ΜΟΡΙΑΚΔ ΣΔΥΝΙΚΔ ΣΗ ΓΙΑΓΝΧΗ ΣΗ ΦΤΜΑΣΙΧΗ ΔΡΓΑΣΗΡΙΑΚΗ ΠΡΟΔΓΓΙΗ

Transcript

1 ΜΟΡΙΑΚΔ ΣΔΥΝΙΚΔ ΣΗ ΓΙΑΓΝΧΗ ΣΗ ΦΤΜΑΣΙΧΗ ΔΡΓΑΣΗΡΙΑΚΗ ΠΡΟΔΓΓΙΗ Π. Ισαλλίδεο, Μνξηαθόο Βηνιόγνο, PhD Μηθξνβηνινγηθό Δξγαζηήξην, Δζληθό Κέληξν Αλαθνξάο Μπθνβαθηεξηδίσλ, ΓΝΝΘΑ «Η σηεξία»

2 Μνξηαθέο δηαγλσζηηθέο κέζνδνη Αληρλεύνπλ ζην γελεηηθό πιηθό αιιεινπρίεο: ραξαθηεξηζηηθέο ηνπ νξγαληζκνύ (όινη νη νξγαληζκνί θέξνπλ ζην γνληδίσκα ηνπο αιιεινπρίεο κε κνλαδηθό ζπλδπαζκό βάζεσληππηθέο ησλ αηόκσλ ηνπ είδνπο ). ραξαθηεξηζηηθέο κηαο ηδηόηεηαο (π.ρ. κεηαιιάμεηο πνπ ζπλδένληαη κε αληνρή ζε αληηβηνηηθά)

3 Τβξηδηζκόο λνπθιετληθώλ νμέσλ Υξεζηκνπνηνύληαη ηρλεζέηεο (DNA ή RNA) κε αιιεινπρίεο ζπκπιεξσκαηηθέο κε ηηο αιιεινπρίεο ζηόρν ζην γελεηηθό πιηθό (DNA ή RNA) ηνπ νξγαληζκνύ πνπ δηεξεπλνύκε Ο ηρλεζέηεο ή ην γελεηηθό πιηθό ηνπ νξγαληζκνύ ηξνπνπνηνύληαη ρεκηθά ή ελδπκηθά ώζηε λα παξάγνπλ ζήκα (ξαδηελέξγεηα, θζνξηζκό, ρεκεηνθσηαύγεηα) Ο ηρλεζέηεο πβξηδίδεηαη κε ηνλ ζηόρν Ο πβξηδηζκόο κπνξεί λα είλαη: 1. πγξήο ή 2. κεηθηήο θάζεο (αθηλεηνπνηεκέλν έλα από ηα δύν κόξηα) Αληρλεύεηαη ην ζήκα

4

5 Τβξηδηζκόο λνπθιεϊληθώλ νμέωλ Hybridization is the process of establishing a non-covalent, sequence-specific interaction between two or more complementary strands of nucleic acids into a single hybrid

6 Τβξηδηζκόο λνπθιεϊληθώλ νμέωλ ΜΔ ΣΗΝ ΔΠΙΛΟΓΗ ΣΩΝ ΚΑΣΑΛΛΗΛΩΝ ΤΝΘΗΚΩΝ (Σ, [Να + ]) ΔΠΙΣΤΓΥΑΝΔΣΑΙ Ο ΤΒΡΙΓΙΜΟ ΜΟΝΟ ΜΔΣΑΞΤ ΜΟΡΙΩΝ ΜΔ 100% ΟΜΟΛΟΓΙΑ

7 AccuProbe (Gen-Probe Biomerieux) Τιηθό: θαιιηεξγεκέλνο κηθξννξγαληζκόο ηόρνο: rrna (~ αληίηππα/θύηηαξν) Γηαθνξεηηθά test γηα: M. tuberculosis complex M. avium M. kansasii M. gordonae m. intracellulare Chemiluminescence is the emission of light as the result of a chemical reaction.

8 Αλίρλεπζε κε κνξηαθέο κεζόδνπο ελίζρπζεο ηνπ ζηόρνπ Amplification Mycobacterium Tuberculosis Direct test (AMTD), Gen Probe biomerieux κέζνδνο TMA αλίρλεπζε rrna Cobas Amplicor Mycobacterium Tuberculosis Direct, Roche Diagnostics κέζνδνο PCR, αλίρλεπζε DNA Genotype Mycobacteria Direct, Hain Life Science κέζνδνο ζπλδπαζκνύ NASBA θαη DNA STRIP, αλίρλεπζε RNA (M. tuberculosis complex, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. malmoense) BD Probe Tec energy transfer System, Becton Dickinson-κέζνδνο SDAζηόρνο DNA (IS6110, 16S rrna) In house PCR ζηόρνο DNA Xpert MTB/RIF, Cepheid- κέζνδνο Real time PCR ζηόρνο DNA (hot spot rpob region)

9 Μέζνδνη-ραξαθηεξηζηηθά Μέζνδνο Μηθξνβηαθό θνξηίν Υξόλνο ρόιηα Μηθξνζθνπηθή ~10 4 Λίγεο ώξεο Με εηδηθή Καιιηέξγεηα ζε LJ ~ εβδνκάδεο Gold standard Τγξή θαιιηέξγεηα ~ ,5 εκέξεο Κίλδπλνο επηκνιύλζεσλ Μνξηαθέο κέζνδνη 1 νξγαληζκόο (ζεσξεηηθά) Λίγεο ώξεο (ελδπκηθή θαηάιπζε) Κίλδπλνο επηκνιύλζεσλ. Carry over

10 Θεξκνθξαζία Transcription Mediated Amplification (TMA) (AMTD Biomerieux) Απνδηάηαμε rrna 95 o C Υβξηδηζκόο Εθθηλεηώλ 42 o C Πξνζζήθε Έλδπκωλ. Πνιιαπιαζηαζκόο 0 Χξόλνο Έλδπκα: Reverse Transcriptase (RT): πλζέηεη DNA κε «θαινύπη» κνλόθιωλν RNA ή DNA Δλεξγόηεηα RNase H ηεο RT: Απνηθνδνκεί ηελ RNA αιπζίδα ζε δίθιωλα DNA:RNA κόξηα T7 RNA polymerase: πλζέηεη RNA κε «θαινύπη» δίθιωλν DNA

