ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ - ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΞΗΡΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΟΣ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Α. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Σκοπός Η κατανόηση του τρόπου αναπαραγωγής των βακτηρίων και της σηµασίας τους για την καθηµερινή µας ζωή. Απαραίτητες γνώσεις - Οι παθογόνοι µικροοργανισµοί επηρεάζουν την υγεία του ανθρώπου και προκαλούν διάφορες ασθένειες. - Η είσοδος και ο πολλαπλασιασµός ενός µικροβίου στον οργανισµό ονοµάζεται λοίµωξη. Η παθογόνος δράση των µικροβίων οφείλεται σε διάφορες ουσίες (τοξίνες) που αυτά παράγουν και οι οποίες προκαλούν βλάβες στον άνθρωπο. Οι παθογόνοι µικροοργανισµοί ανήκουν σε διάφορες κατηγορίες οργανισµών (πρωτόζωα, µύκητες, βακτήρια, ιοί,). Πολλά από τα βακτήρια προκαλούν πολύ σοβαρές ασθένειες στον άνθρωπο. Όργανα και υλικά απαραίτητα για το πείραµα 1. Λύχνος Bunsen 2. Τρίποδο µε πλέγµα 3. Έξι (6) αποστειρωµένα τρυβλία Petri 4. Γυάλινη ράβδος ή σύρµα εµβολιασµού 5. Απεσταγµένο νερό, άγαρ (1), πεπτόνη (2) (υπάρχουν στο εµπόριο) 6. Κύβος ζωµού (3) 7. Χώµα (1) Άγαρ: παράγεται από ορισµένα φύκη της θάλασσας, τα ροδοφύκη. εν αποτελεί τροφή για τα µικρόβια, επειδή δεν διασπάται από τα ένζυµα τους. Χρησιµεύει σαν στερεωτικό των θρεπτικών υλικών επειδή έχει την ιδιότητα να λιώνει στους 80 o C και να πήζει σε θερµοκρασία κάτω των 45 o C. Στο εµπόριο φέρεται µε τη µορφή σκόνης. (2) Πεπτόνες: είναι προϊόντα διάσπασης πρωτεϊνούχων ουσιών µε πρωτεολυτικά ένζυµα. Παρασκευάζονται από διάφορους ζωικούς ιστούς, κυρίως από το κρέας, τα ψάρια, το γάλα, τα σπλάχνα σφαγίων ζώων. Είναι υδατοδιαλυτές και ανθεκτικές στη θέρµανση, δηλαδή δεν αλλοιώνονται µε τη θέρµανση κάτω από 100 o C. (3) Κύβος ζωµού (εκχύλισµα κρέατος): είναι το προϊόν που παίρνουµε από το βράσιµο κρέατος ή άλλων ιστών σε νερό και τη συµπύκνωση του ζωµού κάτω από ελαττωµένη πίεση. Πριν από τη συµπύκνωση αποµακρύνουµε από το ζωµό µε διήθηση τα λίπη και τις πρωτεΐνες που έχουν πήξει. 1 Συνεργάτης Υπεύθυνος βιολογίας: Νίκος Μπαντής
Πορεία του πειράµατος 1. Βάλτε το ειδικό θρεπτικό υλικό για καλλιέργειες στα τρυβλία Petri και αριθµήστε τα από το (1) έως το (6). (Η παρασκευή του θρεπτικού υλικού γίνεται µε 170 cm 3 απεσταγµένο νερό, 2,5 gr άγαρ σε σκόνη, 1 gr πεπτόνη και µισό κύβο ζωµού. Σε ζεστό νερό, περίπου στο σηµείο του βρασµού, διαλύστε το άγαρ σιγά σιγά. Προσθέστε την πεπτόνη και τον κύβο του ζωµού, ανακατεύοντας συνεχώς τα υλικά, και αφήστε το µείγµα να βράσει για λίγα λεπτά.) 2. Αφού βάλετε το θρεπτικό υλικό στα αποστειρωµένα τρυβλία, κλείστε τα (εάν υπάρχει δυνατότητα αποστειρωτικού κλιβάνου, αποστειρώστε τα για 15 λεπτά) και αφήστε το υλικό να κρυώσει. 