ΕΚΦΕ Κέντρου & Τούμπας

Transcript

1 & Τούμπας Δ.Δ.Ε. Ανατολικής Θεσσαλονίκης Βιολογία ΓΕΛ

2 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΑΠO ΦΥΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑ Γ ΛΥΚΕΙΟΥ ΘΕΤΙΚΗΣ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗΣ

3 ΥΛΙΚΑ 1. Απορρυπαντικό για πιάτα 2. Μαγειρικό αλάτι (NaCI) 3. Φάβα 4. Διάλυμα πεψίνης 1% w/v 5. Παγωμένη αλκοόλη (καθαρή ή μπλε)

4 ΟΡΓΑΝΑ 1. Blender 2. Λεπτό στραγγιστήρι 3. Γυάλινη ή ξύλινη ράβδος 4. Τρεις δοκιμαστικοί σωλήνες 5. Ποτήρι ζέσεως 250g

5 ΒΗΜΑ 1: ΣΠΑΣΙΜΟ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΜΕΒΡΑΝΩΝ ΚΙ ΕΛΕΥΘΕΡΩΣΗ ΤΩΝ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ 1. Βάλε στο Blender Μισό φλιτζάνι του τσαγιού (100g) φάβα Μισό κουταλάκι γλυκού μαγειρικό αλάτι Ένα φλιτζάνι τσαγιού κρύο νερό 2. Ομογενοποίησε για 15 δευτερόλεπτα

6 3. Στράγγισε το ομογενοποιημένο μίγμα σε ένα λεπτό στραγγιστήρι 4. Πρόσθεσε 4 κουταλάκια γλυκού απορρυπαντικό πιάτων και ανάδευσε ήπια με κουταλάκι για 5-10 λεπτά 5. Μοίρασε το μίγμα αυτό σε 3 μεγάλους δοκιμαστικούς σωλήνες για σύγκριση του αποτελέσματος

7 ΒΗΜΑ 2: ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΑΠΟΣΥΝΔΕΣΗ ΤΩΝ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΑΠΟ ΤΙΣ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ 1. Πρόσθεσε 5-6 σταγόνες πεψίνης 1% W/V σε κάθε δοκιμαστικό σωλήνα 2. Ανάδευσε ήπια με γυάλινη ή ξύλινη ράβδο

8 ΒΗΜΑ 3: ΑΝΥΨΩΣΗ ΤΟΥ DNA ΣΤΗ ΦΑΣΗ ΤΗΣ ΑΛΚΟΟΛΗΣ 1. Γείρε προσεκτικά κάθε δοκιμαστικό σωλήνα και πρόσθεσε πολύ αργά ΠΑΓΩΜΕΝΗ αλκοόλη, έτσι ώστε να δημιουργηθεί μια ξεχωριστή φάση από τη φάση του μίγματος. Πρόσθεσε τόση αλκοόλη όση είναι η ποσότητα του μίγματος

9 2. Το DNA θα ανυψωθεί μέσα στη φάση της αλκοόλης από τη φάση του μίγματος της φάβας. Το DNA είναι ένα μακρύ ινώδες μόριο που εύκολα διακρίνεται μέσα στην αλκοόλη 3. Με ένα ξύλινο ραβδάκι μπορείς να σύρεις το DNA από τη φάση της αλκοόλης προς τα έξω.

10 ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ 1. Με την ομογενοποίηση ανοίγουν πολλά κύτταρα

11 2. Το απορρυπαντικό προκαλεί γαλακτωματοποίηση των λιπιδίων

12 ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ

13 3. Το απορρυπαντικό καταστρέφει τις μεμβράνες με τη γαλακτωποίηση των λιπιδίων, με αποτέλεσμα να εξέρχεται το DNA από τον πυρήνα και τα μιτοχόνδρια

14 4. Δράση του NaCI Τα ιόντα Να + εξουδετερώνουν τις αρνητικά φορτισμένες φωσφορικές ομάδες του DNA, που θα οδηγούσαν στην αποδιάταξη του δίκλωνου DNA Επιτρέπει τους κλώνους του DNA να παραμείνουν ενωμένοι και τα διαχωρίζει από τις πρωτεΐνες που και αυτές απελευθερώνονται κατά την λύση των κυττάρων

15 H ΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΕΝΖΥΜΩΝ Η χρήση των ενζύμων έχει σαν στόχο: τη προστασία του DNA από τις νουκλεάσες του κυτταροπλάσματος που μπορούν να προκαλέσουν την αλλοίωση του (ολόκληρες αλυσίδες ) την απελευθέρωση του DNA από τις πρωτεΐνες με τις οποίες είναι συνδεδεμένο π.χ. ιστόνες (καθαρό δείγμα)

16 Εναλλακτικά αντί για πεψίνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί: φρέσκος χυμός ανανά ο οποίος περιέχει την πρωτεϊνάση Βromelain ενζυμικό διάλυμα καθαρισμού φακών επαφής που περιέχει Σουμπλισίνη Α και παγκρεατίνη ή

17 5. Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΑΛΚΟΟΛΗΣ Η αλκοόλη έχει μικρότερη πυκνότητα από το νερό και γι αυτό παραμένει πάνω από τη φάση του μίγματος

18 ΤΟ DNA ΕΙΝΑΙ ΑΣΘΕΝΕΣ ΟΞΥ (PH ~ 6,2-6,8) Τοποθέτησε το DNA σε ύαλο ωρολογίου Πρόσθεσε 2-3 σταγόνες δείκτη μπλε της βρωμοθυμόλης Παρατήρεισε αλλαγή χρώματος από μπλε (ΡΗ =7,6) σε κίτρινο (ΡΗ~ 6) Αυτό συμβαίνει λόγω ιονισμού του ασθενούς νουκλεϊκού οξέος

19 ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ Το δείγμα που έχεις συλλέξει μπορεί να διατηρηθεί σε διάλυμα αιθανόλης 70 ο ή 95 ο στο ψυγείο για μεγάλο χρονικό διάστημα, για περαιτέρω έρευνα Πως θα μπορούσα να χρησιμοποιήσω το δείγμα μου;

20 ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Επαναδιαλύω το δείγμα DNA /RNA σε διάλυμα NaCl 5% κ.β Παρατηρώ στο μικροσκόπιο τις ίνες των νουκλεϊνικών οξέων σε μία σταγόνα κυανού του μεθυλενίου ή lugol Εικόνα από μικροσκόπιο αντίθετης φάσης

21 ΤΟ DNA ΕΙΝΑΙ ΑΣΘΕΝΕΣ ΟΞΥ Τοποθετήστε το DNA σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα του περιλαμβάνει περίπου 15 ml διαλύματος 5% NaCl. Προσθέστε 5 σταγόνες δείκτη ερυθρού της φαινόλης σε αυτό το δοκιμαστικό σωλήνα. Καταγράψτε τις παρατηρήσεις σας.