DOMETI I OGRANIČENJA TANKOSLOJNE KROMATOGRAFIJE U LABORATORIJSKOJ DIJAGNOSTICI METABOLIČKIH BOLESTI

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "DOMETI I OGRANIČENJA TANKOSLOJNE KROMATOGRAFIJE U LABORATORIJSKOJ DIJAGNOSTICI METABOLIČKIH BOLESTI"

Αἴσων Βουρδουμπάς
5 χρόνια πριν
Προβολές:

1 DOMETI I OGRANIČENJA TANKOSLOJNE KROMATOGRAFIJE U LABORATORIJSKOJ DIJAGNOSTICI METABOLIČKIH BOLESTI Ana Škaričić, Ksenija Fumić Odjel za dijagnostiku nasljednih metaboličkih bolesti i novorođenački probir KBC Zagreb

2 RIJETKE BOLESTI NASLJEDNE METABOLIČKE BOLESTI > 680 Garrord AE. Inborn errors of metabolism. Oxford University Press. Oxford, ALKAPTONURIJA ALBINIZAM PENTOZURIJA CISTINURIJA Vrlo rijetke, neliječive, uglavnom sa smrtnim ishodom Ugrožavaju život bolesnika, ali se ipak mogu u određenoj mjeri i liječiti...

fenilalaninhidroksilaze FENILALANIN TIROZIN Izlučivanje

3 PATOGENEZA - PRIMJER FENILKETONURIJE Mutacije gena za fenilalaninhidroksilazu Smanjena aktivnost fenilalaninhidroksilaze FENILALANIN TIROZIN Izlučivanje fenilpiruvične kiseline -urin Povišena koncentracija Fenilalanina-serum Mentalna retardacija, neurološki ispadi

4 ORGANIZACIJA LABORATORIJSKE DIJAGNOSTIKE NASLJEDNIH METABOLIČKIH BOLESTI NACIONALNI PROGRAM SKRININGA LABORATORIJ ZA NOVOROĐENAČKI PROBIR KLINIČKA SUMNJA SPECIJALISTIČKA OBRADA LABORATORIJ ZA SELEKTIVNI PROBIR

testovi (jednostavne metode probira) specifične dijagnostičke pretrage

5 Odjel za dijagnostiku nasljednih metaboličkih bolesti i novorođenački probir (SELEKTIVNI PROBIR) Racionalan pristup dijagnostici: osnovni testovi (jednostavne metode probira) specifične dijagnostičke pretrage (GAG, VLCFA, AK...) testovi potvrde (aktivnost enzima i/ili analiza gena)

6 KROMATOGRAFIJA Kromatografiju je izumio ruski botaničar Tswett (Cvet) početkom 20. st. (grč. Chroma = boja) E. Stahl - začetnik tankoslojne kromatografije (TLC), 1950 Kromatografski sustav analizirani uzorak nepokretna (stacionarna) faza pokretna (mobilna) faza u kromatografskoj komori

7 Rf (related to front) = faktor zaostajanja odnos udaljenosti koju prijeđe uzorak i udaljenosti koju prijeđe pokretna faza fronta otapala TLC ploča komponenta A komponenta B startna linija TANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJA

8 TANKOSLOJNA (PLOŠNA) KROMATOGRAFIJA STACIONARNA FAZA 10 X 10 cm 20 X 20 cm celulozne ili silikagel ploče s kemijski modificiranim tankim slojem nepokretne faze High Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC

9 NANOŠENJE UZORKA 1 cm Automatizirano nanošenje uzoraka CAMAG Linomat 5 uzorci se u formi spreja uz pomoć dušika i komprimiranog zraka nanose na TLC ploču

ploča) prije kromatografiranja se mogu zasititi parama

10 KROMATOGRAFSKE KOMORE MOBILNA FAZA komore s ravnim dnom komore s podijeljenim dnom (istovremeno razvijanje dviju ploča) prije kromatografiranja se mogu zasititi parama otapala: filtar papir natopljen mobilnom fazom prisloni se na stijenku komore