11 rrna TMA RT DNA DNA T7 Promoter-primer rrna target Primer 2 RT RNase H DNA RNA

12 RNA amplicon TMA RNA αντίγραφα/ μόριο dsdna T7 RNA pol RT T7 Promoter-primer RT Primer 2 RNase H

13

14 πζηάζεηο γηα ηε ρξήζε επείγνπζαο κνξηαθήο δηάγλσζεο θπκαηίσζεο (Mycobacterium Direct Testing, ΑMTD) 3. ην εξγαζηήξην ε εμέηαζε εθηειείηαη πάληα ζην πξώην δείγκα αζζελνύο κε ζεηηθή κηθξνζθνπηθή εμέηαζε. Όηαλ ην απνηέιεζκα ηεο κνξηαθήο εμέηαζεο είλαη ζεηηθό, ν αζζελήο ζεωξείηαη όηη πάζρεη από θπκαηίωζε θαη γίλεηαη έλαξμε αληηθπκαηηθήο αγωγήο ελ αλακνλή ηωλ απνηειεζκάηωλ ηεο θαιιηέξγεηαο. ε απηά ηα δείγκαηα δηελεξγείηαη θαη κνξηαθόο έιεγρνο επαηζζεζίαο ζηα αληηθπκαηηθά θάξκαθα θαη ην απνηέιεζκα ζηέιλεηαη ζηελ θιηληθή όηαλ είλαη πιεξνθνξηαθό (~85% ησλ πεξηπηώζεσλ). 4. ε θάζε άιιε πεξίπησζε, ε εμέηαζε εθηειείηαη κεηά από παξαγγειία ηνπ θιηληθνύ ηαηξνύ επί πςειήο θιηληθήο ππνςίαο θπκαηίσζεο. 5. Πεξηπηώζεηο κε πςειή θιηληθή ππνςία θπκαηίσζεο αιιά κε αξλεηηθή κηθξνζθνπηθή εμέηαζε πξέπεη λα αμηνινγνύληαη αλά πεξίπησζε. Με βάζε ηηο αλαζεωξεκέλεο νδεγίεο ηνπ Ακεξηθάληθνπ Κέληξνπ ειέγρνπ ινηκώμεωλ (CDC), ζε κηθξνζθνπηθά αξλεηηθά/κνξηαθά ζεηηθά δείγκαηα, ζα πξέπεη λα δηεξεπλάηαη ε έλαξμε αληηθπκαηηθήο αγωγήο κε βάζε ηηο θιηληθέο ελδείμεηο ελ αλακνλή ηωλ απνηειεζκάηωλ ηεο θιαζηθήο θαιιηέξγεηαο. Η απνζηνιή επηπξόζζεηωλ δεηγκάηωλ γηα κνξηαθή εμέηαζε επαθίεηαη ζηελ θξίζε ηνπ θιηληθνύ ηαηξνύ. Έλαο αζζελήο κπνξεί λα ζεωξεζεί όηη πάζρεη από θπκαηίωζε, εάλ 2 ή πεξηζζόηεξα αξλεηηθά κηθξνζθνπηθά δείγκαηα, είλαη ζεηηθά ζηε κνξηαθή εμέηαζε. 6. Σε πεξηπηώζεηο κε ζεηηθό κηθξνζθνπηθό απνηέιεζκα θαη αξλεηηθή κνξηαθή εμέηαζε δηελεξγείηαη δνθηκαζία γηα παξνπζία αλαζηνιέσλ (3-7% ηωλ πεξηπηώζεωλ) Α. Δάλ ππάξρνπλ αλαζηνιείο, ε κνξηαθή εμέηαζε δελ έρεη δηαγλωζηηθή αμία. Θα πξέπεη λα εμεηάδεηαη ε παξαγγειία επηπιένλ δηαγλωζηηθώλ δνθηκαζηώλ θαη λα δηεξεπλάηαη ε έλαξμε αληηθπκαηηθήο αγωγήο κε βάζε ηηο θιηληθέο ελδείμεηο θαη ζε αλακνλή ηωλ απνηειεζκάηωλ ηεο θιαζηθήο θαιιηέξγεηαο. Β. Δάλ δελ ππάξρνπλ αλαζηνιείο, ζα πξέπεη λα δηεξεπλάηαη ε έλαξμε αληηθπκαηηθήο αγωγήο κε βάζε ηηο θιηληθέο ελδείμεηο θαη ζε αλακνλή ηωλ απνηειεζκάηωλ ηεο θιαζηθήο θαιιηέξγεηαο. Ο αζζελήο κπνξεί λα ζεωξεζεί όηη παξνπζηάδεη ινίκωμε από άηππα κπθνβαθηεξίδηα εάλ έλα δεύηεξν δείγκα είλαη κηθξνζθνπηθά ζεηηθό/κνξηαθά αξλεηηθό θαη δελ ππάξρνπλ αλαζηνιείο. 7. Σε πεξηπηώζεηο κε αξλεηηθό κηθξνζθνπηθό απνηέιεζκα θαη αξλεηηθή κνξηαθή εμέηαζε ζα πξέπεη λα δηεξεπλάηαη ε έλαξμε αληηθπκαηηθήο αγωγήο κε βάζε ηηο θιηληθέο ελδείμεηο ελ αλακνλή ηωλ απνηειεζκάηωλ ηεο θιαζηθήο θαιιηέξγεηαο θαη λα εμεηάδεηαη ε παξαγγειία επηπιένλ δηαγλωζηηθώλ δνθηκαζηώλ. Με δεδνκέλε ηε ρακειόηεξε επαηζζεζία ηεο κεζόδνπ ζηα κηθξνζθνπηθά αξλεηηθά δείγκαηα, δελ κπνξεί λα απνθιεηζηεί ε δηάγλωζε ηεο θπκαηίωζεο. 8. Σηα εμσπλεπκνληθά δείγκαηα (θαη ηδηαίηεξα ζε δείγκαηα πιεπξηηηθνύ θαη αζθηηηθνύ πγξνύ, ΕΝΥ, θιπ) ε κέζνδνο έρεη ρακειόηεξε επαηζζεζία ή ελδέρεηαη λα ππάξρνπλ αλαζηνιείο. Η ειάρηζηε πνζόηεηα ΔΝΤ πνπ γίλεηαη δεθηή από ην εξγαζηήξην είλαη 0.5 ml. H ιήςε κεγαιύηεξεο πνζόηεηαο ή πνιιαπιώλ δεηγκάησλ απμάλεη ηε πηζαλόηεηα αλίρλεπζεο ηνπ κπθνβαθηεξηδίνπ. 9. Γείγκαηα αίκαηνο ή εκθαλώο αηκαηεξά δείγκαηα είλαη αθαηάιιεια γηα ηελ κέζνδν AMTD ηηο αθόινπζεο πεξηπηώζεηο, ε εμέηαζε AMTD δελ πξέπεη λα δεηείηαη σο εμέηαζε ξνπηίλαο: 1. Αζζελείο κε γλσζηό AMTD απνηέιεζκα. 2. Αζζελείο κε ρακειή θιηληθή ππνςία γηα ινίκσμε κε M. tuberculosis. 3. Αζζελείο ππό αληηθπκαηηθή αγσγή πεξηζζόηεξεο από 7 εκέξεο ή ζηε δηάξθεηα ησλ ηειεπηαίσλ 12 κελώλ.

