In vitro ωρίμανση ωαρίων. Μποτζάκη Μητροδώρα

Transcript

1 ΔΗΜΟΚΡΙΤΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΡΑΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΑΝΘΡΩΠΙΝΗ ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗ» In vitro ωρίμανση ωαρίων Μποτζάκη Μητροδώρα ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Βύρων Ασημακόπουλος- Αναπληρωτής Καθηγητής ΔΠΘ (επιβλέπων), Χατζημελετίου Αικατερίνη- Επίκουρος Καθηγήτρια ΑΠΘ, Σταυρούλα Βελετζά- Καθηγήτρια ΔΠΘ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΥΠΟΛΗ 2016

2 Η in vitro ωρίμανση ωαρίων είναι μια τεχνολογία υποβοηθούμενης αναπαραγωγής στην οποία ανώριμα ωάρια ανακτώνται από ωοθυλάκια μη διεγερμένων ή ελάχιστα διεγερμένων ωοθηκών και στη συνέχεια, ωριμάζουν σε εργαστηριακές συνθήκες. Η νέα αυτή τεχνολογία έχει αναδειχθεί ως μια πολλά υποσχόμενη διαδικασία με πλεονεκτήματα έναντι στην ελεγχόμενη διέγερση των ωοθηκών, όπως η μείωση του κόστους, η απλότητα και η εξάλειψη του συνδρόμου υπερδιέγερσης των ωοθηκών. Με την εξάλειψη ή τη μείωση της διέγερσης με γοναδοτροπίνες η IVM προσφέρει σε επιλεγμένες ομάδες υπογόνιμων ζευγαριών μια ασφαλή και βολική μορφή θεραπείας ενώ τα αποτελέσματα της είναι σήμερα συγκρίσιμα με ασφάλεια και αποτελεσματικότητα με εκείνες των συμβατικών in vitro γονιμοποίηση θεραπειών. Η IVM έχει εφαρμοστεί κυρίως σε ασθενείς με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών ή σε ασθενείς με πολυκυστικές ωοθήκες αλλά με το χρόνο, οι ενδείξεις για IVM έχουν επεκταθεί και σε άλλες ασυνήθιστες καταστάσεις, όπως η διατήρηση της γονιμότητας, καθώς και σε κανονική ανταπόκριση. Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετώνται και περιγράφονται όλα τα παραπάνω. Λέξεις κλειδιά: IVM, ωρίμανση ωαρίων,ivf,ανώριμα ωάρια, υπογονιμότητα H in vitro maturation (IVM) is an assisted reproductive technology in which the oocytes are recovered from follicles of unstimulated or minimally stimulated ovaries. This new technology has emerged as a promising process with advantages over the controlled ovarian stimulation, such as cost reduction, simplicity and elimination of ovarian hyperstimulation syndrome. By eliminating or reducing stimulation with gonadotropins, the IVM offers to selected groups of infertile couples a safe and convenient form of treatment and the results are now comparable with safety and efficacy to those of conventional in vitro fertilization treatments. IVM is mainly applied to patients with polycystic ovary syndrome or polycystic ovaries, but over time IVM has been extended to other unusual situations, such as the preservation of fertility and in regular patients. This thesis is going to study and describe all the above. Key words: In vitro maturation, IVM, in vitro fertilization, IVF, immature oocytes, assisted reproductive technologies, GV oocytes, PCOs

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1.Εισαγωγή 1 2.Ορισμός IVM: Δεδομένα και Αντιπαραθέσεις IVM: Ιστορική αναδρομή και πρώτες έρευνες Φυσιολογία-Ωρίμανση ωαρίων Πυρηνική ωρίμανση ωαρίων Κυτταροπλασματική Ωρίμανση ωαρίων Maturation Promoting Factor (MPF) Τεχνικές ωρίμανσης ωαρίων 14 5.Ενδείξεις για IVM IVM για τη διατήρηση της γονιμότητας RESCUE IVΜ Παρακολούθηση κύκλου IVM και προγνωστικοί παράγοντες 20 7.Κλινικά σχήματα στην IVM Εργαστηριακές πτυχές της IVM Ωοληψία IVM Καλλιεργητικά μέσα Περιβάλλον Εμφύτευσης και Εμβρυομεταφορά μετά από IVM Αποτελέσματα μετά από IVM Οι προσπάθειες για τη βελτίωση των αποτελεσμάτων IVM Αποτελέσματα Βιβλιογραφία 34

4 1.Εισαγωγή Από το 1978 (Steptoe and Edwards, 1978), που ανακοινώθηκε η πρώτη γέννηση υγιούς παιδιού μετά από in vitro γονιμοποίηση (IVF) έχει σημειωθεί τεράστια πρόοδος στις τεχνικές της υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Η διαρκής προσπάθεια των επιστημονικών ομάδων τελειοποίησης των τεχνικών εξωσωματικής γονιμοποίησης με σκοπό την μεγιστοποίηση πιθανότητας επιτυχίας και με το μικρότερο δυνατό κόστος οδήγησε και συνεχίζει να οδηγεί στην εμφάνιση νέων τεχνολογιών και μεθόδων υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Η ωρίμανση των ωαρίων είναι μία μακρά και σύνθετη διαδικασία, όπου συμβαίνουν πολλές διεργασίες τόσο στον πυρήνα όσο και στο κυτταρόπλασμα του ωαρίου. Τα τελευταία χρόνια έχουν γίνει πολλές προσπάθειες με σκοπό την ωρίμανση ωαρίων in vitro. Από την εισαγωγή της στη δεκαετία του 1990 η in vitro ωρίμανση (IVM) έχει αναδειχθεί ως μια ελκυστική θεραπεία υπογονιμότητας καθώς αποτελεί μια τεχνική η οποία φέρει σημαντικό πλεονέκτημα έναντι στην κλασική εξωσωματική γονιμοποίηση αφού εξαλείφεται η ανάγκη χορήγησης ορμονικών - διεγερτικών φαρμάκων στην γυναίκα που υπόκειται σε θεραπεία υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Αν και οι πρώτες γεννήσεις παιδιών μετά από IVF προήλθαν από κύκλους χωρίς πρόκληση πολλαπλής ωοθυλακιορρηξίας, τα σύγχρονα πρωτόκολλα εξωσωματικής γονιμοποίησης χρησιμοποιούν γοναδοτροπίνες με σκοπό τη διέγερση των ωοθηκών και την παραγωγή πολλαπλών ωρίμων ωοθυλακίων, αφού τα ποσοστά κυήσεων σχετίζονται με τον αριθμό των εμβρύων καλής ποιότητας που προορίζονται για εμβρυομεταφορά. Όμως, κάποιες από τις γυναίκες στις οποίες χορηγούνται γοναδοτροπίνες, παρουσιάζουν αυξημένο κίνδυνο να εκδηλώσουν το σύνδρομο υπερδιέγερσης των ωοθηκών (OHSS) (Beerendonk et al, 1998). Επιπλέον, το υψηλό κόστος των φαρμακευτικών σχημάτων που χρησιμοποιούνται στα πρωτόκολλα IVF και οι γενικές ανεπιθύμητες ενέργειες των φαρμάκων, έκανε επιτακτική την ανάγκη αναζήτησης άλλων τεχνικών. Οι πρώτες προσπάθειες με τη χρήση IVM ωαρίων που συλλέγονται από μη διεγερμένες ωοθήκες χρονολογείται από τις αρχές της δεκαετίας του 1990 αλλά η συστηματική ανάπτυξη της IVM συνέβη μόνο κατά το δεύτερο ήμισυ της δεκαετίας. Η αρχική εμπειρία με IVM απέδωσε περιορισμένη επιτυχία, αλλά σημαντική πρόοδος σε πρωτόκολλα και βελτιώσεις στις μεθόδους ωρίμανσης IVM, καθώς και σε μέσα καλλιέργειας έχουν οδηγήσει σε ικανοποιητικά ποσοστά εγκυμοσύνης σε κατάλληλα 1

5 επιλεγμένες ομάδες ασθενών (Blondin et al.,2002, Barnes et Sirard, 2000). Η IVM είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για τις γυναίκες με πολυκυστικές ωοθήκες (PCO), οι οποίες διατρέχουν κίνδυνο εμφάνισης του συνδρόμου υπερδιέγερσης των ωοθηκών (OHSS). Ωστόσο, με το χρόνο, οι ενδείξεις για IVM έχουν επεκταθεί εντυπωσιακά και περιλαμβάνουν ασθενείς με φυσιολογική ή κακή ανταπόκριση και τη διατήρηση της γονιμότητας καθώς έχει προταθεί ως η μέθοδος εκλογής για ασθενείς που υποβάλλονται σε αντικαρκινική θεραπεία, ιδιαίτερα για τις γυναίκες που απαιτούν ταχεία διατήρηση της γονιμότητας ή αντιμετωπίζουν τον κίνδυνο του καρκίνου ευαίσθητου σε οιστρογόνα (Oktay et al.,2010, Fadini et al.,2012). Ωστόσο, παρά τα πλεονεκτήματα αυτά, ο ρυθμός ωρίμανσης και οι αναπτυξιακές δυνατότητες των εμβρύων που προέρχονται από IVM ωάρια είναι σημαντικά χαμηλότερες από εκείνες των ωαρίων που έχουν ωριμάσει in vivo. Επιπλέον, τα ποσοστά εγκυμοσύνης με IVM είναι χαμηλά σε σχέση με την εξωσωματική γονιμοποίηση. Όλα τα παραπάνω περιγράφουν μια μέθοδο με εξαιρετικό ενδιαφέρον σαν κλινικό πρωτόκολλο και η περαιτέρω μελέτη της αποτελεί πρόκληση. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι να περιγράψει την μέθοδο αυτή, να παρουσιάσει τις τεχνικές που χρησιμοποιούνται στην in vitro ωρίμανση ωαρίων, να παρουσιάσει τα πιο σύγχρονα δεδομένα στον τομέα της έρευνας και της κλινικής της εφαρμογής, τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα της και να την συγκρίνει με την κλασική εξωσωματική γονιμοποίηση. 2.Ορισμός IVM: Δεδομένα και Αντιπαραθέσεις Ωρίμανση ωαρίων στην εξωσωματική (IVM) επί του παρόντος ορίζεται ως εξής: Η ωρίμανση in vitro του ανώριμου συμπλέγματος ωαρίου-κοκκωδών κυττάρων που λαμβάνονται από τα ωοθυλάκια με άντρο. (εικόνα 1A). Αυτή η έννοια της IVM αρχικά περιγράφεται από τους Pincus και Enzmann (1935) και ορίζεται από τον Edwards πριν από 50 περίπου χρόνια (Edwards, 1962), και όπως αξιολογήθηκε πρόσφατα (Thompson et Gilchrist, 20I3) Αν και η πρώτη περιγραφή της IVM πριν από περίπου μισό αιώνα χρησιμοποιούσε ανώριμα ωάρια από μη διεγερμένες ωοθήκες, η χρήση γοναδοτροπινών όπως FSH ή FSH αναλόγων σε μοντέλα ζώων για IVM ξεκίνησε από πολύ πρώιμα στάδια (Cross 2

6 και Brinster, 1970). Το πρωτόκολλο αυτό έχει γίνει ευρέως αποδεκτό καθώς ταιριάζει και με τον ορισμό που έδωσε ο Edwards για την μέθοδο IVM καθώς διέγερση με FSH οδηγεί στην παραγωγή μεγαλύτερου αριθμού ανώριμων ωαρίων (germinal vesicle (GV)-stage) τα οποία έχουν την ικανότητα να ολοκληρώσουν την μείωση τους in vitro. Ως εκ τούτου, ο ισχύων ορισμός του IVM (δείτε ανωτέρω) αφορά την πυρηνική ανωριμότητα του ωαρίου κατά την έναρξη της διαδικασίας IVM, και είναι ευρέως αποδεκτό από τους επιστήμονες και κλινικούς ιατρούς καθώς μπορεί να περιλαμβάνει μια ήπια διέγερση με γοναδοτροπίνες (FSH) τόσο για μοντέλα ζώων όσο και ασθενών που σκοπίμως δημιουργεί ικανοποιητικό αριθμό ανώριμων ωαρίων (εικόνα 1A). (De Vos et al., 2016) Διαγραμματική αναπαράσταση του ορισμού της IVM και παραλλαγές αυτού. Χρησιμοποιώντας τον υπάρχοντα ορισμό της IVM (Α), οι ασθενείς/ζώα είναι μη διεγερμένες ή τους χορηγείται FSH για αρκετές ημέρες, προκαλώντας την παραγωγή ανώριμων ωαρίων (GV) - συμπλέγματα κοκκωδών κυττάρων--ωαρίων (COCs) μετά την ωοληψία (OPU), που ωριμάζουν ως άθικτα COCs μέχρι την μετάφαση II(MII). Καλλιέργεια in vitro απογυμνωμένων GV ωαρίων από διεγερμένους κύκλους εξωσωματικής γονιμοποίηση σε ασθενείς δεν θεωρείται IVM.(Β) truncated (περικομμένο) IVF πρωτόκολλο: Μικρή διέγερση των ασθενών με FSH και ενεργοποίηση με hcg ή GnRH αγωνιστή. Εάν παραλειφθεί η διέγερση με FSH, τότε αυτή η παραλλαγή ονομάζεται «Truncated IVF without FSH» Σε μια πραγματική προσπάθεια για τη βελτίωση των κλινικών αποτελεσμάτων η ομάδες των Tan SL. and Chian RC. αποφάσισαν να ενισχύσουν την πυρηνική ωρίμανση αυτών των ωαρίων χορηγώντας IU hcg ώρες πριν την ωοληψία (Chian et al., 1999).Η προσέγγιση αυτή αναλήφθηκε χωρίς προηγούμενη έρευνα σε μοντέλα ζώων. Σε αντίθεση με προηγούμενες πεποιθήσεις ότι τα μικρά ωοθυλάκια δεν θα ανταποκριθούν σε ερέθισμα LH, παρατήρησαν ότι ένα μικρό ποσοστό του συμπλέγματος κοκκωδών κύτταρων (COCs) είχε υποστεί διεύρυνση των κοκκωδών κυττάρων τους και κάποια GV ωάρια ξεκίνησαν την διάλυση της πυρηνικής τους μεμβράνης (GVBD), προχώρησαν στο στάδιο της μετάφασης I (MI) και στάδιο της μετάφασης II (MII) στάδια κατά την ωοληψία (Εικ. 1β). Ταυτόχρονη μεταφορά τριών ή περισσότερων εμβρύων ήταν κοινή πρακτική εκείνη την εποχή, και τα έμβρυα που προέρχονται από in vivo ωρίμανση ωαρίων συχνά 3

