ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Γ. ηµητριάδης Π. Κατσώρης Σ. Τσάκας ΠΑΤΡΑ 2013

2

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Γενική αίµατος 1. Επίχρισµα αίµατος 2. Χρώση και παρατήρηση κυτταρικών τύπων 3. Πήξη αίµατος χρόνος προθροµβίνης Έλεγχος νεφρικών λειτουργιών 1. Γενική ούρων stick ούρων 2. Γενική ούρων µικροσκοπική παρατήρηση 3. Προσδιορισµός ουρίας, κρεατινίνης 4. Κάθαρση ουρίας, κάθαρση κρεατινίνης Χηµική ανάλυση ουρόλιθου ιερεύνηση αναιµίας 1. Ηλεκτροφορητική ανάλυση αιµοσφαιρινών ιερεύνηση φλεµονής 1. C αντιδρώσα πρωτεΐνη 2. Ταχύτητα καθίζησης ερυθρών ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι αναλύσεις οι οποίες επιλέχθηκαν για το πρακτικό µέρος του µαθήµατος «Κλινικό Εργαστήριο» είναι µερικές από αυτές που εφαρµόζονται σήµερα σε ένα τέτοιο χώρο. Στο φυλλάδιο εργαστηριακών ασκήσεων αναφέρεται επιγραµµατικά η θεωρία κάθε άσκησης, αφού ο φοιτητής µπορεί να ανατρέξει για περισσότερες λεπτοµέρειες στις σηµειώσεις του µαθήµατος. Στόχος τόσο του µαθήµατος όσο και του Εργαστηρίου, κυρίως, είναι να έχει τη αίσθηση ο φοιτητής, έστω και για λίγο ότι βρίσκεται πράγµατι, σε ένα Κλινικό Εργαστήριο και είναι υπεύθυνος για το αποτέλεσµα που θα δώσει. Κάτι που µπορεί να συµβεί και στην πραγµατικότητα µετά από δύο χρόνια. Όλες οι ασκήσεις είναι υποχρεωτικές και απουσία σε µια από αυτές αφαιρούν το δικαίωµα συµµετοχής στις τελικές εξετάσεις. Σε όλες τις ασκήσεις είναι υποχρεωτική η εργαστηριακή ρόµπα. Πριν την έναρξη των ασκήσεων θα έχει προηγηθεί σεµινάριο για το χειρισµό των δειγµάτων και των κανόνων ασφαλείας. Η βαθµολογία των Εργαστηρίων θα είναι το αποτέλεσµα της συνεχούς προφορικής εξέτασης κατά τη διάρκεια µιας άσκησης, καθώς και µιας σύντοµης γραπτής δοκιµασίας. Η ύλη των εργαστηριακών ασκήσεων περιλαµβάνεται στην εξεταστέα ύλη του µαθήµατος. 3

4

ΚΛΙΝΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΣΚΗΣΗ 1 Γενική αίµατος Επίχρισµα αίµατος Χρώση και παρατήρηση κυτταρικών τύπων Πήξη αίµατος χρόνος προθροµβίνης 5

6

Γενική αίµατος Με τον όρο γενική αίµατος εννοούµε την εξέταση δείγµατος από περιφερικό αίµα που δίνει πληροφορίες τόσο για τον αριθµό των κυτταρικών τύπων όσο και για το µέγεθος και το σχήµα τους. Το αίµα, µέσω των έµµορφων συστατικών του, επιτελεί τρεις πολύ σηµαντικές λειτουργίες: α) µεταφορά οξυγόνου στους ιστούς µε τα ερυθρά αιµοσφαίρια, β) κυτταροφαγία και παραγωγή αντισωµάτων µε τα λευκά αιµοσφαίρια και γ) συµµετοχή στην πήξη του αίµατος µε τα αιµοπετάλια. Σήµερα, η γενική αίµατος γίνεται αρχικά σε αυτόµατο αιµατολογικό αναλυτή και δίνει πληροφορίες για αριθµό ερυθρών, λευκών και αιµοπεταλίων, αιµατοκτρίτη, συγκέντρωση αιµοσφαιρίνης καθώς και διάφορα υπολογιστικά µεγέθη, που αφορούν τον όγκο των ερυθρών και την περιεχόµενη αοµοσφαιρίνη σε αυτά (εικόνα 1). Εικόνα 1. Έκθεση αποτελεσµάτων γενικής αίµατος από αιµατολογικό αναλυτή Όταν όµως παρουσιαστούν στη έκθεση των αποτελεσµάτων του αιµατολογικού αναλυτή σηµαντικές ανωµαλίες, σε έναν ή περισσότερους κυτταρικούς πληθυσµούς, ακολουθεί οπτική επιβεβαίωση, που γίνεται µε µικροσκοπική παρατήρηση επιχρίσµατος περιφερικού αίµατος σε αντικειµενοφόρο πλάκα ή κοινώς πλακάκι. Στην εξέταση αυτή επίχρισµα αίµατος απλώνεται σε λεπτή στιβάδα σε αντικειµενοφόρο πλάκα (εικόνα 2) και αφού στεγνώσει, βάφεται µε ειδικές χρωστικές. Ο κλινικός εργαστηριακός επιστήµονας, στη συνέχεια, εκτιµά τα φυσικά χαρακτηριστικά των ερυθρών και λευκών αιµοσφαιρίων στο µικροσκόπιο και οποιαδήποτε 7

επιπρόσθετη πληροφορία καταγράφεται και αναφέρεται στον Μικροβιολόγο ή Αιµατολόγο ιατρό που έχει και την ευθύνη των αποτελεσµάτων. Ερυθρά αιµοσφαίρια (RBC) Τα ερυθρά αιµοσφαίρια είναι κύτταρα µε σχήµα αµφίκοιλου φακού και στο µικροσκόπιο εµφανίζονται µε ελαφρά κόκκινο χρώµα. Η γενική αίµατος µας δίνει πληροφορίες για τη συγκέντρωση των ερυθρών αιµοσφαιρίων και εάν ο πληθυσµός των ερυθρών αιµοσφαιρίων είναι ο φυσιολογικός, τόσο µορφολογικά όσο και στην περιεκτικότητα του σε αιµοσφαιρίνη. Σε φυσιολογικές καταστάσεις τα ερυθρά αιµοσφαίρια έχουν όλα το ίδιο µέγεθος και σχήµα. Αλλαγές παρατηρούνται σε έλλειψη βιταµίνης Β12 και φυλικού οξέως, σε έλλειψη σιδήρου και σε παρουσία µη φυσιολογικής αιµοσφαιρίνης. Ένα άτοµο µπορεί να έχει ερυθρά αιµοσφαίρια µε φυσιολογικό µέγεθος και σχήµα αλλά είναι λιγότερα στον αριθµό, είτε λόγω αναιµίας είτε λόγω απώλειας αίµατος. Σε αντίθετη περίπτωση, µπορεί στο αίµα να κυκλοφορούν πολύ περισσότερα ερυθρά αιµοσφαίρια (ερυθραιµία ή ερυθροκυττάρωση), γεγονός που µπορεί νε οδηγήσει σε παρεµπόδιση της φυσιολογικής ροής του αίµατος. σταγόνα αίµατος Εικόνα 2. Στάδια παρασκευής επιχρίσµατος αίµατος Λευκά αιµοσφαίρια (WBC) Τα λευκά αιµοσφαίρια είναι υπεύθυνα για την προστασία του οργανισµού από την εισβολή µικροοργανισµών και επιβλαβών ουσιών. ιακρίνονται σε πέντε κατηγορίες: ουδετερόφιλα, λεµφοκύτταρα, βασεόφιλα, ηωσινόφιλα και µονοπύρηνα. Η αναλογία των πέντε τύπων των λευκών αιµοσφαιρίων είναι σταθερή και µεταβάλλεται ανάλογα σε κάθε νοσογόνο κατάσταση. Έτσι µια λοίµωξη µπορεί να επάγει την παραγωγή ουδετερόφιλων σε µεγάλη συγκέντρωση για να καταπολεµηθεί το βακτήριο-εισβολέας. Στις αλλεργίες αυξάνεται ο αριθµός των ηωσινόφιλων που απελευθερώνουν αντιισταµινικές ουσίες για να ελαχιστοποιήσουν την 8

