ايران 3 بخش بيماریشناسي گياهي دانشکدۀ کشاورزی دانشگاه تربيت مدرس تهران ايران چکیده هدف از انجام پژوهش حاضر بررسي تأثير غلظته یا چهار آنايم فنيلآالنين آمونيالياز پ يل متفاوت ساليسيليک اس يد ب ر مي اان بي ان ژنه ای رماکنن دۀ فنل اکسيداز پراکسيداز و کاتاالز در گي اه گن دم ررم م متحم ل زاگ رس در برهم کنش با مارچ بيماریزای Mycosphaerella graminicola بود. به منظور گياه گندم در مرحلۀ دو برگي ب ا ساليسيليک اسيد (SA) تلقيح و سپس با مارچ عامل بيماری مايهز ين زماني ر و 24 ساعت پس از مايهز ين شد. نمون هب رداری از اي ن گياه ان در پ ن ۀ نق مارچ بيماریزا انجام شد. سپس مياان بي ان ژنه ای رماکنن دۀ اي ن آنايمها با روش نوردرن بالت معکوس بررسي شد. مقدار بيان ژن رماکنندۀ هر چهار آنايم بر اثر مايهز ين بيماریزا و ساليسيليک اسيد از نخستين نق ۀ زماني پس از مايهز ين داشت. تأثير ساليسيک اسيد بر افاايش بيان ژن آنايمه یا فني لآالن مثبت بود. افاايش ساليسيليک اسيد پس از 12 ساعت بر بيان ژن آنايم پ يل ب ا م ارچ در رمم از گندم اف اايش و تف اوت معن يدار ين آمونيالي از و پراکس يداز در هم ۀ نق ا زم اني فنل اکسيداز مؤثر بود. ساليس يليک اس يد روند جهشي بيان ژن کاتاالز را 12 ساعت پس از آلودگي ب ا م ارچ باع د ش د ام ا اي ن ت أثير ت ا س اعت 24 ت داوم نداشت. بر اساس نتاي ژنه یا پژوهش برای که گياه بتواند در برابر تهاجم عوام ل بيم اریزا مص ون بمان د باي د بي ان دفاعي در ساعات ابتدايي پس از تلقيح مارچ بيماریزا افاايش پيدا کند. از سويي افاايش بي ان اي ن ژنه ا ب ا افاايش مياان فعاليت آنايمهای متناظر ارتبا مستقيم دارد که نشاندهندۀ نقش مستقيم ژنهای دفاعي در فعاليتهای سيستم دفاعي گياه است. در پژوهش حاضر از رمم مقاوم زاگرس استفاده شد ل ذا اف اايش زودهنگ ام بي ان ژنه ا پديدهای مابل توجيه در سازوکار مقاومت گياه در برابر عامل بيماریزا به نظر ميرسد. واژهه یا کلیدی: ساليسيليک اسيد الگوی بيان ژن آنايمه یا اکسيداتيو گندم Mycosphaerella graminicola * نگارنده مسؤول: نشاني پست الکترونيک: jalal.gholamnejad@modares.ac.ir شماره تماس: Copyright 2016, University of Isfahan. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License ( which permits others to download this work and share it with others as long as they credit it, but they cannot change it in any way or use it commercially.

3 زيستشناسي گياهي ايران سال هشتم شماره سيام زمستان تالشهايي مقدمه. گن دم غ ذای اص لي ح دود % 35 جمعي ت جه ان را تشکيل داده اس ت و پ يشبين ي م يش ود در س ال 2020 تقاض ای جه اني ب رای اي ن محص ول ب ين 840 ت ا 1050 ميليون تن باشد. برای رسيدن به اي ن س ح تقاض ا تولي د محصول بايد س االنه 1/6 ت ا %2/6 اف اايش پي دا کن د ر 2004 al.,. Chartrain et گياه گندم در مدت کشت تا برداشت در معرض تنشه ای محي ي زن ده و غيرزن دۀ مختلفي مانند بيماریها و خشکي مرار ميگيرد ک ه رش د گياه را محدود ميکند. در گندم نيا مانن د س اير گياه ان سازوکارهای مختلفي برای سازش با تغييرات و حف بقای گياه تکامل يافته است که از آن جمل ه م يت وان ب ه س ازوکاره ای مورفولوژي ک فيايولوژي ک و تغيي رات مولکولي اشاره کرد ر 2008 Torabi,. Kia and بيماری سوختگي ب ر گن دم رس پتوريوز برگ ي از مهمترين بيماریه ای گن دم در جه ان اس ت ک ه س اليانه خس ارات فراوان ي را ب ه محص ول گن دم وارد م يکن د ر 2003 al.,. Goodwin et عام ل اي ن بيم اری م ارچ بيم اریزای Mycosphaerella graminicola (Fuckel) J.Schröt.in Cohen با شکل غيرجنسي Zymoseptoria tritici است ر 2011 al.,. Quaedvlieg et گاارشهايي مبني بر بروز اپيدميه یا بيماری در بعض ي از اس تانه ا از جمل ه گلس تان خوزس تان و ف ارس وج ود دارد. مي اان کاهش محصول ناشي از خسارت بيماری ب ر تع دادی از ارم ام مت داول در اس تانه ای خوزس تان و گلس تان ت ا ح دود %44 ب رآورد ش ده اس ت ر Kia and Torabi, کنترل بيماری با مارچکش بهک اربردن ارم ام مقاوم و همچنين با روشهای زراعي رتن او بين بردن بقايای گياهان آلوده زارع ي و از نيا گرفته است که هنوز به نت اي نش ده اس ت برای کنترل زيستي مارچ انجام ک اربردی در مارع ه منج ر (Zamani et al., 2016; Lynch et al., al., 2012 ;2016). Gholamnezhad et ب ا توج ه ب ه ناکارآم دی روشه ای زراع ي در مه ار م وثر بيم اری مقاومت جدايههای مارچ به سموم سيستميک ه هه ا و آلودگي ناشي از مصرف سموم شيميايي استفاده از ارم ام مقاوم امتصادیت رين بهت رين و از نظ ر زيس تمحي ي سالمترين روش مقابله با بيماری اس ت ر Berraies et. al., 2013 تأثير موی رمم گندم بر بي ان ژنه ای بيم اریزاي ي.M graminicola ب ا م الع ات نس ل جدي د ت واليي ابي رsequencing next generation مش خ ش ده اس ت (2016 al.,.