Περίγραμμα παρουσίασης Ασφάλεια στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο Ασφαλείς χειρισμοί στο εργαστήριο, μέτρα συλλογικής και ατομικής προστασίας Μικροσκόπηση

Transcript

1 1 ο Εργαστήριο βακτηριολογίας Γεώργιος Φιλιούσης Επίκουρος Καθηγητής Βακτηριολογίας & Λοιμωδών Νοσημάτων 1

2 Περίγραμμα παρουσίασης Ασφάλεια στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο Ασφαλείς χειρισμοί στο εργαστήριο, μέτρα συλλογικής και ατομικής προστασίας Μικροσκόπηση βακτηρίων Τεχνική μικροσκόπησης, χαρακτηρισμός βακτηρίων με βάση το σχήμα και τη διάταξη Παρασκευή επιχρισμάτων Νωπά παρασκευάσματα, ξηρά παρασκευάσματα, είδη χρωστικών και χρώσεων 2

3 Ασφάλεια στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο Γνώση-κατανόηση ορολογίας εργαστηρίου Αποστείρωση: Η διαδικασία καταστροφής όλων των μικροοργανισμών και όλων των μορφών τους Απολύμανση : Η διαδικασία καταστροφής των μικροοργανισμών με χημικές ουσίες (απολυμαντικά) Αντισηψία : Η απολύμανση ιστών με κατάλληλα μη τοξικά απολυμαντικά (αντισηπτικά) 3

4 Ασφάλεια στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο Άσηπτες συνθήκες εξέτασης: Αποτρέπουν τη μόλυνση του προσωπικού του περιβάλλοντος και των υποστρωμάτων Aντισηψία χεριών Απολύμανση πάγκου εργασίας Χρήση λύχνου bunsen 4

5 Ασφάλεια στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο Τήρηση κανόνων του εργαστηρίου (Πρωτόκολλο ασφαλούς εργασίας) Ενημέρωση για τις ασκήσεις στα 10 Όχι προσωπικά αντικείμενα στον πάγκο Προσοχή στην ένδυση 5

6 Ασφάλεια στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο Μην απομακρύνετε από το εργαστήριο υλικά και καλλιέργειες Επανατοποθετήστε όσα υλικά χρησιμοποιήσατε στη θέση τους Απορρίψτε τις χρησιμοποιημένες αντικειμενοφόρες σε ειδικό δοχείο με απολυμαντικό Μην βάζετε τα χέρια σας στο στόμα 6

7 Ασφάλεια στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο Ενέργειες σε περίπτωση ατυχήματος Άμεση γνωστοποίηση του ατυχήματος ( βιολογικού-χημικού) Απόρριψη μολυσμένων ρούχων σε ειδικό κάδο. Κάλυψη της μολυσμένης επιφάνειας με χαρτί εμποτισμένο σε απολυμαντικό επί 20 Απολύμανση περιφερειακά της μολυσμένης επιφάνειας Απόρριψη των χαρτιών που χρησιμοποιήθηκαν σε ειδικό κάδο 7

8 Ασφάλεια στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο Επίπεδα βιοασφάλειας εργαστηρίων nes.pdf 8

9 Επίπεδο βιοασφάλειας 1 (BSL-1) Παράγοντες που δεν προκαλούν νοσήματα στον άνθρωπο Πιθανών να προκαλούν νόσημα σε ανοσοκατασταλμένα άτομα Bacillus subtilis, Naegleria gruberi, infectious canine hepatitis virus, non-pathogenic E. coli species 9

10 Επίπεδο βιοασφάλειας 1 (BSL-1) Απαιτούνται: Απολύμανση χεριών Κλειστές πόρτες κατά την ώρα εργασίας Ελεγχόμενη πρόσβαση στο χώρο εργασίας Απαγόρευση καπνίσματος και φαγητού Απολύμανση πάγκου στο τέλος της εργασίας Καταπολέμηση εντόμων και τρωκτικών Χρήση προστατευτικού εξοπλισμού 10

11 Επίπεδο βιοασφάλειας 2 (BSL-2) Παράγοντες που μπορούν να προκαλέσουν νόσο στον άνθρωπο Απαιτείται για βιολογικά δείγματα (αίμα- ιστοί- εκκρίματα-απεκκρίματα) απεκκρίματα) measles virus, Salmonella species, pathogenic Toxoplasma, Clostridium botulinum,, hepatitis B virus 11

12 Επίπεδο βιοασφάλειας 2 (BSL-2) Βασικοί κίνδυνοι: Ατυχήματα με βελόνες Ατυχήματα με αιχμηρά αντικείμενα Έκθεση των βλεννογόνων Οι παθογόνοι παράγοντες δεν προκαλούν θάνατο και δεν μεταφέρονται αερογενώς σε μεγάλη απόσταση Οι παθογόνοι παράγοντες αντιμετωπίζονται με αντιβιοτικά 12