αλλεργική αντίδραση. Τα λεµφοκύτταρα επάγονται για να παράγουν αντισώµατα. Σε παθολογικές καταστάσεις, όπως η λευχαιµία, εµφανίζονται πρόδροµες µορφές λευκών αιµοσφαιρίων (βλαστοκύτταρα) ενώ αυξάνεται και ο αριθµός. Αιµοπετάλια Τα αιµοπετάλια είναι ειδικά κυτταρικά θραύσµατα που συµµετέχουν στην πήξη του αίµατος. Ασθενής που δεν έχει αρκετά αιµοπετάλια, έχει αυξηµένο κίνδυνο για σοβαρή αιµορραγία. Στη γενική αίµατος µετράµε τον αριθµό και το µέγεθος των αιµοπεταλίων. Σε κάποιες περιπτώσεις, στη γενική αίµατος καταγράφεται αυξηµένο µέγεθος αιµοπεταλίων που µπορεί να οφείλεται σε συσσώρευση τους, µε αποτέλεσµα να µην είναι αξιόπιστη καταµέτρησή τους από τον αναλυτή. Στην περίπτωση αυτή επιβάλλεται η εξέταση επιχρίσµατος περιφερικού αίµατος. Χρόνος προθροµβίνης Με την ανάλυση του χρόνου προθροµβίνης (prothrombin time, PT) διερευνώνται προβλήµατα που σχετίζονται µε αιµορραγίες και µειωµένη πηκτική ικανότητα του αίµατος. Η ανάλυση αυτή βασίζεται στην προσθήκη αντιδραστηρίου που περιέχει θροµβοπλαστίνη και ιόντα ασβεστίου σε δείγµα πλάσµατος και στη συνέχεια µέτρηση του χρόνου που απαιτείται για να δηµιουργηθεί και να γίνει ορατός µε γυµνό µάτι θρόµβος. Ένας παρατεταµένος χρόνος PT συνήθως υποδηλώνει ανεπάρκεια σε έναν ή περισσότερους παράγοντες του εξωγενούς συστήµατος πήξης του αίµατος. Η δυσλειτουργία αυτή µπορεί να οφείλεται σε κληρονοµικά αίτια, ανεπάρκεια βιταµίνης Κ, ηπατική νόσο ή λήψη φαρµάκων. Αρχή της µεθόδου Η θροµβοπλαστίνη ενεργοποιεί το εξωγενές σύστηµα πήξης του αίµατος, παρουσία ιόντων ασβεστίου, µε αποτέλεσµα την υδρόλυση του ινοδογόνου και το σχηµατισµό πλέγµατος ινίνης. Έτσι σε περίπτωση έλλειψης κάποιου παράγοντα πήξης η δηµιουργία ορατού θρόµβου θα απαιτήσει περισσότερο χρόνο. 9

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ Φλεβικό αίµα σε σωληνάκι µε αντιπηκτικό K 2 EDTA Φλεβικό αίµα σε σωληνάκι µε αντιπηκτικό οξαλικά ιόντα Αντικειµενοφόρες πλάκες και καλυπτρίδες Γάντια οχεία χρώσης Μεθανόλη Χρωστική May-Grünwall Χρωστική Giesma Μικροσκόπιο Σωλήνες καθίζησης Αντιδραστήριο θροµβοπλαστίνης Χρονόµετρο Υδατόλουτρο 37 ο C ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΕΠΙΧΡΙΣΜΑΤΟΣ Τοποθετείστε µια µικρή ποσότητα αίµατος (10 µl) στην άκρη µιας αντικειµενοφόρου πλάκας. Φέρτε σε επαφή µε το αίµα την µικρή πλευρά µιας άλλης αντικειµενοφόρου, την οποία στην συνέχεια σύρετε υπό γωνία 30 ο -40 ο προς την άλλη άκρη ώστε να απλώσετε τη σταγόνα αίµατος όπως φαίνεται στο σχήµα. Αφήστε το παρασκεύασµα να στεγνώσει για 15-20 min. ΧΡΩΣΗ Τοποθέτηση δειγµάτων σε δοχείο µε µεθανόλη για 5 min. Μεταφορά δειγµάτων σε δοχείο µε χρωστική May- Grünwall Ξέπλυµα µε άφθονο νερό βρύσης Μεταφορά δειγµάτων σε δοχείο µε χρωστική Giemsa Ξέπλυµα µε άφθονο νερό βρύσης Στέγνωµα και επικάλυψη µε µια σταγόνα γλυκερόλης Τοποθέτηση καλυπτρίδας ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ Παρατηρείστε τα παρασκευάσµατα στο µικροσκόπιο µε αντικειµενικό φακό 40x. Προσπαθήστε να αναγνωρίσετε τους διάφορους τύπους των λευκών αιµοσφαιρίων. Παρατηρήστε τα ερυθρά αιµοσφαίρια και τα αιµοπετάλια 10

ΧΡΟΝΟΣ ΠΡΟΘΡΟΜΒΙΝΗΣ Τοποθετείστε σωληνάκι µε 100 µl πλάσµα σε υδατόλουτρο 37 ο C Τοποθετείστε σωληνάκι µε 200 µl αντιδραστήριο θροµβοπλαστίνης σε υδατόλουτρο 37 ο C Μετά από 5 min µεταφέρετε µε πιπέτα, το αντιδραστήριο στο σωληνάκι του δείγµατος Ταυτόχρονα ενεργοποιήστε το χρονόµετρο και ανακινώντας το σωληνάκι απαλά µέσα στο υδατόλουτρο καταγράψτε µετά από πόσα sec δηµιουργήθηκε θρόµβος. 11

12

ΚΛΙΝΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΣΚΗΣΗ 2 Έλεγχος νεφρικών λειτουργιών Γενική ούρων stick ούρων Γενική ούρων µικροσκοπική παρατήρηση Προσδιορισµός ουρίας, κρεατινίνης Κάθαρση ουρίας, κάθαρση κρεατινίνης Χηµική ανάλυση ουρόλιθου 13