(mcdonald et تفاوت اصلي گياه حس اس و مق اوم شناس ايي ب ه موم ع بيم اریزای مه اجم و فعالسازی سريع است. ژنه یا خ اموش م يش وند. همچن و موثر سازوکارهای دفاعي گي اه مق اوم فراواني در پاسخ گياه به بيماریزا فع ال ي ا افاايش يا کاهش يابد. بررسي بيان روشه ای مه م ب رای مش خ سيستمه یا ين ممک ن اس ت بي ان آنه ا متم ايا ژنه ا يک ي از ک ردن اس اس زيس تي بيولوژيک است ر 2009 al.,. Wang et دانش ژنتيک مقاومت برای اصالح گن دم مق اوم ب ه بيماری لکۀ برگ ي گن دم اهمي ت زي ادی دارد. مقاوم ت ژنتيک ي در ارم ام مختل ب ه دو ش کل کم ي و کيف ي گ اارش ش ده اس ت ر 2010 al.,. Vakili Bastam et تحقيقات در زمينه نشان ميده د ک ه مقاوم ت در براب ر بيماری با ژنهای بارز کنترل ميشود ر al., Boukef et وج ود تخص ي افتگي فيايولوژي ک در اس ت ر al., Adhikari et بيماریزای.M graminicola و راب ۀ ژن برای ژن در اي ن

4 45 بررسي تغييرات بيان ژنه یا دفاعي گياه گندم در پاسخ به آلودگي به Mycosphaerella graminicola پاتوسيستم س اله ا پ يش ب ه اثب ات رس يد و تع داد 18 ژن مقاوم ت رStb1-Stb18 ژنوتيپهای مختل. al., 2007 برادين ب ه بيم اری س پتوريای برگ ي در گندم مک اني ابي ش د ر Arraiano et و همک اران در س ال 2002 ب ا بررس ي مقاومت ويژۀ چند رمم گندم حساس و مقاوم و ژنه ای کنترلکنندۀ مقاومت آنها در مقاب ل جداي هه ای عام ل بيماری لکۀ برگي سپتوريايي بر راب ۀ ژن برای ژن ب ين مقاوم ت اختصاص ي گن دم و بيم اریزاي ي.M graminicola تأکي د کردن د. مقاوم ت ب ه اي ن بيماری ممکن است کم ي يا اختصاص ي باش د. مقاوم ت اختصاصي تقريبا کامل و اليگوژنيک اس ت و از راب ژن برای ژن تبعيت ميکند ر 2002 al.,. Brading et ساليسيليک اسيد است. عالوه برا گيين برابر بيماریزایه یا ۀ (SA) تنظيمکنندۀ طبيعي رش د گي اه اهان مقدار داخل ي اي ن م اده را در مختل افاايش م يدهن د. اس تفاده از SA خ ارجي ب رای الق ای مقاوم ت ب ه بيم اریزایه ای ويروسي باکتريايي و مارچي در گياهان بس ياری آزم وده شده و تاثير مثبت داشته است (2010 al.,.(hayat et در م العه بيان ژنه یا دفاعي که نقش مهم ي در فرد پاسخ به ت نش در گي اه و ب ه خص ود در متحم ل بازی ميکنند در پاتوسيس تم گن دم - graminicola.m با روش نوردرن بالت معکوس مورد بررسي م رار گرفت ه است. آلودگي بازۀ زماني برداشت نمونه تا 24 ساعت اوليه پ س از بود تا گياه با پاسخ س ريع ب ه عام ل بيم اریزا از ايج اد بيم اری جل وگيری کن د ک ه اي ن پاس خ س ريع ب ا اف اايش بي ان ژنه ای مختل انجام ميشود. اگر گياه نتواند از جمل ه ژنه ای دف اعي واکنش س ريع نش ان ده د عامل بيماریزا با گذش ت زم ان غلب ه م يکن د درنتيج ه گي اه بيم ار م يش ود ر Ray et al., ;2003 Adhikari et al., نوردرن بالت معکوس يک ي از روشه ايي است ک ه اطالع ات ت والي رژن وميکس س اختاری را ب ه ژنوميکس عملکردی رتعيين عملکرد و نوع فعاليت رب ط ميده د ر 2003 al.,. Rabbani et ه دف اص لي از اي ن م العه نشاندادن اف اايش بي ان ژنه ای دف اعي در رمم ي نسبتا مقاوم است که متعامب ا اف اايش سيس تمه ای دف اعي گياه را باعد ميش ود. در اي ن م الع ه ت أثير غلظ ته ای متفاوت ساليسيليک اسيد رعامل القای سيستم دف اعي ب ر مياان بيان ژنه ای رم اکنن دۀ چه ار آن ايم فني لآالن ين آمونيالياز رPAL پل يفن لاکس رPOX و کات االز رCAT يداز رPPO پراکس يداز در رم م متحم ل زاگ رس از گياه گندم در برهمکنش با مارچ بيماریزا بررسي شد. مواد و روشها. کشت گیاهان و ایجاد تنش بیماریزا: در تحقي حاض ر رم م گن دم زاگ رس اس تفاده ش د. اص الحي و همک اران اي ن رم م را متحم ل ب ه م ارچ بيم اریزا.M graminicola تش خي دادن د ر Esllahi et al., بذرها پس از استريلشدن ب ا الک ل %70 ب هم دت 30 ثانيه و دو بار شستشو با آ مق ر اس تريل در عم 1 سانتيمتری خاك گلدان رمحتوی پرليت خ اك س ترون و خاكبر با نسبت 1:1:1 کشت شدند. در هر گل دان سه بذر کاشته شد و گلدانها در شرايط 16 ساعت ن ور و هشت ساعت تاريکي و دمای 23 درج ۀ س انتيگراد روز و 18 درجۀسانتيگراد شب نگه داری ش دند. گياهچ هه ا در مرحلۀ دوبرگي ر 12 روزهگي با سوسپانسيون جدايۀ مارچ بيم اریزا ب ه روش Chartrain و همک اران ر 2004 تلقيحشدند. همزمان گياهان ب ا ساليس يليک اس يد در غلظ ته ای ر 0 و 2 ميل يم والر محل ولپاش ي ش دند.