7 μεταφέρονταν μαζί με έμβρυα που είχαν αναπτυχθεί in vitro και σε λιγότερο προχωρημένα στάδια ανάπτυξης.(de Vos et al., 2016). Με αυτόν τον τρόπο, οι Chian et al. (2000) ανέφεραν βελτιωμένα ποσοστά ωρίμανσης και γονιμοποίησης και αναπτύχθηκε το αποκαλούμενο πρωτόκολλο McGill (Son et al., 2008a). Το πρωτόκολλο αυτό βασίζεται στα ωοθυλάκια και στο πάχος ενδομήτριου σε γυναίκες με το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών (PCOS) και με χορήγηση hcg αμέσως μόλις το μεγαλύτερο ωοθυλάκιο μετρηθεί στα mm. Σε περιπτώσεις ανωορρηξίας, δόθηκε μικρή δόση ενέσεων FSH για να ενισχυθεί η ανάπτυξη ωοθυλακίων και η παραγωγή οιστραδιόλης για να αυξηθεί το πάχος του ενδομητρίου (Εικ. 1β). Παρόλο που αυτό είχε αποτέλεσμα, ήταν πολύ δύσκολο να συγχρονιστεί η εμφάνιση του πολικού σωματίου (ωρίμανση) σε όλα τα ωάρια με αποτέλεσμα να χρειάζεται να γίνει μικρογονιμοποίηση σε πολλές και διαφορετικές χρονικές στιγμές. Το πρωτόκολλο αυτό είχε ως αποτέλεσμα τα ποσοστά κλινικής εγκυμοσύνης να κυμανθούν στο 30% περίπου ανά εμβρυομεταφορά (Son et al., 2008b). Το πρωτόκολλο McGill έτυχε θερμής υποδοχής από τους περισσότερους κλινικούς και τους ενέπνευσε να συνδυάζουν τη χρήση της in vivo και in vitro ωρίμανσης ωαρίων για να ενισχύσουν τον αριθμό των ώριμων ωαρίων που συλλέγονται από τις γυναίκες με καλό ωοθηκικό αποθεματικό, οι οποίες δεν παρουσιάζουν την εικόνα των ωοθηκών που έχουν οι ασθενείς με PCO. Η δεύτερη προσέγγιση χαρακτηρίστηκε περιέργως 'Natural cycle IVF/M' (Lim et al., 2009), αν και οι ασθενείς λάμβαναν FSH και hcg (εικ. 1B). Σχεδόν ταυτόχρονα μια ομάδα Ιταλών ερευνητών εισήγαγε ένα παρόμοιο πρωτόκολλο εξαιτίας ενός νόμου που ψηφίστηκε το 2004 και απαγόρευε τη χρησιμοποίηση περισσοτέρων των 3 ωαρίων ανά κύκλο και απαιτούσε την μεταφορά όλων των εμβρύων που είχαν δημιουργηθεί (Fadini et al., 2009). Και πάλι, ένα μίγμα ανώριμων, σε διαδικασία ωρίμανσης και ώριμων ωάριων προέκυπταν και αυτή η προσέγγιση είχε ως αποτέλεσμα τα ποσοστά κλινικής εγκυμοσύνης να κυμανθούν στο 30% σε υπογόνιμες ασθενείς με κανονικό ωοθηκικό απόθεμα (Fadini et al., 2009). Αν και σε μια μικρή τυχαιοποιημένη μελέτη (Zheng et al. 2012) δεν έδειξαν βελτιωμένα ποσοστά ζώντων γεννήσεων με ή χωρίς χορήγηση hcg,τουλάχιστον σε ασθενείς με PCOS, η χορήγηση της hcg υιοθετήθηκε από πολλές ομάδες κλινικών και κυρίως για το θέμα της διατήρησης γονιμότητας σε ασθενείς με καρκίνο (Grynberg et al., 2016). Παρόλα αυτά, οι ομάδες των McGill και Monza 4

8 αναγνώρισαν την κακή αναπτυξιακή δυναμική των ανώριμων ωαρίων σε σχέση με αυτά που είχαν ωριμάσει in vivo στους hcg-κύκλους (Son et al., 2005). Εν τω μεταξύ, υπήρξαν σημαντικές εξελίξεις όσον αφορά τα ποσοστά εγκυμοσύνης στα πρωτόκολλα που ακολουθούσαν τον πρότυπο ορισμό του IVM (συμπεριλαμβανομένου της χορήγησης FSH) (εικ. 1α). Η ομάδα του Perth αναφέρει εξαιρετικά αθροιστικά ποσοστά ζώντων γεννήσεων (> 40% /IVM κύκλο), ιδίως πραγματοποιώντας μεταφορά μιας μόνο βλαστοκύστης (Walls et al., 2015). Ως εκ τούτου, σήμερα υπάρχει σημαντική σύγχυση μεταξύ της επιστημονικής κοινότητας ως προς το τι είναι και τι δεν είναι IVM. Κλινικές δημοσιεύσεις χρησιμοποιώντας τον όρο IVM μπορεί να περιλαμβάνουν οτιδήποτε από καμία έως πλήρως ελεγχόμενη διέγερση με γοναδοτροπίνες που μοιάζει με ένα συμβατικό κύκλο εξωσωματικής γονιμοποίησης, και κύκλους με όλα τα ωάρια να είναι ανώριμα την στιγμή της ωοληψίας, μέχρι ωοληψίες που να περιλαμβάνουν ωάρια σε όλα τα στάδια της ωρίμανσης τους (από ανώριμο GV έως ΜΙΙ). Ως εκ τούτου, η συζήτηση σχετικά με τον ορισμό του IVM πιθανώς να έχει καθυστερήσει αρκετά. Ο προτεινόμενος ορισμός της IVM από τους Dahan et al. (2016) εστιάζει στο μέγεθος του ωοθυλακίου, αγνοώντας την θεραπεία με γοναδοτροπίνη που έχει πάρει ο ασθενής ενώ επιδιώκει να συμπεριλάβει ασθενείς που έχουν λάβει hcg (De Vos et al., 2016). Αυτός ο ορισμός του IVM είναι επομένως αντιφατικός διότι περιλαμβάνει συγκεκριμένες κλινικές παρεμβάσεις που επιδιώκουν την ωρίμανση των ωαρίων in vivo (π.χ. χορηγώντας hcg ή GnRH αγωνιστή στους ασθενείς). Εξ ορισμού τέτοιες θεραπείες δεν μπορούν να χαρακτηριστούν ωρίμανση in vitro καθώς η ίδια η θεραπεία δημιουργεί ένα ποσοστό των ωαρίων που δεν έχουν ωριμάσει in vitro αυτό καθ' εαυτό. Οι διάφοροι προτεινόμενοι ορισμοί και πρωτόκολλα για την IVM όπως προτείνονται από τους Dahan et al. (2016), και όπως παρουσιάζονται στην εικόνα 1 θεωρούνται μάλλον περίπλοκοι και προκαλούν σύγχυση. Ένα παράδειγμα προτεινόμενου ορισμού που είναι μάλλον περίπλοκος είναι 'Modified Natural Cycle IVF with Early hcg or GnRH-agonist Triggering Combined with IVM' δηλαδή «τροποποιημένος φυσικός κύκλος με χρήση hcg ή GnRH-αγωνιστή σε συνδυασμό με IVM». Το πρωτόκολλο αυτό περιλαμβάνει τη χρήση FSH για 6 ημέρες σε συνδυασμό hcg ή GnRH-αγωνιστή (εικ. 1 B), αλλά αυτό είναι δύσκολο να θεωρηθεί φυσικό και όχι ήπιας διέγερσης κύκλος IVF (De Vos et al., 2016). 5

9 Ο ορισμός λοιπόν πρέπει να είναι σύντοµος και απλός και αν και δεν υπάρχουν ισχυρά στοιχεία που να στηρίζουν πως πρέπει να απομακρυνθούμε από τον κλινικό ορισμό της IVM που δόθηκε μισό αιώνα νωρίτερα, παρόλα αυτά οι περισσότεροι ερευνητές συμφωνούν ότι χρειάζονται κάποιες διευκρινήσεις. Έτσι λοιπόν In vitro Ωρίμανση ωαρίων στην εξωσωματική (IVM) επί του παρόντος ορίζεται ως εξής: Η ωρίμανση in vitro του ανώριμου συμπλέγματος ωαρίου-κοκκωδών κυττάρων που λαμβάνονται από τα ωοθυλάκια με άντρο. (εικ. 1A). Αυτός είναι ο υπάρχων ορισμός της IVM (Edwards, 1962) και μπορεί να περιλαμβάνει κύκλους με χρήση FSH ή FSH ανάλογων (Cross and Brinster, 1970; Wynn et al., 1998) για την ανάπτυξη των ωοθυλακίων, αλλά εξαιρεί κύκλους διεγερμένους με γοναδοτροπίνες που προορίζονται για την ενεργοποίηση της ωρίμανσης in vivo, όπως hcg ή GnRH αγωνιστές. Ο ορισμός αυτός εξαιρεί επίσης τα ωάρια GV που απομονώθηκαν κατά την διάρκεια COS-IVF κύκλων (πολλές φορές αναφέρεται σαν 'Rescue IVM' και λανθασμένα απλώς IVM) (De Vos et al., 2016). Τέλος, πέρα από την σημασιολογική συζήτηση σχετικά με τον ορισμό IVM και τα παράγωγά του που έχουν ως αποτέλεσμα ένα μείγμα GV, MI και MII ωαρίων την ημέρα της ωοληψίας, απαιτείται περαιτέρω έρευνα για να διερευνηθούν οι πραγματικές δυνατότητες των διαφορετικών αυτών κλινικών πρωτοκόλλων. Ο απώτερος στόχος άλλωστε είναι να καθιερωθεί σαν πρωτόκολλο θεραπείας φιλικό προς τον ασθενή με υψηλή πιθανότητα γέννησης ζώντων νεογνών (De Vos et al., 2016). 3.IVM: Ιστορική αναδρομή και πρώτες έρευνες Το 1935 οι Pincus και Enzman (Pincus & Enzman, 1935), αναφέρθηκαν στην ικανότητα των ανώριμων ωαρίων για αυτόματη επανέναρξη της μείωσης, μετά την απομάκρυνση των κοκκωδών κύτταρα που τα περιβάλλουν. Το 1965 η παρατήρηση αυτή επιβεβαιώθηκε από τον Edwards (Edwards, 1965), ενώ ο ίδιος το 1969 περιέγραψε για πρώτη φορά την γονιμοποίηση ανθρώπινων ωαρίων που ωρίμασαν in vitro (Edwards et al, 1969). 6