13 Επίπεδο βιοασφάλειας 2 (BSL-2) Απαιτούνται επιπλέον Μειωμένη & ελεγχόμενη πρόσβαση Σήμανση χώρων για την ύπαρξη πιθανών βιολογικών κινδύνων Σύνταξη εγχειριδίου βιοασφάλειας για το χειρισμό των υλικών και των κατάλοιπων Επίβλεψη από εξειδικευμένο προσωπικό Εργασία σε καμπίνες βιοασφάλειας 13

14 Επίπεδο βιοασφάλειας 2 (BSL-2) 14

15 Επίπεδο βιοασφάλειας 3 (BSL-3) Παράγοντες που μεταδίδονται αναπνευστικά και μπορούν να προκαλέσουν θάνατο Mycobacterium tuberculosis, St. Louis encephalitis virus, Francisella tularensis, Coxiella burnetii 15

16 Επίπεδο βιοασφάλειας 3 (BSL-3) Απαιτούνται επιπλέον Απόλυτα ελεγχόμενη πρόσβαση στο χώρο Ειδική εκπαίδευση προσωπικού Δυνατότητα άμεσης απολύμανσης χώρου και αποστείρωσης υλικών Χρήση προστατευτικών μέσων πριν από την είσοδο στο χώρο εργασίας Έλεγχος του χώρου με διπλές πόρτες και σύστημα αρνητικής πίεσης 16

17 Επίπεδο βιοασφάλειας 4 (BSL-4) Έλεγχο εξωτικών νοσημάτων Marburg virus, Ebola virus, viruses that cause Congo-Crimean Crimean hemorrhagic fever, Lassa fever Απαιτείται πλήρης έλεγχος και απομόνωση του χώρου εργασίας 17

18 Χώροι στέγασης εργαστηρίων BSL-1: Σχολεία, κολέγια, εργαστήρια ελέγχου τροφίμων BSL-2: 2:Νοσοκομεία, πανεπιστήμια, εργαστήρια βιολογικών υλικών BSL-3: Κρατικά διαγνωστικά εργαστήρια BSL-4: Κρατικά διαγνωστικά εργαστήρια καταπολέμησης εξωτικών νόσων 18

19 Μικροσκόπηση βακτηρίων A B 19

20 Καθαρισμός μικροσκοπίου Απλοί φακοί με χαρτί. Καταδυτικοί φακοί με ειδικά χημικά ( αιθέρας) 20

21 Καταδυτικοί φακοί 40x 100x 21

22 Τμήματα του μικροσκοπίου 22

23 Χρήση του μικροσκοπίου Αρχική παρατήρηση με τη μικρότερη μεγέθυνση Εντόπιση πεδίου με το μακρομετρικό κοχλία Καθάρισμα του πεδίου με το μικρομετρικό κοχλία Διαδοχικό πέρασμα σε αυξημένη μεγέθυνση Χρήση ειδικού λαδιού για μείωση της διάθλασης στη μέγυστη μεγέθυνση Υπολογισμός της μεγέθυνσης πολλαπλασιάζοντας τη μεγέθυνση του διοφθάλμιου (10x) με τη μεγέθυνση του προσοφθάλμιου φακού. 23

24 Μικροσκοπική εξέταση νωπού παρασκευάσματος Ποιότητα, καταλληλότητα δείγματος Ύπαρξη, αριθμό πυοσφαιρίων Παρουσία μικροοργανισμών Είδος, μορφή, διάταξη, κινητικότητα μικροοργανισμών 24

25 Μικροσκοπική εξέταση νωπού Με NaCl 0,85% παρασκευάσματος Εξέταση ζώντων μικροοργανισμών Κίνηση, μορφολογία Μειονέκτημα: στεγνώνει εύκολα 25

26 26

27 Μικροσκοπική εξέταση νωπού Με διάλυμα ΚΟΗ 10% Λέπια δέρματος, νύχια, τρίχες παρασκευάσματος Διαλύει την κερατίνη και τα περισσότερα οργανικά υποστρώματα του κλινικού δείγματος εκτός από τους μύκητες (χιτίνη κυτταρικού τοιχώματος) Η διαύγαση του κλινικού δείγματος ενισχύεται με θέρμανση Προσθήκη μαύρης μελάνης Parker για καλύτερη διάκριση της Malassezia furfur σε ξέσματα δέρματος

28 Μικροσκοπική εξέταση νωπού Με διάλυμα ιωδίου (Lugol s iodine, αραιωμένο 1:5) παρασκευάσματος Κόπρανα: πρωτόζωα ή ωάρια ελμίνθων χρωματίζονται οι πυρήνες και τα κυτταροπλασματικά στοιχεία Κύστεις Entamoeba coli ( Κοκκία αμύλου 28

29 Μικροσκοπική εξέταση ξηρού παρασκευάσματος Τεχνική στρώσης παρασκευασμάτων Παρασκεύασμα σε αντικειμενοφόρο πλάκα (μία σταγόνα από υγρή καλλιέργεια ή μία αποικία αναμιγνύεται με μία σταγόνα φ.ο.) Αποξήρανση σε θερμοκρασία δωματίου Μονιμοποίηση του παρασκευάσματος με ελαφρά θέρμανση σε φλόγα ή χημικά με αιθανόλη, μεθανόλη, φορμαλδεύδη, πικρικό οξύ

