ΟΞΕΙ ΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΜΕΤΡΗΣΗΣ ΤΟΥΣ

Transcript

1 ΟΞΕΙ ΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΜΕΤΡΗΣΗΣ ΤΟΥΣ Τι είναι οι ελεύθερες ρίζες; Μία «ελεύθερη ρίζα» είναι ένα άτοµο µε ένα αζευγάρωτο ηλεκτρόνιο στον εξωτερικό δακτύλιο. Στερείται δηλαδή ενός ηλεκτρονίου. Η ελεύθερη ρίζα πρέπει πάντα να είναι µόνο ένα άτοµο; Όχι. Μπορεί επίσης να είναι ένα µόριο, φτιαγµένο από 2 ή περισσότερα άτοµα. εδοµένου ότι τα ηλεκτρόνια έχουν µια πολύ ισχυρή τάση να υπάρχουν σε ζεύγη παρά σε ασύζευκτη κατάσταση, οι ελεύθερες ρίζες λαµβάνουν αδιακρίτως ηλεκτρόνια από άλλα άτοµα, τα οποία στη συνέχεια µετατρέπονται και εκείνα σε δευτερεύοντες ελεύθερες ρίζες, δηµιουργώντας έτσι µια αλυσιδωτή αντίδραση που µπορεί να προκαλέσει σηµαντική βιολογική ζηµία. Με ποιο µηχανισµό οι ελεύθερες ρίζες προκαλούν βλάβες και ασθένειες; Οι ελεύθερες ρίζες συµβάλλουν σε πολλές διαφορετικές ασθένειες. Χηµικά, µια ουσία «οξειδώνεται» όταν αφαιρούνται ηλεκτρόνια και «µειώνεται» όταν προστίθενται ηλεκτρόνια. Όλες οι χηµικές αντιδράσεις περιλαµβάνουν τη µεταφορά ηλεκτρονίων. Το σώµα παράγει ενέργεια οξειδώνοντας βαθµιαία µε ελεγχόµενο τρόπο τις τροφές και αποθηκεύοντάς τες υπό µορφή χηµικής ενέργειας, που ονοµάζεται ATP. Ειρωνικά, αυτός ο µηχανισµός παραγωγής ενέργειας- που είναι τόσο ουσιαστικός στη ζωή µπορεί επίσης να προκαλέσει βλάβες στα κύτταρα. Η οξείδωση των µορίων είναι όπως µια ελεγχόµενη πυρκαγιά που ελευθερώνει ενέργεια αλλά µπορεί επίσης να αφήσει σπινθήρες να ξεφύγουν, αυξάνοντας τις πιθανότητες για καταστροφές. Οι σπινθήρες σε αυτήν την περίπτωση είναι τα ελεύθερα ηλεκτρόνια που δραπετεύουν από το σύστηµα µεταφορών. Αυτά τα αταίριαστα ηλεκτρόνια δηµιουργούν µε ευκολία µόρια ελεύθερων ριζών που είναι χηµικώς ενεργά και ιδιαίτερα ασταθή. Αυτά τα µόρια ελεύθερων ριζών αντιδρούν γρήγορα µε άλλα µόρια και πυροδοτούν µια αλυσιδωτή αντίδραση σχηµατισµού ελεύθερων ριζών. Αυτές οι ελεύθερες ρίζες µε την σειρά τους κλέβουν ένα ηλεκτρόνιο από ένα άλλο µόριο διαµορφώνοντας έτσι µία νέα ελεύθερη ρίζα! Αυτό συνεχίζεται για αρκετό καιρό. Εποµένως ονοµάζουµε αυτήν την διαδικασία αλυσιδωτή αντίδραση των ελεύθερων ριζών. Οι κυτταρικές µεµβράνες αποτελούνται από τα ακόρεστα λιπίδια. Τα ακόρεστα µόρια λιπιδίων των κυτταρικών µεµβρανών είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε αυτήν την καταστρεπτική διαδικασία των ελεύθερων ριζών και συµβάλλουν µε ευκολία στην ανεξέλεγκτη αλυσιδωτή αντίδραση. Η

2 οξειδωτική ζηµία, ένα άλλο όνοµα για τη χηµική αντίδραση που οι ελεύθερες ρίζες προκαλούν, µπορεί να οδηγήσει σε µια διακοπή ή ακόµα και µια σκλήρυνση των λιπιδίων, από τα οποία αποτελούνται τα τοιχώµατα των κυττάρων. Εάν το κυτταρικό τοίχωµα σκληρύνει (υπεροξείδωση λιπιδίων) γίνεται αδύνατο έπειτα για το κύτταρο να λάβει σωστά τις θρεπτικές του ουσίες και µπορούν να επηρεαστούν πολλές άλλες κυτταρικές δραστηριότητες. Εκτός από τα κυτταρικά τοιχώµατα και άλλα βιολογικά µόρια είναι επίσης ευαίσθητα σε βλάβες, συµπεριλαµβανοµένου των RNA, DNA και των πρωτεΐνών. Η παραγωγή ριζών οξυγόνου, οι πιο κοινές ρίζες στα βιολογικά συστήµατα (ROS, αντιδραστικά είδη οξυγόνου), εµφανίζεται συνήθως µέσα στα µιτοχόνδρια ενός κυττάρου. Τα µιτοχόνδρια είναι µικρές, εσωκλειόµενες σε µεµβράνη, περιοχές του κυττάρου που παράγουν τις χηµικές ουσίες που ένα κύτταρο χρησιµοποιεί για την ενέργεια. Τα µιτοχόνδρια ολοκληρώνουν αυτόν τον στόχο µέσω ενός µηχανισµού αποκαλούµενου «µεταφορική αλυσίδα ηλεκτρονίων». Σε αυτόν τον µηχανισµό, τα ηλεκτρόνια περνούν µεταξύ διαφορετικών µορίων, παράγοντας σε κάθε πέρασµα χρήσιµη χηµική ενέργεια. Το οξυγόνο καταλαµβάνει την τελική θέση στην µεταφορική αλυσίδα των ηλεκτρονίων. Περιστασιακά, το ηλεκτρόνιο που περνά αλληλεπιδρά λανθασµένα µε το οξυγόνο, παράγοντας ρίζες οξυγόνου. Η αρχική περιοχή της ζηµιάς των ελεύθερων ριζών είναι το DNA που βρίσκεται στα µιτοχόνδρια. Τα µιτοχόνδρια αποτελούν το «ενεργειακό εργοστάσιο» του κυττάρου. Κάθε κύτταρο περιέχει ένα τεράστιο σύνολο µορίων αποκαλούµενων DNA που παρέχουν τις χηµικές οδηγίες για να λειτουργήσει ένα κύτταρο. Το DNA βρίσκεται στον πυρήνα του κυττάρου, το οποίο χρησιµεύει ως το «κέντρο εντολής» του, καθώς επίσης και στα µιτοχόνδρια. Το κύτταρο επισκευάζει αυτόµατα ένα µεγάλο µέρος της ζηµίας που γίνεται στο DNA του πυρήνα. Εντούτοις, το DNA στα µιτοχόνδρια δεν µπορεί να επισκευαστεί εύκολα. Εποµένως, η εκτεταµένη ζηµιά του DNA συσσωρεύεται µε την πάροδο του χρόνου και νεκρώνει τα µιτοχόνδρια, αναγκάζοντας τα κύτταρα να πεθάνουν και τον οργανισµό να γεράσει. Ως εκ