5 زيستشناسي گياهي ايران سال هشتم شماره سيام زمستان غلظتها براساس م العۀ انج امش دۀ مبل ي نگارن دگان در گلخان ه ب ا هم ين رم م و عام ل بيم اری انتخ ا ش د ر 2012 a.l,. Gholamnezhad et گياهان ش اهد تنه ا ب ا آ مق ر استريل تلقيح شدند. ب رای بررس ي پاس خه ای اوليه و سريع گياه در زمانه 6 ای 3 0 پس از مايهز ين 12 و 24 س اعت مارچ بيماریزا نمونهبرداری از بر ه یا گي اه گن دم انج ام ش د. نمون هه ا بالفاص له در مح ل نمونهبرداری ب ه ظ رف نيت روژن م ايع منتق ل و س پس در فري ار 70 - درج ۀ س انتيگراد آزمايش گاه ذخي ره ش دند. آزمايش در مالب طرح کامال تصادفي در سه تکرار انجام ش د و ش امل دو س ح بيم اریزا دو س ح ساليس يليک اسيد و پن س ح زماني رمجموعا 20 تيمار بود. انتخااژ ژنهاا و ارا ای آغاازگر: در پ ژوهش حاض ر بي ان ژن چه ار آن ايم آنت ياکس يداني پل يفن ل اکس يداز ب ا ش ماره شناس ايي AY فني لآالن ين آمونيالياز ب ا ش ماره شناس ايي AEX59143 پراکس يداز ب ا شماره شناسايي CAA39486 و کاتاالز با ش ماره شناس ايي CAA64077 ارزي ابي ش د. ت والي اي ن ژنه ا از بان ک اطالع اتي ژن وم رNCBI اختصاص ي طراح ب ه دس ت آم د و آغازگره ای ي ش د رج دول. 1 ب رای ژن خان هدار رکنترل داخلي رس نيا از ژن آلفا توبولين استفاده شد. استخراج RNA و ساخت :cdna اس تخرا RNA از باف ت ان دامه ای ه وايي گن دم ب ا کي ت RNXplus يناژن اي ران م اب دس تورالعمل انج ام ش د. ب رای ساخت cdna حدود 5 ميکروگرم از RNA اس تخراجي با مقدار 0/5 ميکروليت ر آغازگره ای Oligo dt مخل و شد و در دمای 65 درجۀ سانتيگراد بهم دت 5 دميق ه م رار گرفت و س پس روی ي خ س رد ش د. واک نش رونويس ي معک وس در حض ور Thermo Scientific RiboLock Thermo ر Reverse وTranscriptase RNase Scientific آمريکا و dntp بهمدت 1 ساعت در دمای 42 درج ۀ س انتيگراد انج ام ش د. در مرحل ۀ پاي اني ب رای غيرفعالکردن آنايم واکنش بهمدت 10 دميق ه در دم ای 70 درج ۀ س انتيگراد م رار گرف ت. ب ا الگ وی cdna و آغازگرهای اختصاصي ه ر ژن ب ا واک نش PCR تکثي ر شد. مقدار هر ژن از مقايسۀ مياان روشنايي بان د محص ول PCR روی ژل آگ ارز ب ا مي اان روش نايي بان د متن اظر نش انگر DNA در رن کم انگليس آمي ای ب ا اتي ديوم بروماي د و يک ردن آن ب ا ن رماف اار Totallab رTotallab شد. مشخ جدول 1- نام ژنها و توالي آغازگرهای استفادهشده در نوردرن بالت معکوس توالي آغازگر ر 5-3 نام ژن نام مخف طول توالي دمای ذو درجۀ سانتيگراد F: AGGCTCACCTGGTTAAGTTC R: CAGTGGGATGATGTCCTCTG CAT کاتاالز F: AATCAGACCGTCTCCTGCG R: GGTGGTGTCGTTGTTGAAC پراکسيداز POX F: TTCTGTCCGTCCTTGCTGAG R: CAATGGGGGTGCCTTGGAAG فنيل آالنين آمونيالياز PAL F: AACGACCAGCTCTCCAACAT R: AACAGGGATGTGTAGGTCAG PPO پ يل فنل اکسيداز 56 F:GCTTTCAACACCTTCTTCAG R:GGGGCATAGGAGGAAAGCA آلفا توبولين α-tub

6 47 بررسي تغييرات بيان ژنه یا دفاعي گياه گندم در پاسخ به آلودگي به Mycosphaerella graminicola ساخت پروژ نشااندار: در بررس ي الگ وی بي ان ژنها از RNA استخراجي از گياه ان تيم ارش ده ب رای تهيۀ نشانگر رProbe استفاده شد. مراحل تهيۀ پرو ي ا نشانگر نشاندار مانند تهيه cdna معم ولي ب ود ب ا اي ن تفاوت که به ج ای اس تفاده از dntp معم ولي از DIG labeled dntp رScience Roche Life آلم ان استفاده شد. نوردرن بالت معکوس و بررسی بیان ژنها: پس از بهينهسازی شرايط واکنش PCR 0/5 تا 1 ميکروگرم از محص ول PCR ه ر ژن روی غش ا لک هگ ذاری ش د. محص ول PCR ژنه ای انتخ ابي ب ا محل ول 1 NaOH ميليموالر و محلول 0/25 موالر NaCl واسرشت ش دند و در دستگاه بالت ر 96 چ اهکي روی غش ا لک هگ ذاری شدند. پس از خشکشدن غش ا در دم ای ات ا لک هه ا بهمدت 1 ساعت در دم ای 100 درج ۀس انتيگراد تثبي ت شدند. از cdna ژن آلفا- توبولين گن دم ب رای کنت رل داخل ي و از آ مق ر و محل ول واک نش PCR ب دون الگ و ب رای کنت رل منف ي اس تفاده ش د. ب رای واسرش تک ردن نش انگرهای تهي ه ش ده رcDNA نشاندارشده با DIG دنب ال آن 5 دميق ۀ بهمدت 5 دميقه در آ جوش و ب ه ديگ ر روی ي خ م رار داده ش دند. پ يشدورگ هس ازی غش ا ب ا 50 ميل يليت ر از محل ول پيشهيبريداسيون ب ا ph= 7/2 ر 35 ميل يليت ر 7% SDS 100 ميکروليتر 1 EDTA ميل يم والر و 12/5 ميل يليت ر بافر فسفات 0/25 موالر در دم ای 65 درج ۀس انتيگراد بهمدت 1/5 ساعت داخ ل دس تگاه هيبريداس يون انج ام ش د. پ س از تخلي ۀ محل ول پ يشدورگ هس ازی 50 ميکروليت ر نش انگر