ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗΣ Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΚΑΡΟΤΕΝΟΕΙΔΩΝ ΤΟΥ ΚΡΟΚΟΥ ΤΟΥ ΗΜΕΡΟΥ (CROCUS SATIVUS LINNEAUS) ΣΕ ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΟΥ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΤΑΥΡΟΥ ΚΑΙ ΣΤΗΝ IN VITRO ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΒΑΣΙΛΙΚΗ Γ. ΣΑΠΑΝΙΔΟΥ Κτηνίατρος Α.Π.Θ. ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2015

Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΚΑΡΟΤΕΝΟΕΙΔΩΝ ΤΟΥ ΚΡΟΚΟΥ ΤΟΥ ΗΜΕΡΟΥ (CROCUS SATIVUS LINNEAUS) ΣΕ ΠΟΙΟΤΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΟΥ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΤΑΥΡΟΥ ΚΑΙ ΣΤΗΝ IN VITRO ΓΟΝΙΜΟΠΟΙΗΣΗ ΒΑΣΙΛΙΚΗ Γ. ΣΑΠΑΝΙΔΟΥ Κτηνίατρος Α.Π.Θ. ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φυσιολογίας του Τμήματος Κτηνιατρικής ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Μαρία Τσανταρλιώτου αναπληρώτρια καθηγήτρια Επιβλέπουσα Ιωάννης Ταϊτζόγλου καθηγητής Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής Ιωάννης Τσακμακίδης επίκουρος καθηγητής Μέλος συμβουλευτικής επιτροπής Γεώργιος Αμοιρίδης καθηγητής Μέλος εξεταστικής επιτροπής Κωνσταντίνος Μπόσκος καθηγητής Μέλος εξεταστικής επιτροπής Δήμητρα Χατζηπαύλου-Λίτινα καθηγήτρια Μέλος εξεταστικής επιτροπής Σοφία Λαυρεντιάδου επίκουρη καθηγήτρια Μέλος εξεταστικής επιτροπής

Στην οικογένειά μου Βασιλική Σαπανίδου Η έγκριση της παρούσας διδακτορικής διατριβής από το Τμήμα Κτηνιατρικής της Σχολής Επιστημών Υγείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των απόψεων του συγγραφέα (Ν. 5343/32 αρ. 202 παρ. 2).

ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΑΠΟ ΤΗΝ ΠΑΡΟΥΣΑ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Πλήρεις ερευνητικές εργασίες που έχουν δημοσιευθεί σε διεθνή περιοδικά Antioxidant effect of crocin on bovine sperm quality and in vitro fertilization. Sapanidou V., Taitzoglou I., Tsakmakidis I., Kourtzelis I., Fletouris D., Theodoridis A., Zervos I., Tsantarliotou M. Theriogenology 84: 1273-1282, 2015 Ανακοινώσεις σε διεθνή συνέδρια Crocin improves frozen/thawed bovine sperm motility and viability Sapanidou V., Taitzoglou I., Tsakmakidis I., Abas Z., Zervos I., Lavrentiadou S., Tsantarliotou M. The 16 th Annual Conference of the European Society for Domestic Animal Reproduction (ESDAR), 29 th August-1 st September 2012, Dublin, Ireland. Crocin promotes in vitro sperm capacitation of bovine sperm Sapanidou V., Abas Z., Taitzoglou I., Tsakmakidis I., Zervos I., Lavrentiadou S., Tsantarliotou M. Fertility and Antioxidants, 6-7 th December 2012, Paris, France. Crocin reduced oxidative stress and DNA damage of frozen/thawed bull spermatozoa Sapanidou V., Fletouris D., Kourtzelis I., Abas Z., Taitzoglou I., Tsakmakidis I., Zervos I., Tsantarliotou M. The 17 th Annual Conference of the European Society for Domestic Animal Reproduction (ESDAR), 12-14 th September 2013, Bologna, Italy.

ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ-ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 1. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΟΞΥΓΟΝΟΥ 1 1.1 Οι δραστικές μορφές οξυγόνου 1 1.2 Παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου στο κύτταρο 4 1.3 Παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου στο σπέρμα 7 1.4 Φυσιολογικός ρόλος των δραστικών μορφών οξυγόνου 9 1.5 Τεχνικές προσδιορισμού των δραστικών μορφών οξυγόνου 12 2. ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ 13 2.1 Μηχανισμός πρόκλησης οξειδωτικής βλάβης στο κύτταρο 13 2.1.1 Κατακερματισμός του DNA 15 2.1.2 Απόπτωση 16 2.1.3 Λιπιδική υπεροξείδωση 17 2.1.4 Οξείδωση των πρωτεϊνών 20 2.1.5 Διαταραχή της παραγωγής ΑΤΡ 21 2.2. Η επίδραση της οξειδωτικής βλάβης στο σπέρμα 21 2.2.1 Κινητικότητα 21 2.2.2 Ζωτικότητα 23 2.2.3 Κατακερματισμός του DNA 24 2.2.4 Λιπιδική υπεροξείδωση 27 2.2.5 Μετάθεση της φωσφατιδυλοσερίνης 28 3. ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ 31 3.1 Κατηγορίες αντιοξειδωτικών ουσιών 31 3.2 Αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί στο σπέρμα 32 3.3 Φυσικές αντιοξειδωτικές ουσίες 33 3.3.1 Τα καροτενοειδή 35 3.3.2 Η αντιοξειδωτική δράση των καροτενοειδών 36 3.3.3 Κρόκος ο ήμερος (Crocus Sativus Linneaus) 37 3.3.4 Κροκίνη 39 3.3.5 Κροκετίνη 40 4. IN VITRO ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΕΜΒΡΥΩΝ ΒΟΟΕΙΔΩΝ (In Vitro Embryo Production- IVEP) 41 4.1 Η χρήση της αγελάδας ως ζωικού μοντέλου για τη μελέτη της IVEP στον άνθρωπο 42 4.2 Οξειδωτικό στρες κατά την IVEP 44 4.3 Η τεχνική της ΙVEP 45 4.3.1 In vitro ωρίμανση 45 4.3.2 In vitro γονιμοποίηση 45 4.3.3 In vitro καλλιέργεια 46 4.4 Τα καροτενοειδή του κρόκου του ημέρου στην IVEP 47 5. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ 48 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 50 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 51 Α. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΣΜΩΝ 51 1. Δείγματα σπέρματος 51 2. Αντιδραστήρια 52 3. Προετοιμασία κροκίνης και κροκετίνης 52