11 KROMATOGRAFSKE KOMORE MOBILNA FAZA OTAPALO /SMJESA OTAPALA CAMAG smartalert Solvent Front Monitor - za sigurno praćenje tijeka kromatografije- svjetlosni i zvučni alarm

12 JEDNOSTRUKO RAZVIJANJE započinje čim otapalo nošeno kapilarnim silama počne putovati na nekoj udaljenosti sile postaju preslabe da održe brzinu pokretne faze kada se otapalo približi gornjem rubu ploče, ona se izvadi iz komore i osuši u struji zraka JEDNODIMENZIJSKO VIŠESTRUKO RAZVIJANJE kromatogram se razvija do određene udaljenosti, izvadi iz komore, osuši i ponovo vrati u komoru ponovi se postupak razdvajanja može se mijenjati sastav mobilne faze (otapala) omogućuje bolju razlučivost složenih smjesa

13 RAZVIJANJE KROMATOGRAMA CAMAG automatska komora za razvijanje (Automatic Developing Chamber, ADC2) jednostavna, sigurna i reproducibilna potpuno automatizirano razvijanje kromatograma

14 DETEKCIJA KROMATOGRAFSKI RAZDVOJENIH SASTOJAKA DERIVATIZIRAJUĆI REAGENSI uranjanje ploče u reagens PRSKALICE KOMORA ZA PRSKANJE fino raspršena otopina reagensa reagira s analitom prskati treba cijelu površinu JEDNOLIČNO!!!

15 IDENTIFIKACIJA KROMATOGRAFSKI RAZDVOJENIH SASTOJAKA CAMAG TLC Visualizer 2 slikovni prikaz TLC/HPTLC kromatograma s digitalnom CCD kamerom CAMAG TLC Scanner 4 denzitometrijska evaluacija TLC/HPTLC kromatograma CAMAG TLC-MS Interface 2 elucija TLC/HPTLC zona s online transferom u spektrometar masa (MS)

Ilija, 8 godina IZ ANAMNEZE -drugo dijete zdravih roditelja -ima starijeg zdravog brata i dvije zdrave sestre -dva majčina brata umrla pod nejasnim okolnostima u ranoj dojenačkoj dobi -trudnoća i

16 Ilija, 8 godina IZ ANAMNEZE -drugo dijete zdravih roditelja -ima starijeg zdravog brata i dvije zdrave sestre -dva majčina brata umrla pod nejasnim okolnostima u ranoj dojenačkoj dobi -trudnoća i porođaj uredni -u dobi od 2 mjeseca u razdoblju od nekoliko dana povraćanje iz nejasnog razloga -u dobi od 2 godine ponovno epizoda povraćanja, tada praćena i gubitkom svijesti -oporavio se nakon trodnevne infuzije -u dobi od 7 godina nakon povraćanja jednom do dva puta dnevno u trajanju od 4 dana postao klonuo, a uskoro i somnolentan -zbog sumnje na intrakranijalni tumor upućen u KBC -po primitku amonijak 123 mol/l -CT mozga uredan POSLANI UZORCI SERUMA I URINA (uzeti u vrijeme krize) u Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku, KBC Zagreb

17 AMINOKISELINE TANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJA - kvalitativna metoda ILIJA PROBIR!!! Ala Glu OTC

18 Glutamin = 2464 µm (ref.raspon: µm) Citrulin = 0 µm (ref.raspon:9-35 µm) 500 Arginin = nm µm (ref.raspon:6 130 µm) Blaskovic Nikola dat Retention Time Name 450 Pk # Alanin = 2670 µm (ref.raspon: µm) Phophethanolamin Phosphoserin ,300 Taurin 1 3,633 7,800 10, Urea (Hydroxyprolin) Asparaginacid ,632 23,832 Threonine 5 29,198 31,398 Glutamicacid Asparagin SERIN Aminadipic Acid 36, ,531 8 Glutamin (Sarcosin) a-aminobutric Acid 42, ,764 45,930 (Citrulline) 11 48,364 Prolin 12 49,897 Glycin 17 51, Alanin 14 55,130 (DL/Cystathionine) Alloisoleucin 16 58,463 Valin 62,663 Argininosuccinic Cystine acid 63,996 Methionin , Isoleucine (aa-isobutyric Acid) ,995 (g-aminobutyric Acid) 76,162 Leucine 78, b-alanine 81,028 Tyrosine Phenylalanin 23 82, ,128 Homocystine (Hydroxylysin) Ethanolamin 90, ,327 Ammoniak 94, , Lysin 1-Metylhisidin (3-metilhistidin) 29 Ornithine 104,493 (Tryptophan) 109, ,593 Histidin (anserin) (karnozin) 125,859 Arginine Minutes Uz orotsku kiselinu u urinu nalaz upućuje na MANJAK ORNITIN TRANSKARBAMOILAZE