واسرش ته ب ه 5 ميل يليت ر محل ول پيشهيبريداسيون اضافه شد و دورگهسازی بهمدت يک ش ب در دم ای 65 درج ۀس انتيگراد و داخ ل دس تگاه هيبريداسيون انجام شد. پس از تخليۀ مخل و محلول دورگهسازی در لولۀ استريل نش انگر و و نگه داری آن در 20- درجۀ سانتيگراد غشا س ه مرتب ه شستش و داده ش د. شستشوی اول با محلول SSC 2X حاوی %0/1 SDS دو مرتب ه ب هم دت 15 دميق ه در دم ای ات ا انج ام ش د. شستشوی دوم غشا ب ا محل ول SSC 0/5X ح اوی %0/1 از SDS يک بار بهم دت 15 دميق ه در دم ای 65 درج ۀ سانتيگراد انجام شد و در شستشوی آخر غشا با محل ول SSC 0/2X بدون SDS بهمدت 15 دميقه در دمای ات ا شستشوش د. در مرحل ۀ آخ ر 10 ميکروليت ر گهرماي ۀ CDS-Star رScience Roche Life آلمان ب ه غش ای مرار گرفته در پاکت سلوفوني اضافه شد. سپس غش ا در تاري کخان ه در مع رض ف يلم راديول وژی رX-ray گذاشته شد و فيلم پس از 30 دميقه ظاهر شد. امتيازدهي به لکهها با نرمافاار TotalLab که مياان تيرگي لک هه ا را براساس تعداد نقا تيرۀ موجود در محدودۀ لک ۀ م د نظر مشخ ميکند انجام شد. پس از آنکه همۀ لکهها با نرمافاار براساس لکۀ دادهه یا Excel شدند آلفا - توبولين استاندارد شدند حاصل از ن رماف اار TotalLab وارد ن رماف اار و با نرم افاار ver.9 SAS تجايه و تحلي ل شدند. مي انگين مرب و ب ه بي ان ه ر ژن در مال ب ط رح کامال تصادفي ب ا چه ار تک رار ردو تک رار زيس تي و دو تک رار روش ي تجاي ۀ واري انس ش د. پ س از تجاي ۀ واريانس برای هر ژن مقايسۀ ميانگينه یا به ه ر مربو ژن با آزمون چند دامنهای دانک ن در س ح اطمين ان %1 انجام شد.

7 زيستشناسي گياهي ايران سال هشتم شماره سيام زمستان نتایج. براساس اطالعات بهدستآمده از غشاها ربرای مث ال ش کل ر 1 مرب و ب ه آن ايم پل يفن ل اکس يداز در پاتوسيس تم گي اهي م الع هش ده بي ان ژن آن ايمه ای بررسيشده در دورۀ 24 ساعت نمون هب رداری اف اايش پيدا کرد. خالصۀ تجاي ۀ واري انس ب رای تغيي رات بي ان ژنه یا بررسيشده در حالت تيمار با م ارچ بيم اریزا و ساليسيليک اسيد در جدول ر 2 آمده است. جدول 2- خالصۀ تجايۀ واريانس مياان تغييرات بيان ژنه یا تيماره یا مختل ساليسيليک اسيد. :SA ساليسيليک اسيد P: بيماریزا بررسيشدۀ درگير در برهمکنش گندم و مارچ بيماریزای.M graminicola در منابع تغييرات PPO PAL POX CAT ميانگين مربعات 631 /4 ** ** ** / / 9 تيمار 1/03 1/ 71 1/ 46 2/ 27 خ ا 3/36 4/ 58 2/ 94 2/ 09 ضريب تغييرات رC.V شکل 1- تصوير درشتآرايه از پروفايل بياني ژن PPO در تنش با مارچ و ساليسيليک اسيد. تيرگي لکهها نش اندهن دۀ مق دار cdna نش اندار متصلشده به DNA ژن PPO تثبيتشده در کاغذ نيترو سلولا رمقدار بيان ژن توبولين با نرمافاار استاندارد شدند. است. برای آنالياهای نهايي تيرگي لکهه ا براس اس لک ۀ آلف ا - بي ان ژن رماکنن دۀ آن ايم فني لآالن ينآمونيالي از رPAL در طول 24 ساعت در هر دو تيمار مارچ و تيمار همزم ان م ارچ و ساليس يليک اس يد ر 2SA+P اف اايش نشان داد. با که افاايش بيان در ه ر دو تيم ار رون دی مشابه داشت مايهز ين همزمان ساليسيليک اسيد و م ارچ بيشتر از تلقيح با مارچ تنها بر بيان اي ن ژن ت اثير داش ت

8 49 بررسي تغييرات بيان ژنه یا دفاعي گياه گندم در پاسخ به آلودگي به Mycosphaerella graminicola که نشاندهندۀ بيان بيشتر آن در حضور ساليسيليکاس يد و مارچ بيماریزا در رمم مقاوم است رشکل 2-A. بيان ژن رماکنندۀ پ يل 24 ساعت در هر دو تيمار فنل اکسيداز رPPO در ط ول مارچ و تيمار همزمان م ارچ و ساليسيليک اسيد افاايش يافت. با که اف اايش بي ان در ه ر دو تيم ار از ش ش س اعت پ س از تلق يح ب ا رون د جهشي همراه ش د و ت ا 24 س اعت پ س از تلق يح ادام ه يافت. در همۀ ساعات نمونهبرداری بجا نق ۀ زماني 24 بيان ژن رماکنندۀ آنايم در تيمار با م ارچ اخ تالف معنيداری با تيمار ه مزم ان م ارچ و ساليس يليک اس يد نشان نداد رشکل 2-B. بيان ژن رما کنن دۀ آن ايم پراکس يداز در م دت 24 ساعت در ه ر دو تيم ار م ارچ و آ مق ر و ني ا تيم ار همزم ان م ارچ و ساليس يليک اس يد ر 2SA+P اف اايش ياف ت. رون د اف اايش بي ان اي ن ژن در ه ر دو تيم ار ساليسيليک اس يد هم راه ب ا م ارچ بيم اریزا و همچن ين مارچ بيماریزا بهتنهايي مشابه بود و تا 24 ساعت پس از نمونهبرداری ادامه داشت. همچن ين اف اايش بي ان ژن در تيم ار ب ا م ارچ بيم اریزا کمت ر از تيم ار ه مزم ان ساليسيليک اسيد و مارچ بود رشکل 2- C. بيان ژن رماکنندۀ آنايم کاتاالز در مدت 24 ساعت در هر دو تيمار