14

Έλεγχος νεφρικών λειτουργιών Οι νεφροί παίζουν σηµαντικό ρόλο στην οµοιόσταση του οργανισµού, αφού ρυθµίζουν το ισοζύγιο ύδατος, τη συγκέντρωση βασικών ηλεκτρολυτών και την αποµάκρυνση τοξικών ουσιών. Επίσης συµµετέχουν στη ρύθµιση της αιµοποίησης µε την παραγωγή ερυθροποιητίνης και στη ρύθµιση της πίεσης του αίµατος µε την παραγωγή ρενίνης. Με βάση αυτά τα δεδοµένα, εξωκρινική ή ενδοκρινική δυσλειτουργία των νεφρών σηµαίνει αυτόµατα εµφάνιση αναιµίας, υπέρτασης και τοξικότητας, όχι απαραίτητα µε αυτή τη σειρά, µε ό,τι επιπλοκές µπορεί να εµφανιστούν σε άλλα όργανα. Ο αρχικός έλεγχος των νεφρικών λειτουργιών περιλαµβάνει τη γενική ούρων και την ικανότητα απέκκρισης τοξικών ουσιών. Γενική ούρων Η γενική ούρων ξεκινάει µε τη µακροσκοπική εικόνα ενός δείγµατος πρωινών ούρων και αφορά το χρώµα (κιτρινωπό, κοκκινωπό, κίτρινο ιριδίζον) και τη διαύγεια ή τη θολερότητα του. Στη συνέχεια ακολουθεί προσδιορισµός διαφόρων παραµέτρων µε τα λεγόµενα stick ούρων. Αυτά είναι πλαστικές ταινίες που φέρουν στην επιφάνεια τους αντιδραστήρια ξηράς χηµείας για τον ηµιποσοτικό προσδιορισµό ειδικού βάρους, νιτρικών αλάτων, αιµοσφαιρίνης, πρωτεϊνών, γλυκόζης, κετονοσωµάτων, ουροχολινογόνου και παρουσίας λευκών αιµοσφαιρίων. Σε περίπτωση που ένας από τους παραπάνω δείκτες είτε µακροσκοπικά είτε στο stick, φανεί µη φυσιολογικός, ακολουθεί µικροσκοπική παρατήρηση του ιζήµατος των ούρων µετά από φυγοκέντρηση. Η µικροσκοπική παρατήρηση αφορά παρουσία ερυθρών και λευκών αιµοσφαιρίων, κρυσταλλικών σχηµατισµών από άλατα, κυλίνδρων, επιθηλιακών κυττάρων και µικροοργανισµών. Κρεατινίνη και ουρία ορού Η κρεατινίνη και η ουρία είναι οι βασικοί βιοχηµικοί δείκτες για τον έλεγχο της νεφρικής λειτουργίας. Η κρεατινίνη διηθείται από το σπείραµα και απεκκρίνεται στα ούρα. Η ουρία αντίθετα ενώ διηθείται από το σπείραµα, ένα µέρος της επαναρροφάται από το νεφρικό σωληνάρια µε αποτέλεσµα η συγκέντρωση της στο ορό να είναι µεγαλύτερη από αυτή της κρεατινίνης. Ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης τους στον ορό γίνεται φασµατοφωτοµετρικά. Η συγκέντρωση της κρεατινίνης γίνεται µε κινητική αντίδραση και της ουρίας µε ανττίδραση τελικού σηµείου. Κάθαρση κρεατινίνης και ουρίας Η κάθαρση µιας ουσίας από τον οργανισµό είναι ένα υπολογιστικό θεωρητικό µέγεθος που αφορά τον όγκο αίµατος που καθαρίζεται από αυτή την ουσία ανά λεπτό. Στην περίπτωση της κρεατινίνης η κάθαρση της είναι ανάλογη του ρυθµού σπειραµατικής διήθησης του νεφρού, αφού διηθείται πλήρως και δεν επαναρροφάται. Η κρεατινίνη δεν είναι τοξική για τον οργανισµό αλλά η κάθαρση και η συγκέντρωση της είναι ανάλογες µε αυτές των διαφόρων τοξινών οι οποίες αποµακρύνονται από το αίµα, µέσω των νεφρών. 15

Φασµατοφωτοµετρία ιάφορες ουσίες που περιέχουν συγκεκριµένες δοµές στο µόριο τους, απορροφούν είτε την ορατή ακτινοβολία, όπως η αιµοσφαιρίνη λόγω της αίµης, είτε την υπεριώδη ακτινοβολία, όπως οι πρωτεΐνες λόγω των αρωµατικών δακτυλίων διαφόρων αµινοξέων. Κάθε τέτοιο µόριο απορροφά ακτινοβολία συγκεκριµένου µήκους κύµατος, κάνοντας την φασµατοφωτοµετρία ένα χρήσιµο εργαλείο του εργαστηρίου. Σύµφωνα µε το νόµο των Lambert και Beer εάν µια ακτινοβολία µε µήκος κύµατος λ και ένταση I ο περάσει µια διαδροµή a µέσα από διάλυµα µιας ουσίας µε συγκέντρωση c και συντελεστή µοριακής απορρόφησης b, τότε το διάλυµα θα εκπέµψει ακτινοβολία µε ένταση I. Το µέγεθος log I/I o ονοµάζεται οπτική πυκνότητα OD (optical density) και συνδέεται µε τα υπόλοιπα µεγέθη σύµφωνα µε τον τύπο: OD λ = - log I/I o = a x b x c Στην ουσία ο τύπος αυτός µας λέει ότι η ένταση του χρώµατος µιας διαλυµένης έγχρωµης ουσίας είναι ευθέως ανάλογο µε την συγκέντρωση της. Σε περίπτωση όπου θέλουµε να βρούµε τη συγκέντρωση ενός άχρωµου µορίου σε ένα διάλυµα αρκεί µε µια χηµική ή ενζυµική αντίδραση ώστε να δηµιουργηθεί ένα έγχρωµο προϊόν, του οποίου η αύξηση της OD θα είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της ουσίας που µελετάµε και συµµετείχε σε αυτή την αντίδραση. Φασµατοφωτοµετρία τελικού σηµείου Όταν η παραγωγή έγχρωµου προϊόντος γίνει αυτόµατα µε την ανάµιξη των συστατικών της χηµικής αντίδρασης τότε µιλάµε για φασµατοφωτοµετρία τελικού σηµείου. Με αυτό τον τρόπο προσδιορίζεται η συγκέντρωση της ουρίας σε ένα βιολογικό υγρό µε προσθήκη το οποίο σχηµατίζει µε την ουρία έγχρωµο σύµπλοκο του οποίου η οπτική πυκνότητα στα 520nm, είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της ουρίας. Φασµατοφωτοµετρία κινητικής Όταν η αλλαγή του χρώµατος γίνεται σταδιακά µε την πάροδο του χρόνου και ακολουθεί παραβολική καµπύλη, όπως µια ενζυµική αντίδραση, τότε µιλάµε για φασµατοφωτοµετρία κινητικής αντίδρασης. Έτσι γίνεται ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης της κρεατινίνης η οποία δηµιουργεί έγχρωµο σύµπλοκο µε το πικρικό οξύ σε αλκαλικό περιβάλλον, το οποίο απορροφά στα 490 nm. Η δηµιουργία του συµπλόκου είναι σταδιακή σχεδόν ανάλογη στην αρχή µέχρι που επιβραδύνει και σταθεροποιείται µετά από µερικά λεπτά. 16