15 ΑΞΙΟΛΟΓΗΗ ΣΗ ΜΔΘΟΓΟΤ * ΓΔΙΓΜΑΣΑ ΣΟΤ ΑΝΑΠΝΔΤΣΙΚΟΤ AFB (+) AFB(-) ΔΞΧ- ΑΝΑΠΝΔΤΣΙΚΑ ΓΔΙΓΜΑΣΑ ΔΤΑΙΘΗΙΑ ΔΙΓΙΚΟΣΗΣΑ ΘΔΣΙΚΗ ΠΡΟΓΝΧΣΙΚΗ ΑΞΙΑ ΑΡΝΗΣΙΚΗ ΠΡΟΓΝΧΣΙΚΗ ΑΞΙΑ * Μεηά ηημ περαιηέρω κλιμική διερεύμηζη και επίλυζη ηωμ αζυμθωμιώμ

16 ΑΞΙΟΛΟΓΗΗ AMTD ΣΗ ΓΙΑΓΝΩΗ AFB AMTD KΛΙΝΙΚΗ ΤΠΟΦΙΑ ΠΑΡΑΣΗΡΗΔΙ ΘΔΣΙΚΗ ΘΔΣΙΚΗ ΤΦΗΛΗ/ΥΑΜΗΛΗ ΔΝΔΡΓΟ ΣΒ ΑΡΝΗΣΙΚΗ ΑΡΝΗΣΙΚΗ ΤΦΗΛΗ/ΥΑΜΗΛΗ ΓΔΝ ΑΠΟΚΛΔΙΔΣΑΙ ΣΒ ΑΡΝΗΣΙΚΗ ΘΔΣΙΚΗ (1 ή 2 ΓΔΙΓΜΑΣΑ) ΤΦΗΛΗ ΔΝΑΡΞΗ ΑΓΧΓΗ ΔΠΑΝΔΚΣΙΜΗΗ ΜΔ ΚΑΛΛΙΔΡΓΔΙΑ ΑΡΝΗΣΙΚΗ ΘΔΣΙΚΗ (2 ΓΔΙΓΜΑΣΑ) ΥΑΜΗΛΗ ΔΝΔΡΓΟ ή ΠΑΛΑΙΑ ΣΒ ή ΔΠΙΜΟΛΤΝΗ ΘΔΣΙΚΗ ΑΡΝΗΣΙΚΗ (ΔΛΔΓΥΟ ΑΝΑΣΟΛΔΧΝ) ΤΦΗΛΗ ΝΣΜ (ΓΔΝ ΑΠΟΚΛΔΙΔΣΑΙ ΜΣΒ) ΔΝΑΡΞΗ ΑΓΧΓΗ ΔΠΑΝΔΚΣΙΜΗΗ ΜΔ ΚΑΛΛΙΔΡΓΔΙΑ ΘΔΣΙΚΗ ΑΡΝΗΣΙΚΗ (ΔΛΔΓΥΟ ΑΝΑΣΟΛΔΧΝ) ΥΑΜΗΛΗ ΝΣΜ (ΓΔΝ ΑΠΟΚΛΔΙΔΣΑΙ ΜΣΒ) ΔΝΑΡΞΗ ΑΓΧΓΗ ΔΠΑΝΔΚΣΙΜΗΗ ΜΔ ΚΑΛΛΙΔΡΓΔΙΑ

17 Θερμοκραζία 100 PCR Μεηνπζίωζε 94 o C 50 0 Χξόλνο

18 Θερμοκραζία 100 Μεηνπζίωζε 94 o C PCR 50 0 Χξόλνο 3 5 Θεξκόηεηα 5 3

19 Θεξκνθξαζία PCR Μεηνπζίωζε 94 o C Πξόζδεζε εθθηλεηώλ 50 o C Επέθηαζε 72 o C Μεηνπζίωζε 94 o C 0 T i m e

20 Θεξκνθξαζία PCR Μεηνπζίωζε 94 o C Υβξηδηζκόο εθθηλεηώλ 50 o C Επέθηαζε 72 o C Μεηοσζίωζη 94 o C 30x 0 3 Χξόλνο Θεξκόηεηα Θεξκόηεηα 3

21 Σν DNA κεηαμύ ηωλ εθηλεηώλ δηπιαζηάδεηαη κε θάζε ζεξκηθό θύθιν Αριθμός Κύκλοι

22 Θεσξεηηθή απόδνζε ηνπ PCR Θεωρηηική απόδοζη = 2 n x y y = αξρηθόο αξηζκόο αληηγξάθωλ n = αξηζκόο ζεξκηθώλ θύθιωλ Για 100 αρτικά ανηίγραθα, μεηά από 30 κύκλοσς έτοσμε: 2 n x y = 2 30 x 100 = 1,073,741,824 x 100 = 107,374,182,400 ανηίγραθα