30 Μικροσκοπική εξέταση ξηρού παρασκευάσματος Χρωστικές Είναι παράγωγα της πίσσας Αποτελούνται από 2 ή περισσότερους δακτυλίους βενζολίου που συνδέονται με χρωμοφόρα Χρωμοφόρες ομάδες είναι χημικές ομάδες που απορροφούν το φως και δίνουν χρώμα (C=C, C=O, C=S, C=NΗ, Ν=N, ΝΟ2) Η ένταση του χρώματος σχετίζεται με τον αριθμό των χρωμοφόρων 30

31 Μικροσκοπική εξέταση ξηρού παρασκευάσματος Χρωστικές Φέρονται με τη μορφή σκόνης ή κρυστάλλων Φυσικές ( sepia) Ζωικής Φυτικής προέλευσης (αιματοξυλίνη, καρμίνιο) Τεχνητές (με τη μορφή αλάτων) Χρωστικά διαλύματα Μητρικά διαλύματα: κορεσμένα διαλύματα χρωστικών σε αιθυλική αλκοόλη 95 0 Διαλύματα χρήσης: αραίωση μητρικών διαλυμάτων με αποσταγμένο νερό 31

32 Μικροσκοπική εξέταση ξηρού παρασκευάσματος Βασικές χρωστικές: Αποτελούνται από θετικό ιόν (cationic auxochrome) Συνδέονται με τη χρωματίνη του πυρήνα κρυσταλλικό ιώδες κυανό της τολουϊδίνης ιώδες της γεντιανής πράσινο του μαλαχίτη σαφρανίνη θειονίνη βασική φουξίνη 32

33 Μικροσκοπική εξέταση ξηρού παρασκευάσματος Όξινες χρωστικές: Αποτελούνται από αρνητικό ιόν (anionic auxochrome) Συνδέονται με το κυτταρόπλασμα κυανό του μεθυλίου όξινη φουξίνη, εωσίνη 33

34 Μικροσκοπική εξέταση ξηρού παρασκευάσματος Ουδέτερες χρωστικές: Προέρχονται από ανάμιξη βασικής και όξινης χρωστικής Για τη χρώση και του πυρήνα και του κυτταροπλάσματος (χρώση παρασίτων και αίματος) Romanowsky: εωσίνη και κυανό του μεθυλενίου Giemsa: εωσίνη και κρυσταλλικό ιώδες 34

35 Μικροσκοπική εξέταση ξηρού παρασκευάσματος Κατηγορίες χρώσεων Θετικές: χρωματίζονται τα κύτταρα των βακτηρίων Αρνητικές: χρωματίζεται το περιβάλλον του βακτηρίου ενώ το κύτταρο παραμένει άχρωμο 35

36 Χρώσεις μικροβίων Streptococcus pyogenes Corynebacterium diphtheriae Cryptococcus neoformans Mycobacterium tuberculosis 36

37 Μικροσκοπική εξέταση ξηρού παρασκευάσματος Κατάταξη κατηγοριών χρώσεων ( θετικών-αρνητικών) Απλές Σύνθετες Ειδικές 37

38 Απλές χρώσεις Είναι υδατικά ή αλκοολικά διαλύματα μιας μόνο βασικής χρωστικής κυανό του μεθυλενίου, βασική φουξίνη, κρυσταλλικό ιώδες Μορφολογία των βακτηρίων (σχήμα, διάταξη) Εφαρμόζονται για ορισμένο χρονικό διάστημα (1-3 min), ξέπλυμα, στέγνωμα, μικροσκόπηση 38

39 Κύρια χρωστική Σύνθετες χρώσεις Σταθεροποιητής Αποχρωματισμός (αιθανόλη, ακετόνη) Χρώση με αντιθέτου χρώματος χρωστική 39

40 Ειδικές χρώσεις Χρώση ενδοσπορίων Bacillus sp, Clostridium sp. Χρώση κατά Schaeffer Fulton Ι: Πράσινο του μαλαχίτη και θέρμανση ΙΙ: Σαφρανίνη Το μικροβιακό σώμα χρωματίζεται κόκκινο και οι σπόροι πράσινοι Χρώση κατά Moeller Ι: Φαινικούχος φουξίνη και θέρμανση ΙΙ: Κυανό του μεθυλενίου κατά Loeffler Το μικροβιακό σώμα χρωματίζεται κυανό και οι σπόροι κόκκινοι 40

41 Acridine Orange Φθορίζουσες χρώσεις Αντιδρά με το DNA και το RNA των μικροοργανισμών Ανιχνεύονται χαμηλές συγκεντρώσεις βακτηρίων cfu/ml Άμεσο παρασκεύασμα από βιολογικά υγρά όπου το μικροβιακό φορτίο είναι χαμηλό ή σε περιπτώσεις όπου οι μικροοργανισμοί μπορεί να ναι εγκλωβισμένοι μέσα σε στρώμα κατεστραμμένων ιστών Μικροσκόπηση με UV S. aureus Salmonella typhi 41