19 NASLJEDNI METABOLIČKI POREMEĆAJI KOJI SE MOGU DIJAGNOSTICIRATI MJERENJEM AMINOKISELINA Fenilketonurija* Neketotična hiperglicinemija* Poremećaj sinteze serina* Cistinurija* Citrulinemija* Lizinurička intolerancija proteina* Argininosukcinična acidurija* Hartnupova bolest* Manjak prolidaze* Tirozinemija tipa I i II* Leucinoza Homocistinurija Argininemija* Manjak ornitin transkarbamoilaze Hipofosfatazija* Hiperornitinemija* Hiperamonijemija Hiperornitinemija Homocitrulinurija sindrom* Manjak sulfit oksidaze * Poremećaji koje se mogu otkriti primarno mjerenjem aminokiselina

20 AMINOKISELINE Asn Ser Hyp Gly EtN Gln Asp Cit Thr Sar bala Ala His 1MHis 3MHis Glu Asa Hcit Ans Car Aad GABA baib Abu Arg Hyp Pro Met Orn Val Cth Nva Cys Hcy Allolle Tyr Lys Lle Leu Nle Phe Trp Pser PEtN Tau 18 min

21 Tuga N. hepatomegalija, žutica, E.coli, zaostajanje u razvoju... prekid unosa mlijeka - prehrana isključivo intravenski GLC i AK -Reduktivne tvari: -TLC-šećera -Galaktoza u krvi: -Galaktoza u mokraći: -Organske kiseline u urinu: Značajno povišene 4-OH-fenilmliječna, 4-OH-fenilpropionska kiselina. SUKCINILACETON NIJE PRISUTAN. Takav nalaz upućuje na oštećenje jetre nepoznate etiologije, a isključuje tirozinemiju tipa I. Neonatalna hemokromatoza Nedostatak alfa-1-antitripsina Poremećaji glikozilacije proteina - Jetrena bolest nepoznate etiologije?!?

22 LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA REDUKTIVNE TVARI U MOKRAĆI TLC MONO-DISAHARIDA glukoza, galaktoza, fruktoza, laktoza, manoza, ksiloza, homogentizinska kiselina, sijalinska kiselina ksiloza fruktoza galaktoza laktoza

23 GALAKTOZEMIJA PREDANALITIČKA FAZA Tuga N dobila mliječni obrok 1 sat iza toga izvađena EDTA-krv i uzet uzorak urina Galaktoza u krvi : 1980 mol/l (referentni raspon nakon mliječnog obroka < 350 mol/l) Galaktoza u mokraći : 8,9 mmol/l (referentni raspon nakon mliječnog obroka < 3,33 mmol/l) PORUKA : 1. Kada u laboratoriju zaprimimo uzorak krvi i/ili mokraće, za mjerenje galaktoze, uvijek odmah liječnika i pitati za vrijeme uzimanja uzorka!!! 2. Ako se mjeri aktivnost galaktoza-1-fosfat uridil transferaze (ERITROCITI), uvijek odmah pitati kada je dijete primilo transfuziju krvi!