3 τούτου, αυτή η διαδικασία παραγωγής ελεύθερων ριζών µπορεί να αποδιοργανώσει όλα τα επίπεδα λειτουργίας των κυττάρων. Για αυτό οι βλάβες των ελεύθερων ριζών θεωρούνται ένας βασικός µηχανισµός τραυµατισµού των ιστών. Μας βλάπτουν σε κυτταρικό επίπεδο. Οι ελεύθερες ρίζες αυξάνονται σε δραστηριότητα και ποσότητα µε την πρόσκρουση σε τοξικά µέταλλα στο σώµα. Κατά συνέπεια, τα τοξικά µέταλλα αποτελούν µια αιτία δηµιουργίας ελεύθερων ριζών. Αρκετές εκατοντάδες έτη πριν δεν είχαµε στους οργανισµούς το φορτίο των τοξικών µετάλλων µας που έχουµε τώρα και επίσης δεν είχαµε µια τέτοια έκθεση σε ελεύθερές ρίζες. Είναι σαφές ότι οι περιβαλλοντικοί παράγοντες προκαλούν προβλήµατα µε τις ελεύθερες ρίζες. Η τοξικότητα του µολύβδου, των φυτοφαρµάκων, του καδµίου, της ακτινοβολίας ιονισµού, του οινοπνεύµατος, του καπνού και των τσιγάρων µπορεί να οφείλεται στην ιδιότητά τους να δηµιουργούν ελεύθερες ρίζες. Έτσι, τα ενδεχοµένως επιβλαβή αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παράγονται ως αποτέλεσµα του βιολογικού µεταβολισµού και της έκθεσης στους περιβαλλοντικούς παράγοντες που περιγράφηκαν παραπάνω. Ασθένειες που προκαλούνται: CHD, φλεγµονές, ποδάγρα, παχυσαρκία, αναπνευστικές ασθένειες, καρκίνος, Parkinson, αρθρίτιδα, διαβήτης, κ.λπ. Πώς µπορούµε να προστατευθούµε από τις ελεύθερες ρίζες; Τα ζωντανά κύτταρα χαρακτηρίζονται από πολυάριθµες άµυνες που χωρίζονται σε ενζυµατικά και µη- ενζυµατικά αντιοξειδωτικά συστήµατα. Τα αντιοξειδωτικά αποτρέπουν τα ROS από το να προκαλέσουν εκτεταµένη κυτταρική βλάβη. Κατόπιν, οι ελεύθερες ρίζες συνήθως αποµακρύνονται ή αδρανοποιούνται από µια οµάδα φυσικών αντιοξειδωτικών. Οξειδωτικό στρες είναι το γενικό φαινόµενο της έκθεσης σε οξειδωτικά και αναγωγής της αντιοξειδωτικής ικανότητας ή διαφορετικά της οξειδωτικο-αντιοξειδωτικής ισορροπίας. Οι ζωντανοί οργανισµοί έχουν αναπτύξει ένα σύνθετο αντιοξειδωτικό δίκτυο για να αντιδράσουν στα ROS. Η µείωση της συνολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας εµπλέκεται σε έναν πλήθος ασθενειών, όπως ο καρκίνος και οι καρδιακές παθήσεις που αποτελούν δύο κύριες αιτίες θανάτου σήµερα. Ως εκ τούτου το «οξειδωτικό στρες» αποτελεί ένα σηµαντικό παράγοντα στην υγεία και την ασθένεια και συνεπώς το τεστ οξειδωτικού στρες αποτελεί την αιχµή για τους σύγχρονους τοµείς ιατρικής και υγειονοµικής περίθαλψης. Τύποι και πηγές αντιοξειδωτικών Τα αντιοξειδωτικοί κυνηγοί στον ανθρώπινο ορό αντιπροσωπεύουν µια ετερογενή οµάδα ουσιών, µερικές που συντίθενται στο σώµα και µερικές που προέρχονται αποκλειστικά από τη διατροφή.

4 Τα µεµονωµένα µέλη της αντιοξειδωτικής αµυντικής οµάδας λαµβάνουν θέση για να αποτρέψουν την παραγωγή ROS, για να καταστρέψουν τα πιθανά οξειδωτικά, και για να κυνηγήσουν ROS. Μια ανεπάρκεια σε οποιαδήποτε από αυτά τα συστατικά µπορεί να προκαλέσει µια µείωση της γενικής αντιοξειδωτικής ικανότητας ενός ατόµου. Τα αντιοξειδωτικά λειτουργούν µε διαφορετικούς τρόπους: αποτρέπουν το σχηµατισµό ελεύθερων ριζών καθυστερούν ή σταµατούν τις οξειδωτικές διαδικασίες αφότου αρχίσουν, µε τη σάρωση και την αποµάκτυνση των ριζών απενεργοποιούν τα µέταλλα. Τα αντιοξειδωτικά µπορούν να διακριθούν επίσης βάσει της προέλευσής τους σε: Ενδογενή Ένζυµα (π.χ., δισµουτάση υπεροξιδίων SOD, περοξιδάση γλουταθείου GSHPx, ρεδουκτάση γλουταθείου GR, καταλάση) Μέταλλο-δεσµευτικές πρωτεΐνες (π.χ., Σερουλοπλασµίνη, φεριτίνη, Λακτοφερίνη, τρανσφερίνη, µεταλλοθειονίνη, αιµογλοβίνη/µυογλοβίνη, οξειδάσεις κυτοχρωµάτων) Άλλα ( π.χ., σελήνιο, γλουταθείο, χαλκός, µαγγάνιο) Εξωγενή Βιταµίνη C Βιταµίνη Ε Βιταµίνη Α/καρωτινοειδή Φλαβονοειδή, Φυτοχηµικά και Ολιγοστοιχεία Η προκληθείσα από το οξειδωτικό στρες ζηµιά µετέπειτα ελαχιστοποιείται. Εντούτοις, µια ανεπάρκεια των αντιοξειδωτικών αµυνών ή µια υπερπαραγωγή ROS µπορεί να οδηγήσει σε µια επικίνδυνη δυσαναλογία στον οργανισµό και σε µία «κατάσταση οξειδωτικού στρες». Η ενδοκυτταρική αντιοξειδωτική ικανότητα αποδίδεται κυρίως στο ενζυµικό σύστηµα, ενώ αυτή του εξωκυτταρικού διαµερίσµατος αποτελείται συνήθως από τα αντιοξειδωτικά διαιτολογικής προέλευσης. Μέσα στη στρατηγική για να διατηρήσει την οξειδοαναγωγική ισορροπία ενάντια στις οξειδωτικές συνθήκες, το αίµα έχει έναν κεντρικό ρόλο επειδή µεταφέρει και ανακατανέµει τα αντιοξειδωτικά σε κάθε µέρος του σώµατος. Η αντιοξειδωτική κατάσταση του πλάσµατος είναι το αποτέλεσµα της αλληλεπίδρασης πολλών διαφορετικών ενώσεων και συστηµικών