Β. ΕΚΤΕΛΕΣΗ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΣΜΩΝ 52 1. Εκτίμηση των παραμέτρων κινητικότητας του σπέρματος με τη χρήση του συστήματος CASA (Computer Assisted Sperm Analyzer) 52 2. Εκτίμηση των παραμέτρων ζωτικότητας του σπέρματος με τη χρώση εωσίνη Υ νιγροσίνη 55 3. Έλεγχος της ακεραιότητας του DNA με τη χρήση της χρωστικής πορτοκαλόχρουν της ακριδίνης 55 4. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του Ο2 -, του Η2Ο2 και του ποσοστού μετάθεσης της PS των ζωντανών σπερματοζωαρίων με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής 57 5. Προσδιορισμός της λιπιδικής υπεροξείδωσης μέσω της παραγωγής MDA 60 6. Ενεργοποίηση/Αντίδραση του ακροσώματος 62 7. In vitro παραγωγή εμβρύων 64 Γ. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ 69 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 70 1. Κροκίνη 70 1.1 Εκτίμηση των παραμέτρων κινητικότητας του σπέρματος με τη χρήση του συστήματος CASA 70 1.2 Εκτίμηση των παραμέτρων ζωτικότητας του σπέρματος με τη χρώση εωσίνη Υ- νιγροσίνη 73 1.3 Έλεγχος της ακεραιότητας του DNA με τη χρήση της χρωστικής πορτοκαλόχρουν της ακριδίνης 73 1.4 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του Ο2 -., του Η2Ο2 και του ποσοστού μετάθεσης της PS των ζωντανών σπερματοζωαρίων με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής 74 1.5 Προσδιορισμός της λιπιδικής υπεροξείδωσης μέσω της παραγωγής MDA 78 1.6 Ενεργοποίηση/ Αντίδραση του ακροσώματος 79 1.7 In vitro παραγωγή εμβρύων 81 2. Κροκετίνη 82 2.1 Εκτίμηση των παραμέτρων κινητικότητας του σπέρματος με τη χρήση του συστήματος CASA 82 2.2 Εκτίμηση των παραμέτρων ζωτικότητας του σπέρματος με τη χρώση εωσίνη Υ- νιγροσίνη 86 2.3 Έλεγχος της ακεραιότητας του DNA με τη χρήση της χρωστικής πορτοκαλόχρουν της ακριδίνης 87 2.4 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης του Ο2 -., του Η2Ο2 και του ποσοστού μετάθεσης της PS των ζωντανών σπερματοζωαρίων με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής 87 2.5 Προσδιορισμός της λιπιδικής υπεροξείδωσης μέσω της παραγωγής MDA 91 2.6 Ενεργοποίηση/ Αντίδραση του ακροσώματος 92 2.7 In vitro παραγωγή εμβρύων 93 3. Συσχετίσεις μεταξύ των ποιοτικών παραμέτρων εκτίμησης του σπέρματος (Pearson correlation coefficient) 94 3.1 Yπό την επίδραση κροκίνης 94 3.2 Yπό την επίδραση κροκετίνης 95 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 96

Α. Εκτίμηση της επίδρασης της κροκίνης και της κροκετίνης στις ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις του Ο2 -. και του Η2Ο2 καθώς και στη λιπιδική υπεροξείδωση 99 Β. Εκτίμηση της επίδρασης της κροκίνης και της κροκετίνης στην κινητικότητα και στη ζωτικότητα των σπερματοζωαρίων 103 Β.1 Κινητικότητα 103 Β.2 Ζωτικότητα 108 Γ. Εκτίμηση της επίδρασης της κροκίνης και της κροκετίνης στον κατακερματισμό του DNA και στη μετάθεση της PS 110 Γ.1 Κατακερματισμός του DNA 110 Γ.2 Μετάθεση της PS 112 Δ. Eκτίμηση της επίδρασης της κροκίνης και της κροκετίνης στην ενεργοποίηση/αντίδραση του ακροσώματος και στην επιτυχία της in vitro γονιμοποίησης 115 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 121 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 123 SUMMARY 132 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 133 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 165 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ 165 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ IVEP 167 ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΓΙΑ ΤΗΝ IVEP 169