10 Έκτοτε, ανακοινώθηκαν από αρκετούς ερευνητές επιτυχείς κυήσεις και γεννήσεις παιδιών μετά από in vitro ωρίμανση ωαρίων (Cha & Chian, 1998). Η πρώτη γέννηση παιδιών (τρίδυμα) μετά από in vitro ωρίμανση ωαρίων ανακοινώθηκε από το 1991 όταν μια γυναίκα 33 χρόνων με πρόωρη απώλεια ωοθηκών υποβλήθηκε στη νέα αυτή μέθοδο με τη δωρεά 11 ωαρίων από δότρια. Αφού ωρίμασαν γονιμοποιήθηκαν με επιτυχία τα 7 από τα 11 ωάρια με τη μέθοδο ICSI και μεταφέρθηκαν 5 έμβρυα τεσσάρων με οχτώ κυττάρων στη μήτρα της. Εννιά μήνες αργότερα γεννήθηκαν τρίδυμα. Σημαντικός επίσης σταθμός ήταν η απομόνωση ανώριμων ωαρίων από ασθενείς με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών όπου αναφέρεται ότι το 65% των ωαρίων που τοποθετηθήκαν σε καλλιεργητικό υλικό εμπλουτισμένο με οιστρογόνα και γοναδοτροπίνες κατόρθωσαν να ωριμάσουν σε ώρες ενώ το 81% έφτασε σε μετάφαση II εντός 54 ωρών. Αν και τα ποσοστά ωρίμανσης ήταν ενθαρρυντικά, δυστυχώς τα ποσοστά κύησης ήταν 11,1%.(Cha et al.,1991). Παρ όλα αυτά, η μέθοδος IVM ξεκίνησε να αποτελεί μια εναλλακτική μέθοδο σε ασθενείς με πολυκυστικές ωοθήκες καθώς αυτές οι ασθενείς είναι υπερευαίσθητες στην ορμονική διέγερση και φέρουν το μεγαλύτερο κίνδυνο για να αναπτύξουν το σύνδρομο υπερδιέγερσης ωοθηκών-ohss (Trounson et al, 1994; Chian, 2004). Έχουν αναφερθεί πολλές επιτυχημένες προσπάθειες ωρίμανσης ωαρίων in vitro τις τελευταίες δεκαετίες χωρίς να προηγηθεί διέγερση των γυναικών πριν την ωοληψία των ανώριμων ωαρίων ( Cha et al. 1991, Trounson et al. 1994, Barnes et al., 1996, Russell et al. 1997) και έχουν επιτευχθεί υψηλά ποσοστά γονιμοποίησης αυτών όταν υποβάλλονται σε ICSI, αν και η αναπτυξιακή τους δυνατότητα παρουσιάζεται χαμηλή. Αν και τα ποσοστά εγκυμοσύνης που παρουσιάζονται από έρευνες που έχουν διεξαχθεί σε ανθρώπους είναι μέχρι σήμερα χαμηλά, τα ποσοστά που έχουν καταγραφεί σε ζώα είναι αρκετά ενθαρρυντικά. Η δυνατότητα των ανώριμων ωαρίων (σε στάδιο GV), που απομονώθηκαν από ωοθυλάκια κουνελιού να προχωρούν αυθόρμητα σε μείωση (σπάσιμο πυρηνικής μεμβράνης -GV breakdown) καταδείχτηκε αρχικά από τους καθηγητές Pincus και Enzman το Τα ωάρια που απομονώθηκαν οδηγήθηκαν αυθόρμητα σε GV breakdown και εμφάνισαν την δημιουργία του πρώτου πολικού σωματίου όταν τοποθετήθηκαν σε καλλιεργητικό υλικό χωρίς την προσθήκη γοναδοτροπινών που προκαλούν ωρίμανση ωοθυλακίων και ωορρηξία. Τα ανθρώπινα ωάρια μπορούν να 7

11 ωριμάσουν και να ολοκληρώσουν την διαδικασία της ωρίμανσης, σε μικρότερη όμως από τα υπόλοιπα θηλαστικά συχνότητα (Edwards, 1965). Μελέτες με πιθήκους στους οποίους είχε χορηγηθεί η ορμόνη FSH πριν την ωοληψία των ανώριμων ωαρίων, κατέδειξε αυξημένη ικανότητα κυτταροπλασματικής και πυρηνικής ωρίμανσης των ωαρίων in vitro με αποτέλεσμα να επιτευχθεί η δημιουργία βλαστοκύστης έπειτα από γονιμοποίηση των IVM ωαρίων (Schramm et Barister, 1994). Διεγείροντας τους πιθήκους με την ορμόνη FSH πριν την συλλογή των ανώριμων ωαρίων, μας δίδεται η δυνατότητα λήψης GV ωαρίων από ωοθυλάκια που έχουν αναπτυχθεί κάτω από τις ίδιες συνθήκες με τα ωοθυλάκια από τα οποία προκύπτουν τα ώριμα ωάρια in vivo με την εξαίρεση ότι τα προηγούμενα δεν έχουν εκτεθεί στην ανθρώπινη χοριακή γοναδοτροπίνη. Αυτό δίνει τη δυνατότητα στους επιστήμονες να μελετήσουν την ωρίμανση των ωαρίων αυτή καθ' εαυτή, παρά την αύξηση των ωοθυλακίων και την ανάπτυξή τους. Η αύξηση της συγκέντρωσης της FSH εντός του ωοθυλακίου δημιουργεί ένα θετικό σήμα απαραίτητο για την ολοκλήρωση της ωρίμανσης των ωαρίων in vivo (Gomez et al. 1993), ενώ μια μικρή διέγερση με FSH έχει δείξει να αυξάνει τα ποσοστά των ωαρίων που φτάνουν στο στάδιο της μετάφασης II μετά από IVM. Η διέγερση με FSH πριν την λήψη των ανώριμων ωαρίων είναι ένα θέμα που έχει μελετηθεί εκτενώς και τα αποτελέσματα που προκύπτουν από τις διάφορες έρευνες έρχονται πολλές φορές σε αντίθεση όσον αφορά και τον αριθμό των ανώριμων ωαρίων που συλλέγονται και τα ποσοστά ωρίμανσης αυτών. Όσον αφορά το πρώτο θέμα, κάποιες μελέτες παρουσιάζουν αυξημένο αριθμό ωαρίων που λήφθηκαν από γυναίκες που είχαν διεγερθεί με FSH πριν την ωοληψία έναντι γυναικών στις οποίες δεν είχε χορηγηθεί η ορμόνη FSH (Wynn et al,1998). Υπάρχουν όμως και έρευνες στις οποίες δεν παρουσιάστηκε καμία διαφορά στον αριθμό των ωαρίων που λήφθηκαν στις δύο ομάδες γυναικών (Trounson et al. 1998). Όσον αφορά τα ποσοστά ωρίμανσης των ωαρίων in vitro, κάποιες έρευνες καταδεικνύουν αύξηση αυτών ύστερα από χορήγηση FSH ενώ κάποιες άλλες δεν παρουσιάζουν καμία μεταβολή σε αυτά έπειτα από χορήγηση της ορμόνης (Wynn et al., 1998). Οι ερμηνείες που δίνονται προσπαθώντας να εξηγηθεί αυτή η διαφορά των αποτελεσμάτων, επικεντρώνονται κυρίως στις διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας που πιθανώς χρησιμοποιήθηκαν καθώς και στην χρονική στιγμή της ωοληψίας. Ένας άλλος παράγοντας που έχει μελετηθεί εκτενώς είναι η ικανότητα των ανώριμων ωαρίων να οδηγηθούν σε μείωση και να ολοκληρώσουν κατ' επέκταση την ωρίμανσή τους σε σχέση με το μέγεθος των ωοθυλακίων από τα οποία 8

12 προέρχονται. Εμφανίζονται μειωμένα τα ποσοστά ωρίμανσης των ωαρίων που προέρχονται από ωοθυλάκια 3-4 mm σε σχέση με τα ποσοστά ωαρίων που προέρχονται από ωοθυλάκια μεγαλύτερου μεγέθους 9-15 mm, (Tsouji et al 1985). Σημαντική μείωση στο ποσοστό ωρίμανσης και γονιμοποίησης έχει παρουσιαστεί σε λήψη των ανώριμων ωαρίων όταν το μεγαλύτερο ωοθυλάκιο έχει ξεπεράσει το μέγεθος των 14 mm. Ο έλεγχος λοιπόν του μεγέθους των ωοθυλακίων αποδεικνύεται ένα χρήσιμο μέσο στην πρακτική επιλογής ωαρίων ικανά για ωρίμανση in vitro. Ένας άλλος σημαντικός παράγοντας είναι η διέγερση του ενδομητρίου. Έχει βρεθεί πως γυναίκες με χαμηλά επίπεδα οιστραδιόλης εμφανίζουν χαμηλότερα ποσοστά επιτυχίας σε σχέση με ομάδα γυναικών στις οποίες έχουν χορηγηθεί αυξημένα ποσοστά οιστραδιόλης. Καθώς οι δύο αυτές ομάδες δεν παρουσίαζαν καμία διαφορά στην ποιότητα και στον αριθμό των ωαρίων, η απάντηση αναζητήθηκε σε άλλο παράγοντα με αποτέλεσμα να βρεθεί πως το πάχος του ενδομητρίου την ημέρα της εμβρυομεταφοράς βρέθηκε να είναι αρκετά μεγαλύτερο στην ομάδα των γυναικών με τα υψηλά επίπεδα οιστραδιόλης (Buckett et al., 2004). Επιπλέον μελέτες τονίζουν πως τα ποσοστά εμφάνισης κλινικών εγκυμοσύνων έπειτα από IVM αυξάνουν καθώς αυξάνεται το πάχος του ενδομητρίου. Η διαφορά αυτή στο πάχος του ενδομητρίου εξηγεί λοιπόν καλύτερα τα αυξημένα ποσοστά εγκυμοσύνης που εμφανίζονται σε γυναίκες στις οποίες έχει χορηγηθεί αυξημένη ποσότητα οιστραδιόλης. Κατά την διάρκεια ενός φυσιολογικού έμμηνου κύκλου, στην παραγωγική φάση τα επίπεδα FSH και LH στο αίμα αρχίζουν σταδιακά να αυξάνονται προκαλώντας αύξηση ορισμένων ωοθυλακίων και την παραγωγή οιστρογόνων από αυτά. Όσο αυξάνουν τα επίπεδα των οιστρογόνων στο αίμα, το ενδομήτριο αρχίζει να γίνεται παχύτερο ενώ οι αδένες εντός του ενδομητρίου αυξάνουν σε μέγεθος (βλαστική φάση). Κατά την διάρκεια ενός κύκλου IVF, παράγεται αρκετή ποσότητα οιστρογόνων από τα πολυάριθμα ωάρια που ωριμάζουν λόγω αυξημένης χορήγησης γοναδοτροπινών. Σε έναν κύκλο όμως IVM, καθώς δεν αναπτύσσονται ώριμα ωάρια, η χορήγηση εξωγενούς οιστρογόνου θεωρείται απαραίτητη. Μελέτες έχουν δείξει πως θεωρείται καλύτερο η χορήγηση εξωγενούς οιστρογόνου την ημέρα της ωοληψίας και μετέπειτα, ενώ η ποσότητα που θα χορηγηθεί εξαρτάται από το πάχος του ενδομητρίου. Παρ' όλα αυτά η πραγματική εφαρμογή της μεθόδου in vitro ωρίμανσης ωαρίων θα έπρεπε να περιλαμβάνει λήψη ωοκυττάρων χωρίς καμία εξωγενή χορήγηση 9

13 ορμονών. Μια τέτοια προσέγγιση θα επέτρεπε πλήρη εκμετάλλευση των πλεονεκτημάτων που προσφέρει αυτή η μέθοδος. Κλινικές εγκυμοσύνες που προέκυψαν έπειτα από in vitro ωρίμανση ωαρίων χωρίς καμία εξωγενή χορήγηση ορμονών έχουν αναφερθεί τις τελευταίες δεκαετίες προτείνοντας την μέθοδο αυτή σε συνδυασμό με την in vitro γονιμοποίηση ως έναν εναλλακτικό τρόπο τεκνοποίησης. Εντούτοις, η συγκεκριμένη τεχνική απαιτεί εκτενή αξιολόγηση καθώς τα συσσωρευτικά ποσοστά επιτυχίας από όλες αυτές τις έρευνες (όσον αφορά τη γέννηση ζωντανών βρεφών) είναι μικρότερα του 5%. Πολυάριθμοι είναι οι παράγοντες που χωριστά ή σε συνδυασμό συντελούν στην εμφάνιση χαμηλών ποσοστών επιτυχίας. Κάποιοι από αυτοί θεωρούνται πως είναι η ποιότητα των ωαρίων, οι συνθήκες καλλιέργειες και η δεκτικότητα του ενδομητρίου καθώς και η εμβρυϊκή αναπτυξιακή ικανότητα. Σήμερα είναι πλέον γνωστό πως περισσότερα από 5000 παιδιά έχουν γεννηθεί στον κόσμο με την μέθοδο της in vitro ωρίμανσης ωαρίων.(chian et al., 2013) Πριν προχωρήσουμε όμως στην περαιτέρω μελέτη και ανάλυση αυτής της μεθόδου, θεωρώ απαραίτητο να επεξηγηθούν και να αναλυθούν ορισμένοι όροι και διαδικασίες που λαμβάνουν χώρα. 4.Φυσιολογία-Ωρίμανση ωαρίων Περίπου ένα εκατομμύριο αρχέγονα ωοθυλάκια είναι παρόντα στις ανθρώπινες ωοθήκες, κατά τη γέννηση. Αυτά αποτελούνται από ένα ωοκύτταρο, σταματημένο στην πρόφαση της πρώτης μειωτικής διαίρεσης και συγκεκριμένα στο στάδιο της δικτυοταινίας, το οποίο περιβάλλεται από μία στιβάδα αποπλατυσμένων κυττάρων (προκοκκώδη κύτταρα), τα οποία είναι οι πρόδρομες μορφές των κοκκωδών κυττάρων. Στην αρχή της εφηβείας υπάρχουν μόνο αρχέγονα ωοθυλάκια και στις δύο ωοθήκες, ενώ τα υπόλοιπα έχουν καταστραφεί με τη διαδικασία της ατρησίας. Από την τεράστια αυτή δεξαμενή ωοθυλακίων, στη διάρκεια της αναπαραγωγικής ζωής της γυναίκας, 400 περίπου θα φτάσουν έως την ωοθυλακιορρηξία. Όταν τα ωοθυλάκια εισέρχονται στην φάση της ωρίμανσης, τα ωοκύτταρα που περιλαμβάνουν μεγαλώνουν σε μέγεθος (στον άνθρωπο η διάμετρός τους αυξάνει από 35 μm σε 120 μm), ενώ τα κοκκώδη κύτταρα που τα περιβάλλουν πολλαπλασιάζονται και τα κύτταρα της θήκης διαφοροποιούνται. Η ωρίμανση των ωαρίων συνοδεύεται από σημαντικό αριθμό σύνθετων κυτταρικών διαδικασιών 10