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ είγµατα ούρων (πρωινή συλλογή) είγµατα ορών Stick ούρων Κλινική φυγόκεντρος Σωληνάκια φυγοκέντρου Φασµατοφωτόµετρο Ρυθµιζόµενες πιπέτες 10-100 µl, 100-1000 µl Σωληνάρια Falcon Σωληνάρια RIA Κυβέτες φωτοµέτρου Kit προσδιορισµού ουρίας Kit προσδιορισµού κρεατινίνης Χρονόµετρο STICK ΟΥΡΩΝ Βυθίστε από µια ταινία (stick) ούρων σε κάθε δείγµα ούρων και αφού αφήσετε να αποµακρυνθεί η περίσσεια υγρού ακουµπήστε την στο στόµιο του δοχείου. Μετά από 3-5 λεπτά καταγράψτε την αλλαγή του χρώµατος και κάντε την αντιστοίχιση για τον ηµιποσοτικό προσδιορισµό. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΙΖΗΜΑΤΟΣ ΟΥΡΩΝ Μεταφέρετε σε πλαστικό σωληνάκι Falcon 10 ml ούρων. Φυγοκεντρήστε για 5 λεπτά σε 2.500 στροφές. Αδειάστε το υπερκείµενο χωρίς να στραγγίσετε. Επαναιωρείστε το ίζηµα στη µικρή ποσότητα υγρού που έχει µείνει στο σωληνάκι. Μεταφέρετε 50 µl σε µια αντικειµενοφόρο πλάκα και Παρατηρείστε στο µικροσκόπιο µε φακό 40Χ. ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΟΥΡΙΑΣ Ετοιµάστε σωληνάρια RIA για τα δείγµατα, συν δύο ακόµα για control και τυφλό Προσθέστε από 1 ml αντιδραστήριο Ρυθµίστε το φωτόµετρο σε µήκος κύµατος 520 nm Προσθέστε 25 µl από κάθε δείγµα Τοποθετείστε την κυβέτα στο φωτόµετρο Καταγράψτε την οπτική πυκνότητα των δειγµάτων Για τα δείγµατα ούρων κάντε αραίωση 1/10 17

ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΚΡΕΑΤΙΝΙΝΗΣ Ετοιµάστε κυβέτες φωτοµέτρου για τα δείγµατα, συν µια ακόµα για control Προσθέστε από 1 ml αντιδραστήριο Ρυθµίστε το φωτόµετρο σε µήκος κύµατος 490 nm Μηδενίστε το χρονόµετρο Προσθέστε 100 δείγµα control και ταυτόχρονα εκκινήστε το χρονόµετρο Τοποθετείστε την κυβέτα στο φωτόµετρο Σε χρόνο 20 sec µηδενίστε το φωτόµετρο Σε χρόνο 1 min 20 sec καταγράψτε την ένδειξη του φωτοµέτρου Επαναλάβετε τη διαδικασία για όλα τα δείγµατα ορού και ούρων Για τα δείγµατα ούρων κάντε αραίωση 1/10 ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΘΑΡΣΗΣ ΚΡΕΑΤΙΝΙΝΗΣ ΚΑΙ ΟΥΡΙΑΣ Υπολογίστε την ηµερήσια απέκκριση κρεατινίνης και ουρίας Υπολογίστε τις καθάρσεις κρεατινίνης και ουρίας Συγκρίνεται τα παραπάνω µεγέθη µε τις φυσιολογικές τιµές 18

ΚΛΙΝΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΣΚΗΣΗ 3 ιερεύνηση αναιµίας Ηλεκτροφορητική ανάλυση αιµοσφαιρινών ιερεύνηση φλεγµονής C αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP) Ταχύτητα καθίζησης ερυθρών 19

20

ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ Η αιµοσφαιρίνη (hemoglobin, Hb) είναι η κύρια πρωτεΐνη των ερυθρών αιµοσφαιρίων, η οποία δεσµεύει οξυγόνο από τους πνεύµονες και το µεταφέρει στους ιστούς. Η σύνθεση της φυσιολογικής αιµοσφαιρίνης Hb A, στα ενήλικα άτοµα, είναι του τύπου α 2 β 2. Εκτός από τις αµινοξικές αντικαταστάσεις σε αλυσίδες της φυσιολογικής αιµοσφαιρίνης, µη φυσιολογικά µόρια δηµιουργούνται και από τη αντικατάσταση και των δύο β αλυσίδων από άλλες, µε εντελώς διαφορετική αµινοξική αλληλουχία και ηλεκτροφορητική κινητικότητα (Πίνακας 1). Τέτοιες αιµοσφαιρίνες είναι η Hb A 2 (α 2 δ 2 ) και η Hb F (α 2 γ 2 ), που έχουν µικρότερη ικανότητα πρόσληψης του οξυγόνου σε σχέση µε την Hb A. ΑΝΑΙΜΙΑ ΚΑΙ ΟΜΙΚΕΣ ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ ΤΗΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ Η αιµοσφαιρίνη αποτελείται από δύο ζεύγη πολυπεπτιδικών αλυσίδων που η κάθε µία περιέχει ένα µόριο αίµης που έχει ένα δισθενές άτοµο σιδήρου στο κέντρο. Στα ενήλικα άτοµα η φυσιολογική αιµοσφαιρίνη (Hb A) αποτελείται από ένα ζεύγος αλυσίδων α και ένα ζεύγος β (α 2 β 2 ). Μη φυσιολογικά µόρια αιµοσφαιρίνης προκαλούν αναιµία και αυτά µπορεί να δηµιουργηθούν είτε από αλλαγή της αµινοξικής αλληλουχία των α και β αλυσίδων, είτε από αντικατάσταση των β αλυσίδων από άλλες, µε διαφορετική αµινοξική αλληλουχία και διαφορετικές ιδιότητες ως προς την πρόσληψη του οξυγόνου. Η πιστοποίηση της ύπαρξης µη φυσιολογικών αιµοσφαιρινών γίνεται µε ηλεκτροφορητική ανάλυση, όπου οι διάφοροι τύποι κινούνται, κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου, σε διαφορετικές αλλά συγκεκριµένες θέσεις, λόγω διαφορετικού φορτίου (εικόνα 1). ρεπανοκυτταρική αναιµία Η αντικατάσταση του πολικού γλουταµινικού οξέος στη θέση 5 των β αλυσίδων της αιµοσφαιρίνης, από το µη πολικό βαλίνη, λόγω σηµειακής µεταλλαγής του γονιδίου, έχει ως αποτέλεσµα το µεταλλαγµένο µόριο να χάσει αρνητικό φορτίο και να υστερεί σε ηλεκτροφορητική κινητικότητα. Σε µια ηλεκτροφόρηση, η αιµοσφαιρίνη S δίνει µια ζώνη στη µέση περίπου του ηλεκτροφορήµατος. Όµως, η εµφάνιση µιας τέτοιας ζώνης, δεν σηµαίνει και απαραίτητα ύπαρξη δρεπανοκυτταρικής αιµοσφαιρίνης, αφού την ίδια περίπου κινητικότητα έχει και µια άλλη αιµοσφαιρίνη, που ονοµάζεται αιµοσφαιρίνη C (Hb C) και προέρχεται επίσης από σηµειακή µεταλλαγή. β-θαλασσαιµία Σε κάθε άνθρωπο κάθε µια από τις α-αλυσίδα και β-αλυσίδες κληρονοµείται από τον ένα γονέα. Σε ετεροζυγωτία, µε µη λειτουργικές β-αλυσίδες, αυξάνεται η σύνθεση της λειτουργικής Hb A, συµπληρώνεται από αύξηση της σύνθεσης Hb A 2 που εµφανίζεται µε αύξηση του ποσοστού της 3,5%-6,5% (στίγµα). Σε περίπτωση οµοζυγωτίας στην προηγούµενη περίπτωση, η Hb A εξαφανίζεται εντελώς και στη θέση της αρχίζει να συνθέτονται γ-αλυσίδες, µε αποτέλεσµα την εµφάνιση Hb F αιµοσφαιρίνης, ενώ αυξάνεται και η σύνθεση της Hb A 2. 21