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Οι τεχνικές υποβοηθούμενης αναπαραγωγής άρχισαν να εφαρμόζονται σε ζωικούς πληθυσμούς από το δεύτερο μισό του 19 ου αιώνα. Ο συγχρονισμός του οίστρου, η κατάψυξη του σπέρματος και η τεχνητή σπερματέγχυση χρησιμοποιήθηκαν σε ευρεία κλίμακα με σκοπό να εξυπηρετήσουν τη γενετική βελτίωση των παραγωγικών χαρακτηριστικών των ζώων ώστε να καλυφθούν οι ολοένα αυξανόμενες ανάγκες του καταναλωτικού κοινού. Ακολούθησαν για τον ίδιο σκοπό οι εργαστηριακές δοκιμές της in vitro παραγωγής και της μεταφοράς εμβρύου και του προκαθορισμού του φύλου μέσω της επιλογής σπερματοζωαρίων ή και εμβρύων. Σε όλες τις in vitro τεχνικές η έκθεση των κυττάρων σε υψηλές συγκεντρώσεις οξυγόνου, μειώνει σημαντικά τα ποσοστά επιτυχίας της in vitro γονιμοποίησης, αφού οι δραστικές μορφές οξυγόνου, τα ενδιάμεσα προϊόντα του μεταβολισμού του, μπορούν να βλάψουν τη δομική και λειτουργική ακεραιότητα των σπερματοζωαρίων, των ωοκυττάρων όσο και των εμβρύων. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα ενδιάμεσα προϊόντα μεταβολισμού του οξυγόνου, σε χαμηλές συγκεντρώσεις, είναι απαραίτητα στις φυσιολογικές διεργασίες που λαμβάνουν χώρα κατά τη γονιμοποίηση. Στην in vitro γονιμοποίηση, ο συνδυασμός της απουσίας των αντιοξειδωτικών παραγόντων του πλάσματος με την έκθεση των σπερματοζωαρίων σε υψηλές συγκεντρώσεις οξυγόνου και την καταπόνηση που αυτά υφίστανται κατά την προετοιμασία τους, αποτελεί μία από τις κυριότερες αιτίες για τα μειωμένα ποσοστά επιτυχούς γονιμοποίησης. Για το σκοπό αυτό τα τελευταία χρόνια διεξάγονται μελέτες που αφορούν στην τροποποίηση των υποστρωμάτων της in vitro παραγωγής εμβρύων με προσθήκη διαφόρων αντιοξειδωτικών ουσιών. Ο κρόκος ο ήμερος (Crocus sativus L.), γνωστός από την αρχαιότητα ως θεραπευτικό φυτό, έχει αντιοξειδωτικές ιδιότητες που έχουν αποδειχτεί τόσο in vivo, όσο και in vitro. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετάται η πιθανή ευεργετική δράση δύο κύριων καροτενοειδών του κρόκου του ήμερου, της κροκίνης και της κροκετίνης, σε βασικά ποιοτικά χαρακτηριστικά του κατεψυγμένου σπέρματος του ταύρου, καθώς και στην in vitro παραγωγή εμβρύων βοοειδών. Η διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φυσιολογίας του Τμήματος Κτηνιατρικής, της Σχολής Επιστημών Υγείας του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου

Θεσσαλονίκης και αποτελεί καρπό προσπαθειών και συνεργασίας πολλών ανθρώπων, τους οποίους σε αυτό το σημείο θα επιθυμούσα να ευχαριστήσω. Αρχικά, θα ήθελα να απευθύνω θερμές ευχαριστίες στην επιβλέπουσά μου, αναπληρώτρια καθηγήτρια του Εργαστηρίου Φυσιολογίας κ. Μαρία Τσανταρλιώτου, για την υπόδειξη του θέματος, τις συμβουλές της, την πρόθυμη καθοδήγηση, αλλά και την ηθική της συμπαράσταση σε κάθε στάδιο της εκπόνησης της. Η μαθητεία μου δίπλα της αποτελεί αναμφίβολα πηγή εμπειριών και γνώσεων. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά το Διευθυντή του Εργαστηρίου Φυσιολογίας, καθηγητή κ. Ιωάννη Ταϊτζόγλου για κάθε βοήθεια, υποστήριξη και συμβουλή που μου παρείχε κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της παρούσας διατριβής. Από καρδιάς ευχαριστώ και το τρίτο μέλος της Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής, τον επίκουρο καθηγητή της Κλινικής των Παραγωγικών Ζώων, κ. Ιωάννη Τσακμακίδη, για τη συμβολή και την πρόθυμη βοήθειά του σε οποιοδήποτε στάδιο αυτή χρειάστηκε. Βαθιές ευχαριστίες επιθυμώ να εκφράσω προς: Τους επίκουρους καθηγητές του Εργαστηρίου Φυσιολογίας, κ. Ιωάννη Ζερβό και κ. Σοφία Λαυρεντιάδου για την πολύπλευρη βοήθειά τους και τις εύστοχες παρατηρήσεις τους. Το λέκτορα του Εργαστηρίου Οικονομίας Ζωικής Παραγωγής, κ. Αλέξανδρο Θεοδωρίδη, για την πολύτιμη βοήθειά του στάδιο της στατιστικής επεξεργασίας των αποτελεσμάτων των πειραματισμών. Τον καθηγητή του Εργαστηρίου Γαλακτομίας, κ. Δημήτριο Φλετούρη, για τη βοήθειά του κατά τον προσδιορισμό της λιπιδικής υπεροξείδωσης. Το μεταδιδάκτορα του Τμήματος Βιολογίας, Βιολόγο κ. Ιωάννη Κουρτζέλη, για τις πολύτιμες συμβουλές του κατά τη διάρκεια των πειραματισμών με τη χρήση του κυτταρομετρητή ροής, καθώς και τον καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας, κ. Γεώργιο Μόσιαλο, για τη φιλοξενία και την παραχώρηση του παραπάνω μηχανήματος. Το Διευθυντή του Ινστιτούτου Αναπαραγωγής και Τεχνητής Σπερματέγχυσης Θεσσαλονίκης, κ. Δημήτριο Βαφειάδη, για την ευγενική παραχώρηση των δειγμάτων κατεψυγμένου σπέρματος, καθώς και όλο το προσωπικό του Ινστιτούτου. Την επίκουρη καθηγήτρια του Εργαστηρίου Βιοχημείας, κ. Κατερίνα Αγγελοπούλου, για τις εύστοχες παρατηρήσεις της κατά τη διάρκεια της συγγραφής της παρούσας διατριβής.