24 LIZOSOMSKE BOLESTI NAKUPLJANJA MUTACIJE KLINIČKA SLIKA LIZOSOMSKI ENZIMI AKTIVACIJSKI PROTEINI SFINGOLIPIDI GLIKOGEN OLIGOSAHARIDI KOLESTEROL GLIKOZAMINOGLIKANI AMINOKISELINE PEPTIDI PROTEINI

MUKOPOLISAHARIDOZE - PATOFIZIOLOGIJA Središnji

vidom Poteškoće sa sluhom Teškoće s dišnim putovima

problemi Promjene na lokomotornom sustavu 11 tipova

25 MUKOPOLISAHARIDOZE - PATOFIZIOLOGIJA Središnji živčani sustav Periferni živčani sustav Poteškoće s vidom Poteškoće sa sluhom Teškoće s dišnim putovima Kardiovaskularni problemi Nutritivni i abdominalni problemi Promjene na lokomotornom sustavu 11 tipova MUKOPOLISAHARIDOZA Dermatan sulfat Heparan sulfat Hondroitin sulfat

Keratan sulfat Hondroitin sulfat Dermatan sulfat

26 RAZDVAJANJE GLIKOZAMINOGLIKANA- MUKOPOLISAHARIDA iz 24-satnog urina izolirati glikozaminoglikane Keratan sulfat Hondroitin sulfat Dermatan sulfat MPS tipa I, II, VI MPS tipa IV

27 URIN porcija OLIGOSAHARIDI GM1-GANGLIOZIDOZA M.POMPE -MANOZIDOZA MPS IVB GM2-SANDHOFF -FUKOZIDOZA -MANOZIDOZA SIJALIDOZA

29 Glikogenoza tipa II - Pompeova bolest Manjak kisele α-glukozidaze 1: Zbog nedovoljne aktivnosti enzima kisele α-glukozidaze (kisele maltaze) glikogen se nakuplja u lizosomima svih stanica, a osobito u skeletnom i srčanom mišiću

INFANTILNI OBLIK POMPEOVE BOLESTI simptomi se javljaju u prvim mjesecima života poteškoće hranjenja, zaostajanje u somatskom i psihomotornom razvoju, progresivna mišićna

30 INFANTILNI OBLIK POMPEOVE BOLESTI simptomi se javljaju u prvim mjesecima života poteškoće hranjenja, zaostajanje u somatskom i psihomotornom razvoju, progresivna mišićna slabost, izrazita hipotonija, hipertrofična kardiomiopatija hepatomegalija i makroglosija gotovo svi umiru unutar prve godine života zbog zatajenja srca i respiratorne insuficijencije

listova apneje u spavanju osteoporoza, kontrakture zglobova nakon 10-ak godina od pojave

31 JUVENILNI OBLIK POMPEOVE BOLESTI prvi simptomi u ranom djetinjstvu tijek bolesti je teži što se simptomi ranije jave simetrična slabost proksimalne skupine mišića hipertrofija listova apneje u spavanju osteoporoza, kontrakture zglobova nakon 10-ak godina od pojave simptoma invalidska kolica i respirator smrt do kraja 2. desetljeća života zbog respiratornog zatajenja

DIJAGNOZA -glukozidaza - limfociti - FIBROBLASTI- bioptat kože

32 POMPEOVA BOLEST-DIJAGNOZA KLINIČKA SUMNJA OSNOVNI LABORATORIJSKI NALAZI CK, aminotransferaze U R I N KONAČNA DIJAGNOZA -glukozidaza - limfociti - FIBROBLASTI- bioptat kože ANALIZA MUTACIJA u sterilnom hranilištu

33 TANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJA U LABORATORIJSKOJ DIJAGNOSTICI NASLJEDNIH METABOLIČKIH BOLESTI vrlo korisna metoda razdvajanja ekonomski isplativa ne zahtjeva posebnu opremu ALI... traži iskustvo analitičara ima svoje domete i ograničenja

Σχετικά έγγραφα

4 ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ. Γ ε ν ε τ ι κ ή

4 ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ. Γ ε ν ε τ ι κ ή 4 ο ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ ε ν ε τ ι κ ή 1. Κύκλος της ζωής του κυττάρου 3ο Γελ. Ηλιούπολης επιμέλεια: Αργύρης Γιάννης 2 2. Μοριακή Γενετική i). Ροή της γενετικής πληροφορίας DNA RNA πρωτεΐνες νουκλεΐκά οξέα ή πρωτεΐνες