3. Στη συνέχεια κάντε τις εξής ενέργειες: α. Αφήστε το τρυβλίο (1) ανοιχτό µέσα στην τάξη για 5 λεπτά. β. Αφήστε το τρυβλίο (2) ανοιχτό έξω από την τάξη για 5 λεπτά. γ. Ένας µαθητής ανοίγει το τρυβλίο (3) και το αγγίζει µε τα δάχτυλα του. δ. Ένας άλλος µαθητής ανοίγει το τρυβλίο (4) και το αγγίζει µε τα δάχτυλα του, αφού προηγουµένως έχει πλύνει τα χέρια του µε σαπούνι, χωρίς να τα σκουπίσει. ε. Βάλτε στο τρυβλίο (5) λίγο χώµα µε την γυάλινη ράβδο ή ένα σύρµα εµβολιασµού που έχετε αποστειρώσει προηγουµένως στη φωτιά. (Ο τρόπος µε τον οποίο εµβολιάζουµε το τρυβλίο, φαίνεται στις παρακάτω εικόνες). στ. Αφήστε το τρυβλίο (6) συνεχώς κλειστό, ώστε να χρησιµοποιηθεί για σύγκριση µε τα άλλα τρυβλία «µάρτυρας». 4. Τοποθετήστε τα τρυβλία σε θερµοκρασία δωµατίου και µακριά από το ηλιακό φως. 5. Μετά από δύο ηµέρες παρατηρήστε σε ποιο από τα αριθµηµένα τρυβλία έχουν εµφανιστεί αποικίες (διακρίνονται σαν στρογγυλοί υπόλευκοι κύκλοι). 6. Συνεχίστε να καταγράφετε τις παρατηρήσεις σας για 1-2 εβδοµάδες. Παρατηρείτε διαφορές ως προς τον αριθµό και το χρώµα των αποικιών στα διάφορα τρυβλία; 2 Συνεργάτης Υπεύθυνος βιολογίας: Νίκος Μπαντής
Παρατηρήσεις Κατά τη διεξαγωγή του πειράµατος πιθανόν να δηµιουργηθούν και αποικίες από µύκητες. Για να διακρίνετε τις αποικίες βακτηρίων από αυτές των µυκήτων, αναζητήστε την παρουσία υφών (νηµάτων) στις αποικίες των µυκήτων. Β. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΞΗΡΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΟΣ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Όργανα και υλικά απαραίτητα για το πείραµα α) Ένα από τα τρυβλία 1-5 που ετοιµάσατε µε την προηγούµενη διαδικασία. (Προτιµήστε το τρυβλιο µε τον αριθµό 5) β) Φυσιολογικός ορός ή απεσταγµένο νερό ή εµφιαλωµένο νερό. γ) Γυάλινη ράβδος ή σύρµα εµβολιασµού. δ) Λύχνος Bunsen. ε) Αντικειµενοφόρες πλάκες. Πορεία του πειράµατος 1. Στο κέντρο µιας καθαρής αντικειµενοφόρου πλάκας τοποθετούµε µια σταγόνα φυσιολογικού ορού ή απεσταγµένου νερού ή εµφιαλωµένου νερού, µε µια πιπέτα Pasteur. 2.Με την γυάλινη ράβδο ή το σύρµα εµβολιασµού παίρνουµε µικρή ποσότητα µικροβίων, από τις αποικίες της καλλιέργειας και κάνουµε µικρές και σταθερές κινήσεις µέσα στην σταγόνα του φυσιολογικού ορού ή απεσταγµένου νερού ή εµφιαλωµένου νερού της αντικειµενοφόρου πλάκας, που εξ αρχής έχουµε προετοιµάσει. Στην συνέχεια και αφού έχουµε δηµιουργήσει ένα εναιώρηµα µικροβίων µέσα στην σταγόνα, µε τη γυάλινη ράβδο ή το σύρµα εµβολιασµού, απλώνουµε τη σταγόνα µας κατά µήκος και κατά πλάτος της αντικειµενοφόρου πλάκας κάνοντας οµόκεντρους κύκλους, προσέχοντας να µην εξαπλωθεί το παρασκεύασµα µέχρι τις άκρες του περιγράµµατος της πλάκας. 