Τη διδάκτορα του Πανεπιστημίου Federico II της Νεάπολης Ιταλίας, Marina De Blasi για τη βοήθειά της στα πρώτα μου βήματα στην τεχνική της in vitro παραγωγής εμβρύων. Το φίλο, συνάδελφο και υποψήφιο διδάκτορα του Διαγνωστικού Εργαστηρίου, Σεραφείμ Χαϊντούτη, για τη βοήθεια και την ηθική συμπαράστασή του. Τη διδάκτορα του Εργαστηρίου Ανατομίας, Ιστολογίας και Εμβρυολογίας, κ. Χρύσα Μπεκιάρη, για τη βοήθειά της στη χρήση του συνεστιακού μικροσκοπίου. Τους κυρίους Γιάννη και Θόδωρο Αλιματήρη, καθώς και όλο το προσωπικό του Βιομηχανικού Σφαγείου Χαλάστρας για τη θερμή φιλοξενία και την πολύτιμη βοήθειά τους στο στάδιο της συλλογής των ωοθηκών. Την Επιτροπή Ερευνών Α.Π.Θ. για τη χορήγηση της υποτροφίας αριστείας κατά το ακαδημαϊκό έτος 2012-2013. Ιδιαίτερη μνεία θα ήθελα να κάνω στον αείμνηστο καθηγητή του Τμήματος Ζωικής Παραγωγής του Δημοκρίτειου Πανεπιστημίου Θράκης, Ζαφείρη Άμπα, του οποίου ο ξαφνικός θάνατος μας λύπησε βαθύτατα και διέκοψε απρόσμενα την άριστη συνεργασία μας. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω από τα βάθη της καρδιάς μου το σύντροφό μου, Ανδρέα, για την κατανόηση και την ενθάρρυνση της προσπάθειάς μου καθώς και τους γονείς μου, Γιώργο και Φωτεινή, και την αδελφή μου, Μαριάννα, για την αγάπη, την εμψύχωση, την υλική, ψυχολογική και ηθική συμπαράστασή τους.