14 (Gosden et al, 1995, Moor rm et al, 1998). Αυτές περιλαμβάνουν: πυρηνική και κυτταροπλασματική ανάπτυξη, παραγωγή οργανιλίων, παραγωγή rrna που υποστηρίζει την πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη, πυρηνική και κυτταροπλασματική ωρίμανση. Η πυρηνική ωρίμανση χαρακτηρίζεται από την απόκτηση της δυνατότητας επανέναρξης της μείωσης από το ωάριο, ενώ η κυτταροπλασματική ωρίμανση σχετίζεται με την ικανότητα του ωαρίου για γονιμοποίηση καθώς και για πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη Πυρηνική ωρίμανση ωαρίων Η πυρηνική ωρίμανση των ωαρίων περιλαμβάνει τις τροποποιήσεις που πραγματοποιούνται στον πυρήνα των ωοκυττάρων κατά τη διάρκεια της μείωσης με αποτέλεσμα την δημιουργία ενός απλοειδούς κυττάρου από την διπλοειδική κατάσταση στην οποία βρισκόταν. Τα ωάρια τα οποία βρίσκονται στο στάδιο της πρόφασης της μείωσης Ι χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη ενός ορατού πυρήνα, στον οποίο αναφερόμαστε με τον όρο Germinal Vesicle (GV). Η διάλυση της πυρηνικής μεμβράνης ( η οποία όπως προαναφέραμε χαρακτηρίζετε ως germinal breakdown, GVBD ) και ενεργοποιείται από την επίδραση ορμονών. Πολλοί είναι οι παράγοντες οι οποίοι συμμετέχουν και επηρεάζουν την διαδικασία της GVBD των ανθρώπινων ωαρίων. Έχει ειπωθεί πως υψηλά επίπεδα κυκλικής αδενοσίνης της φωσφατάσης και υποξανθίνης σε μέσον καλλιέργειας εμποδίζουν την διάλυση του πυρηνικού φακέλου (Heller at el. 1981, Downs et al.,l985, Epig et al., 1985, Hillensjo et al 1985, Tornel et all 1993). Επίσης, μελέτες έχουν δείξει πως προσθήκη της ωχρινοτρόπου ορμόνης (LH) στο μέσο της καλλιέργειας προκαλεί την έναρξη του GVBD. Η ωχρινοτρόπος ορμόνη δρα με έμμεσο τρόπο προκαλώντας GVBD, μέσω των κυττάρων της θήκης αφού δεν υπάρχουν υποδοχείς της ορμόνης LH στα ωάρια (Dekel et al., 1981). Τα ανθρώπινα ωοκύτταρα στην διάρκεια της προγεννητικής ζωής (εμβρυϊκή φάση ) βρίσκονται στο στάδιο της πρόφασης I. Από την στιγμή της γέννησης του θηλυκού ατόμου, κάθε ωοθήκη περιέχει περίπου ωοκύτταρα (primary oocytes), τα οποία χαρακτηρίζονται ως πρωτοταγή. Τα πρωτοταγή αυτά ωοκύτταρα παραμένουν αδρανή μέχρι την ήβη βρισκόμενα σε παρατεταμένη πρόφαση, η οποία ονομάζεται στάδιο της δικτυοταινίας (Baker, 1963). Μετά την ήβη, κατά την διάρκεια της αναπαραγωγικής ηλικίας του θηλυκού ατόμου όταν ολοκληρώνεται η πρώτη μειωτική διαίρεση σχηματίζεται ένα δευτεροταγές ωοκύτταρο. Κατά την διάρκεια λοιπόν της πρώτης μειωτικής διαίρεσης ( μετάφαση I, ανάφαση I, τελόφαση I ) ο 11

15 πυρηνίσκος εξαφανίζεται και το πυρηνικό περίβλημα αρχίζει να διαλύεται (germinal vesicle breakdown). Μόλις ολοκληρωθεί σχηματίζεται όπως προαναφέραμε το δευτερογενές ωοκύτταρο(secondary oocyte) με διάμετρο περίπου 120 μm μαζί με το πρώτο πολικό σωμάτιο, το οποίο μπορεί να θεωρηθεί σαν ωοκύτταρο με ελαττωμένη ποσότητα κυτταροπλάσματος. Τόσο το δευτεροταγές ωοκύτταρο όσο και το πολικό σωμάτιο περιέχουν απλοειδή αριθμό χρωμοσωμάτων. Μόλις λοιπόν ολοκληρωθεί η πρώτη μειωτική διαίρεση αρχίζει η δεύτερη μειωτική διαίρεση με τον σχηματισμό των δευτεροταγών ωοκυττάρων τα οποία τα οποία φτάνουν μέχρι το στάδιο της μετάφασης II. Η ολοκλήρωση της δεύτερης μειωτικής διαίρεσης τελειώνει μετά την ρήξη του ωοθυλακίου (ωοθυλακιορρηξία) αλλά μόνον μετά την διείσδυση ενός σπερματοζωαρίου. Ως ωρίμανση λοιπόν των ωαρίων ορίζουμε την έναρξη και ολοκλήρωση της πρώτης μειωτικής διαίρεσης από το στάδιο της πρόφασης I (GV stage) έως το στάδιο της μετάφασης II (της δεύτερης μειωτικής διαίρεσης ) συνοδευόμενη από την κυτταροπλασματική ωρίμανσή τους, η οποία θεωρείται απαραίτητη για την γονιμοποίηση του ωαρίου και τα αρχικά στάδια ανάπτυξης του εμβρύου. 4.2.Κυτταροπλασματική Ωρίμανση ωαρίων Η Κυτταροπλασματική ωρίμανση μπορεί να περιγραφεί ως το σύνολο των διαδικασιών που τροποποιούν το κυτταρόπλασμα των ωοκυττάρων και οι οποίες είναι ουσιαστικές αρχικά για την γονιμοποίηση των ωαρίων και στη συνέχεια για την εμβρυϊκή αναπτυξιακή ικανότητα. Είναι γνωστό πως ο μεταβολισμός των ωοκυττάρων προ της ωορρηξίας χαρακτηρίζεται από έντονη μεταγραφική και μεταφραστική ικανότητα (Telford et al. 1990, Wassarman,1996). Παρ' όλα αυτά, τα επίπεδα της μεταγραφής μειώνονται σημαντικά στην περίοδο της ωορρηξίας, με αποτέλεσμα τόσο το ωοκύτταρο όσο και το πρώιμο έμβρυο να εξαρτώνται στενά από τα αποθέματα mrna και πρωτεϊνών που έχουν συντεθεί την περίοδο πριν την ωορρηξία (Telford et al. 1990). Η ποιότητα λοιπόν του ωαρίου εξαρτάται σημαντικά από την ωρίμανση του κυτταροπλάσματος του τελευταίου. Το κυτταρόπλασμα σε συνδυασμό με την πυρηνική ωρίμανση προετοιμάζουν το ωάριο για το στάδιο της γονιμοποίησης και για την πρώιμη εμβρυακή ανάπτυξη. Εάν δεν ολοκληρωθεί σωστά η κυτταροπλασματική ωρίμανση τότε αναπόφευκτα το ωάριο θα αποτύχει να γονιμοποιηθεί ή να αναπτυχθεί ένα έμβρυο επιτυχώς (Tribault et al. 1975, Tribault 12

16 1977). Εν κατακλείδι σημαντική είναι η παραγωγή και η παρουσία ειδικών παραγόντων, ο εντοπισμός κυτταροπλασματικών οργανιδίων και η μεταγραφική τροποποίηση των m-rna που έχουν συσσωρευτεί κατά την διάρκεια της ωογένεσης. Η in vitro ωρίμανση των ωαρίων (IVM) συνεπώς είναι διαδικασία κατά την οποία, ωάρια που βρίσκονται στο στάδιο του βλαστικού κυστιδίου (GV, ωάρια πρόφασης Ι) συλλέγονται από ωοθυλάκια με άντρο διαμέτρου 2mm-10 mm, καλλιεργούνται, ολοκληρώνουν την πρώτη μειωτική διαίρεση (εμφάνιση του πρώτου πολικού σωματίου) και φτάνουν στη μετάφαση ΙΙ σε ώρες. Μέσα από έρευνες και πειράματα έχει καταστεί σαφές πως διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας για την ωρίμανση των ωαρίων in vitro επηρεάζουν και επιδρούν με διαφορετικό τρόπο στην γονιμοποίησή τους και στην εμβρυϊκή ανάπτυξη. Τα περισσότερα πρωτόκολλα αναφέρουν πρόσθεση της ορμόνης FSH στο υλικό ωρίμανσης των ωαρίων αν και έχει αποδειχθεί πως η χορήγηση της ωοθυλακιοτρόπους ορμόνης (FSH) δεν αυξάνει την πυρηνική ωρίμανση των τελευταίων ούτε στους αρουραίους, ούτε στους πιθήκους, αλλά ούτε και στους ανθρώπους. Κάποιες μελέτες αναφέρουν πως έχει ανασταλτική δράση στην ωρίμανση των ωαρίων στα ποντίκια (Downs et al, 1988). Αναφέρεται πως η χορήγηση FSH αναστέλλει το GVBD σε ωοκύτταρα ποντικιών εξ' αιτίας της αύξησης των επιπέδων camp που προκαλεί στα ωοθυλακικά κύτταρα. Η χορήγηση FSH θεωρείται απαραίτητη για να εκφραστούν οι υποδοχείς της LH στα ωοθυλάκια πριν την ωορηξία. Αν και ο μηχανισμός δράσης της FSH στην πυρηνική και κυτταροπλασματική ωρίμανση δεν είναι ξεκάθαρος, εκτιμάται πως αν και δεν αυξάνει σημαντικά την ικανότητα των ωαρίων να φτάσουν στο στάδιο της μετάφασης II, η προσθήκη FSH σε καλλιεργητικό μέσο ωρίμανσης ωαρίων αυξάνει την ικανότητα γονιμοποίησης και πρώιμης εμβρυϊκής ανάπτυξης. 4.3.Maturation Promoting Factor (MPF) Η ανίχνευση ενός μη ειδικού παράγοντα του Maturation Promoting Factor (MPF) ο οποίος είναι υπεύθυνος για τη μετάβαση των κυττάρων από τη φάση G2 στη φάση Μ του κυτταρικού κύκλου, αποτελεί σημαντικό βήμα στη διερεύνηση της ωρίμανσης των ωαρίων. Η κυτταρική διαίρεση (κυτταρικός κύκλος) αποτελείται από 2 φάσεις: Τη φάση Μ (μίτωση - μείωση) και την ενδιάμεση φάση (G1 - S - G2). Η μετάβαση στα διάφορα στάδια του κυτταρικού κύκλου ρυθμίζεται από πρωτεΐνες που 13

17 ονομάζονται κυκλίνες. Οι κυκλίνες ελέγχουν τον κυτταρικό κύκλο, ρυθμίζοντας κινάσες εξαρτώμενες από τις κυκλίνες (CDKs). Οι κινάσες αυτές γίνονται ενεργές όταν δημιουργήσουν σύμπλεγμα με τις κυκλίνες. Το ενεργοποιημένο αυτό σύμπλεγμα διεγείρει την κυτταρική διαίρεση φωσφορυλιώνοντας συγκεκριμένες πρωτεΐνες του κυττάρου. Ο MPF είναι ένα σύμπλεγμα κυκλίνης κινάσης (p34cdc-serine/threonine κινάση και κυκλίνη Β) και ενεργοποιεί τη μετάβαση του κυττάρου από τη φάση G2 στη φάση Μ του κυτταρικού κύκλου και ρυθμίζεται από την κυκλίνη Β (Dunphy et al, 1988). Αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης των κυττάρων οδηγεί σε αποτυχία ενεργοποίησης του MPF (Maller et al, 1985).Πολλοί παράγοντες μεσολαβούν στον έλεγχο της επανέναρξης της μείωσης των ωαρίων και δρουν στο ωάριο μέσω των κοκκωδών κυττάρων. Τα κοκκώδη κύτταρα επικοινωνούν με το ωάριο μέσω των χασμοτοσυνδέσμων (gap junctions). Υψηλά επίπεδα camp και υποξανθίνης στα καλλιεργητικά μέσα αναστέλλουν την επανέναρξη της μείωσης (Eppig et al, 1985; Loutradis et al, 1994). Η LH βοηθά στην επανέναρξη της μείωσης, μέσω ελάττωσης του camp και των πουρινών και αύξησης του MPF και της πρωτεϊνικής σύνθεσης (Dekel et al, 1981).Το c-mos ογκογονίδιο κατέχει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της δραστηριότητας του MPF. Εκφράζεται νωρίς στη διαδικασία της ωρίμανσης των ωαρίων και παυει να εκφράζεται αμέσως μετά από τη γονιμοποίηση. Κωδικοποιεί την πρωτεϊνική κινάση Mos, η οποία στη συνέχεια ενεργοποιεί είτε άμεσα τον MPF, μέσω φωσφορυλίωσης της κυκλίνης Β (Roy et al, 1990), είτε έμμεσα μέσω MAP κινάσης (Nebreda & Hunter, 1993). 4.4.Τεχνικές ωρίμανσης ωαρίων Δύο τεχνικές ωρίμανσης ωαρίων χρησιμοποιούνται σήμερα. Στην πρώτη, ωάρια που συλλέγονται από ωοθυλάκια διαμέτρου 2mm-10 mm, με ή χωρίς προηγηθείσα διέγερση των ωοθηκών, καλλιεργούνται για ώρες, ώστε να φτάσουν στη μετάφαση ΙΙ (Cha et al, 1998). Σημαντικός, όμως, αριθμός ωαρίων φτάνουν στη μετάφαση ΙΙ, μετά από καλλιέργεια ωρών, αφού όλα τα ωάρια που συλλέγονται δε βρίσκονται στο ίδιο στάδιο ωρίμανσης. Επομένως, για την αποφυγή παραμονής των ωαρίων αυτών στην μετάφαση ΙΙ για ώρες πριν την γονιμοποίηση και, επειδή τα ωάρια που φτάνουν πρώτα στη μετάφαση ΙΙ είναι πιο πιθανό να αναπτυχθούν έως το στάδιο της βλαστοκύστης (Barnes et al,1995), ο χρόνος καλλιέργειας των ωαρίων έχει μειωθεί στις (Smith et al, 2000). 14