5 µεταβολικών αλληλεπιδράσεων. Η συνεργασία µεταξύ των διαφορετικών αντιοξειδωτικών παρέχει µεγαλύτερη προστασία ενάντια στην επίθεση από τα ROS, από οποιαδήποτε ένωση που δρ α µόνη της. Τη ν αντιοξειδωτική ικανότητα του πλάσµατος αποτελούν κυρίως τα: υδροδιαλυτά αντιοξειδωτικά πρωτεΐνη/sh-group/albumin ( mmol/l) ουρικό ( mmol/l) ασκορβικό οξύ ( mmol/l) λιποδιαλυτά αντιοξειδωτικά τοκοφερόλες (20-50 mmol/l) καρωτινοειδή (0.5-3 mmol/l) οξύ Υπάρχει ένα ευρύ αντιοξειδωτικό δίκτυο συµπεριλαµβανοµένων των λιποδιαλυτών και υδροδιαλυτών αντιοξειδωτικών στο πλάσµα και οι δραστηριότητες αυτών εξαρτώνται από τον εντοπισµό των επιτιθέµενων ριζών. Οι σηµαντικότεροι συνεισφέροντες στις αντιοξειδωτικές ενέργειες, όπως αυτοί καθορίζονται µε τις συµβατικές µεθόδους που χρησιµοποιούν υδρόφιλες προσεγγίσεις, είναι οι πρωτεΐνες, το ουρικό οξύ και το ασκορβικό οξύ. Αυτές οι ενώσεις, που καταστρέφονται γρήγορα κατά τη διάρκεια της σάρωσης των ROS, πρέπει να αναπαραχθούν ή να αντικατασταθούν από νέες διαιτολογικά προερχόµενες ενώσεις ή/και από εξωγενή προϊόντα. Κατά συνέπεια η αντιοξειδωτική ικανότητα του πλάσµατος διαµορφώνεται είτε από την υπερφόρτωση µε ρίζες είτε από την πρόσληψη των διαιτολογικών αντιοξειδωτικών. Για αυτό το λόγο η αντιοξειδωτική ικανότητα του πλάσµατος µπορεί να θεωρηθεί ως πιο αντιπροσωπευτική της in vivo ισορροπίας µεταξύ των οξειδωτικών και αντιοξειδωτικών ενώσεων (γνωστών και άγνωστων, µετρήσιµων και µη µετρήσιµων) από ότι η συγκέντρωση ενός συγκεκριµένου µόνο αντιοξειδωτικού. Το οξειδωτικό στρες, δηλ. η παρουσία µιας σχετικής αύξησης των προ-οξειδωτικών στο εξωκυτταρικό υγρό, προκαλεί µια µείωση σε αυτές τις τιµές. Μελέτες σε διαβητικούς ασθενείς, ασθµατικούς, άτοµα µε καρδιαγγειακά προβλήµατα και πρόωρα µωρά, έχουν επιβεβαιώσει τη χρησιµότητα αυτής της µέτρησης σε ορισµένες κλινικές καταστάσεις και θεωρούµε ότι υπάρχουν πολλοί άλλοι ασθενείς στους οποίους µια γνώση της συνδυασµένης δραστηριότητας όλων των αντιοξειδωτικών θα βοηθούσε στην κλινική αξιολόγηση και φροντίδα. Σηµαντικοί παράγοντες που συνεισφέρουν στην αντιοξειδωτική δράση: Κύριες διατροφικές πηγές βιταµίνης C: φρούτα και λαχανικά. Ιδιαίτερα τα φρούτα και λαχανικά µε πορτοκαλί χρώµα και τα φρούτα µε κιτρικό οξύ όπως γκουάβα, ακτινίδιο, µάνγκο, γκρέϊπφρουτ, παπάγια, πεπόνι και καρπούζι, ανανάς, ταµαρίλιο, ντοµάτα, σταυρανθή λαχανικά (λάχανο, µπρόκολο, κουνουπίδι), πατάτες, πράσινη και κόκκινη πιπεριά, σπανάκι. Η βταµίνη C (ή ασκορβικό οξύ) αποτελεί ένα σηµαντικό αντιοξειδωτικό µε ιδιότητες διάσπασης δεσµών, που δρα απευθείας µε τις ρίζες υπεροξειδίου, υδροξυλίου και µε το οξυγόνο απλής κατάστασης. Επίσης αναγεννά την βιταµίνη E όταν η τελευταία έχει παγιδέψει µία ελεύθερη ρίζα ενώ διαθέτει και άλλες βιολογικές ιδιότητες όπως η δράση της στην βιοσύνθεση κατεχολαµίνης και καρνιτίνης ενώ αποτελεί και υπόστρωµα για το προκολλαγόνο την πρωτεΐνη που δίνει µορφή στα οστά, στους χόνδρους, στους µύες και στα αιµοφόρα αγγεία. Η βιταµίνη C συµβάλλει επίσης στην απορρόφηση σιδήρου και βοηθά στην διατήρηση των αγγείων, τον οστών και των δοντιών. Το Food and Nutrition Board of the Institute of Medicine, (Washington DC, National Academy Press, 2000) έχει δηµιουργήσει ένα σύστηµα διαιτολογικών τιµών αναφοράς για τον πληθυσµό στις ΗΠΑ. Με αυτές συµφωνούν και οι εκτιµήσεις της Ευρωπαικής Αρχής Ασφάλειας Τροφίµων ( και το Expert Group on Vitamins and Minerals του Ηνωµένου Βασιλείου ( Στον πίνακα παρακάτω παρουσιάζονται η συνιστώµ ενη ηµερήσια πρόσληψη (RDA) και οι ανώτερες ανεκτές τιµές (UL). Το RDA αποτελεί την ποσότητα που χρειάζεται για την διατήρηση µ ιας φυσιολογικής διατροφής στον γενικό πληθυσµό. Το UL αποτελεί το ανώτατο όριο της