Πίνακας 1. Ηλεκτροφορητική ανάλυση αιµοσφαιρινών Ηλεκτροφορητική ζώνη Είδος αιµοσφαιρίνης Λειτουργία (+) Hb A (96-98 %) Αιµοσφαιρίνη Α Η φυσιολογική αιµοσφαιρίνη των ενηλίκων Hb F (0-2 %) Εµβρυική αιµοσφαιρίνη Αιµοσφαιρίνη που εµφανίζεται στο εµβρυικό στάδιο Hb C/S (0 %) Αιµοσφαιρίνη C ή S Αιµοσφαιρίνης C ή S από σηµειακή µεταλλαγή Hb A2 (1,8-3,3 %) Αιµοσφαιρίνη A2 Αιµοσφαιρίνη που υπάρχει στους ενήλικες σε µικρό ποσοστό Καρβονική ανυδράση (-) Βοηθάει τη δέσµευση Ο 2 και CO 2 στα ερυθρά αιµοσφαίρια Hb A Hb F Hb C/S Hb A 2 Εικόνα 1. Ηλεκτροφορητική ανάλυση αιµοσφαιρινών 22

Ταχύτητα καθίζησης ερυθρών Σε ένα δείγµα αίµατος, σε ηρεµία, τα ερυθρά καθιζάνουν λόγω βάρους µε την πάροδο του χρόνου. Το ύψος της στήλης του πλάσµατος σε mm µετά από 1 h ονοµάζεται ταχύτητα καθίζησης ερυθρών. Η ταχύτητα καθίζησης ερυθρών είναι µια εύκολη, απλή και οικονοµική εξέταση που συνήθως συνοδεύει ένα παραπεµπτικό γενικής αίµατος. Μια αυξηµένη τιµή σε αυτή την εξέταση δηµιουργεί υποψίες για την ύπαρξη κάποιας φλεγµονής, λοίµωξης ή γενικά µιας διαταραχής στην ισορροπία του οργανισµού. CRP Η φλεγµονή (inflammation) είναι ένα σύνολο διεργασιών, σε ένα ιστό, ως αντίδραση σε κάποια βλάβη. Τα συµπτώµατά της φλεγµονής είναι οίδηµα, ερυθρότητα, πόνος και πολλές φορές πυρετός. Η οξεία φλεγµονή (acute inflammation), όπως µια παιδική ασθένεια ή σκωλικοειδίτιδα, συνήθως συνοδεύεται από αύξηση των πολυµορφοπύρηνων κυττάρων στο αίµα, αύξηση της C- αντιδρώσας πρωτεΐνης (CRP) στον ορό και αύξηση της ταχύτητας καθίζησης των ερυθρών αιµοσφαιρίων (ΤΚΕ). Παράλληλα, τόσο στη χρόνια όσο και στην οξεία φλεγµονή, ως απόκριση του οργανισµού, παρουσιάζεται αλλοίωση του ηλεκτροφορητικού προτύπου των πρωτεϊνών του ορού. Ο πιο γρήγορος τρόπος για την ταυτοποίηση και την παρακολούθηση της πορείας µιας φλεγµονής είναι ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης της στον ορό. Μέχρι πρότινος αυτό γινόταν αποκλειστικά µε ανοσοσυγκόλληση, όµως τα τελευταία χρόνια χρησιµοποιούνται µέθοδοι που βασίζονται στη νεφελοµετρία και γίνονται σε βιοχηµικό αναλυτή. Αρχή της µεθόδου Η αναοσοσυγκόλληση χρησιµοποιεί πολυµερή σφαιρίδια που φέρουν στην επιφάνεια τους αντισώµατα έναντι της CRP. Η ανάµιξη αντιδραστηρίου σφαιριδίων µε ίση ποσότητα ορού δίνει αναοσοσυγκόλληση, σε συγκεντρώσεις CRP πάνω από το φυσιολογικό όριο των 6 µg/ml. Για τον ηµιποσοτικό προσδιορισµό της συγκέντρωσης της, χρησιµοποιούµε υποδιπλασιαζόµενες αραιώσεις ορού µέχρι να προσδιοριστεί η µέγιστη αραίωση που δίνει ανοσοσυγκόλληση. Στην περίπτωση αυτή η συγκέντρωση της CRP ισούται µε τι γινόµενο 6 µg/ml επί το συντελεστή αραίωσης. 23

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΙΑΛΥΜΑΤΑ Συσκευή ηλεκτροφόρησης - Τροφοδοτικό συνεχούς ρεύµατος Συσκευή εναπόθεσης δειγµάτων (εικόνα 2) Θάλαµος θερµού αέρα Θήκη πηκτώµατος για χρώση οχεία χρώσης Χρονόµετρο Αναδευτήρας Vortex Πιπέτα των 10 λ Πιπέτα των 100 1000 λ Φυσιολογικός ορός 0,9% NaCl Πήκτωµα Αγαρόζης 0,8% Ρυθµιστικό διάλυµα: 0,1 Μ tris-barbital ph 9,2 είγµατα ολικού αίµατος Ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροδίων (stock διάλυµα 75 ml και απιονισµένο νερό µέχρι 1 l): 0,1Μ tris-barbital ph 9,2 ιάλυµα µονιµοποίησης: 60% αιθανόλη, 10% οξεικό, 30% απιονισµένο νερό Χρωστική (stock διάλυµα 75 ml και απιονισµένο νερό µέχρι όγκο 300 ml): 0,4% amidoblack, 6,7% αιθυλενογλυκόλη Αποχρωστικό (stock διάλυµα 1 ml σε 1 l απιονισµένο νερό): 0,05% κιτρικό οξύ Απιονισµένο νερό ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΕΙΓΜΑΤΩΝ Σε σωληνάκια Eppendorff προσθέτουµε 200 µl ολικό αίµα από κάθε δείγµα Προσθέτουµε 1 ml φυσιολογικό ορό και αναδεύουµε απαλά Φυγοκεντρούµε τα δείγµατα στις 3.000 στροφές για 1 min Αφαιρούµε το υπερκείµενο και προσθέτουµε 1 ml φυσιολογικό ορό Αναδεύουµε και φυγοκεντρούµε τα δείγµατα στις 3.000 στροφές για 1 min Αφαιρούµε το υπερκείµενο και προσθέτουµε 1 ml φυσιολογικό ορό Αναδεύουµε και φυγοκεντρούµε τα δείγµατα στις 3.000 στροφές για 1 min Αφαιρούµε το υπερκείµενο Σε αντίστοιχα σωληνάκια Eppendorff προσθέτουµε 130 µl διαλύµατος λύσης Σε κάθε σωληνάκι προσθέτουµε 10 µl από το αντίστοιχα ίζηµα ερυθρών Λύουµε τα ερυθρά µε Vortex για 5-6 sec ΕΝΑΠΟΘΕΣΗ ΕΙΓΜΑΤΩΝ Προετοιµάζουµε τη συσκευή εναπόθεσης δειγµάτων (εικόνα 2) Στην επιφάνεια τοποθέτησης του πηκτώµατος ρίχνουµε 100 λ Η 2 Ο 24