23 Carry over (ν εθηάιηεο!!) 1 ζεηηθή αληίδξαζε PCR παξάγεη ~250 ng/50 κl πξντόλ Γηα πξντόλ 600 bp = ~ 3.9 X κόξηα 1/1000 ηνπ κl πεξηέρεη ~ κόξηα ΦΤΙΚΟ ΓΙΑΥΧΡΙΜΟ ΣΧΝ ΓΙΑΦΟΡΔΣΙΚΧΝ ΒΗΜΑΣΧΝ ΚΑΣΑΣΡΟΦΗ ΠΙΘΑΝΧΝ ΠΡΟΨΟΝΣΧΝ (δηάιπκα ρισξίλεο, UV) ΓΙΑΓΙΚΑΙΔ, ΣΡΟΠΟ ΔΡΓΑΙΑ ΑΝ ΤΜΒΔΙ.

24 Προϊόν Ν(i)=2 i x y i=1-n Χρόνος

25 ΑΠΟΓΙΑΣΑΞΗ ΤΒΡΙΓΙΜΟ ΜΔΣΡΗΗ Fluorescence is the emission of light by a substance that has absorbed light or other electromagnetic radiation of a different wavelength

26 Θεσξεηηθή απόδνζε = 2n x y

27 WHO endorses new rapid tuberculosis test Product name: Xpert MTB/RIF Developers: FIND and Cepheid Stage of Development: Endorsed by WHO (2010) Product description The Cartridge-Based Automated NAAT is a self-contained and fully automated technological platform that integrates sputum processing, DNA extraction and amplification, TB and MDR-TB diagnosis. It has similar sensitivity to culture, targets Mycobacterium tuberculosis specifically and enables simultaneous detection of rifampicin resistance via the rpob gene. Training requirements are generally 1-2 days, and the 1-step external sample preparation is extremely simple. The closed system ensures that there is no risk of contamination and no requirement for bio-safety facilities. Test results can be obtained in just 90 minutes.

28 Xpert MTB/RIF (Cepheid) 5 ηρλεζέηεο πνπ θζνξίδνπλ ζε δηαθνξεηηθό κήθνο θύκαηνο θαιύπηνπλ ηελ hot-spot region πεξηνρή ηνπ rpob γνληδίνπ

29 Helb, D. et al J. Clin. Microbiol. 48(1): FIG. 2. Detection of RRDR mutations

30 Multi-country evaluation by FIND (Boehme et al. NEJM 2010, v.363, p.1005) Study sites: 5 Patients: 1730 Samples: Sputum A single test on sputum detected : 551/561 (98.2%) AFB (+) 124/171 (72.5%) AFB (-) A single test on sputum correctly identified: 200/205 (97.6%) RIF-resistant isolates 504/514 (98.1%) RIF-susceptible isolates Indeterminate results: 3.7% (culture: 5.5%)

31 Figure 4. The sensitivity (95% CI) of Xpert MTB/RIF assay for smear-positive and smear-negative TB according to whether 1, 2 or 3 sputum samples were tested compared to a gold standard of four cultures from two sputum samples. Data taken from the FIND multicountry laboratory validation study. Boehme et al. NEJM 2010, v.363, p.1005

32 Lawn & Nicol: Xpert( ) MTB/RIF assay: development, evaluation and implementation of a new rapid molecular diagnostic for tuberculosis and rifampicin resistance Future Microbiol. 2011,6, Respiratory samples Sen. AFB(+): % Sen. AFB (-): 57-83% Pediatric samples (1 Study, 452 children, median age: 19.4 months) Sen. AFB(+): 100% Sen. AFB (-): 33.3% (1 sample) -61.1% (2 samples) Non respiratory samples Sen % Sp %

33 Αμηνιόγεζε Xpert MTB/RIF ζην ΔΚΑΜ SAMPLES (n) Se Sp PPV NPV ALL SAMPLES (101) 91% 91% 83% 95% PULMONARY (64) 90% 91% 90% 91% EXTRA-PULMONARY (37) 100% 91% 50% 100% AFB (-) (87) 86% 92% 78% 95% AFB (+) (13) 100% 100% 100% 100% Ioannidis et al JCM

34 GeneXpert MTB/RIF MTBDRplus SENSITIVE RESISTANT WT 28 - MUTATED 1* 3 Ioannidis et al JCM

35 WHO endorses new rapid tuberculosis test A major milestone for global TB diagnosis and care Affordable assessment Co-developer FIND (the Foundation for Innovative and New Diagnostics) is announcing today it has negotiated with the manufacturer, Cepheid, a 75% reduction in the price for countries most affected by TB, compared to the current market price. Preferential pricing will be granted to 116 lowand middle- income countries where TB is endemic, with additional reduction in price once there is significant volume of demand."there has been a strong commitment to remove any obstacles, including financial barriers, that could prevent the successful roll-out of this new technology," said Dr Giorgio Roscigno, FIND's Chief Executive Officer. "For the first time in TB control, we are enabling access to state-of-the-art technology simultaneously in low, middle and high income countries. The technology also allows testing of other diseases, which should further increase efficiency. (8 December 2010)

36 WHO monitoring of Xpert MTB/RIF roll-out

37 Αλάζηξνθνο πβξηδηζκόο

38 Phylogenetic tree of the members of the genus Mycobacterium.

39 16S rrna Secondary-structure model of the 16S rrna (double lines indicate variable or hypervariable; gray lines indicate highly conserved; V1 to V9 indicate major variable regions). The 16s rrna mycobacterial phylogeny and taxonomy focuses on hypervaliable region A (V 8-11) and hypervariable region B (V18) Clinical Microbiol Rev 2003, p ΑΛΛΔ ΠΔΡΙΟΥΔ.. 23 S rrna gyrb RD1 16S-23S rrna Internal Transcribed Spacer