6 ηµερήσιας πρόσληψης που δεν προκαλεί κινδύνους ή παρενέργειες σε κανένα σχεδόν άτοµο του γενικού πληθυσµού. Πίνακας. 1 1 Τα διαιτολογικά συµπληρώµατα της βιταµίνης E αναφέρονται συνήθως µε διεθνείς µονάδες (IU). Ένα mg συνθετικής βιταµίνης E ισοδυναµεί µε 1 IU βιταµίνης E. Ένα mg φυσικής βιταµίνης E παρέχει 1.5 IU. 2 Αυξήστε κατά 35mg για τους καπνιστές. Αλλαγές επίσης προτείνονται για εγκύους και/ή γυναίκες που θηλάζουν. Κύριες διατροφικές πηγές βιταµίνης E: οργανικός βλαστός σιταριού, δηµητριακά, έλαια λαχανικών και τα προϊόντα τους (π.χ. µαργαρίνη), σπόροι και φιστίκια, βούτυρο, κρόκος αυγού, γλυκοπατάτες, κάθαρµο, µάνγκο και λαχανικά µε πράσινα φύλα. Η βιταµίνη (ή α-τοκοφερόλη) αποτελεί το πιο διαθέσιµο και αποτελεσµατικό βιολογικό λιποδιαλυτό αντιοξειδωτικό στις κυτταρικές µεµβράνες, στους ιστούς και στις LDL. Αποτελεί επίσης ένα σηµαντικό αντιοξειδωτικό µε ιδιότητες διάσπασης δεσµών που αποτρέπει την οξείδωση παγιδεύοντας τις ελεύθερες ρίζες υπεροξειδίου. Συνήθως λειτουργεί αποτρέποντας την οξείδωση των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων και πρωτεϊνών κάτι το οποίο θεωρείται σηµαντικός προστατευτικός παράγοντας στην ανάπτυξη ασθενειών που σχετίζονται µε το οξειδωτικό στρες. Ο αντιοξειδωτικός µηχανισµός δράσης του περιλαµβάνει επίσης την σάρωση του οξυγόνου απλής κατάστασης και των ελεύθερων ριζών θειόλης. Η βιταµίνη E στα συµπληρώµατα διατροφής αναγράφεται ως οξική α-τοκοφερόλη µία µορφή που προστατεύει την ικανότητά της να λειτουργεί ως αντιοξειδωτικό. Η συνθετική µορφή της αναγράφεται ω ς D, L ενώ η φυσική της µορφή ως D. Η συνθετική της µορφή είναι το µισό ενεργή σε σχέση µε την φυσική της µορφή. Πέρα από τις αντιοξειδωτικές ιδιότητες παίζει ρόλο επίσης στον γενετικό καθορισµό, τον µεταβολισµό των µιτοχονδρίων, την κυτταρική διαφοροποίηση και την ρύθµιση του ανοσοποιητικού συστήµατος.

7 Πίνακας. 2 Συνιστώµενη ηµερήσια πρόσληψη (RDA) και ανώτερες ανεκτές τιµές (UL) για την βιταµίνη E. Οι τιµές RDA αναφέρονται ως mg/day των ισοδύναµων α-τοκοφερόλης (ATE) για να υπολογίσουν τις διαφορετικές βιολογικές δραστηριότητες των διαφορετικών µορφών βιταµίνης E. Σε γενικές γραµµές οι διεθνείς τιµές (IU) χρησιµοποιούνται σε ετικέτες τροφίµων και συµπληρωµάτων (1 mg ATE βιταµίνης E = 1.5 IU). Κύριες διατροφικές πηγές βιταµίνης A/καροτινοειδών: φρούτα/λαχανικά πορτοκαλί και κόκκινου/κίτρινου χρώµατος, σπανάκι και άλλα λαχανικά µε φύλλα, αρακάς, πιπεριές, µπρόκολα, ντοµάτες. Η βιταµίνη A αποτελεί τµήµα του αµυντικού φράγµατος του οργανισµού ενάντια στις ελεύθερες ρίζες. Αποτελεί µέρος των καροτινοειδών όπως και της β-καροτίνης και της λυκοπένης. Ο αντιοξειδωτικός µηχανισµός δράσης της περιλαµβάνει το σάρωµα του οξυγόνου απλής κατάστασης και των ελεύθερων ριζών θειόλης. Επίσης µπορεί να συνδέεται µε διαδικασίες που αφορούν τον γενετικό καθορισµό και την κυτταρική διαφοροποίηση.

8 Πίνακας. 3 Συνιστώµενη ηµερήσια πρόσληψη (RDA) και ανώτερες ανεκτές τιµές (UL) για την βιταµίνη A. Οι τιµές RDA αναφέρονται ως µικρογραµµάρια ισοδύναµων ρετινόλης (RAE) για να υπολογίσουν τις διαφορετικές βιολογικές δραστηριότητες των διαφορετικών µορφών ρετινόλης και προβιταµίνης A/ καροτινοειδών. Σε γενικές γραµµές οι διεθνείς τιµές (IU) χρησιµοποιούνται σε ετικέτες τροφίµων και συµπληρωµάτων (1 RAE = 3.3 IU). εν υπάρχουν τιµές RDA για την β-καροτίνη ή τα άλλα καροτινοειδή. Στις ΗΠΑ, το Institute of Medicine (IOM) αναφέρει ότι η κατανάλωση 3 µε 6 mg β-καροτίνης καθηµερινά (ισοδύναµο σε 833-1,667 IU βιταµίνης A) διατηρεί τα επίπεδα της β-καροτίνης στο αίµα σε ένα εύρος που συνδέεται µε χαµηλό κίνδυνο χρόνιων ασθενειών (Institute of Medicine. Food and Nutrition Board. National Academy press, Washington DC, 2001). Μέθοδοι µέτρησης της αντιοξειδωτικής ικανότητας στο πλάσµα Για την µέτρηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας έχουν αναπτυχθεί µία σειρά από µεθόδους. Παρόλα αυτά ένα µεγάλο ποσοστό της έρευνας έχει επικεντρωθεί στην αντιοξειδωτική ικανότητα στο υδάτινο τµήµα του πλάσµατος ή σε αποµονωµένα µέρη του όπως οι λιποπρωτεΐνες (LDL). Ενώ τα υδροδιαλυτά αντιοξειδωτικά όπως το ασκορβικό οξύ (βιταµίνη C), το ουρικό οξύ, οι πολυφαινόλες και οι πρωτεΐνες βρίσκονται στο υδρόφιλο τµήµα, τα λιποδιαλυτά αντιοξειδωτικά όπως τα καροτεινοειδή βρίσκονται στον πυρήνα των λιποπρωτεϊνών. Επιπροσθέτως η οδηγός οµάδα της α-τοκοφερόλης (βιταµίνη E) κατευθύνεται προς την επιφάνεια της µεµβράνης ενώ η ακραία αλυσίδα βρίσκεται µέσα στο λιπώδες τµήµα. Εποµένως µία ανάλυση για την µέτρηση της συνολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας στο πλάσµα θα πρέπει να λάβει υπόψιν: 1. την ετερογένεια του πλάσµατος που αποτελείται τόσο από υδρόφιλα όσο και από λιπόφιλα τµήµατα και περιέχουν υδροδιαλυτά και λιποδιαλυτά αντιοξειδωτικά και 2. την συνδυασµένη δράση και αλληλεπίδραση των αντιοξειδωτικών στο πλάσµα. Μέτρηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας Εκτός από την µέτρηση της δραστηριότητας ενός συγκεκριµένου αντιοξειδωτικού στο αίµα µπορεί να ελεγχθεί επίσης και το σύνολο των µη-ενζυµατικών αντιοξειδωτικών. Τα µηενζυµατικά αντιοξειδωτικά δηλαδή η αντιοξειδωτική ικανότητα, αποτελούν θεµελιώδη παράµετρο του αµυντικού δικτύου του οργανισµού. Καθώς η συνολική αντιοξειδωτική ικανότητα µπορεί να δώσει πιο σχετικές βιολογικές πληροφορίες από ότι η µέτρηση του κάθε