Βγάζουµε το πήκτωµα από το φάκελο του και το τοποθετούµε στη συσκευή (εικόνα 3) Στεγνώνουµε το πήκτωµα µε διηθητικό χαρτί Προσθέτουµε 10 λ αιµολύµατος από κάθε δείγµα στις αριθµηµένες θέσεις της συσκευής (εικόνα 4) Ακουµπάµε το βραχίονα εναπόθεσης πάνω στο πήκτωµα για 1 min (εικόνα 5) Αποµακρύνουµε το βραχίονα Μεταφέρουµε το πήκτωµα στη συσκευή ηλεκτροφόρησης ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ Προσθέτουµε 300 ml ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροδίων στη συσκευή ηλεκτροφόρησης Κλείνουµε το καπάκι της συσκευής και συνδέουµε τα ηλεκτρόδια Ανοίγουµε το τροφοδοτικό Ρυθµίζουµε την τάση του ρεύµατος στα 150 V Αφήνουµε να αναπτυχθεί η ηλεκτροφόρηση για 11 min Κλείνουµε το τροφοδοτικό Βγάζουµε το πήκτωµα από τη συσκευή και το τοποθετούµε στο πλαίσιο χρώσης ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΖΩΝΩΝ Τοποθετούµε το πήκτωµα στο µονιµοποιητικό για 4 min Ξηραίνουµε το πήκτωµα στη συσκευή ζεστού αέρα για 15min Τοποθετούµε το πήκτωµα στο πλαίσιο χρώσης Τοποθετούµε το πλαίσιο στη χρωστική για 4 min Ξεπλένουµε καλά µε νερό βρύσης Τοποθετούµε το πλαίσιο διαδοχικά τρεις φορές σε αποχρωστικό από 2 min Ξηραίνουµε το πήκτωµα στη συσκευή ζεστού αέρα για 3 min Σαρώνουµε το ηλεκτροφόρηµα ΗΜIΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ CRP Σε κατάλληλο λευκό πλακίδιο τοποθετούµε 30 µl ορό και 30 µl αντιδραστήριο Αναµιγνύουµε µε τη βοήθεια ενός κίτρινου ρύγχους από πιπέτα Τοποθετούµε το πλακίδιο σε αναδευτήρα Ελέγχουµε το δείγµα µας για κροκίδωση µετά 3-4 min Σε περίπτωση κροκίδωσης επαναλαµβάνω µε υποδιπλασιαζόµενες ποσότητες ορού Με βάση το συντελεστή αραίωσης του τελευταίου δείγµατος που κροκιδώθηκε υπολογίστε τη συγκέντρωση της CRP ΤΑΧΥΤΗΤΑ ΚΑΘΙΖΗΣΗΣ ΕΡΥΘΡΩΝ Σε σωληνάκι µε αίµα τοποθετήστε κατάλληλα το σωληνάκι καθίζησης. Παρατηρήστε πως γεµίζει µε αίµα και αφήστε σε ηρεµία για 1 h σε θερµοκρασία δωµατίου. Τέλος, καταγράψτε το ύψος του πλάσµατος στην κορυφή της στήλης. 25

ΣΧΗΜΑΤΙΚΗ ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ ΕΝΑΠΟΘΕΣΗΣ ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ Εικόνα 2: συσκευή εναπόθεσης δειγµάτων Εικόνα 3: τοποθέτηση πηκτώµατος πήκτωµα Εικόνα 4: εναπόθεση δειγµάτων Εικόνα 5: εναπόθεση δειγµάτων στο 26

ΚΛΙΝΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΣΚΗΣΗ 3 ιερεύνηση φλεµονής Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού C αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP) 27

28

ΟΡΟΣ ΠΛΑΣΜΑ Η υπερκείµενη διαλυτή φάση του αίµατος που ξεχωρίζει µετά από φυγοκέντρηση, παρουσία αντιπηκτικού, ονοµάζεται πλάσµα (plasma). Όταν στο δείγµα αίµατος δεν προστεθεί αντιπηκτικό, τότε τα τοιχώµατα του σωληναρίου, στο οποίο έχει συλλεχθεί το αίµα, θα ενεργοποιήσουν τη διαδικασία της πήξης του αίµατος µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία θρόµβου (clot). Η υπερκείµενη διαλυτή φάση του αίµατος που ξεχωρίζει µετά από φυγοκέντρηση απουσία αντιπηκτικού ονοµάζεται ορός (serum). Ουσιαστικά ο ορός είναι το πλάσµα χωρίς το ινωδογόνο (fibrinogen) που συµµετέχει στη δηµιουργία του θρόµβου µε την παραγωγή του πλέγµατος ινικής (fibrin). ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ Ένα σωµατίδιο µε φορτίο q που βρίσκεται σε ένα µέσο µε συντελεστή ιξώδους f, θα κινηθεί µε σταθερή ταχύτητα υ όταν εφαρµοστεί ηλεκτρικό πεδίο ένταση Ε=V/l. Στο φορτίο q θα ασκηθεί δύναµη F = Eq = fυ Vq/l = fυ υ = Vq / fl υ = V Η ταχύτητα µεταφοράς σε ένα µέσο µε συντελεστή τριβής, ενός φορτισµένου µορίου, κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου έντασης εξαρτάται από : 1. Την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου (V/cm) 2. To καθαρό φορτίο του µορίου 3. Το µέγεθος και το σχήµα του µορίου 4. Το ιξώδες, την ιοντική ισχύ και τη θερµοκρασία του µέσου ηλεκτροφόρησης Η ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΩΣ ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΟ ΜΕΣΟ Στις διαγνωστικές ηλεκτροφορήσεις χρησιµοποιούνται πηκτώµατα αγαρόζης σε διάφορες συγκεντρώσεις ανάλογα µε το είδος των προς ανάλυση πρωτεϊνών. Οι ηλεκτροφορήσεις που χρησιµοποιούνται ευρύτερα είναι: πρωτεινών ορού (λοιµώξεις, δυσλειτουργία οργάνων) αιµοσφαιρινών (αιµοσφαιρινοπάθειες) λιποπρωτεϊνών ορού (υπερλιπιδαιµίες) πρωτεϊνών ούρων (πρωτεϊνουρία) Ηλεκτροφορητική ανάλυση των πρωτεϊνών του ορού O διαχωρισµός των πρωτεϊνών του ορού µε ηλεκτροφόρηση (εικόνα 1) δίνει πέντε χαρακτηριστικές ζώνες οι οποίες αποτελούνται από ένα ή περισσότερα διαφορετικά είδη πρωτεϊνικών µορίων (πίνακας 1). 29