مارچ و آ مق ر و ني ا تيم ار ه مزم ان مارچ و ساليس يليک اس يد ر 2SA+P اف اايش نش ان داد رش کل 2-D. در تيم ار ه مزم ان SA و بيم اریزای مارچي در ساعت 12 روند جهشي افاايش ديده شد که در تيمار مارچ بدون ساليسيليک اسيد مشاهده نشد. پ س از آن در ساعت 24 تيمار با مارچ افاايش سريع داشت اما تيمار همزمان ساليسيليک اسيد و مارچ اي ن اف اايش را نشان نداد رشکلD-2. شکل 2- تاثير ساليسيليک اسيد و مارچ بيماریزا بر بيان ژن آنايمه Aای فني لآالن ين آمونيالي از (PAL) B پراکس يداز (POX) C اکسيداز (PPO) و D دانکن در س ح (0.01 P) معنيدار هستند. پل يفن ل کاتاالز (CAT) در گندم. :SA سالسيليک اسيد P: بيماریزا. مقادير ميانگين چهار تکرار و بر اساس آزم ون چن دمتغي رۀ

9 زيستشناسي گياهي ايران سال هشتم شماره سيام زمستان بحث. نتاي آزمايش مربو ب ه بي ان ژن رماکنن دۀ آن ايم فني لآالن ين آمونيالي از رPAL در گي اه گن دم ک ه ب ا ساليسيليک اسيد تيمار شده بود نشان داد که 24 ساعت پس از تلق يح م ارچ بيم اریزا بي ان اي ن ژن در ه ر دو تيم ار اف اايش داش ت و ساليس يليک اس يد ه م ت أثير معنيداری در افاايش بيان ژن آنايم داشت. با توجه به شکل ر 1 در گياهان تيمارشده با مارچ و سالس يليک اسيد افاايش بيان س ژن مشاهده ميش ود و ش يب اي ن افاايش از ساعت 12 تا 24 بيش تر ش ده اس ت. ترکيب ات فنيل پروپانوئيدی از س يناميک اس يد مش ت م يش وند و خود سيناميک اسيد از آمينو اس يد فني لآالن ين تش کيل شده اس ت ر 2010 al.,. Huang et آن ايم فني لآالن ين آمونيالي از رPAL واک نش تب ديل فني لآالن ين را ب ه ت رانس س يناميک اس يد کات اليا م يکن د. اي ن مرحل ه نخستين مدم در مسير فني ل پروپانوتي د اس ت و گلوگ اه تنظيمي مهم بين متابوليسم اوليه و ثانويه به شمار م يرود ر 2010 al.,. Vogt, 2010; Huang et ت رانس _ يناميک اس متابوليته یا يد پ يشم ادۀ طي گس تردهای از فنلي و ديگر ترکيبات است. فعاليت آنايم PAL با عوامل زنده و غيرزندۀ مختل القا ميش ود ک ه در نتيجه تجم ع ترکيب ات فنل ي مانن د اس يدهای فنل ي و فالونوئيدها را موج ب م يش ود. آن ايم PAL ب ا تنظ يم متابوليسم ترکيبات مختل فنلي مقاومت گياهان نس بت به ت نشه ا را س بب م يش ود ر 2005 al.,. Wen et در آل ودگي گن دم ب ا م ارچ Fusarium graminearum اف اايش بي ان ژن PAL در رم م حس اس ف الت 3 براب ر گاارش شده است که تيمار همزمان ساليس يليک اس يد اي ن اف اايش را ب ه 7 براب ر نس بت ب ه گي اه ش اهد تلقيحشده با آ مق ر رساند. افاايش فعالي ت آن ايم فنيلآالنينآمونيالياز بهدنبال افاايش بيان ژن آن مش اهده شد. در پژوهش حاضر افاايش بيان ژن و فعاليت آنايم PAL در واريت ۀ متحم ل پ س از آل ودگي ب ا م ارچ مشاهده شد و تيمار ساليسيليک اسيد آن را تشديد ک رد ر 2015 al,. Sorahinobar et افاايش بيان ژن PAL در گي اه توت ون 10 س اعت پ س از آل ودگي ب ا Pseudomonas syringae گاارش شده است ک ه اي ن افاايش بيان با افاايش فعاليت ه یا بر آنايم نيا هم راه ب وده اس ت ر 2005 al.,. Denslow et همچن ين در گندم آل وده ش ده ب ا Botrytis cinerea در محل آلودگي با اي ن م ارچ بيم اریزا اف اايش فعالي ت آنايم PAL مشاهده شده است ر 2010 al.,. Huang et آن ايم پل يفن ل اکس يداز در اکسيداس يون فن ل ب ه ترکيبات کينون و تشکيل ليگنين نق ش دارد. پ ژوهشه ا نشان داده است که آنايمهايي مانن د پل يفن ل اکس يداز و فنيلآالنين آمونيالياز در فعاليته یا فو حساس در مقابل مارچه یا دفاعي و واکنشه یا بيماریزای گياهي نق ش دارند. آنايم همچن ين مس وول واک نشه ای مه وهای شدن بافته یا زخمي و تشکيل سدهای دفاعي در مقاب ل بيماریزاه ا اس ت. از س ويي ترکيب ات کين ون حاص ل از اکسيداسيون فنلها ترکيباتي به مراتب سميتر از فن له ا هس تند و نق ش آنه ا در دف اع از گي اه در براب ر عوام ل بيم اریزا در گياه ان ک امال ش ناخته ش ده اس ت ر 2002 Kazemi,. Mohammadi and نتاي مرب و ب ه بيان ژنه یا گياه گندم شاهد رماکنندۀ پ يل فن لاکس يداز رش کل 2-B در و آلوده با مارچ بيماریزای الق ا ش ده ب ا ساليسيليک اسيد نشان داد که القاکننده بي ان ژنه ای ي ادش ده را در گي اه گن دم در حض ور و غي ا م ارچ