9 αντιοξειδωτικού ξεχωριστά, κρίνεται απαραίτητο να µετράται η συνολική αντιοξειδωτική ικανότητα του αίµατος όταν γίνεται αξιολόγηση της οξειδωτικής κατάστασης. Επιπροσθέτως ο προσδιορισµός του κάθε αντιοξειδωτικού ξεχωριστά απαιτεί διαφορετικές συσκευές και διαδικασίες ανάλυσης. Για την ανάλυση των επιµέρους αντιοξειδωτικών του πλάσµατος απαιτείται η εξαγωγή από το πλάσµα του στοιχείου που σας ενδιαφέρει. Εποµένως, οποιαδήποτε πληροφορία σχετικά µε πιθανές συνδυαστικές δράσεις των αντιοξειδωτικών µηχανισµών δεν γίνεται να προέλθει από αυτές τις αναλύσεις. Υπάρχουν δύο βασικές µέθοδοι για τον προσδιορισµό της αντιοξειδωτικής ικανότητας στο πλάσµα. Η πρώτη µέθοδος περιλαµβάνει την χρήση οξειδωτικών που δρουν ως προ-οξειδωτικά (παραγωγοί ριζών) και που ελέγχονται από ένα εξωγενή, που δύναται να οξειδωθεί καθετήρα. Η οξείδωση του καθετήρα θεωρητικά θα εµποδιστεί από την παρουσία των αντιοξειδωτικών στο πλάσµα κατά την διάρκεια της παραγωγής ριζών. Σε αυτή την κατηγορία µεθόδων περιλαµβάνονται: η µέθοδος ανάλυσης (TRAP) των Wayner et al (FEBS Lett 1985, 187:33-37), η µέθοδος ανάλυσης της ικανότητας απορρόφησης των ριζών οξυγόνου (ORAC) και οι µέθοδοι ανάλυσης που βασίζονται στο dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA), στην φυκοερυθρίνη (R-Pe), και στην κροκίνη. Η δεύτερη µέθοδος για την µέτρηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας στο πλάσµα είναι η αναχαίτιση µιας σταθερής και προ-σχηµατισµένης ρίζας που δεν δρα ως προ-οξειδωτικό. Σε αυτή την κατηγορία περιλαµβάνονται οι µέθοδοι ανάλυσης TEAC και FRAP και η διαδικασία κυκλικής βολταµετρίας. Τα αντιοξειδωτικά αποτελούν την απάντηση στο οξειδωτικό στρες. Τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί πολλές µέθοδοι ανάλυσης για τον προσδιορισµό της αντιοξειδωτική ικανότητα σε ουσίες όπως το πλάσµα, τα αφεψήµατα, τα λαχανικά και τα φρούτα. Μετά από παρεµβατικές έρευνες µε τσάι, φρούτα και λαχανικά ερευνήθηκε τόσο η αντιοξειδωτική δυνατότητα του πλάσµατος όσο και η αντιοξειδωτική δραστηριότητα των τροφών και αφεψηµάτων. Αυτές οι µέθοδοι µετρούν την ικανότητα για µείωση των προ-οξειδωτικών και χρησιµοποιούν διάφορες ρίζες ή ιόντα µετάλλου ως οξειδωτικά. Το FORD τεστ αποτελεί το πρώτο σετ µέτρησης στην αγορά που αποθηκεύεται σε θερµοκρασία δωµατίου και που περιέχει ένα λυοφιλιοποιηµένο χρωµογόνο που περιορίζει την ανάγκη πολύπλοκων χειρισµών από τον χρήστη και την επαφή του µε το χρωµογόνο. Μία γρήγορη και απλή µέθοδος ανάλυσης που µετρά την συνδυαστική δράση όλων των αντιοξειδωτικών αµυνών στο αίµα είναι χρήσιµη για την δηµιουργία ενός δείκτη ικανότητας του ατόµου να αντιστέκεται στις οξειδωτικές βλάβες. Το τεστ FORD της Callegari επιτρέπει την αξιολόγηση του αντιοξειδωτικού συστήµατος του οργανισµού το οποίο συµπεριλαµβάνει και τις βιολογικές παραµέτρους µε αντιοξειδωτικές ικανότητες. Αυτό έχει οφέλη στον: εντοπισµό ασθενών που κινδυνεύουν από ασθένειες και γήρανση εντοπισµό ασθενών µε κακή διατροφική κατάσταση προσδιορισµό των θεραπευτικών και αντιοξειδωτικών δυνατοτήτων των φαρµάκων προσδιορισµό της αντιοξειδωτικής ικανότητας των τροφών και τον εντοπισµό αυτών που θα είναι πιο χρήσιµο να χορηγούνται σε άτοµα µε έλλειψη σε αντιοξειδωτικά. FORT test Η αρχή µέτρησης του τεστ FORT Το τεστ FORT αποτελεί ένα χρωµατοµετρικό τεστ που στηρίζεται στην ικανότητα των µεταβατικών µετάλλων όπως ο σίδηρος, να καταλύουν την διάσπαση των υπεροξειδίων σε παράγωγες ρίζες σύµφωνα µε την αντίδραση του Fenton. Μόλις σχηµατιστούν στα κύτταρα τα