18 Ο στόχος της δεύτερης τεχνικής ωρίμανσης, που ακόμη δεν έχει οδηγήσει στην πλήρη ωρίμανση των ωαρίων, είναι η καλλιέργεια in vitro αρχέγονων ωοθυλακίων καθώς και ωοθυλακίων πριν το σχηματισμό του άντρου (Hovatta et al, 1997).Οι τεχνικές καλλιέργειας που δίνουν τα καλύτερα αποτελέσματα έως τώρα είναι: καλλιέργεια τμήματος ωοθηκικού ιστού και καλλιέργεια μεμονωμένων ωοθυλακίων. Σε καλλιέργειες ωοθηκικού ιστού, τα αρχέγονα ωοθυλάκια φτάνουν έως το στάδιο του δευτερογενούς ωοθυλακίου (ωοκύτταρο που περιβάλλεται από δύο τουλάχιστον στιβάδες κοκκωδών κυττάρων), ενώ σε καλλιέργειες μεμονωμένων αρχέγονων ωοθυλακίων, τα κύτταρα εκφυλίζονται άμεσα (Hovatta et al, 1997). Τα δευτερογενή ωοθυλάκια όταν καλλιεργούνται, φτάνουν στο στάδιο του ωοθυλακίου με πρώιμο άντρο και μετά εκφυλίζονται, ενώ τα ωοθυλάκια με μικρό άντρο φτάνουν στο στάδιο του ωοθυλακίου με πλήρως αναπτυγμένο άντρο σε περιορισμένο όμως αριθμό (Hovatta et al, 1999). 5.Ενδείξεις για IVM Οι ενδείξεις για IVM περιλαμβάνουν τις γυναίκες που φέρουν τον κίνδυνο να αναπτύξουν το σύνδρομο υπερδιέγερσης ωοθηκών (OHSS) όπως τα άτομα με το σύνδρομο των πολυκυστικών ωοθηκών (PCOS) ή τα άτομα με ιστορικό υπερδιέγερσης ωοθηκών, τα άτομα με όγκους οιστρογόνο-ευαίσθητους και εκείνα που απαιτούν ταχεία διατήρηση της γονιμότητας τους πριν από την έναρξη δυνητικά γοναδοτοξικής-χήμειο θεραπείας. Διάφορες δημοσιεύσεις έχουν περιγράψει τη χρήση IVM για γυναίκες με PCO (Soderstrom-Anttila et al.,2005, Le Du et al.,2005, Cha et al., 2000, Child et al., 2002, Lin et al., 2003, Chianet al., 2000, Mikkelsen et al., 2001, Child et al., 2001). Οι μελέτες αυτές έχουν συμπεριλάβει γυναίκες με ακανόνιστο εμμηνορρυσιακό κύκλο, που προκαλείται από το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών (PCOS) και εκείνες με κανονικούς κύκλους που φέρουν εικόνα πολυκυστικών ωοθηκών με βάση τον υπέρηχο τους (PCO). Οι λόγοι που γυναίκες με PCO και σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών είναι οι καλύτερες υποψήφιες για IVM είναι το μεγάλος αριθμός ωοθυλακίων με άντρο που είναι διαθέσιμα ανά ωοθήκη. Επειδή οι γυναίκες με PCO ή PCOS είναι πιο πιθανό να εμφανίσουν OHSS, είναι επίσης πιο πιθανό να επωφεληθούν από την IVM. 15

19 Η in vitro ωρίμανση ωαρίων επίσης, έχει χρησιμοποιηθεί σε γυναίκες με φυσιολογική έμμηνο ρύση και κανονική εικόνα ωοθηκών. Το σκεπτικό για τη χρήση IVM σε αυτή την ομάδα ασθενών είναι να επιχειρήσει μια λιγότερο δαπανηρή και λιγότερο απαιτητική θεραπεία για την υπογόνιμότητα τους συγκριτικά με ελεγχόμενη διέγερση ωοθηκών σε συνδυασμό με IVF. Για τους ίδιους λόγους, φαίνεται επίσης λογικό να αποφευχθεί η θεραπεία με ορμόνες (γοναδοτροπίνες) σε γυναίκες των οποίων το πρόβλημα υπογονιμότητας τους αφορά αποκλειστικά σε ανδρικό παράγοντα ή σε προηγουμένως γόνιμες γυναίκες που αναγκαστήκαν να προχωρήσουν σε απολίνωση σαλπίγγων και επιθυμούν να συλλάβουν ξανά. Μια περίληψη από την τρέχουσα συνολική παγκόσμια εμπειρία περιγράφεται στον πίνακα 1 (γυναίκες με PCOs και PCO) και στον πίνακα 2(γυναίκες με φυσιολογικές ωοθήκες). Η In vitro ωρίμανση ωαρίων έχει εφαρμοστεί, αν και σε μικρότερη κλίμακα και για άλλες εξειδικευμένες ομάδες ασθενών. Μία μελέτη περιέγραψε την επιτυχή χρήση της IVM σε γυναίκες με φτωχή ανταπόκριση μετά από COS-IVF (Liu et al., 2003). Σε αυτή τη μελέτη οι ερευνητές περιγράφουν τα αποτελέσματα οκτώ κύκλων IVM που πραγματοποιούνται κατά τη θεραπεία με COS-IVF που διαφορετικά θα έχουν ακυρωθεί λόγω μια φτωχής απάντησης. Πέτυχαν ποσοστά κλινικών εγκυμοσύνων και εμφύτευσης 37,5% (3/8) και 20% (4/20), αντίστοιχα. Είναι σημαντικό να αναφέρουμε ότι οι ασθενείς ήταν κατά μέσο όρο 30 ετών και ότι, αν και ένας από τις ασθενείς είχε μια αρχική τιμή FSH 19.1 IU/l, όλα οι έγκυες ασθενείς είχαν περισσότερα από 10 ωοθυλάκια μεγέθους 8-12 mm κατά τη στιγμή της μετατροπής από IVF σε IVM. Η In vitro ωρίμανση ωαρίων έχει χρησιμοποιηθεί και σε γυναίκες που εμφάνισαν υπερδιέγερση των ωοθηκών τους και διέτρεχαν κίνδυνο για OHSS (Jaroudi et al.,1997, Lim et al., 2005, Coskun et al., 1998). Σε μία μελέτη (Coskun et al., 1998), στην οποία 20 κύκλοι εξωσωματικής γονιμοποίησης είχαν ακυρωθεί μετά από κατά μέσο όρο 9 ημέρες διέγερσης (εύρος 5-20 ημέρες) λόγο υψηλών επιπέδων οιστραδιόλης και μεγάλο αριθμό ωοθυλακίων (μεταξύ 11 και 15 mm) τριτογενή ωοθυλάκια αναρροφήθηκαν για να μειωθεί ο κίνδυνο της υπερδιέγερσης, χωρίς την πρόθεση να γίνει μετέπειτα η γονιμοποίηση τους. Σε αυτούς τους ασθενείς λήφθηκαν κατά μέσο όρο 8,1 ωάρια ανά ωοληψία και ωρίμασαν in vitro το 66% αυτών εντός 48 ωρών. Σε μια άλλη μελέτη (Lim et al., 2005) 56 κύκλοι με COS IVF διακόπτονται λόγω κινδύνου υπερδιέγερσης και χορηγείται hcg όταν το κυρίαρχο ωοθυλάκιο ήταν mm. Οι ερευνητές ανέφεραν την λήψη 628 ανώριμων ωαρίων τα οποία ωρίμασαν σε ποσοστό 76% in 16

20 vitro, 82% γονιμοποιήθηκαν και το 94% αυτών διαιρέθηκαν δίνοντας συνολικό ποσοστό εγκυμοσύνης (PR) 46% ανά μεταφορά. Πίνακας 1.Κλινικά αποτελέσματα σε κύκλους IVM σε ασθενείς με PCOs και PCO (Jurema et Nogueira,2006) Πίνακας 2.Κλινικά αποτελέσματα σε κύκλους IVM σε ασθενείς με φυσιολογικές ωοθήκες. (Jurema et Nogueira,2006) Οι μελέτες αυτές δείχνουν το δυνητικό ρόλο της IVM ως εναλλακτική λύση στην ακύρωση του κύκλου εξωσωματικής γονιμοποίησης σε γυναίκες με υψηλή 17

21 ανταπόκριση και κίνδυνο ακύρωσης της προσπάθειας τους. Δεν είναι γνωστό βέβαια κατά πόσο η IVM υπό αυτές τις συνθήκες θα μπορούσε να συγκριθεί με άλλες εναλλακτικές έναντι της ακύρωσης όπως το coasting ή χρήση ενός GnRH αγωνιστή για ωοθυλακιορρηξία. Τέλος, δύο κλινικά περιστατικά (Fuchinoue 2004, Abdul-Jalil 2001) περιγράφουν την επιτυχή χρήση της IVM (εγκυμοσύνες και γεννήσεις) σε ζευγάρια με σοβαρό ανδρικό παράγοντα υπογονιμότητας όπου απαιτείται η ορχική αναρρόφηση ή ανάκτηση σπερματοζωαρίων. Στο σύνολό τους, οι παραπάνω μελέτες καταδεικνύουν την επιτυχή χρήση του IVM σε ένα ευρύ φάσμα υπογόνιμων ασθενών. Ωστόσο, η IVM δεν έχει σχέση αυστηρά με την παραδοσιακή εξωσωματική Γονιμοποίηση, η οποία θα μπορούσε να θεωρηθεί το τρέχον πρότυπο αντιμετώπισης αυτών των ασθενών. Μέχρι περισσότερες συγκριτικές μελέτες να είναι διαθέσιμες, είναι λογικό οι καταλληλότερες υποψήφιες για IVM να είναι γυναίκες που διατρέχουν σημαντικό κίνδυνο από τις παρενέργειες των γοναδοτροπινών και έχουν επαρκή ωοθηκικά αποθέματα, όπως αυτά εκτιμώνται από την ιστορικό ή τους βιοχημικούς δείκτες (AFC,ηλικία, επίπεδα FSH, AMH,επίπεδα inhibin Β). Οι πρόσφατες βελτιώσεις επίσης στην ογκολογική θεραπεία έχουν αυξήσει σημαντικά τα ποσοστά επιβίωσης του καρκίνου. Ωστόσο, ο κίνδυνος απώλειας της λειτουργίας των ωοθηκών παραμένει και από αυτή την άποψη, η IVM η οποία μπορεί να πραγματοποιηθεί ταχέως χωρίς ορμονική διέγερση πριν από τη θεραπεία του καρκίνου, μπορεί να είναι μια ελκυστική επιλογή για αυτούς τους ασθενείς. Ωστόσο, εκτός από την μείωση σημαντικών παρενεργειών της ελεγχόμενης διέγερσης των ωοθηκών, όπως το OHSS, η διαδικασία IVM εξαλείφει την ανάγκη για συχνή υπερηχογραφική παρακολούθηση και κοστίζει λιγότερο από την IVF (Marcus et al., 2006). Παρ 'όλα αυτά, η IVM δεν έχει γίνει ευρέως αποδεκτή σε κλινικές υπογονιμότητας σε όλο τον κόσμο, επειδή τα ποσοστά εγκυμοσύνης με IVM είναι χαμηλότερα από εκείνα που επιτυγχάνονται με τη συμβατική εξωσωματική. Επιπλέον, οι πρόσφατες εξελίξεις στα ελεγχόμενα πρωτόκολλα διέγερσης των ωοθηκών, τα οποία εμποδίζουν την εμφάνιση συνδρόμου OHSS σε ασθενείς με PCOS, όπως η χρήση ενός GnRH ανταγωνιστή για την πρόληψη της πρόωρης ωχρινοποίησης ή ένας αγωνιστής GnRH στην θέση της hcg για την πρόκληση ωορρηξίας έχουν ελαχιστοποιήσει σημαντικά τον κίνδυνο της υπερδιέγερσης των ωοθηκών(marcus et al., 2006). 18