- Αλβουµίνη - Ζώνη α1 - Ζώνη α2 - Ζώνη β - Ζώνη γ Εικόνα 1. Ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνών ορού Πίνακας 1. Ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνών ορού Ηλεκτροφορητική ζώνη Πρωτεΐνες Λειτουργία (+) Αλβουµίνη (55-68 %) Αλβουµίνη ιατήρηση του όγκου του αίµατος Μεταφορά χολερυθρίνης α1 σφαιρίνες (2-4 %) α1 αντιτρυψίνη α1 αντιχυµοτρυψίνη α2 σφαιρίνες (8-13 %) α2 µακροσφαιρίνη Απτοσφαιρίνη Σερουλοπλασµίνη α λιποπρωτεΐνη Αναστολείς ενζύµων Μεταφορά πρωτεϊνών, ορµονών β σφαιρίνες (7-13 %) Τρανσφερρίνη Πλασµινογόνο Φιµπρονεκτίνη C3 συµπλήρωµα β λιποπρωτεΐνη και λιποδιαλυτών µορίων (-) γ σφαιρίνες (9-16 %) IgG, IgA, IgM, IgD, IgE Καταπολέµηση µολύνσεων 30

CRP Η φλεγµονή (inflammation) είναι ένα σύνολο διεργασιών, σε ένα ιστό, ως αντίδραση σε κάποια βλάβη. Τα συµπτώµατά της φλεγµονής είναι οίδηµα, ερυθρότητα, πόνος και πολλές φορές πυρετός. Η οξεία φλεγµονή (acute inflammation), όπως µια παιδική ασθένεια ή σκωλικοειδίτιδα, συνήθως συνοδεύεται από αύξηση των πολυµορφοπύρηνων κυττάρων στο αίµα, αύξηση της C- αντιδρώσας πρωτεΐνης (CRP) στον ορό και αύξηση της ταχύτητας καθίζησης των ερυθρών αιµοσφαιρίων (ΤΚΕ). Παράλληλα, τόσο στη χρόνια όσο και στην οξεία φλεγµονή, ως απόκριση του οργανισµού, παρουσιάζεται αλλοίωση του ηλεκτροφορητικού προτύπου των πρωτεϊνών του ορού. Ο πιο γρήγορος τρόπος για την ταυτοποίηση και την παρακολούθηση της πορείας µιας φλεγµονής είναι ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης της στον ορό. Μέχρι πρότινος αυτό γινόταν αποκλειστικά µε ανοσοσυγκόλληση, όµως τα τελευταία χρόνια χρησιµοποιούνται µέθοδοι που βασίζονται στη νεφελοµετρία και γίνονται σε βιοχηµικό αναλυτή. Αρχή της µεθόδου Η αναοσοσυγκόλληση χρησιµοποιεί πολυµερή σφαιρίδια που φέρουν στην επιφάνεια τους αντισώµατα έναντι της CRP. Η ανάµιξη αντιδραστηρίου σφαιριδίων µε ίση ποσότητα ορού δίνει αναοσοσυγκόλληση, σε συγκεντρώσεις CRP πάνω από το φυσιολογικό όριο των 6 µg/ml. Για τον ηµιποσοτικό προσδιορισµό της συγκέντρωσης της, χρησιµοποιούµε υποδιπλασιαζόµενες αραιώσεις ορού µέχρι να προσδιοριστεί η µέγιστη αραίωση που δίνει ανοσοσυγκόλληση. Στην περίπτωση αυτή η συγκέντρωση της CRP ισούται µε τι γινόµενο 6 µg/ml επί το συντελεστή αραίωσης. 31

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΙΑΛΥΜΑΤΑ Τροφοδοτικό συνεχούς ρεύµατος Συσκευή ηλεκτροφόρησης Συσκευή εναπόθεσης δειγµάτων (εικόνα 2) Θάλαµος θερµού αέρα Θήκη πηκτώµατος για χρώση οχεία χρώσης Χρονόµετρο Αναδευτήρας Vortex Πιπέτα των 10 λ Πιπέτα των 100 1000 λ Πήκτωµα Αγαρόζης 0,8% Ρυθµιστικό διάλυµα: 0,1 Μ tris-barbital ph 9,2 είγµατα ορών Ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροδίων (stock διάλυµα 75 ml και απιονισµένο νερό µέχρι 1 l): 0,1Μ tris-barbital ph 9,2 ιάλυµα µονιµοποίησης: 60% αιθανόλη, 10% οξεικό, 30% απιονισµένο νερό Χρωστική (stock διάλυµα 75 ml και απιονισµένο νερό µέχρι όγκο 300 ml): 0,4% amidoblack, 6,7% αιθυλενογλυκόλη Αποχρωστικό (stock διάλυµα 1 ml σε 1 l απιονισµένο νερό): 0,05% κιτρικό οξύ Απιονισµένο νερό ΕΝΑΠΟΘΕΣΗ ΕΙΓΜΑΤΩΝ Προετοιµάζουµε τη συσκευή εναπόθεσης δειγµάτων (εικόνα 2) Στην επιφάνεια τοποθέτησης του πηκτώµατος ρίχνουµε 100 λ Η 2 Ο Βγάζουµε το πήκτωµα από το φάκελο του και το τοποθετούµε στη συσκευή (εικόνα 3) Στεγνώνουµε το πήκτωµα µε διηθητικό χαρτί Προσθέτουµε 10 λ από κάθε δείγµα στις αριθµηµένες θέσεις της συσκευής (εικόνα 4) Ακουµπάµε το βραχίονα εναπόθεσης πάνω στο πήκτωµα για 40 sec (εικόνα 5) Αποµακρύνουµε το βραχίονα Μεταφέρουµε το πήκτωµα στη συσκευή ηλεκτροφόρησης ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ Προσθέτουµε 300 ml ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροδίων στη συσκευή ηλεκτροφόρησης Κλείνουµε το καπάκι της συσκευής και συνδέουµε τα ηλεκτρόδια 32

Ανοίγουµε το τροφοδοτικό Ρυθµίζουµε την τάση του ρεύµατος στα 100 V Αφήνουµε να αναπτυχθεί η ηλεκτροφόρηση για 20 min Κλείνουµε το τροφοδοτικό Βγάζουµε το πήκτωµα από τη συσκευή και το τοποθετούµε στο πλαίσιο χρώσης ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΖΩΝΩΝ Τοποθετούµε το πήκτωµα στο µονιµοποιητικό για 4 min Ξηραίνουµε το πήκτωµα στη συσκευή ζεστού αέρα για 15min Τοποθετούµε το πήκτωµα στο πλαίσιο χρώσης Τοποθετούµε το πλαίσιο στη χρωστική για 4 min Ξεπλένουµε καλά µε νερό βρύσης Τοποθετούµε το πλαίσιο διαδοχικά τρεις φορές σε αποχρωστικό από 2 min Ξηραίνουµε το πήκτωµα στη συσκευή ζεστού αέρα για 3 min Σαρώνουµε το ηλεκτροφόρηµα ΗΜIΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ CRP Σε κατάλληλο λευκό πλακίδιο τοποθετούµε 30 µl ορό και 30 µl αντιδραστήριο Αναµιγνύουµε µε τη βοήθεια ενός κίτρινου ρύγχους από πιπέτα Τοποθετούµε το πλακίδιο σε αναδευτήρα Ελέγχουµε το δείγµα µας για κροκίδωση µετά 3-4 min Σε περίπτωση κροκίδωσης επαναλαµβάνω µε υποδιπλασιαζόµενες ποσότητες ορού Με βάση το συντελεστή αραίωσης του τελευταίου δείγµατος που κροκιδώθηκε υπολογίστε τη συγκέντρωση της CRP 33