10 ROOH διατηρούν την χηµική δραστικότητά τους και οξειδωτική ικανότητα για να παράγουν αντίστοιχες ποσότητες ριζών αλκοξυλίου(ro ) και περοξυλίου (ROO ) (εικόνα. 5, αντιδράσεις A και B). Αυτές οι παράγωγες ρίζες κατόπιν παγιδεύονται επιλεκτικά από κατάλληλα ρυθµισµένο χρωµόγενο (ένα παράγωγο αµίνης, αντιδραστήριο R1 στο σετ FORT, CrNH2) και αναπτύσσουν σε µια γραµµική κινητικά βασισµένη αντίδραση στους 37 C, ένα έγχρωµο σχετικά µακρόβιο κατιόν ρίζας που φωτοµετρικά ανιχνεύσιµο (εικόνα. 5, αντίδραση C). Η ένταση του χρώµατος συσχετίζεται άµεσα µε την ποσότητα των ριζών, σύµφωνα µε τον νόµο του Lambert-Beer s και δύναται να συσχετισθεί µε την οξειδωτική κατάσταση του δείγµατος. Εικόνα 5. Αντιδράσεις που χαρακτηρίζουν το τεστ FORT σύµφωνα µε την χηµεία του Fenton. A. Σχηµατισµός ριζών αλκοξυλίου. B. Σχηµατισµός ριζών περοξυλίου. C. Σχηµατισµός χρωµατιστής χηµικής ένωσης. Επεξήγηση των αποτελεσµάτων του τεστ FORT Λαµβάνοντας υπόψιν την χηµική ετερογένεια των δευτερεουσών ριζών που προέρχονται από την σιδηρο-εξαρτώµενη διάσπαση των ROOH κατά την διάρκεια του τεστ FORT (RO καιroo), οι µετρήσεις της απορροφητικότητας µετατράπηκαν σε συµβατικές µονάδες µέτρησης που ονοµάζονται µονάδες FORT. Η µετατροπή των µονάδων γίνεται αυτόµατα από την συσκευή ούτως ώστε τα αποτελέσµατα να είναι ξεκάθαρα και η ερµηνεία τους πιο εύκολη για τους χειριστές. Προκειµένου να κάνουµε µια σωστή αξιολόγηση, τα αποτελέσµατα µπορούν να εκφραστούν επίσης και σε ισοδύναµα συγκέντρωσης H 2 O 2 ως υδροϋπεροξείδιο αναφοράς. Μία µονάδα FORT αντιστοιχεί σε περίπου 7.6 mmol/l που ισοδυναµούν σε 0.26 mg/l H 2 O 2. Όσο υψηλότερο το αποτέλεσµα τόσο υψηλότερο και το επίπεδο του οξειδωτικού στρες. Για να ερµηνεύσει καλύτερα τα αποτελέσµατα και να καταγράψει σηµαντικές αλλαγές, ο χρήστης θα πρέπει να ελέγχει τις τιµές που µετρήθηκαν σε σύγκριση µε τις τιµές αναφοράς του κάθε εξεταζόµενου. Φ υσιολογικές τιµές: έως 310 µονάδες FORT. Αξιοπιστία µεθόδου Γραµµικότητα: Η γραµµικότητα του συστήµατος του τεστ FORT έχει ελεγχθεί µε δύο διαφορετικές µεθόδους (LOF τεστ και Mandel τεστ). Και µε τα δύο η γραµµικότητα ήταν στατιστικά σηµαντική. Εύρος γραµµικότητας: µονάδες FOR. Αξιοπιστία: συντελεστής µεταβλητότητας intra-assay, CV<5% δηλαδή περίπου 350 µονάδες FORT (N=40). Εγκυρότη τα: συντελεστής µεταβλητότητας intra-assay, CV<5% δηλαδή περίπου 350 FORT (N=20). Ευαισθησία: S = , η ευαισθησία (S) ορίζεται ως: S = Abs/ C; Abs=απορροφητικότητα, C=συγκέντρωση. Ακρίβεια: Το BIAS για το τεστ FORT προσδιορίστηκε αναλύοντας µία σειρά διαλυµάτων H 2 O 2 σε νερό. Για κάθε επίπεδο συγκέντρωσης (C) πραγµατοποιήθηκαν δέκα µετρήσεις. Το

11 προβλεπόµενο BIAS υπολογίστηκε ως: [(αναµενόµενο C µετρηµένο C)/ µετρηµένο C] x 100. BIAS<4% για 1.43 mm H 2 O 2 C 4.23 mm H 2 O 2. C=1.214 mm H 2 O 2 BIAS<12% for C 4.74 mm H 2 O 2. Παρεµβολές: η χρήση οποιουδήποτε παράγοντα χειλικού σιδήρου (π.χ., EDTA, κιτρικό άλας, δεσφεριοξαµίνη), εξωγενούς υδροπεροξειδίου και/ή αντιοξειδωτικών πηγών (π.χ., H2O2, βενζοϊκό υπεροξείδιο, BHT, BHA, ασκορβικό οξύ), ανώµαλες τιµές αιµατοκρίτη και αιµολυτικά δείγµατα αιµόλυσης (όταν το τεστ πραγµατοποιείται σε αίµα). είγµα: 20µl αίµατος. Προσαρµόζεται για αίµα ή για πλάσµα. Τεστ FORD Η αρχή µέτρησης του τεστ FORD Το FORD αποτελεί ένα χρωµατοµετρικό τεστ που βασίζεται στην ικανότητα των αντιοξειδωτικών που βρίσκονται στο πλάσµα να «µειώνουν» ένα προακαθορισµένο κατιόν ρίζας. Ένα σταθερό και έγχρωµο κατιόν (φωτοµετρικά ανιχνεύσιµο στα 505 nm) σχηµατίζεται µε παρουσία ενός όξινου διαλύµατος (ph=5.2) και ενός κατάλληλου οξειδωτικού (FeCl 3 ). Τα αντιοξειδωτικά συστατικά που είναι παρόντα στο προς ανάλυση δείγµα «µειώνουν» το κατιόν της ρίζας του χρωµόγενου εξασθενίζοντας το χρώµα του και προκαλώντας αποχρωµατισµό του διαλύµατος που είναι ανάλογος της συγκέντρωσής τους στο δείγµα. Το φάσµα UV του κατιόντος της ρίζας του χρωµόγενου του τεστ FORD που παρουσιάζεται στο γράφηµα 1, δείχνει µία µέγιστη απορροφητικότητα στα 505nm. Στο γράφηµα 2 παρουσιάζεται η χρονική πορεία του σχηµατισµού της ρίζας του χρωµόγενου FORD που επιτυγχάνεται µε το οξειδωτικό διάλυµα FeCl 3. Ένα επίπεδο απορροφητικότητας µεταξύ 0.80 και 1.00 επιτυγχάνεται µετά από 3-4 λεπτά όταν σχηµατίζεται ένα σταθερό έγχρωµο διάλυµα. Αυτό εξασφαλίζει µία µέτρηση βάσει του βαθµού «αναγωγής» της ρίζας σε ένα συγκεκριµένο χρονικό σηµείο 4 λεπτών και όχι βάσει του ρυθµού «αναγωγής». Αυτό το χαρακτηριστικό αποκλείει τυχόν περιπλοκές που οφείλονται στον έλεγχο της χρονικής πορείας αναστολής του χρώµατος που συµβαίνει σε άλλες µεθόδους όπως στις αναλύσεις που