40 Μέζνδνη πνπ ζηεξίδνληαη ζηνλ αλάζηξνθν πβξηδηζκό Η αξρή ηεο κεζόδνπ: 1. Πνιιαπιαζηαζκόο ζπληεξεκέλσλ πεξηνρώλ πνπ πεξηιακβάλνπλ (ππεξ-) κεηαβιεηέο πεξηνρέο κε ραξαθηεξηζηηθέο αιιεινπρίεο γηα θάζε είδνο (π.ρ. 16S rrna) 2. Τβξηδηζκόο ησλ πξντόλησλ ηνπ πνιιαπιαζηαζκνύ ζε αθηλεηνπνηεκέλνπο ηρλεζέηεο. Η θάζε επηκέξνπο ηρλεζέηεο θέξεη ηελ ραξαθηεξηζηηθή γηα ην είδνο αιιεινπρία. 3. Οη απζηεξέο ζπλζήθεο πβξηδηζκνύ κπνξεί λα εμαζθαιίζνπλ ην δηαρσξηζκό κεηαμύ αιιεινπρηώλ πνπ δηαθέξνπλ ζε κηα κόλν βάζε (ηδηαίηεξα ρξήζηκν γηα ζηελ αλαδήηεζε ζεκεηαθώλ κεηαιιάμεσλ)

41 Sequences of 16S rrna hypervariable region A of new mycobacteria. Positions, as derived from the E. coli sequence, are indicated. Only nucleotides that differ from M. tuberculosis are shown; dashes indicate deletions. Clinical Microbiol Rev 2003, p

42 GCC TTG Forward Primer GCC CTA Reverse Primer CGG GAT M. tuberculosis CGG AAC M. genavense CGA GGC CTC GGC M. heidelbergence/ M. interjectum M intermedium

43 ΣΑΤΣΟΠΟΙΗΗ MTBC (Hain Life Science) The GenoType MTBC assay: based on an M. tuberculosis complex-specific 23S ribosomal DNA fragment, gyrb DNA sequence polymorphisms, and the RD1 deletion of M. bovis BCG

44 Σαπηνπνίεζε ΝΣΜ (CM/AS Hain Life Science) 14 ΔΙΓΗ 16 ΔΙΓΗ

45 ΜΔΣΑΛΛΑΞΔΙ ΚΑΙ ΑΝΣΟΥΗ ΣΗΝ RIF & INH Σν ~95% ησλ αλζεθηηθώλ ζηειερώλ ζηελ rifampicin θέξνπλ κεηαιιάμεηο πνπ εληνπίδνληαη ζε κηα πεξηνρή 81 bp ηνπ γνληδίνπ rpob Οη κεηαιιάμεηο πνπ ζπλδένληαη κε αληνρή ζηελ isoniazid εληνπίδνληαη ζε πεξηζζόηεξεο πεξηνρέο ή γνλίδηα: 1. 50% -95% ησλ αλζεθηηθώλ ζηειερώλ θέξνπλ κεηαιιάμεηο ζην 315 θσδηθόληνπ ηνπ katg γνληδίνπ 2. 20%-35% ζηελ ξπζκηζηηθή πεξηνρή ηνπ inha γνληδίνπ 3. Έρνπλ επίζεο ελνρνπνηεζεί Μεηαιιάμεηο ζε άιιεο πεξηνρέο (aphc-oxyr intergenic region) ή γνλίδηα (π.ρ. kasa, fura, inia)

46 Resistance to rifampin exists at a rate of approximately 1 in 10 8 bacilli Blanchard, J. S Annu. Rev. Biochem 65: Resistance to isoniazid exists at a rate of 1 in 10 6 bacilli Musser, J. M Clin. Microbiol. Rev. 8: >10 8 bacilli per cavity with a diameter of less than 2 cm. Palomino-Leao-Ritacco, Tuberculosis 2007

47 Single amino acid substitutions in the 81 bp core-region of the rpob gene responsible for conferring rifampicin (RIF) resistance. Changes in codon Ser531 and His526 account for more than 70% of the mutations with RIF resistance (depicted in shaded ellipses).

48 MTBDRplus Multiplex PCR κε βηνηηλπ- ιησκελνπο εθίλεηεο Amplicons: 1. Amplification control 2. Mtb complex 3. rpob gene 4. katg gene 5. inha gene Τβξηδηζκόο αθηλεηνπνη- εκέλσλ ζε κεκβξάλε ηρλεζεησλ

49 RESISTANCE DETECTION RIF: (14 comparisons in 10 studies) Excellent accuracy even on primary specimens pooled sensitivity 98.1% pooled specificity 98.7% INH: (15 comparisons in 10 studies) specificity excellent, but sensitivity modest and variable pooled sensitivity 84.3% pooled specificity 99.5%

50 Η ΔΦΑΡΜΟΓΗ ΣΗ ΜΔΘΟΓΟΤ MTBDRplus Δ ΚΛΙΝΙΚΑ ΓΔΙΓΜΑΣΑ (n=431) ΜΙΚΡΟΚΟΠΙΚΗ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΚΟ ΑΠΟΣΔΛΔΜΑ ΝΑΙ ΟΥΙ ΘΕΤΙΚΗ 295 (81,5%) 67 (18,5%) ΑΡΝΗΤΙΚΗ 27 (42,2%) 37 (57.8%) ΥΠΟΠΤΟ 1 4

51 ΠΡΑΓΜΑΣΙΚΟ ΟΦΔΛΟ* ΑΠΟ ΣΗΝ ΤΝΣΟΜΔΤΗ ΣΟΤ ΥΡΟΝΟΤ ΓΙΑΓΝΧΗ Mean ( SD) : 14, 7 6,4 εκέξεο Min-Max: 3-33 εκέξεο * Έρεη ππνινγηζηεί κε βάζε ην πξώην δείγκα ηνπ αζζελνύο πνπ ζεηηθνπνίεζεθε ζηελ θαιιηέξγεηα (LJ ή MGIT960) θαη όρη ην δείγκα πνπ αλαιύζεθε κε ην MTBDRplus