10 51 بررسي تغييرات بيان ژنه یا دفاعي گياه گندم در پاسخ به آلودگي به Mycosphaerella graminicola پل بيماریزا افاايش داد. اندازهگيری آنايم پ يل فنل اکس يداز در برهمکنش گياه گندم ب ا م ارچ Alternaria triticina مشخ کرد که گرچه فعاليت آنايم در رمم متحمل مبل از رويارويي ب ا م ارچ بيش تر از رم م حس اس اس ت تلقيح مارچ بيم اریزا اف اايش فعالي ت در ه ر دو رم م را موجب م يش ود (2000 al.,.(tyagi et تش ديد فعالي ت يفن ل اکس يداز در ج و دوس ر ب ر اث ر آل ودگي ب اavenaceum Fusarium ني ا گ اارش ش ده است 2014 ) al.,.(fuerst et پراکس يداز و کات االز آن ايمه ای آنت ياکس يداني هستند که غلظت H 2O 2 را تنظيم ميکنند ر Chandra et al., گياهان برای ازبينب ردن اث ر راديک اله ای آزاد ناشي از تنشهای زنده و غيرزن ده س ازوکاره ای دفاعي خود را به کار ميگيرند. نق ش چن دين آن ايم از جمل ه پراکس يداز کات االز سوپراکس ايد ديس موتاز پل يفن ل اکس يداز و ترکيب اتي ش بيه ب ه فن ل از ان واع متابوليتهای ثانوي ه ک ه در پاس خ ب ه ت نش در گياه ان تجمع مييابند ب ه اثب ات رس يده اس ت ر al., Honty et بيان بيم اریزا در غي ا زمانه یا دو آنايم در گندمه یا آلوده ب ه م ارچ و حض ور ساليس يليک اس يد در نمونهبرداری اف اايش ياف ت رش کل 2 -. C,D در پاتوسيس تم بيم اری زن برگ ي رمه وهای گن دم اف اايش بي ان ژن آن ايمه ای اکس يداتيو ب ر اث ر م ارچ بيماریزا گ اارش ش ده اس ت (2007 al,.(fofana et در ب رهمک نش گن دم ب ا م ارچ بيم اریزای Blumeria graminis اف اايش فعالي ت آن ايمه ای اکسيداتيو 48 ساعت پ س از آل ودگي در گي اه متحم ل نسبت به گياه حساس مشاهده شد (2015 al.,.(ma et دادهه ا درب ارۀ نق ش ساليس يليک اس يد ب ر فعالي ت آنايم کاتاالز متنامض هستند. خيس اندن دان هه ای ذرت در 0/1 ميل يم والر SA فعالي ت آن ايمه ای کات االز و پراکس يداز را اف اايش داد (2012 al.,.(momeni et پيشتيمار گياه شاهي با غلظت 0/05 ميليم والر SA ب ه کاهش فعاليت آنايم کاتاالز منجر ش د ام ا ب ا اف اايش غلظت به 0/1 ميل يم والر فعالي ت اي ن آن ايم اف اايش يافت. اگر چه در هر دو غلظت فعاليت آنايم نس بت ب ه گي اه ش اهد کمت ر ب ود (2010 al.,.(hashemi et گاارش شده است که پيشتيمار با 0/2 SA ميل يم والر فعاليت آنايم کات االز را در گي اه ع دس پ س از 7 روز ت نش ش وری ک اهش داد ر Kayednezami and Balouchi, پاشيدن 1 SA ميل يم والر در گي اه بادرنجبويۀ تيمارشده با اشعۀ فرابنفش به افاايش فعالي ت آنايم پراکسيداز و کاهش فعاليت آن ايم کات االز منج ر ش د (2014 Adedzadeh,.(Pourakbar and ب ه نظ ر م يرس د غلظ ت SA اس تفاده ش ده و همچن ين زم ان برداشت نمونه در تن امض دخي ل باش ند. در تحقي حاضر ساليسيک اسيد در غلظت 2 ميليم والر اف اايش شديد بيان ژن کاتاالز را نسبت ب ه نمون ۀ تلق يح ش ده ب ا مارچ در مدت 12 ساعت پس از اعم ال تيم ار ب ه دنب ال داشت اما در مدت 24 ساعت پس از اعمال تيمار اي ن تاثير را نداشت. جمعبندی. براساس نتاي م العه بيان ژنه یا رماکنندۀ ه ر چهار آنايم که در م العه بررسي ش دند ب ا اف اايش ساعات نمونهبرداری افاايش پيدا ک رد. البت ه اي ن رون د افاايشي بهعل ت زم انه ای ابت دايي نمون هب رداری ب ود رشکل. 2 همانطورکه مبال هم در بسياری از تحقيق ات

11 زيستشناسي گياهي ايران سال هشتم شماره سيام زمستان به اثبات رسيده است برای ک ه گي اه بتوان د در براب ر تهاجم عوامل بيماریزا مصون بمان د باي د بي ان ژنه ای دف اعي در س اعات ابت دايي يح بيم اریزا پ س از تلق اف اايش پي دا کن د. در پ ژوهش حاض ر از رم م مق اوم زاگرس استفاده شد ل ذا اف اايش زودهنگ ام بي ان ژنه ا پديدهای مابل توجيه در سازوکار مقاومت گياه در براب ر عامل بيماریزا به نظر ميرسد. سپاسگزاری. نگارن دگان از پژوهش گاه مل ي مهندس ي ژنتي ک و زيس تفن اوری و دانش گاه تربي ت م درس ب رای فراهمکردن امکان پژوهش سپاسگااری ميکنند. Adhikari, T. B., Balaji, B., Breeden, J. and Goodwin, S. B. (2007) Resistance of wheat to Mycosphaerella graminicola involve early and late peaks of gene expression. Physiological and Molecular Plant Pathology 71: Arraiano, L. S., Chartrain, L., Bossolini, E., Slatter, H. N., Keller, B. and Brown, J. K. M. (2007) A gene in European wheat cultivars for resistance to an African isolate of Mycosphaerella graminicola. Plant Pathology 56: Berraies, S., Gharbi, M. S., Belzile, F., Yahyaoui, A., Hajlaoui, M. R., Trifi, M., Jean, M. and Rezgui, S. (2013) High genetic diversity of Mycospaherella graminicola (Zymoseptoria tritici) from a single wheat field in Tunisia as revealed by SSR markers. African Journal of Biotechnology 