12 βασίζονται στην κροκί νη (J Org Chem 1993, 58: , JAOCS 1996, 73: ) και στην ABTS(Free Radical Res 1997, 26: ). Η απόσβεση του χρώµατος προσδιορίζεται από τη συµβολή αντιοξειδωτικών όπως οι πρωτεΐνες (αλµπουµίνη), ανηγµένη (reduced) γλουταθιόνη, βιταµίνη C, Trolox (υδατοδιαλυτό ανάλογο της βιταµίνης E). Αυτά τα αντιοξειδωτικά (µαζί µε το ουρικό οξύ που δεν είναι ανιχνεύσιµο από το τεστ FORD) συντελούν σε σηµαντικό βαθµό στο αντιοξειωτικό φράγµα του πλάσµατος. Τα αποτελέσµατα του τεστ FORD προκύπτουν από την ικανότητα των αντιοξειδωτικών του πλάσµατος να σταµατούν την ρίζα του χρωµόγενου σε σχέση µε το Trolox. Όπως και σε πολλές άλλες µεθόδους τα αποτελέσµατα εκφράζονται σε ισοδύναµα Trolox (mmol/l). Η καµπύλη βαθµονόµησης δηµιουργείται χρησιµοποιώντας ένα συγκεκριµένο διάλυµα Trolox και κατόπιν αποθηκεύεται στην συσκευή. Επεξήγηση των αποτελεσµάτων του τεστ FORD Μία µελέτη συσχέτισης έχει πραγµατοποιηθεί µεταξύ των τεστ FORD και TAS (Randox test) και έχει βρεθεί σηµαντική συσχέτιση µεταξύ των δύο µεθόδων. Φυσιολογικές τιµές: Σύµφωνα µε ένα προκαταρκτικό δείγµα 1 έως 70 δοτών αίµατος (αναλογία ανδρών/γυναικών 37/33, ηλικία έτη, µέση ηλικία 36 έτη) και τις τιµές της βιβλιογραφίας έως τώρα, οι τιµές αναφοράς του τεστ FORD υπολογίστηκε ότι κυµαίνονται µεταξύ mmol/l Trolox (µέση τιµή = 1.23 mmol/l Trolox). Απόδοση της µεθόδου Γραµµικότητα: Η γραµµικότητα του τεστ FORD εξετάστηκε χρησιµοποιώντας διάλυµα Trolox ως στάνταρντ χηµικό αντιοξειδωτικό. Τα τεστ πραγµατοποιήθηκαν σε ένα µεγάλο φάσµα συγκεντρώσεων από επακόλουθα διαλύµατα µετρώντας τις αντίστοιχες αυξήσεις στο FORD. Η γραµµικότητα επιβεβαιώθηκε στατιστικά εφαρµόζοντας το τεστ του Mendel. Εύρος γραµµικότητας: mmol/l Trolox. Όρια ανίχνευσης (yd): Το όριο ανίχνευσης προσδιορίστηκε µετρώντας το τεστ FORD µε κενό (blank) δείγµα (νερό). Πραγµατοποιήθηκαν δέκα επαναλαµβανόµενες µετρήσεις. yd = 0.16 mm Trolox. Το όριο ανίχνευσης υπολογίστηκε ως εξής: yd = µblank + 2* t (0.05; 9) * sblank Όπου: µblank = µέσος όρος µέτρησης κενού (blank), sblank = σταθερή απόκλιση µέτρησης κενού (blank), t (0.05; 9) = τιµή t για α = 0.05 και βαθµοί ελευθερίας = 9

13 Ευαισθησία: S = , η ευαισθησία (S) ορίζεται ως: S = Abs/ C, Abs=απορροφητικότητα, C=συγκέντρωση. Ακρίβεια: το BIAS του τεστ FORD προσδιορίστηκε αναλύοντας µία σειρά από διαλύµατα Trolox σε νερό (συνολικά 11 διαφορετικά επίπεδα συγκεντρώσεων). Πραγµατοποιήθηκαν δέκα επαναλαµβανόµενες µετρήσεις για κάθε επίπεδο συγκέντρωσης (C). Το προβλεπόµενο BIAS υπολογίστηκε ως: [(C αναµενόµενο C µετρηµένο)/ C µετρηµένο] x 100. BIAS<8% για 0.5 mm Trolox C 3 mm Trolox C=0.25 mm Trolox. Αξιοπιστία και ακρίβεια: Τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις Trolox (2.5, 1.25 και 0.25 mm) αναλύθηκαν 10 φορές µε την ίδια σειρά προκειµένου να προσδιοριστεί ο συντελεστής µεταβλητότητας της ανάλυσης (CV). Βρέθηκε συντελεστής µεταβλητότητας CV < 5%. Επιπροσθέτως, η αξιοπιστία και η ακρίβεια προσδιορίστηκαν ελέγχοντας αίµα τριχοειδούς αγγείου. Το τεστ FORD πραγµατοποιήθηκε χρησιµοποιώντας δύο διαφορετικές συσκευές και ένα επίπεδο συγκέντρωσης στα 1.25 mm Trolox. Πραγµατοποιήθηκαν 20 επαναλαµβανόµενες µετρήσεις για κάθε συσκευή την ίδια ηµέρα. Αξιοπιστία (N=20): CV < 5%. Ακρίβεια (N=40): CV < 5%. Παρεµβολές: η χρήση οποιουδήποτε παράγοντα χειλικού σιδήρου (π.χ., EDTA, κιτρικό άλας, δεσφεριοξαµίνη), εξωγενούς υδροπεροξειδίου και/ή αντιοξειδωτικών πηγών (π.χ., H 2 O 2, βενζοϊκό υπεροξείδιο, BHT, BHA, ασκορβικό οξύ), ανώµαλες τιµές αιµατοκρίτη και αιµολυτικά δείγµατα αιµόλυσης (όταν το τεστ πραγµατοποιείται σε αίµα). είγµα: 50µl αίµατος. Βιβλιογραφία 1. Relationship between Oxidative Stress parameters and Atherosclerotic Carotid plaque. Riccioni G, Sblendorio V, Mancini B, Paolino I, Palumbo N, Guerra PA, Palmieri B. World Conference of Stress August, Budapest, Hungary, Oxidative status in Chronic Liver Disease. Sblendorio V, Palmieri B, Tesini EMC; Vandelli C. World Conference of Stress August, Budapest, Hungary, Menopause and Oxidative Stress: Effect of methyltetrahydrofolate Supplementation. Sblendorio V, Cannoletta M, Palmieri B, Cagnacci A. World Conference of Stress August, Budapest, Hungary, FORT and FORD two novel assays for the assessment of oxidative stress in patients with thalassemia intermedia and sickle cell disease. Papastamataki M, Apostolakou F, Lazaropulou C, Matsiouri C, Ladis V, Kanavakis E, Kattamis A. 12th Congress of the European Hematology Association (EHA), Neue Messe Vienna, Austria, June 7-10, A quantitative evaluation of the PEFS treatment by Thermotone Plus and oxidative stress level measurement. E. Raposio, I. Baldelli, P. Barabino, E. Canini, F. Ugolini, A. Caielli, C. Porzio, P.L. Santi, U.O. 2th International Congress of Preventive Medicine and Healthy Aging, Milan, April, Oxidative stress detection: what for? Part I. Palmieri B, Sblendorio V. Eur Rev Med Pharmacol Sci 10(6): , The FORD assay: a preliminary study. Torri C. Callegari SpA, 2006.