52 ΜΔΣΑΛΛΑΞΔΙ ΚΑΙ ΑΝΣΟΥΗ ΣΙ ΚΙΝΟΛΟΝΔ, ΔΝΔΙΜΑ, ΔΘΑΜΒΟΤΣΟΛΗ Σν 50%-90% ησλ αλζεθηηθώλ ζηειερώλ ζηηο FQ θέξνπλ κεηαιιάμεηο πνπ εληνπίδνληαη ζε κηα κηθξή πεξηνρή ηνπ γνληδίνπ DNA gyra (θπξίσο ζηα ακηλνμέα: A90 & D94 θαη ζπαληόηεξα ηα G88 & S91) ε κηθξό αξηζκό αλζεθηηθώλ ζηειερώλ έρνπλ εληνπηζζεί κεηαιιάμεηο ζην γνλίδην DNA gyrβ. Οη κεηαιιάμεηο πνπ ζπλδένληαη κε αληνρή ζηηο aminoglycosides AMK-KAN & ζην cyclic polypeptide CAPREOMYCIN εληνπίδνληαη ζην γνλίδην rrs (λνπθινείδηα: 1401, 1402 θαη 1484 ) θαη πηζαλά ζην γνλίδην tlya Οη κεηαιιάμεηο πνπ ζπλδένληαη κε αληνρή ζηελ Δζακβνπηόιε εληνπίδνληαη ζην νπεξόλην embcab ~ 50% ησλ αλζεθηηθώλ ζηειερώλ θέξνπλ κεηάιιαμε ζην θσδηθόλην 306 ηνπ γνληδίνπ embb

53 MTBDRsl Multiplex PCR κε βηνηηλπ- ιησκελνπο εθίλεηεο Amplicons: 1. Amplification control 2. Mtb complex 3. gyra gene 4. rrs gene 5. embb gene Τβξηδηζκόο αθηλεηνπνη- εκέλσλ ζε κεκβξάλε ηρλεζεησλ

54 MTBDRsl Resistance to fluoroquinolones is based on the use of 3 wild-type probes covering gyra codons 85 to 97. The presence of the most frequently observed mutations are confirmed by positive hybridization with 6 mutant probes (A90V, S91P, D94A, D94N/Y, D94G, and D94H) For aminoglycosides/cyclic peptide resistance, two wild-type probes cover nucleotides 1401 and 1402 and nucleotide 1484, and two mutant probes specifically detect the A1401G and G1484T exchanges For ethambutol resistance, one wild-type probe covers codon 306, and the presence of the most frequently observed mutations, M306V and M306I.

55

56 Η κνξηαθή γελεηηθή ζηελ γεσθπιεηηθή θαη επηδεκηνινγηθή αλάιπζε Π. Ισαλλίδεο, Μνξηαθόο Βηνιόγνο, PhD Μηθξνβηνινγηθό Δξγαζηήξην, Δζληθό Κέληξν Αλαθνξάο Μπθνβαθηεξηδίσλ, ΓΝΝΘΑ «Η σηεξία»

57 Η κνξηαθή γελεηηθή ζηελ γεσ-θπιεηηθή θαη επηδεκηνινγηθή αλάιπζε ρεκαηίδεη ην γελεηηθό απνηύπσκα ζε επίπεδν ζηειέρνπο αλαιύνληαο γελεηηθνύο ηόπνπο πνπ εκθαλίδνπλ πςειή κεηαβιεηόηεηα (κεηαζεηά ζηνηρεία, επαλαιακβαλόκελεο αιιεινπρίεο) πγθξίλνληαο ηα γελεηηθά απνηππώκαηα αλαιύεη ηελ γεσγξαθηθή/πιεζπζκηαθή δηαζπνξά ησλ ζηειερώλ θαη δηεξεπλά ηε αιπζίδα ηεο κεηάδνζεο

58 MTB genome 4,441,529 bp, high CG content (~65%). Numerous repetitive sequences, no plasmid Cole, Nature 1998 No exchange of genetic material. Propagates clonally (the offspring are genetically identical to their parent) The only requirement for population genetics is to use molecular markers that show sufficient level of polymorphism and make possible multilocus analysis Tibayrenc, C. R. Acad Sci III, 1995

59 The speed of evolution of a given marker conditions its power of resolution (both in time and space) Fast markers short-term epidemiology (IS6110, MIRU-VNTR) Slower markers long-term epidemiology (Direct Repeat) Slow markers phylogenetic studies (rrna) Tibayrenc, C. R. Acad Sci III, 1995

60 Ρπζκόο κεηάιιαμεο: 0,287/ γνληδηώκα/ έηνο (Γηα ζηειέρε κε 10 IS6110 elements) Γνλνηππηθή αλάιπζε κε βάζε ηελ ζέζε θαη ησλ αξηζκό ησλ αληηηύπσλ ηνπ ζηνηρείνπ IS6110

61 Spacer Oligonucleotide typing Γνλνηππηθή αλάιπζε κε βάζε ηνλ πνιπκνξθηζκό ηεο πεξηνρήο «Direct Repeat» (DR) Ρπζκόο κεηάιιαμεο 0,039/έηνο

62 Dendrogram of Pakistani isolates. The clustering pattern of 314 isolates is illustrated. The five most predominant shared spoligotypes, CAS1 (n = 121), Beijing (n = 18), T1 (n = 7), ST357 (n = 7), and East African-Indian strain 3 (EAI3; n = 5), are indicated. J Clinical Microbiology, 2006, p ,

63 Γνλνηππηθή αλάιπζε κε βάζε ηνλ αξηζκό ησλ αληηηύπσλ ζηηο πεξηνρέο MIRU-VNTR Ρπζκόο κεηάιιαμεο 0,0014/locus/έηνο ή 0,034/γνληδηώκα/εηνο

64 IS6110 pattern and the MIRU VNTR shown for isolates that could not be discriminated on the basis of their spoligotype patterns and/or on mutations in the drug resistance genes. Wt. Grey shading highlights isolates with identical genotype patterns. J. Antimicrob. Chemother. (2009)