12(12): Boukef, S., McDonald, B. A., Yahyaoui, A., Rezgui, S. and Brunner, P. C. (2012) Frequency of mutations associated with fungicide resistance and population structure of Mycosphaerella graminicola in Tunisia. European Journal of Plant Pathology 132(1): Brading, P. A., Verstappen, E. C., Kema, G. H. and Brown, J. K A gene-for-gene relationship between wheat and Mycosphaerella graminicola, the Septoria tritici Blotch Pathogen. Phytopathology, 92: Chandra, A., Saxena, R., Dubey, A. and Saxena, P. (2007) Change in phenyalalanine ammonia lyase activity and isozyme patterns of poly phenol oxidase and peroxidase by salicylic acid leading to enhanced resistance in cowp ea against Rhizoctonia Solani. Acta Physiologiae Plantarum 29: Chartrain, L., Brading, P., Makepeace, J. and Brown, J. (2004) Sources of resistance to Septoria tritici blotch and implications for wheat breeding. Plant Pathology 53: Denslow, S. A., Walls, A. A. and Daub, M. E. (2005) Regulation of biosynthetic genes and antioxidant properties of vitamin B6 vitamins during plant defense responses. Physiological and Molecular Plant Pathology 66: Esllahi M. R., Safaie, N. and Saidi, A. (2013) Study of resistant gene expression of wheat against to Mycosphaerella graminicola by cdna - AFLP. PhD thesis, Tarbiat Modares university (in Persian with English abstract). Fofana, B., Banks, T.W., McCallum, B., Strelkov, S.E. and Cloutier, S. (2007) Temporal gene expression profiling of the wheat leaf rust pathos stem using cdna microarray reveals differences in compatible and incompatible defiance pathways. International Journal of Plant Genomics 2007: منابع

12 53 بررسي تغييرات بيان ژنه یا دفاعي گياه گندم در پاسخ به آلودگي به Mycosphaerella graminicola Fuerst, E.P., Okubara, P.A., Anderson, J. V. and Morris C.F. (2014) Poly phenol oxidaseas a biochemical seed defense mechanism. Plant Physiology 5 (689): 1-9. Gholamnezhad, J., Sanjarian, F., Mohammadi Goltapeh, E., Safaei, N. and Razavi, Kh. (2012) The evaluation of salicylic acid effect on septorios disease by Mycospharella graminicola. Researches Plant Pathology 2(2): (in Persian). Goodwin, S. B., McDonald, B. A. and Kema, G. H. J. (2003) The Mycosphaerella sequencing initiative. In: Global Insights into the Septoria and Stagonospora Diseases of Cereals (Eds. Kema, G. H. J., van Ginkel, M. and Harrabi, M.) In: Proceeding of the 6 th International Symposium on Septoria and Stagonospora Diseases of Cereals, Tunis, Tunisia. Hashemi, Sh., Asrar, Z. and Pourseyedi, Sh. (2010) Effects of seed pretreatment by salicylic acid on growth and some physiological and biochemical parameters in Lepidium sativum. Iranian Journal of Plant Biology 2(2):1-10. (in Persian). Hayat, Q., Hayat, S., Irfan, M. and Ahmad, A. (2010) Effect of exogenous salicylic acid under changing environment: A review. Environmental and Experimental Botany 68: Honty, K., Hevesi, M., Toth, M. and Stefanovits-Banyai E. (2005) Some biochemical changes in pear fruit tissue induced by Erwinia aymlovora. Acta Biologica Szegediensis 49: Huang, J., Gu, M., Lai, Z., Fan, B., Shi, K., Zhou, Y. H., Yu, J. Q. and Chen, Z. (2010) Functional analysis of the Arabidopsis PALgene family in plant growth, development, and response to environmental stress. Plant Physiology 153: Kayednezami, R. and Balouchi, H. (2013) Effect of salicylic acid priming on lens cultivars (Lens culinaris Medik.) germination and some physiological traits under salinity conditions. Iranian Journal of Plant Biology 5(18): (in Persian). Kia, S. and Torabi, M. (2008) Effects of infection with septoria leaf blotch (Septoria tritici) at different growth stages on yield and yield components of wheat cultivars in Gorgan. Seed and Plant 24: (in Persian). Lynch, K. M., Zannini, E., Guo, J., Axel, C., Arendt, E. K., Kildea, S. and