14 8. Changes of Reactive Oxygen Species (ROS) in Infants after Supplementary Surfactant. Parmigiani S. J Perinat Med 34 (Suppl. I) Advances in Perinatal Medicine 5th, The FORT test: Reply to dr Harma and colleagues. Abramson JL. The FORT test: A novel oxidative stress marker or a well-known measure of ceruloplasmin oxidase activity? Harma MI. Atherosclerosis 187: , A phase II study with antioxidants, both in the diet and supplemented, pharmaconutritional support, progestagen, and anti-cyclooxygenase-2 showing efficacy and safety in patients with cancer-related anorexia/cachexia and oxidative stress. Mantovani G, Macciò A, Madeddu C, Gramignano G, Lusso MR, Serpe R, Massa E, Astara G, and Deiana L. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 15(5): , Efficacy of L-carnitine administration on fatigue, nutritional status, oxidative stress, and related quality of life in 12 advanced cancer patients undergoing anticancer therapy. Gramignano G, Lusso MR, Madeddu C, Massa E, Serpe R, Deiana L, Laconica G, Dessì M, Spiga C, Astara G, Macciò A, and Mantovani G. Nutrition 22: , Hemoglobin levels correlate with interleukin-6 levels in patients with advanced untreated epithelial ovarian cancer: role of inflammation in cancer-related anemia. Macciò A, Madeddu C, Massa D, Mudu MC, Lusso MR, Gramignano G, Serpe R, Melis CB and Mantovani G. Blood 106 (1): , C-Reactive protein versus reactive oxygen species in infants. Parmigiani S and Bevilacqua G. J Perinat Med 33 (Suppl 1), Association between novel oxidative stress markers and C-reactive protein among adults without clinical coronary heart disease. Abramson JL, Hooper WC, Jones DP, Ashfaq S, Rhodes SD, Weintraub WS, Harrison DG, Quyyumi AA, Vaccarino V. Atherosclerosis 178: , Reactive oxygen species (ROS) after surfactant administration in premature infants. Parmigiani S and Bevilacqua G. 20th International Workshop on Surfactant Replacement, Belfast, 2-5 June, Oxidative Stress and Quantum Therapies. Zabala BE, Flichman JC. Quant Med Assoc, 33-35, Hyperacusis treatment with a combination of Laser therapy, Pulsed Electromagnetic Therapy and Reactive Oxygen Specimen Control. PA Mikael Backman, ALIR Forlag, Field 18. Cancer related anorexia/cachexia (CACS) and oxidative stress: an innovative approach beyond current treatment. Mantovani G, Madeddu C, Macciò A, Gramignano G, Lusso MR, Massa E, Astara G, Serpe R. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 13: , Confronto fra due metodi di misura dei lipidi-idroperossidi nel plasma. Giovannini F, Masini A, Torri C, Trenti T. Biochimica Clinica, 28 (1): p.200, 36 Congresso Nazionale SIBioC, Kvicksilver i Sweden, amalgamfyllningar en oacceptabel halsorisk. Magnus N. Medikament 5-04, 21. Hydroperoxides in venous blood: a comparison between two photometric methods. Dossett A and Arends J. Klinik für Tumorbiologie an der Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg.

15 22. Subcutaneous interleukin-2 in combination with medroxyprogesterone acetate and antioxidants in advanced cancer responders to previous chemotherapy: phase II study evaluating clinical, quality of life, and laboratory parameters. Mantovani G, Madeddu C, Gramignano G, Lusso MR, Mocci M, Massa E, Ferreli L, Astara G, Macciò A, and Serpe R. J Exp Ther Oncol 3: , Normal Values and Reproducibility of the Major Oxidative Stress obtained thanks to FORM System. Dal Negro R W, Visconti M, Micheletto C, Pomari C, Squaranti M, Turati C, Trevisan F, Tognella S. GIMT, Italian Journal of Chest Diseases, 57 (3): , Oxidative Stress, Human Diseases and Biomarkers. Torri C. Clinical Laboratory International, 27(5): 28-29, Innovatives Testsystem kann oxidativen stress messen. Naturamed 18 (4): Determination of Reactive Oxygen Species:Evaluation of a Simple Colorimetric Method. Parmigiani S, Grassi L, Solari E, Torri C, Bacchi-Modena A, Bevilacqua G. J Perinat Med 31 (Suppl 1): pp-264, 6th World Congress of Perinatal Medecine, Blood measures of oxidative stress assessed in capillary blood: range of measures in normals and asymptomatic current smokers. M. Visconti, C. Micheletto, S. Tognella, F. Trevisan, C. Pomari, RW. Dal Negro. European Respiratory Journal 22 (Suppl 45): pp. 83S, 13th ERS Annual Congress, Effects of montelukast 10 mg OD or placebo on blood ROS levels in current smokers: a controlled, randomised, double blind-study. RW. Dal Negro, C. Micheletto, M. Visconti. European Respiratory Journal 22 (Suppl 45): pp. 101S, 13th ERS Annual Congress, Radicales Oxidativos Libres. Flichman JC, Adelardi V, Erijman M. Pren Mèd Argent, 90: , Comparison between two Different Methods of Lipid Peroxidation Determination. Masini A., Giovannini F. Dept. Biomedical Sciences, Sect. Pathology, University of Modena and Reggio Emilia, Italy, Oxidativer Stress ausgefeilte Technik macht Messung moglich. Der Neue Apotheker, Juli, Indicatori Bed-side dello Stress Ossidativo. C. Micheletto, M. Visconti. UO Pneumologia, Ospedale Orlandi, Bussolengo, VR. Proceedings of the 6 ACCP Meeting (American College of Chest Physicians, Capitolo Italiano), Asma Bronchiale e BPCO: Obiettivi Rimedi Strategie, Gennaio, Palazzo della Gran Guardia, Verona, Italy, Variabilità, Ripetibilità e Valori di Normalità delle Misure di Stress Ossidativo determinate mediante Form System. Visconti M, Micheletto C, Dal Negro RW. UO Pneumologia, Ospedale Orlandi, Bussolengo, VR. Proceedings from 6 ACCP Meeting (American College of Chest Physicians, Capitolo Italiano), Asma Bronchiale e BPCO: Obiettivi Rimedi Strategie, Gennaio, Palazzo della Gran Guardia, Verona, Italy, Linearity Study, Bonaretti P, Callegari SpA, The Form System: an EPR Analysis, Callegari SpA, Oxygen Free Radicals Measurement in Capillary Blood in Healthy Subjects, Smokers and COPD Patients. Verduri A, Del Donno M, Chetta A, Olivieri D. Dip. Malattie Respiratorie,

16 Università degli Studi di Parma. Proceeding from 98th International Conference, American Thoracic Society, May 17-22, Atlanta, Georgia, USA, Einfache, schnelle Messung der freien Radikale. Deutsche Apotheker Zeitung 142 Jahrgang; 22: Oxidativer Stress Radikalassoiierte Erkrankungen: Belastung mit freien Radikalen ermitteln. Symposium MEDICAL 8: Oxidativer Stress Neues Testgerät ermöglicht gezielte Patientenberatung. PharmaRundschau 7-8: Oxidativer Stress endlich ohne groben Aufwand messbar! Döll M. HealthCare, Ausgabe, 1: Form and Parkinson s Disease. Agnati L.F. and Leo G. Sect. of Physiology, Dept. of Biochemical Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, Italy, Form and Obesity. Agnati L.F. and Leo G. Sect. of Physiology, Dept. of Biochemical Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, Italy, Form System Application on Healthy and Phlebopathic Subjects. Tomasi A. Sect. of Pathology, Dept. of Biochemical Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, Italy, Report on the Efficiency and Reliability of the FORM System. Jori G. Dept. of Biology, University of Padova, Italy, 2002.