65 Schruch et al : High-Resolution Typing by Integration of Genome Sequencing Data in a Large Tuberculosis Cluster JCM, 2011 A remarkably large outbreak began in Harlingen in 1992, and grew to over 100 cases in it soon became impossible to distinguish sources of infection and secondary and subsequent cases in the cluster. Some contact chains in the Harlingen cluster were suggested by contact tracing, performed according to the stone-in-the-pond principle but the exact transmission chains could not be validated by fingerprinting of the M. tuberculosis isolates, Fig1 Schematic depiction of two contact chains from the Harlingen (H) cluster suggested by contact tracing. Patient H4 experienced two relapses of the disease in 2004 and 2005 (referred as H4.a, H4.b,and H4.c in Fig.2) Fig 2. Most likely transmission scheme suggested by typing,temporal, and contact tracing data

66 Laboratory cross-contaminations occur at a considerable rate 3-5% (low prevalence settings) (de Boer 2002, Small 1993) Nosocomial infections by BCG (Vos 2003) Exogenous re-infection after curative treatment plays a much higher role than anticipated (estimated in S. Africa at 75%) (Das 1995, Sonnenberg 2001, van Rie 1999) Multiple infections occurring by more than one strain are more prevalent than assumed (may be of concern in case of drug resistant strains) (Richarson 2202, Shamputa 2004, Warren 2004)

67 DNA fingerprinting and contact investigation and source case finding Case finding & treatment the most important measures to inhibit spread Contact investigation is performed by Mantoux test Only a minority of epidemiological linked cases disclosed by DNA finger printing are also found by conventional tracing A large part of TB transmission takes place through casual contacts in the community. In S. Africa the household transmission was found to be 19%. Verver, 2004 Routine molecular typing highly useful for evaluating performance of TB control by revealing in which population and at what rate certain strains are spreading

68 The Beijing family Highly conserved strains (their spread started recently?) Are more frequently isolated from young patients (are emerging?) Are associated with drug resistance and MDR-TB outbreaks Their genetic background favors transmission despite the fact that resistance cost fitness?

69 Figure 1. Evolutionary relationships of the Mycobacterium tuberculosis complex. T.Wirth at al. PLoS Pathog doi: /journal.pp at

70 Figure 5. M. tuberculosis evolutionary scenario (out of Mesopotamia). T.Wirth at al. PLoS Pathog doi: /journal.pp at

71 Brudey K. et. al. Mycobacterium tuberculosis complex genetic diversity: mining the fourth international spoligotyping database (SpolDB4) for classification, population genetics and epidemiology BMC Microbiology, 2006,v.6, p

72 Molecular surveillance of MDR/XDR-TB in the EU, European participants

73 Progress and results of the ECDC project on the surveillance ofmdr-tb in the European Union 3 rd ECDC/RIVM meeting,27 & 28 September 2011, Crete, Greece Project mananger: Jessica de Beer (RIVM) Project leader: Dick van Soolingen (RIVM) Coordinator: Csaba Ködmön (ECDC)

74 Molecular surveillance of MDR/XDR-TB in the EU European Clusters 1823 samples >5000 MDR/XDR-TB cases are not included in the molecular surveillance project Coverage of molecular surveillance is 22% In total; 45 % of the patterns is clustered Cluster definition: Two or more MDR-/XDR-TB strains with identical typing pattern, isolated in at least two different European countries 68 European clusters detected Detection of European transmission, 68 clusters Detection of national transmission, 10 clusters (>4 isolates)

75 Denmark Norway Cyprus France Ireland Italy Germany Bulgaria Slovakia Sweden Cyprus (n=1) Denmark (n=2) Estonia (n=559) Spain (n=210) Finland (n=20) Great-Britain (n=42) Greece (n=36) Hungary (n=36) Lithuania (n=9) The Netherlands Lithuania Hungary Greece Great-Britain Finland Spain Estonia The Netherlands (n=74) Sweden (n=60) Slovakia (n=13) Bulgaria (n=36) Germany (n=62) Italy (n=40) France (n=79) Ireland (n=18) Norway (n=28)

76 Ireland Norway Sweden VNTR0003 The Netherlands Lithuania Hungary Greece Finland Spain Estonia Germany VNTR0002 n= ECDC0002, largest EU cluster In total, 449/1823 isolates belong to this European outbreak 53% of all the clustered cases included in this cluster This large cluster is also detected in Canada and the USA

77 MDR/XDR TB IN GREECE. DATA FROM THE GREEK NATIONAL REFERENCE LABORATORY FOR MYCOBACTERIA

78 Mutation incidence in the 1730 strains analyzed by the MTBDRplus assay katg and/or inha 6,25% rpob 0,94% rpob+katg and/or inha 3,12% wt 89,7%