Coffey, A. (2016) Control of Zymoseptoria tritici cause of septoria tritici blotch of wheat using antifungal Lactobacillus strains. Journal of Applied Microbiology 121: Ma, L. X.,. Zhong, S. F., Liu, N., Chen, W. Q., Liu, T. G., Li, X., Zhang, M., Ren, Z. L., Yang, J. Z. and Luo, P. G. (2015) Gene expression profile and physiological and biochemical characterization of hexaploid wheat inoculated with Blumeria graminis f. sp. Tritici. Physiological and Molecular Plant Pathology 90: McDonald, M.C., McDonald, B.A., Solomon, P.S. (2015) Recent advances in the Zymoseptoria tritici wheat interaction: insights from pathogenomics. Frontiers in Plant Science 6(102): 1-5. Mohammadi, M. and Kazemi, H. (2002) Changes in peroxidase and polyphenol oxidase activities in susceptible and resistant wheat heads inoculated with Fusarium graminearum and induced resistance. Plant Science 162: Momeni, N., Arvin, M., Khagoei nejad, Gh., Daneshmand, F. and Keramat, B. (2012) The effect of sodium chloride and salicylic acid on antioxidant defense system in maize (Zea mays L.). Journal of Plant Biology 4(14): (in Persian). Pourakbar, L. and Abedzadeh, M. (2014) Effects of UV-B and UV-C radiation on antioxidative enzymes activity of Melissa officinalis and influences of salicylic acid in UV-stress ameliorations. Iranian Journal of Plant Biology 6(21): (in Persian).

13 زيستشناسي گياهي ايران سال هشتم شماره سيام زمستان Quaedvlieg, W., Kema, G. H. J., Groenewald, J. Z., Verkley, G. J. M., Seifbarghi, S., Razavi, M., Gohari, A. M. and Mehrabi, R. (2011) Zymoseptoria gen. Nov.: A new genus to accommodate Septoria-like species occurring on graminicolous hosts". Persoonia - Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi 26: Rabbani, M. A., Maruyama, K., Abe, H., Khan, M. A., Katsura, K., Ito, Y., Yoshiwara, K., Seki, M., Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K. (2003) Monitoring expression profiles of rice genes under cold, drought, and high-salinity stresses and abscisic acid application using cdna microarray and RNA gel-blot analyses. Plant Physiology 133: Ray, S., Anderson, J. M., Urmeev, F. I. and Goodwin, S. B. (2003) Rapid induction of a protein disulfide isomerase and defense-related genes in wheat in response to the hemibiotrophic fungal pathogen Mycosphaerella graminicola. Plant Molecular Biology 53: Sorahinobar, M., Niknam, V., Ebrahimzadeh, H., Soltanloo, H., Behmanesh, M. and Tahmasebi nferad, S. (2015) Central Role of Salicylic Acid in Resistance of Wheat Against Fusarium graminearum. Journal of Plant Growth Regulation 35(2): Tyagi, M., Kayastha, A. M. and Sinha, B. (2000). The role of peroxidase and polyphenol oxidase isozymes in wheat resistwnce to Alternaria triticina. Biologia Plantarum 43(40): Vakili Bastam, S., Ramezanpour, S. S., Soltanloo, H., Kia, S., Kalatearabi, M. and Pahlavani, M. H. (2010) Inheritance of resistance to septoria tritici blotch (STB) in some Iranian genotypes of wheat (Triticum aestivum L.). International Journal of Genetics and Molecular Biology 2(3): Vogt, T. (2010) Phenylpropanoid biosynthesis. Molecular Plant 3: Wang, X., Tang, C., Zhang, G., Li, Y., Wang, C., Liu, B. Z., Zhao, J., Han, Q. and Huang, L. (2009) cdna-aflp analysis reveals differential gene expression in compatible interaction of wheat challenged with Puccinia striifonnis f. sp. tritici. BMC Genomics 10: Wen, P., Chen, J. Y., Kong, W. F., Pan, Q. H., Wan, S. B. and Huang, W. D. (2005) Salicylic acid induced the expression of Phenylalanine ammonia-lyase gene in grape berry. Plant Science 169: Zamani, E., Sanjarian, F., Mohammadi-Goltapeh, E. and Safaie, N. (2016) Studying the resistance of wheat seedlings grown from treated seeds with salicylic acid against Mycosphaerella graminicola. Plant Protection 39(1): (in Persian).