22 5.1.IVM για τη διατήρηση της γονιμότητας Επί του παρόντος, οι κλινικές επιλογές για τις γυναίκες που επιθυμούν άμεση διατήρηση της γονιμότητας τους είναι χειρουργική επέμβαση και κρυοσυντήρηση του εμβρύου, του ωάριου ή του ωοθηκικού ιστού. Μια πρόσφατη μελέτη προτείνει τη χρήση αγωνιστή GnRH κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας προτείνοντας ότι μπορεί να μειώσει την απώλεια λειτουργίας των ωοθηκών. Ωστόσο, επί του παρόντος, το αποτέλεσμά της δεν έχει αποδειχθεί ακόμη (Yang et al., 2005). Έτσι, η μόνη επιλογή με αποδεδειγμένη αποτελεσματικότητα για τη διατήρηση της γονιμότητας είναι η κρυοσυντήρηση εμβρύου. Παρ 'όλα αυτά, την κρυοσυντήρηση εμβρύου μπορεί να μην είναι κατάλληλη επιλογή για τις γυναίκες χωρίς σύντροφο. Επιπλέον, ακόμη και αν η κρυοσυντήρηση εμβρύου για ασθενείς με καρκίνο του μαστού έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία πολλές φορές χωρίς συγκεκριμένες παρενέργειες, υπάρχει ο θεωρητικά ο κίνδυνος για υποτροπή του καρκίνου (Turan V. et al., 2013).Η αφαίρεση, κρυοσυντήρηση και επαναμεταμόσχευση ωοθηκικού ιστού μπορεί να είναι παραμένει σαν επιλογή για αυτούς τους ασθενείς με μικρά όμως ποσοστά επιτυχών γεννήσεων να έχουν αναφερθεί (Donnez et al.,2011, Anderson etv al., 2011, Chian et al., 2013). Επιπλέον, η αφαίρεση των ωοθηκών και η μεταμόσχευση τους είναι μακροχρόνια και επίπονη διαδικασία με σημαντική σωματική και οικονομική επιβάρυνση για τους ασθενείς. Η κρυοσυντήρηση ωαρίων μπορεί να ξεπεράσει αυτές τις αδυναμίες και σήμερα θεωρείται ως η πλέον υποσχόμενη μέθοδος για τις γυναίκες που επιθυμούν διατήρηση της γονιμότητας τους. Μέχρι σήμερα, πάνω από 500 ζωντανές γεννήσεις έχουν προκύψει από κρυοσυντήρηση ωαρίων(chang et al., 2014). Ωστόσο, μόνο λίγα έχουν αναφερθεί μετά την εμφύτευση των κρυοσυντηρημένων ωαρίων μετά από IVM (Chian et al., 2013). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η IVM μπορεί να πραγματοποιηθεί επειγόντως ανεξαρτήτως της φάσης του έμμηνου κύκλου χωρίς να επηρεάζει την ποσότητα και τον ρυθμό ωρίμανσης των ωαρίων. Ως εκ τούτου, IVM μπορεί να είναι μια χρήσιμη επιλογή για τη διατήρηση της γονιμότητας σε ασθενείς με καρκίνο, χωρίς διέγερση των ωοθηκών και χωρίς καθυστέρηση στην θεραπεία του καρκίνου. Πρόσφατα, έχει αναφερθεί επιτυχής εγκυμοσύνη μετά από κρυοσυντηρημένα έμβρυα που προήλθαν από ωάρια IVM μετά από ωοθηκεκτομή σε έναν ασθενή με καρκίνο των ωοθηκών (Prasath et al., 2014). Ένα από τα τεχνικά προβλήματα που ζητούν επίλυση είναι ο χρόνος κατά τον οποίο θα κρυοσυντηρήσουμε τα ανώριμα ωάρια. Κρυοσυντήρηση 19

23 στο στάδιο του βλαστικού κυστιδίου(gv)μπορεί να μειώσει πιθανές βλάβες στον πυρήνα του ωάριου. Ωστόσο, τα τελευταία στοιχεία δείχνουν βελτίωση των ποσοστών επιβίωσης με την κρυοσυντήρηση ωαρίων μετά από ωρίμανση in vitro με την μέθοδο της υαλοποίησης( Cao et al., 2009, Borini et al., 2010). 5.2.RESCUE IVΜ Τα ωάρια που συλλέγονται μετά από ελεγχόμενη διέγερση των ωοθηκών (COS- IVF), είναι σε ποσοστό 20% ανώριμα-gv ωάρια ή MI ωάρια- (Smith et al., 2000). Αυτά τα ωάρια συνήθως απορρίπτονται, λόγω αδυναμίας να οδηγήσουν σε φυσιολογική εμβρυϊκή ανάπτυξη ενώ αυξάνουν σημαντικά τα ποσοστά των αποβολών. Ωστόσο, σε περιπτώσεις ασθενών που δεν ανταποκρίνονται ικανοποιητικά ή όπου η παρουσία των ανώριμων ωαρίων είναι συχνή μετά από διέγερση (Smitz et Cortvrindt, 1999), η χρήση των ανώριμων ωαρίων για εξωσωματική γονιμοποίηση είναι σημαντική προκειμένου να αυξηθεί ο αριθμός των εμβρύων που αποκτήθηκαν σε κάθε κύκλο. Η ωρίμανση όμως αυτών των ωαρίων in vitro δυστυχώς οδηγεί σε χαμηλά ποσοστά γονιμοποίησης τους και μετέπειτα σε υψηλά ποσοστά εμβρύων που αδυνατούν να διαιρεθούν περαιτέρω ενώ φέρουν και μεγάλο ποσοστό χρωμοσωμικών ανωμαλιών (Nogueira et al., 2000). Μια άλλη μελέτη που πραγματοποιήθηκε (Vlaisavljevic et al.,2007) έδειξε πως το ποσοστό ανευπλοειδίας IVM GV-ωαρίων είναι συγκρίσιμο με το ποσοστό ανευπλοειδίας (μελετήθηκαν τα χρωμοσώματα 13,16,18,21 και 22) των in vivo ώριμων ωαρίων ανεξάρτητα από τη διάρκεια της περιόδου ωρίμανσης. Αυτό βάση της συγκεκριμένης μελέτης υποδηλώνει ότι τα ανώριμα ωάρια μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη θεραπεία της υπογονιμότητας, αφού ολοκληρωθεί πρώτα η πυρηνική τους ωρίμανση. Αποτελεί λοιπόν ένα αμφιλεγόμενο πεδίο και απαιτούνται περισσότερες κλινικές μελέτες για την υιοθέτηση ενός τέτοιου πρωτοκόλλου στον τομέα της Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής. 6.Παρακολούθηση κύκλου IVM και προγνωστικοί παράγοντες Δεν υπάρχει ακόμη ένα καθολικό πρωτόκολλο παρακολούθησης για IVM κύκλους. Οι περισσότερες δημοσιευμένες μελέτες περιλαμβάνουν έναν υπέρηχο την 3 η ημέρα του εμμηνορροϊκού κύκλου (αυθόρμητος ή προκληθείς) για να αποκλείσει την παρουσία κύστεων των ωοθηκών, κυρίαρχου ωοθυλάκιου ή πάχυνση του ενδομητρίου. Στη συνέχεια προγραμματίζονται υπερηχογραφήματα σύμφωνα με το επιμέρους IVM πρωτόκολλο του κάθε κέντρου και τον πληθυσμό των ασθενών. Ένας 20

24 επαναληπτικός υπέρηχος την 6η ημέρα του κύκλου είναι σε θέση να εκτιμήσει την ταχύτητα με την οποία το κυρίαρχο ωοθυλάκιο αναπτύσσεται. Σε γυναίκες με κανονικούς εμμηνορροϊκούς κύκλους το κυρίαρχο ωοθυλάκιο φαίνεται να μεγαλώνει με πιο γρήγορους ρυθμούς από ό, τι στις γυναίκες με ωοθηκικούς παράγοντες υπογονιμότητας, ως εκ τούτου, το χρονοδιάγραμμα για την υπερηχογραφική παρακολούθηση και την χρονική στιγμή της ωοληψίας μπορεί να διαφέρουν. Εκτός από το μέγεθος των ωοθυλακίων, το πάχος και η ωρίμανση του ενδομητρίου επίσης παρατηρείται και χρησιμοποιείται για τον καθορισμό της ημέρας της ωοληψίας. Προσπάθειες ανάπτυξης προγνωστικών παραγόντων για την έκβαση ενός IVM περιλαμβάνουν μόνο λίγες αναδρομικές μελέτες. Σε μία από αυτές τις μελέτες, (Mikkelsen et al., 2000) δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στον αριθμό των ωαρίων που λήφθηκαν, ωρίμασαν, γονιμοποιήθηκαν, διαιρέθηκαν ή οδήγησαν σε εγκυμοσύνη μετά από IVM όταν το κυρίαρχο ωοθυλάκιο ήταν <12 mm ή 12 mm σε γυναίκες με κανονικούς εμμηνορροϊκούς κύκλους. Στην ίδια μελέτη, οι ερευνητές μέτρησαν και την μεταβολή των συγκεντρώσεων οιστραδιόλης (E2) και ινχιμπίνης Α( inhibin A) στον ορό κατά την έναρξη σε σχέση με την στιγμή της ωοληψίας και συμπεράνανε ότι μια αύξηση σε ποσοστό 100% της E2 και 80% της inhibin A βελτίωσε σημαντικά τα ποσοστά κυήσεων σε σύγκριση με τους κύκλους που δεν είχε επιτευχθεί με την ίδια αύξηση στις συγκεντρώσεις της E2 (19% vs. 0) ή της ινχιμπίνης A (24% vs. 0). Σε μια μελέτη παρακολούθησης οι Mikkelsen et al.(2000) αξιολογώντας την προγνωστική ικανότητα των βασικών επίπεδων της Ε2 και Ινχιμπίνης έδειξαν ότι η εγκυμοσύνη ήταν πιο πιθανή σε κύκλους που ξεκινούσαν με μια βασική συγκέντρωση Ε2<200 pmol/l (55 pg/ml) και Ινχιμπίνης Α <10 pg/ml. Επίσης δεν παρατηρήθηκε καμία συσχέτιση μεταξύ των ποσοστών εγκυμοσυνών και των αρχικών επιπέδων FSH (μέχρι 15 IU/L) αλλά παρατήρησαν μια όχι στατιστικά σημαντική διαφορά αλλά κλινικά σημαντική στα ποσοστά εγκυμοσυνών των κύκλων που ξεκινούσαν με AFC >5 σε σύγκριση με αυτούς τους κύκλους που είχαν AFC <5 (21% vs. 0) Μία άλλη ομάδα μελετητών παρατήρησε μια συσχέτιση μεταξύ της αρχικής τιμής της FSH και τον αριθμό των ωαρίων που ανακτώνται κατά την ωοληψία καθώς και αυξημένες πιθανότητες εγκυμοσύνης όταν η τιμή της E2 ήταν μεγαλύτερη > 100 pmol/l(child et al.,2002) ανέφεραν τα ευρήματα από 175 κύκλους IVM που αφορούσαν γυναίκες με φυσιολογικούς εμμηνορροϊκούς κύκλους και γυναίκες με PCO και σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών στις οποίες χορηγήθηκε hcg και 21

25 βρήκαν μια πτωτική τάση στα ποσοστά εμφύτευσης με την αύξηση της ηλικίας και μια σημαντική βελτίωση στα ποσοστά εγκυμοσυνών (PRs) όταν περισσότερα από 6 έμβρυα είχαν δημιουργηθεί. Bρήκαν επίσης ότι το πάχος του ενδομητρίου κατά την εμβρυομεταφορά είναι διαφορετικό σε κύκλους που έδωσαν εγκυμοσύνη (10.2 ± 2.0 mm) έναντι σε αυτούς που δεν οδήγησαν σε εγκυμοσύνη (9.4 ± 2.1 mm), ενώ δεν υπήρχε διαφορά στο πάχος του ενδομητρίου κατά τον χρόνο της ωοληψίας (6.5 ± 1,0 mm έναντι 6.6 ± 1.3 mm, αντίστοιχα). (Child et al.,2002) Μερικοί ερευνητές έχουν προτείνει κρυοσυντήρηση των εμβρύων όταν το πάχος του ενδομητρίου δεν είναι μεγαλύτερο των 7 mm την ημέρα της εμβρυομεταφοράς. (Le Du et al., 2005, Chian et al., 2000). Ωστόσο, παρατηρήθηκε ότι το λεπτότερο ενδομήτριο που μπορεί να οδηγήσει σε εγκυμοσύνη την στιγμή της ωοληψίας ήταν 3 mm. (Soderstrom-Anttila et al., 2005) Στο σύνολο τους, οι μελέτες για τους προγνωστικούς παράγοντες της έκβασης των IVM κύκλων υποδηλώνουν ότι νεότερες ασθενείς με επαρκή ωοθηκικά αποθέματα και που παράγουν περισσότερα από 6 έμβρυα έχουν καλύτερη πρόγνωση. Όπως σημειώνεται όμως, οι μελέτες αυτές είναι περιορισμένες σε αριθμό και επομένως τα αποτελέσματά τους δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να διακρίνουμε με ακρίβεια τα περιστατικά που θα έχουν ή όχι καλή πρόγνωση. 7.Κλινικά σχήματα στην IVM Η in vitro ωρίμανση των ωαρίων μπορεί να πραγματοποιηθεί σε δύο ομάδες: σε μη διεγερμένους κύκλους που δεν έχουν χορηγηθεί εξωγενώς γοναδοτροπίνες η οποία μπορεί να είναι ευεργετική για την αποφυγή του συνδρόμου υπερδιέγερσης των ωοθηκών (OHSS) και σε διεγερμένους κύκλους στους οποίους το 15-20% των ωαρίων που συλλέγονται είναι ανώριμα ενώ σε πολλές περιπτώσεις (GV) ωάρια αποτελούν το μεγαλύτερο μέρος των ανακτημένων ωαρίων. Τα ωάρια αυτά μπορεί να έχουν αναπτυξιακές δυνατότητες και η τεχνική αυτή αποτελεί σημαντική ευκαιρία να εκμεταλλευτούμε τα δυνητικά αυτά καλά ωάρια. Το κλινικό πρωτόκολλο για IVM δεν έχει αλλάξει σημαντικά από τότε που αναπτύχθηκε η τεχνική. Η IVM χωρίς καμία εξωγενής χρήση ορμονών είναι το πρωτότυπο και το πιο αυστηρό πρωτόκολλο. Χωρίς τη χορήγηση γοναδοτροπινών, η ωοληψία προγραμματίζεται όταν τα μεγαλύτερα ωοθυλάκια είναι mm, ένα στάδιο κατά το οποίο δεν έχει αναπτυχθεί ακόμα το κυρίαρχο 22