79 Papaventsis et al. Eurosurveillance Jul 15;15(28). pii: 19614

80 NJ- Tree, MIRU- VNTR [24]: Dc: Cavalli- Sforza and Edwards, Bovis (8217/ 02) Bovis (951/ 01) Bovis (1601/ 01) Bovis (5346/ 02) Bovis (7540/ 01) Bovis (751/ 01) Bovis (7072/ 01) Bovis (9564/ 00) Bovis (1290/ 03) Bovis (4258/ 00) Bovis (8490/ 00) Caprae (8986/ 99) Caprae (1694/ 00) Caprae (7618/ 99) Caprae (8522/ 00) Caprae (11443/ 99) Caprae (7140/ 99) Caprae (1696/ 00) Caprae (8319/ 99) Caprae (5358/ 99) Caprae (9577/ 99) Caprae (9062/ 01) llama (6997/ 99) Seal (7739/ 01) Seal (7011/ 02) llama (8753/ 00) llama (417/ 01) llama (8668/ 99) vole (1479/ 00) vole (287/ 99) West African 2 (5383/ 02) West African 2 (10485/ 01) West African 2 (10512/ 01) West African 2 (10476/ 01) West African 2 (10462/ 01) West African 2 (8163/ 02) West African 2 (10517/ 01) West African 2 (8236/ 02) West African 2 (10514/ 01) West African 2 (5468/ 02) West African 2 (9550/ 00) West African 1 (1449/ 02) West African 1 (2577/ 02) West African 1 (5398/ 02) West African 1 (10400/ 02) West African 1 (3482/ 03) West African 1 (1473/ 02) West African 1 (5434/ 02) West African 1 (5473/ 02) West African 1 (1465/ 02) West African 1 (4802/ 03) West African 1 (1410/ 02) West African 1 (10473/ 01) West African 1 (10458/ 02) West African 1 (8303/ 02) West African 1 (5432/ 02) West African 1 (4804/ 03) West African 1 (2569/ 02) West African 1 (10480/ 01) Haarlem (2336/ 02) Haarlem (4130/ 02) Haarlem (4993/ 02) Haarlem (9532/ 03) West African 1 (10494/ 01) West African 1 (1443/ 02) Ghana (10469/ 01) Ghana (1438/ 02) Ghana (2597/ 02) Ghana (2570/ 02) Ghana (10470/ 01) Ghana (10486/ 01) Ghana (10515/ 01) Ghana (2582/ 02) Ghana (5357/ 02) -?- (AFRICA388_LARISA) Ghana (10493/ 01) Haarlem (3342/ 02) Haarlem (9400/ 02) Haarlem (12637/ 02) -?- (AFRICA545_SOTIRIA) Haarlem (3103/ 03) -?- (GREECE698_SPARTI) Haarlem (4192/ 03) -?- (GREECE097_XANTHI) -?- (GREECE259_XANTHI) -?- (GREECE145_SOTIRIA_ATH) Haarlem (4217/ 02) Haarlem (6946/ 03) Haarlem (3686/ 03) X (9953/ 04) X (4412/ 04) X (9787/ 04) Haarlem (8750/ 03) -?- (FSU284_KAVALA) TUR (10264/ 03) TUR (10529/ 03) TUR (11313/ 03) TUR (2258/ 03) URAL (1657/ 03) URAL (2679/ 03) URAL (8431/ 03) URAL (8577/ 03) -?- (MOLDOVA675_SOTIRIA_ATH) -?- (POLY295) -?- (POLY642) -?- (POLY468) -?- (POLY441) -?- (POLY376) -?- (POLY345) -?- (POLY388) LAM (8078/ 03) -?- (FSU432_SOTIRIA_ATH) LAM (3262/ 02) -?- (POLAND131_AG_KYRIAKOY_ATH) -?- (GREECE300_MEGARA_ROMA) -?- (GREECE581_SOTIRIA_ATH) -?- (GEORGIA574_THESAL) LAM (10581/ 03) LAM (3310/ 02) LAM (4431/ 02) LAM (4428/ 02) -?- (GEORGIA389_XANTHI) LAM (3995/ 03) LAM (7968/ 03) LAM (946/ 03) S (282/ 04) S (2151/ 03) S (7955/ 03) LAM (1850/ 03) S (11046/ 04) S (2318/ 06) S (742/ 06) LAM (8885/ 03) S (1897/ 04) S (4526/ 04) S (6424/ 05) S (3270/ 04) S (8583/ 04) H37Rv (9679/ 00) -?- (GREECE686_SOTIRIA_ATH) -?- (BULGARIA465_SOTIRIA) UgandaII (2176/ 99) UgandaII (1647/ 99) UgandaII (2253/ 99) UgandaII (2191/ 99) UgandaII (2319/ 99) UgandaII (2211/ 99) UgandaII (2307/ 99) UgandaII (1521/ 99) UgandaII (2379/ 99) UgandaII (2197/ 99) Cameroon (5400/ 02) Cameroon (10439/ 01) Cameroon (1417/ 02) Cameroon (5429/ 02) Cameroon (1428/ 02) Cameroon (10481/ 01) S (6411/ 05) -?- (BULGARIA106_KIATO) Cameroon (10446/ 01) Cameroon (5390/ 02) Cameroon (10445/ 01) Cameroon (10438/ 01) NEW- 1 (10459/ 03) NEW- 1 (8870/ 03) NEW- 1 (12591/ 02) UgandaI (2169/ 99) UgandaI (2331/ 99) UgandaI (2333/ 99) UgandaI (2111/ 99) UgandaI (2263/ 99) UgandaI (2173/ 99) UgandaI (1571/ 99) UgandaI (2224/ 99) UgandaI (2201/ 99) UgandaI (2329/ 99) Beijing (3256/ 02) Beijing (3277/ 02) Beijing (3364/ 02) -?- (GEORGIA180_SERRES) -?- (FSU431_SOTIRIA_PRISON) Beijing (3309/ 02) Beijing (4498/ 02) Beijing (4499/ 02) -?- (GEORGIA152_SOTIRIA) Beijing (4445/ 02) -?- (GREECE469_SOTIRIA) -?- (FSU380_SOTIRIA_ATH) Beijing (3243/ 02) -?- (GEORGIA131_SERRES) Beijing (4436/ 02) -?- (FSU495_SOTIRIA) -?- (FSU283_SOTIRIA) -?- (GREECE123_KARPATHOS) Beijing (3329/ 02) -?- (FSU254_SOTIRIA) -?- (GEORGIA368_XANTHI) -?- (GREECE596_THESAL) -?- (AFRICA246_SOTIRIA_ATH) Dehli/ CAS (7936/ 01) Dehli/ CAS (9915/ 01) Dehli/ CAS (6427/ 01) Dehli/ CAS (9398/ 01) Dehli/ CAS (2637/ 02) Dehli/ CAS (7747/ 01) Dehli/ CAS (7507/ 01) Dehli/ CAS (8260/ 01) -?- (AFRICA135_SOTIRIA) Dehli/ CAS (1805/ 02) Dehli/ CAS (7746/ 01) EAI (9267/ 01) EAI (8915/ 03) EAI (947/ 01) EAI (7190/ 03) EAI (1797/ 03) EAI (6538/ 03) EAI (4850/ 03) EAI (4058/ 03) EAI (11051/ 03) EAI (12778/ 03) EAI (6006/ 03) EAI (11359/ 03) Canetti (3041/ 99) Canetti (3040/ 99) MIRU-VNTR typing of strains isolate in the NRLM, Athens, Greece Data available for 31 MDR/XDR and 7 polymorphic strains up to now