ΣΧΗΜΑΤΙΚΗ ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ ΕΝΑΠΟΘΕΣΗΣ ΕΙΓΜΑΤΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ Εικόνα 2: συσκευή εναπόθεσης δειγµάτων Εικόνα 3: τοποθέτηση πηκτώµατος πήκτωµα Εικόνα 4: εναπόθεση δειγµάτων Εικόνα 5: εναπόθεση δειγµάτων στο 34

ΚΛΙΝΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΣΚΗΣΗ 4 Αυτοανοσία Αντιπυρηνικά αντισώµατα 35

36

Αυτοανοσία Ο ανθρώπινος οργανισµός έχει την ικανότητα να αντιστέκεται και να αντιµετωπίζει την εισβολή παθογόνων µικροοργανισµών (ιοί, βακτήρια και παράσιτα) µέσω του ανοσοποιητικού συστήµατος (immune system) µε την παραγωγή εξειδικευµένων πρωτεϊνών που ονοµάζονται αντισώµατα (antibodies). Όµως υπάρχουν περιπτώσεις όπου το ανοσοποιητικό σύστηµα αρχίζει να δυσλειτουργεί και να αναγνωρίζει δικά του βιοµόρια (πρωτεΐνες, υδατάνθρακες, DNA) ως ξένα µε αποτέλεσµα την παραγωγή αντισωµάτων έναντι των δικών του µορίων. Η δυσλειτουργία αυτή, ονοµάζεται αυτοανοσία (autoimmunity) και τα παραγόµενα αντισώµατα ονοµάζονται αυτoαντισώµατα (auto-antibodies). Τα αντιγόνα έναντι των οποίων ένας οργανισµός παράγει αυτό-αντισώµατα, µπορεί να βρίσκονται είτε στον πυρήνα είτε στο κυτταρόπλασµα των κυττάρων. Στην πρώτη περίπτωση ονοµάζονται αντιπυρηνικά αντισώµατα (antinuclear antibodies) και περιλαµβάνουν αντισώµατα έναντι δίκλωνου ή µονόκλωνου DNA (anti-dsdna ή anti-ssdna, αντίστοιχα), ριβοσωµατικού RNA (rrna) καθώς και πυρηνικών πρωτεϊνών (histones). Στην κατηγορία των αντικυτταροπλασµατικών αντισωµάτων (anticytoplasmic antibodies) τα αντιγόνα µπορεί να βρίσκονται στα µιτοχόνδρια, στον κυτταροσκελετό, στα ριβοσώµατα κ.α. Ανοσοφθορισµός Tα αντισώµατα, εκτός από τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης ουσιών σε διάφορα βιολογικά υλικά, χρησιµοποιούνται και για τον εντοπισµό της θέσης ενός αντιγόνου σε µεµονωµένα κύτταρα ή σε ένα ιστό. Η διαδικασία αυτή ονοµάζεται ανοσοκυτταροχηµεία (immunocytochemistry) ή ανοσοϊστοχηµεία (immunohistochemistry) αντίστοιχα (Eικόνα 2). Για να γίνει ο εντοπισµός ενός αντιγόνου απαιτείται η µονιµοποίηση ιστού ή κυττάρων πάνω σε µια αντικειµενοφόρο πλάκα. Η υπόλοιπη διαδικασία περιλαµβάνει δύο στάδια: 1. Αναγνώριση και σύνδεση του αντισώµατος πάνω στο αντιγόνο στην επιφάνεια ή στο εσωτερικό ενός κυττάρου (πυρήνας, κυτταρόπλασµα) Ορός µε αυτοαντίσωµα + Αντικειµενοφόρος πλάκα µε επιστρωµένα κύτταρα ή τοµή ιστού 2. Αναγνώριση του συµπλόκου αντιγόνου-αντισώµατος µε τη χρήση ενός δεύτερου αντισώµατος που είναι συνδεδεµένο µε ένα φθορίζον µόριο (φλουοροσεΐνη. Φ Αντί IgG φλουοροσεϊνη + Σύµπλοκο αντιγόνου-αντισώµατος πάνω στον ιστό 37

Η εµφάνιση ανοσοφθορισµού (immunofluoresense), σε ένα σηµείο του ιστού ή των κυττάρων, αντικατοπτρίζει την ύπαρξη συγκεκριµένου αντιγόνου και η παρατήρηση του παρασκευάσµατος γίνεται σε µικροσκόπιο φθορισµού. Αντιπυρηνικά αντισώµατα Ο έλεγχος για την ύπαρξη αυτο-αντισωµάτων σε ένα δείγµα ορού, γίνεται σε αντικειµενοφόρες πλάκες που κυκλοφορούν στο εµπόριο, οι οποίες είναι επιστρωµένες µε ενδοθηλιακά κύτταρα Hep-2, πολυµορφοπύρηνα κύτταρα καθώς και τοµές από διάφορους ιστούς, όπως µυικός, ηπατικός, νεφρικός κ.α. Ο πρώτος έλεγχος για την παρουσία αυτοάνοσου νοσήµατος είναι η ανίχνευση αντιπυρηνικών αντισωµάτων στον ορό ενός ασθενή, µε τον εντοπισµό αντιγόνων στον πυρήνα ανθρώπινων επιθηλιακών κυττάρων. Τα θετικά δείγµατα παρουσιάζουν χαρακτηριστικό πρότυπο ανοσοφθορισµού (pattern). Αντικυτταροπλασµατικά αντισώµατα Σε περίπτωση απουσίας αντιπυρηνικών αντισωµάτων αλλά µε δεδοµένη την υποψία για την ύπαρξη αυτοάνοσου νοσήµατος, το επόµενο βήµα είναι η αναζήτηση αυτοαντιγόνων στο κυτταρόπλασµα. Τα θετικά δείγµατα παρουσιάζουν χαρακτηριστικό πρότυπο ανοσοφθορισµού (pattern). 38

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ είγµατα ανθρώπινων ορών Αντικειµενοφόρες πλάκες επιστρωµένες µε ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα Hep-2 Καλυπτρίδες Μικροσκόπιο φθορισµού µε αντικειµενικό φακό 40Χ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ Φωσφορικός φυσιολογικός ορός PBS (phosphate buffered saline) Αντισώµατα έναντι ανθρώπινων IgG συνδεµένα µε φλουοροσεΐνη Γλυκερόλη ΠΟΡΕΙΑ Ετοιµάζουµε αραιωµένα δείγµατα ανθρώπινων ορών 1:80 σε PBS. Σε κάθε θέση Hep-2 κυττάρων πάνω στην αντικειµενοφόρο πλάκα τοποθετούµε 20 λ αραιωµένου ορού. Επωάζουµε για 20 min σε θερµοκρασία δωµατίου. Αφαιρούµε τον ορό και ξεπλένουµε µε PBS τέσσερις φορές. Προσθέτουµε 20 λ αντισώµατα έναντι ανθρώπινων IgG συνδεµένα µε φλουοροσεΐνη. Αφαιρούµε το αντίσωµα και ξεπλένουµε µε PBS τέσσερις φορές. Προσθέτουµε µια σταγόνα γλυκερόλη και καλύπτουµε µε καλυπτρίδα. Παρατηρούµε σε µικροσκόπιο φθορισµού. Μορφοποιηµένo: Κουκκίδες και αρίθµηση 39

40