26 ωοθυλάκιο. Πρόσφατα, αυτό το πρωτόκολλο έχει χρησιμοποιηθεί σε γυναίκες με φυσιολογική ωορρηξία και σε ασθενείς με PCOS (Trounson et al., 1994, Fadini et al., 2009) Ένα εναλλακτικό πρωτόκολλο που χρησιμοποιούσε μικρή ποσότητα FSH για να αυξήσει τον αριθμό των ωαρίων και το ποσοστό ωρίμανσης εισήχθη μεταξύ των ετών 1999 και Τα αποτελέσματα με το πρωτόκολλο αυτό είναι αμφιλεγόμενα, και οι πρόσφατες ενδείξεις δεν έχουν δείξει σαφές πλεονέκτημα με αυτή την τεχνική (Suikkari et al., 2000, Mikkelsen et al., 2001, Fadini et al.,2009). Η τρίτη τεχνική, IVM με την χρήση hcg, χρησιμοποιείται ως εναλλακτική λύση έναντι της FSH, προκειμένου να διευκολυνθεί η έναρξη της μείωσης in vivo πριν από την πλήρη ωρίμανση (Chian et al., 1999, Buckett et al., 2004) Μια πρόσφατη όμως δήλωση από την Αμερικανική Εταιρεία Αναπαραγωγικής Ιατρικής (American Society for Reproductive Medicine Committee) ορίζει την IVM ως «ωρίμανση ανώριμων ωαρίων σε καλλιεργητικό υλικό μετά την ανάκτηση τους από ωοθυλάκια που μπορεί ή όχι να έχουν εκτεθεί σε FSH αλλά δεν είχαν εκτεθεί σε LH ή hcg πριν από την ανάκτηση τους για την επαγωγή της μείωσης.» Τα δύο πρώτα πρωτόκολλα ανταποκρίνονται στον ορισμό αυτό. Ωστόσο η έκθεση σε hcg είναι το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο πρωτόκολλο επειδή αυξάνει σημαντικά το ποσοστό κύησης. Σύμφωνα με μελέτες που συνέκριναν τα διαφορετικά πρωτόκολλα του IVM σε γυναίκες με PCOS, η χρήση της hcg, η οποία δεν ήταν δοσοεξαρτώμενη, αύξησε το ποσοστό ωρίμανσης από 69% σε 84%, το ποσοστό γονιμοποίησης από 45% έως 80%, το ποσοστό εγκυμοσύνης από 31% σε 38,5%, και το ποσοστό των γεννήσεων σε 33% (Syristatidis et al., 2013). Ο προσδιορισμός της βέλτιστης χρονικής στιγμής για την συλλογή των ωοκυττάρων είναι το πιο σημαντικό δίλημμα για IVM. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η επιλογή ενός κυρίαρχου ωοθυλακίου μπορεί να προκαλέσει ενδοκρινικές αλλαγές στην υπόλοιπη ομάδα ωαρίων που έχουν στρατολογηθεί που μπορούν να αποβούν επιζήμιες για την μετέπειτα γονιμοποίηση και εμβρυϊκή τους ανάπτυξη. Αρκετές μελέτες που διερευνούν το μέγεθος του ωοθυλακίου κατά τη στιγμή της ωοληψίας έχουν δείξει ότι τα ωοθυλάκια έως 12 mm δεν θέτουν σε κίνδυνο την έκβαση της προσπάθειας (Fadini et al., 2009). Επιπλέον, η ωοληψία κατά την ωχρινική φάση δεν διέφερε από άποψη ωρίμανσης και ρυθμού γονιμοποίησης ωαρίων με την ωοληψία 23

27 κατά την ωοθυλακική φάση (Maman et al., 2011). Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν την χρησιμότητα της IVM σε ασθενείς με επείγουσα ανάγκη διατήρησης της γονιμότητας τους. Πρόσφατα, αρκετά πρωτόκολλα χρησιμοποιώντας αντισυλληπτικά ή οιστρογόνα έχουν αναπτυχθεί για να μειωθεί η πολυπλοκότητα του χρονικού πλαισίου ανάκτησης ανώριμων ωαρίων. 8.Εργαστηριακές πτυχές της IVM Ο χειρισμός των ανώριμων ωαρίων στο εμβρυολογικό εργαστήριο είναι πιο χρονοβόρος και διαφέρει τεχνικά σε σύγκριση με την παραδοσιακή εξωσωματική γονιμοποίηση. Το ωοθυλακικό υγρό που ανακτάται κατά την ωοληψία IVM είναι μικρότερο σε όγκο και περιέχει μεγάλο ποσοστό προϊόντων αίματος ως αποτέλεσμα τραυματισμού των ωοθηκών κατά τη διάρκεια της αναρρόφησης των ωοθυλακίων. Η προσθήκη ηπαρίνης (2-5 IU/mL) στο καλλιεργητικό μέσο συλλογής των ωαρίων ελαχιστοποιεί την πήξη του αίματος. Επίσης το ωοθυλακικό υγρό που αναρροφάται μπορεί να φιλτραριστεί σε ειδικά φίλτρα (π.χ.sterile filter Millex-GV) για την απομάκρυνση μικρών υπολειμματικών κυττάρων και ερυθροκυττάρων (Hreinsson et al., 2003). Ιδιαίτερη προσοχή θα πρέπει να δοθεί στις ρυθμίσεις του ph και της θερμοκρασίας κατά τη διάρκεια όλων των εργαστηριακών βημάτων που ακολουθούν την τεχνική IVM για να εξασφαλιστεί η σωστή πρωτεϊνική σύνθεση και η μορφολογία της μιτωτικής ατράκτου (Sun et al., 2004, Roth et al., 2005, Tong et al., 2004, Edwards et al.,1996). Μεταβολές σε αυτές τις παραμέτρους (Roth et al., 2005) βοοειδών και χοιροειδών ((Tong et al., 2004)) μοντέλων έχουν αποδειχθεί ότι επηρεάζουν αρνητικά την ικανότητα των ωαρίων IVM να γονιμοποιηθούν και να διαιρεθούν. Μόλις απομονωθεί το ωοθυλακικό υγρό θα πρέπει να δοθεί ιδιαίτερη σημασία στην αναγνώριση και τον εντοπισμό των ανώριμων ωαρίων εντός αυτού καθώς η μορφολογία των ωαρίων που ανακτώνται από μικρά ωοθυλάκια είναι διαφορετική από εκείνα των ώριμων ωαρίων που προέρχονται από τα πλήρως ανεπτυγμένα γραφιανά ωοθυλάκια όπως συμβαίνει στους COS-IVF κύκλους. Τα ανώριμα ωάρια, που όπως γνωρίζουμε, χαρακτηρίζονται από ένα συμπαγές σύμπλεγμα κοκκιωδών κυττάρων-ωαρίου(cocs-cumulus oocyte complex) είναι πιο δύσκολο να εντοπιστούν σε σχέση με τα ώριμα ωάρια που είναι πιο διευρυμένα και φέρουν ένα μη συμπαγές σύμπλεγμα κοκκιωδών κυττάρων, με μεγαλύτερη έκφραση των mrna υποδοχέων LH, γεγονός που σχετίζεται με πιο αποτελεσματική ωρίμανση 24

28 του ωαρίου και υψηλότερων ποσοστών διαίρεσης και δημιουργίας βλαστοκύστεων. (Yang et al., 2005). 8.1.Ωοληψία IVM Συνήθως όταν το κυρίαρχο ωοθυλάκιο έχει μέγεθος μεταξύ 8 και 12 mm ή/και ένα πάχος ενδομητρίου μεγαλύτερο των 5 χιλιοστών θεωρούνται ως δείκτες ωοθυλακικής κυριαρχίας και θεωρούνται σαφείς ενδείξεις έναρξης της ωοληψίας των ανώριμων ωαρίων. Η βασική αρχή είναι να πραγματοποιηθεί η ανάκτηση των ανώριμων ωαρίων μόνο μετά την έναρξη της ατρησίας αλλά πριν από την παρατεταμένη έκθεση στο κυρίαρχο ωοθυλάκιο που μπορεί να έχει ενδεχομένως επιζήμιες επιπτώσεις λόγω των ενδοκρινών και παρακρινών επιδράσεων του. Αυτή η ιδέα, αν και αμφισβητούμενη (Russell JB, 1998), τοποθετεί την ιδανική χρονική στιγμή για την ωοληψία μεταξύ της πρόωρης και πλήρους ατρησίας. Μερικές έρευνες δείχνουν σαφές πλεονέκτημα όταν το κυρίαρχο ωοθυλάκιο φθάσει τα 10 mm (Mikkelsen et al.,1999), ενώ άλλες καταδεικνύουν ότι αυτό είναι επιζήμιο και θεωρείται πολύ αργά και προτείνουν την ακύρωση του κύκλου ((Le Du et al., 2005, Cobo et al., 1999). Ως αποτέλεσμα, οι δημοσιευμένες μελέτες διαφέρουν σημαντικά στα υπερηχογραφικά τους κριτήρια για την στιγμή της ωοληψίας. Εν ολίγοις, ο ακριβής χρόνος της ωοληψίας πιθανώς να εξαρτάται από πολλούς και διαφορετικούς παράγοντες, όπως ο τύπος της αναισθησίας, το πρωτόκολλο για την ωρίμανση και την γονιμοποίηση των ανώριμων ωαρίων ώστε να συμπίπτει με τις ώρες εργασίας του εμβρυολογικού εργαστηρίου. Ως εκ τούτου, η ενσωμάτωση της μεθόδου IVM στην καθιερωμένη πρακτική ενός κέντρου Εξωσωματικής Γονιμοποίησης απαιτεί κάποια ευελιξία. Η τεχνική της αναρρόφησης αυτών των ωοθυλακίων απαιτεί ορισμένες τροποποιήσεις από την τεχνική ανάκτησης ώριμων ωαρίων στα πλαίσια του κλασσικού πρωτοκόλλου εξωσωματικής γονιμοποίησης. Πρώτον, ειδικές βελόνες έχουν περιγραφεί για την αναρρόφηση μικρών ωοθυλακίων που είναι πιο άκαμπτες, μικρότερες σε συνολικό μήκος (για την παρακέντηση μικρότερου όγκου),με εργονομική λαβή που να επιτρέπει μεγαλύτερο έλεγχο της κινητικότητας εντός των μη διεγερμένων ωοθηκών ενώ έχουν και υψηλή ορατότητα μειώνοντας τον χρόνο της παρακέντησης. Μια δεύτερη προτεινόμενη τροποποίηση από την ωοληψία της κλασσικής εξωσωματικής γονιμοποίησης είναι η βελόνα 25

29 αναρρόφησης να δουλεύει σε μικρότερη πίεσης αναρρόφησης που να κυμαίνεται από mm Hg, σε σύγκριση με mm Hg για την κλασσική IVF για να μειωθεί ο κίνδυνος απογύμνωσης των ανώριμων ωαρίων από το σύμπλεγμα κοκκωδών κυττάρων. Παρ όλα αυτά είναι εξαιρετικά ενδιαφέρον ότι οι IVM ωοληψίες που χρησιμοποιούν τον σταθερό εξοπλισμότης IVF (βελόνες μονού αυλού 17- και mm Hg της πίεσης αναρρόφησης) έχουν αποδώσει άριστα αποτελέσματα (Chian et al.,2000, Cha et al., 2000). Στην πράξη όμως η τεχνική της ωοληψίας IVM διαφέρει αρκετά καθώς δεν είναι ορατή η διάρρηξη του ωοθυλακίου όπως στην κλασσική IVF και ο κλινικός ιατρός θα πρέπει να εισέλθει αρκετές φορές με την βελόνα του εντός του ωοθυλακίου και υπό διαφορετικές γωνίες για να επιτύχει την ανάκτηση του ανώριμου ωαρίου, Η δυνατότητα ανάκτησης ανώριμων ωαρίων με επιτυχία (ιδιαίτερα σε ασθενείς χωρίς PCOS) και η ικανότητα να εντοπιστούν και να χειριστούν τα ανώριμα ωάρια στο εμβρυολογικό εργαστήριο, όπως και οποιαδήποτε τεχνική διαδικασία, περιλαμβάνει μια καμπύλη μάθησης. Προτείνεται ο χειρουργός να αποκτήσει εμπειρία στην τεχνική της IVM ωοληψίας σε πολυκυστικές ωοθήκες ασθενών πριν επιχειρήσει την αναρρόφηση σε μη πολυκυστικές ωοθήκες. Ομοίως, οι εμβρυολόγοι θα πρέπει να λάβουν την κατάλληλη κατάρτιση, επίβλεψη, και εμπειρία, εκτελώντας IVM υπό την καθοδήγηση ενός καταρτισμένου στην τεχνική ατόμου. 8.2.Καλλιεργητικά μέσα Αν και υπάρχουν πολλές μελέτες σε αρκετά ζωικά είδη που έχουν οδηγήσει στα βέλτιστα καλλιεργητικά μέσα για την in vitro ωρίμανση ωαρίων, στον άνθρωπο δοκιμάζονται ακόμη διάφορα καλλιεργητικά μέσα και χρησιμοποιείται η εμπειρία που υπάρχει από τις μεθόδους καλλιέργειας άλλων τύπων κυττάρων. Σύνθετα καλλιεργητικά μέσα, όπως το ιστικό καλλιεργητικό μέσο 199 (tissue culture medium 199, TCM-199), το Ham sf10 και το μέσο Chang με προσθήκη HEPES, καθώς και αρκετά άλλα, έχουν δοκιμαστεί έως τώρα. Ανεξάρτητα από το καλλιεργητικό μέσο που χρησιμοποιείται στην in vitro καλλιέργεια ανώριμων ωαρίων, είναι γενικώς αποδεκτό ότι η παρουσία κοκκωδών κυττάρων είναι ευεργετική για την in vitro ωρίμανση αυτών (Cha and Chian, 1998). Επιπλέον, η προσθήκη γοναδοτροπινών FSH και LH στα καλλιεργητικά μέσα φαίνεται πως βελτιώνει τα ποσοστά ωρίμανσης ωαρίων in vitro και ακολούθως τα ποσοστά εμβρυϊκής ανάπτυξης (Andereiz et al, 26