3.Αφήνουµε στην συνέχεια την πλάκα µας µε το παρασκεύασµα, να στεγνώσει ή µπορούµε να την κουνάµε πάνω κάτω, κοντά στη φλόγα. 4. Αφού περιµένουµε 5-10 min για το στέγνωµα της πλάκας, στην συνέχεια επακολουθεί το στάδιο της µονιµοποίησης του παρασκευάσµατος. Κατά το στάδιο αυτό ενεργούµε ως εξής: Την περνάµε πολύ γρήγορα πάνω από την φλόγα, κρατώντας την µε µια ξύλινη λαβίδα (ή µανταλάκι), από µία έως τέσσερις φορές, έτσι ώστε να δώσουµε την ευκαιρία στα µικρόβια να καθηλωθούν επάνω στην επιφάνεια της πλάκας και να µην είναι εύκολο να αποκολληθούν ή να παραµορφωθούν κατά τη διαδικασία της χρώσης του παρασκευάσµατος. 5. Μετά τη µονιµοποίηση των µικροβίων επάνω στην αντικειµενοφόρο πλάκα επακολουθεί το στάδιο της χρώσης. Μια απλή χρώση που µπορούµε να χρησιµοποιήσουµε είναι η «τεχνική χρώσης µπλε του µεθυλενίου» µε την οποία βάφονται όλα ανεξαιρέτως τα βακτήρια. Η χρωστική, που χρησιµοποιείται κατά την διαδικασία της χρώσης αυτής είναι το µπλε του µεθυλενίου. Τα στάδια της χρώσης είναι τα ακόλουθα: α) Καλύπτουµε το παρασκεύασµα µε την χρωστική για 1 λεπτό. β) Ξεπλένουµε µε νερό βρύσης. 3 Συνεργάτης Υπεύθυνος βιολογίας: Νίκος Μπαντής
γ) Αφήνουµε το παρασκεύασµα να στεγνώσει ή το τοποθετούµε ανάµεσα σε δύο φύλλα διηθητικού χαρτιού (χαρτί κουζίνας). Έτσι είναι έτοιµο για µικροσκόπηση. 6. Μετά το τέλος της χρώσης του παρασκευάσµατος µας, επακολουθεί το στάδιο της µικροσκόπησης. Η µικροσκόπηση των ξηρών παρασκευασµάτων γενικά γίνεται µε καταδυτικό φακό, τον 100Χ έχοντας τελείως ανοικτό το διάφραγµα και την ένταση του φωτός, έτσι ώστε να επικρατεί άπλετος φωτισµός στο οπτικό µας πεδίο. Πριν ξεκινήσει η µικροσκόπηση του παρασκευάσµατος, τοποθετούµε στο κέντρο αυτού µια σταγόνα κεδρέλαιου, του οποίου ο ρόλος είναι να βελτιώσει τις συνθήκες µικροσκόπησης του αντικειµένου µας. ΦΥΛΛΟ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Καλλιέργεια βακτηρίων - Μικροσκοπική παρατήρηση 1. Καταγράψτε τις παρατηρήσεις σας στον πίνακα: Τρυβλίο Αριθµός αποικιών Μέγεθος αποικιών Παρουσία αποικιών µυκήτων ΝΑΙ ΟΧΙ 1 2 3 4 5 6 2. Σε ποιο τρυβλίο αναπτύχθηκαν οι περισσότερες και σε ποιο οι λιγότερες αποικίες; Αιτιολογήστε τις απαντήσεις σας.. 3. Πως εξηγείτε την παρουσία των µικροβίων στα διάφορα τρυβλία;. 4 Συνεργάτης Υπεύθυνος βιολογίας: Νίκος Μπαντής
4. Ποια είναι η επίδραση του σαπουνιού στην ανάπτυξη των µικροβίων;. 5. Ποιος είναι ο λόγος για τον οποίο βράζουµε για µερικά λεπτά το διάλυµα του θρεπτικού υλικού; Τι ρόλο παίζει ο κύβος του ζωµού στο θρεπτικό υλικό;. 6. Γιατί συνηθίζουµε να κλείνουµε τα τρυβλία Petri κατά τη διάρκεια ενός πειράµατος;. 7. Σχεδιάστε ένα τµήµα του παρασκευάσµατος µε βακτήρια. 40x 100x 5 Συνεργάτης Υπεύθυνος βιολογίας: Νίκος Μπαντής