30 2000). Οι LH και HCG φαίνεται πως αυξάνουν στον ίδιο βαθμό τα ποσοστά in vitro ωρίμανσης ανώριμων ωαρίων (Hreinsson et al, 2003). Τα καλλιεργητικά μέσα που χρησιμοποιούνται στην in vitro ωρίμανση ανθρώπινων ωαρίων συνήθως εμπλουτίζονται με ορό που προέρχεται από την ίδια την ασθενή για την αποφυγή μετάδοσης λοιμογόνων παραγόντων (Smith et al, 2000). Επιπροσθέτως, στεροειδή όπως η οιστραδιόλη και διάφοροι αυξητικοί παράγοντες και ορμόνες, όπως EGF, TGFα και TGFβ, IGF-Ι ινσουλίνη, GH, φαίνεται πως βελτιώνουν τόσο τα ποσοστά in vitro ωρίμανσης ωαρίων, όσο και την ακόλουθη εμβρυϊκή ανάπτυξη (Lorenzo et al, 1994; Brucker et al, 1991; Liu X et al, 1998; Zhao J et al, 2001; Kiapekou et al, 2005a). Ένα άλλο θέμα στο οποίο διίστανται οι απόψεις των επιστημόνων που έχουν διενεργήσει μελέτες με την in vitro ωρίμανση των ωαρίων είναι η χορήγηση hcg 36 ώρες πριν την ωοληψία των ανώριμων ωαρίων. Μελέτες του καθηγητή Morimoto στην Ιαπωνία σε 2 ομάδες γυναικών (στην πρώτη ομάδα είχε χορηγηθεί hcg 36 πριν την ωοληψία ενώ στην δεύτερη όχι) έδειξαν ότι η χορήγηση της συγκεκριμένης ορμόνης μπορεί να προωθήσει την απομόνωση των ανώριμων ωαρίων από τα ωοθυλάκια και να βελτιώσει την ικανότητα ωρίμανση τους. Στην hcg (+) ομάδα γυναικών μεγαλύτερο ποσοστό ωαρίων ωρίμασε ενώ επετεύχθη ποσοστό κλινικών εγκυμοσύνων 40 %. Αντίθετα στην hcg (-) ομάδα το ποσοστό των κλινικών εγκυμοσυνών ήταν 18,5 %.Παρόμοια υψηλά ποσοστά εγκυμοσυνών μετά από χορήγηση hcg έχουν επιτύχει και άλλες επιστημονικές ομάδες (Chian et al.,1999,2000). 9.Περιβάλλον Εμφύτευσης και Εμβρυομεταφορά μετά από IVM Η προετοιμασία του ενδομητρίου για IVM περιλαμβάνει την χορήγηση οιστραδιόλης την ημέρα της ωοληψίας και κολπική προγεστερόνη για υποστήριξη της ωχρινικής φάσης που αρχίζει την ημέρα της γονιμοποίησης. Ωστόσο η ανάπτυξη του ενδομητρίου μπορεί να είναι ανεπαρκής σε σχέση με εκείνη των φυσικών ή διεγερμένων κύκλων (Chang et al., 2014). Από αυτή την άποψη, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι τα έμβρυα που προέρχονται από IVM μπορούν να κρυοσυντηρηθούν με επιτυχία και να μεταφερθούν κατά τη διάρκεια του επόμενου κύκλου ορμονικής υποκατάστασης με υψηλά ποσοστά εμφύτευσης και κύησης (Ortega et al., 2013). Επιπλέον, το βασικό αίτιο υπογονιμότητας στους ασθενείς που 27

31 είναι οι καταλληλότεροι υποψήφιοι για IVM όπως είναι οι γυναίκες με PCOS που συχνά συνοδεύεται από το μεταβολικό σύνδρομο και την αντίσταση στην ινσουλίνη μπορεί να συμβάλλει στην χαμηλή εμφύτευσης και εγκυμοσύνης ρυθμούς μετά τη διαδικασία (Chang et al., 2014). Μια πρόσφατη μελέτη διαπίστωσε ότι η ποιότητα εμβρύων και ωαρίων ήταν συγκρίσιμη σε ασθενείς ανθεκτικούς και μη-ανθεκτικούς στην ινσουλίνη Ωστόσο, η εμφύτευση (11,6% έναντι 28,7%) και τα ποσοστά εγκυμοσύνης (23,5% έναντι 53,1%) ήταν χαμηλότερα στους ασθενείς ανθεκτικούς στην ινσουλίνη μετά από IVM (Chang et al.,2013). Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν τη σημασία του περιβάλλοντος εμφύτευσης για την επιτυχή εμφύτευση IVM. Ωστόσο, λίγες μελέτες έχουν διερευνήσει τις βέλτιστες προϋποθέσεις ενδομητρίου για IVM, και απαιτούνται περαιτέρω μελέτες στον τομέα αυτό. Συνήθως, η μεταφορά IVM εμβρύων πραγματοποιείται 2-3 ημέρες μετά την γονιμοποίηση(d2 ή D3). Ίσως είναι προτιμότερο να μεταφέρονται IVM έμβρυα στο στάδιο της βλαστοκύστης με στόχο να μελετηθεί η αναπτυξιακή δυνατότητα των εμβρύων. Ωστόσο, λίγες μελέτες έχουν περιγράψει επιτυχημένη μεταφορά βλαστοκύστης IVM (Barnes et al., 1998, Son et al., 2002, Son et al., 2005). Έχει ακόμα προταθεί ότι τα ωάρια που φθάνουν στο στάδιο της ωρίμανσης εντός 24 ωρών έχουν μια μεγαλύτερη πιθανότητα να φτάσουν στο στάδιο της βλαστοκύστης (Son et al.,2005).θα ήταν ωστόσο δόκιμο κάθε κέντρο να πραγματοποιεί IVM εμβρυομεταφορές με βάση τα ίδια κριτήρια που χρησιμοποιεί για τα έμβρυα που προκύπτουν από κλασσικούς COS-IVF κύκλους.(marcus et al., 2006) 10.Αποτελέσματα μετά από IVM Παρά το γεγονός ότι πολλά υποσχόμενα στοιχεία σχετικά με την τεχνική IVM έχουν δημοσιευθεί, δυστυχώς, δεν υπάρχει ακόμη καμία απόδειξη από τυχαιοποιημένες κλινικές μελέτες πάνω στις οποίες θα βασίζονται τυχών συστάσεις σχετικά με την πρακτική IVM πριν από την εξωσωματική γονιμοποίηση ή ICSI για τις γυναίκες με PCOS(Bucket et al., 2004). Μελέτες παρατήρησης έδειξαν ένα υψηλό ποσοστό ωρίμανσης των ωαρίων έως 80,3%, ποσοστά γονιμοποίησης από 10% έως 76,5%, ποσοστά κλινικής εγκυμοσύνης από 21,5% έως 50% ανά κύκλο, ποσοστά εμφύτευσης της τάξης του 18%, και τα ποσοστά ζώντων γεννήσεων από 15,9 % ανά ωοληψία έως 33% ανά κύκλο (Beckers et al.,1999, Bucket et al., 2004, Child et al., 2001,Chian RC et al.,2000) Αναδρομικές μελέτες ανέφεραν παρόμοια αποτελέσματα 28

32 με ποσοστά ωρίμανσης ωαρίων να κυμαίνονται έως και 84%, τα ποσοστά γονιμοποίησης από 43% έως 70%, και τα ποσοστά εγκυμοσύνης από 22% σε 55,6%, ενώ τα ποσοστά των αποβολών, έκτοπης κύησης και αποβολών ήταν παρόμοια για γυναίκες με PCOS σε IVM και IVF ή ICSI (Bucket et al., 2004, Le Du et al, 2005,Soderstrom et al.,2005). Μια πρόσφατη συγκριτική μελέτη έδειξε ότι δεν υπήρξε καμία διαφορά στα ποσοστά κλινικής εγκυμοσύνης σε φρέσκους ή κατεψυγμένους (FET) κύκλους μεταξύ των γυναικών με PCOs που υποβλήθηκαν σε IVM και σε IVF αντίστοιχα(walls et al., 2014) Ωστόσο, η ομάδα IVM παρουσίασε χαμηλότερα ποσοστά κλινικής εγκυμοσύνης συσωρευτικά. Επίσης η ίδια ομάδα (IVM) παρουσίασε σημαντικά λιγότερες γεννήσεις ζώντων νεογνών τόσο στους φρέσκους κύκλους όσο και αθροιστικά, ωστόσο, δεν υπήρξε καμία διαφορά στα ποσοστά γέννησης ζωντανών νεογνών μετά από την μεταφορά κρυοσυντηρημένων εμβρύων μεταξύ της ομάδας IVM και της ομάδας IVF (Walls et al., 2014). Οι γεννήσεις που προέκυψαν μετά από IVM / IVF εκτιμάται ότι είναι πάνω από 5.000(Chian et al., 2013). Ωστόσο, επειδή οι περισσότερες από τις γεννήσεις που προέκυψαν μετά από IVM δεν έχουν αναφερθεί και δημοσιευθεί επίσημα, τα ακριβή στοιχεία είναι περιορισμένα. Μέχρι πρόσφατα, περίπου 400 γεννήσεις αναφέρθηκαν από έξι κέντρα ενώ τα στατιστικά στοιχεία τους έδειξαν ότι δεν παρατηρείται αύξηση των μαιευτικών/περιγεννητικών ανωμαλιών μετά από IVM σε σύγκριση με την κλασική IVF ( Πίνακας 3 ) (De Vos et al.,2005,cha KY et al.,2005, Buckett WM et al., 2007, Shu-Chi et al., 2006, Fadini et al., 2012, Mikkelsen et al., 2005, Soderstrom et al., 2006)Η μεγαλύτερη πρόσφατη μελέτη IVM, η οποία περιελάμβανε 200 γεννήσεις, διαπίστωσε καμία αύξηση των ανεπιθύμητων αποτελεσμάτων και μια αύξηση 178 g στο βάρος γέννησης σε σύγκριση με την κλασική IVF (Fadini et al., Επειδή η διαδικασία γονιδιωματικής αποτύπωσης εμπλέκει την de novo μεθυλίωση στα γεννητικά κύτταρα που διαιρούνται, ευρεία απομεθυλίωση σε επίπεδο γονιδιώματος στα πρώιμα έμβρυα και διατήρηση αυτών στις βλαστοκύστες και τα σωματικά κύτταρα, καθώς και η παρατεταμένη καλλιέργεια των ωαρίων in vitro μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο εμφάνισης ανωμαλιών. Ωστόσο, τα τελευταία στοιχεία σχετικά με τις επιπτώσεις της παρατεταμένης καλλιέργειας των ωαρίων μετά από IVM και των κινδύνων εμφάνισης διαταραχών που σχετίζονται με γονιδιωματική αποτύπωση είναι 29

33 καθησυχαστικά σε σύγκριση με αυτά της καλλιέργειας των προεμφυτευτικών εμβρύων και τους κινδύνους της γονιδιωματικής αποτύπωσης (Anckaert E. Et al.,2013). Επιπλέον, βρέθηκαν υψηλότερα ποσοστά μεθυλίωσης του KvDMR1 σε GV ωάρια και ωάρια μετάφασης I σε μη διεγερμένες ασθενείς με σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών, σε σύγκριση με ωάρια στο ίδιο στάδιο που προέκυψαν από ασθενείς των οποίων οι ωοθήκες είχαν διεγερθεί, γεγονός που δείχνει ότι η διέγερση των ωοθηκών μπορεί να εμπλέκεται στην γονιδιωματική αποτύπωση(khoueiry et al.,2008, Market-Velker et al.,2010) et al.,)έτσι, προς το παρόν, δεν μπορούμε να βγάλουμε ασφαλή συμπεράσματα για το αν η τεχνική IVM πλεονεκτεί έναντι της συμβατικής εξωσωματικής σε αυτόν τον τομέα.(chang et al., 2014) Πίνακας 3. Μαιευτικές/περιγεννητικές ανωμαλίες μετά από IVM σε σύγκριση με την κλασική IVF (Chang et al., 2014) 11.Οι προσπάθειες για τη βελτίωση των αποτελεσμάτων IVM Για να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα της μεθόδου IVM, θα πρέπει να καθοριστούν οι βέλτιστες συνθήκες καλλιέργειας για IVM ωαρίων ενώ θα πρέπει να αποσαφηνιστούν οι διάφοροι μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν την ωρίμανση των ωαρίων. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων 20 ετών, σημαντικές πρόοδοι στις συνθήκες καλλιέργειας έχουν βελτιώσει συνεχώς την αποτελεσματικότητα της μεθόδου IVM. Παρ 'όλα αυτά, η IVM δεν υποστηρίζει όλες τις πυρηνικές και κυτταροπλασματικές αλλαγές που συμβαίνουν φυσιολογικά στα ωάρια in vivo ως 30