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΔΡΑΣΤΙΚΩΝ ΜΟΡΦΩΝ ΟΞΥΓΟΝΟΥ 1.1 Οι δραστικές μορφές οξυγόνου Το μόριο του οξυγόνου (Ο2) είναι απαραίτητο για τις μεταβολικές διεργασίες των αερόβιων οργανισμών. Ωστόσο, παρουσιάζει μία ιδιαιτερότητα ως προς τη μοριακή δομή του. Στη βασική του κατάσταση (μη διεγερμένη), παρά το γεγονός ότι διαθέτει άρτιο αριθμό ηλεκτρονίων, διατηρεί δύο από αυτά τα ηλεκτρόνια ασύζευκτα, με παράλληλη στροφορμή (spin), που το καθένα καταλαμβάνει ένα διαφορετικό μοριακό τροχιακό στο μόριο του οξυγόνου (Gutteridge 1995). Σε έναν κανονικό ομοιοπολικό δεσμό τα δύο ηλεκτρόνια που βρίσκονται σε κάθε ένα από τα δύο μοριακά τροχιακά είναι συζευγμένα και έχουν αντιπαράλληλη στροφορμή. Η παρουσία ασύζευκτων ηλεκτρονίων προσδίδει στα μόρια ιδιαίτερη χημική δραστικότητα, καθώς για να διατηρηθούν δύο τέτοιες μορφές χωριστά απαιτείται μεγαλύτερη κατανάλωση ενέργειας σε σχέση με την ένωσή τους σε ένα πλήρες μοριακό τροχιακό ενός ομοιοπολικού δεσμού (Αitken και Fischer 1994). Το οξυγόνο λειτουργεί, κυρίως, ως αποδέκτης ηλεκτρονίων (Fuchs και συν. 1997) και εξαιτίας της ηλεκτρονικής δομής του, η αναγωγή του επιτυγχάνεται με τη μεταφορά ενός μόνο ηλεκτρονίου κάθε φορά, γεγονός που οδηγεί στο σχηματισμό των επονομαζόμενων «δραστικών μορφών οξυγόνου» (Reactive Oxygen Species, ROS) (Gutteridge 1995, Halliwell και Gutteridge 2007). Το μόριο του οξυγόνου έχει περιορισμένη οξειδωτική ικανότητα, καθώς τα ηλεκτρόνια για να συζευχθούν θα πρέπει το οξυγόνο να αποσπάσει με διαδοχικό τρόπο συνολικά 2 ηλεκτρόνια από άλλο άτομο ή μόριο. Η αναγωγή που επιτυγχάνεται με τη μεταφορά ενός ηλεκτρονίου στο οξυγόνο είναι, από 1

θερμοδυναμική άποψη, ασθενής αντίδραση, με αποτέλεσμα να περιορίζεται η οξειδωτική ικανότητα του οξυγόνου. Η ιδιαιτερότητα αυτή είναι δυνατόν να παρακαμφθεί είτε με τη μετακίνηση τού ενός μόνο ηλεκτρονίου του σε άλλη στιβάδα ώστε να σχηματιστεί το μονήρες οξυγόνο ( 1 Ο2), είτε μέσω της αντίδρασης του οξυγόνου με άτομα ή μόρια που έχουν ασύζευκτα ηλεκτρόνια (ελεύθερες ρίζες). Τα μεταβατικά στοιχεία, όπως ο χαλκός και ο σίδηρος, έχουν ασύζευκτα ηλεκτρόνια και αποτελούν εξαιρετικούς καταλύτες αναγωγής του μοριακού οξυγόνου (Παπαγεωργίου 2005, Halliwell και Gutteridge 2007). Οι ROS ταξινομούνται σε δύο κατηγορίες: τις ελεύθερες ρίζες και τα δραστικά παράγωγα του οξυγόνου (μη ρίζες) με δυνατότητα απόσπασης ηλεκτρονίων από άλλα μόρια. Στις ελεύθερες ρίζες κατατάσσονται η ρίζα του υπεροξειδικού ανιόντος ή ανιόν του σουπεροξειδίου (Ο2 - ), η υδροξυλική ρίζα ( ΟΗ), η υδροϋπεροξειδική ρίζα (ΗΟ2 ), η υπεροξειδική ρίζα (RΟO ), η αλκοξειδική ρίζα (RO ) και η ρίζα μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ ). Στα δραστικά παράγωγα του οξυγόνου περιλαμβάνονται το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2), το μονήρες οξυγόνο ( 1 Ο2), το όζον (Ο3), το υποχλωριώδες οξύ (HOCl), τα οργανικά υδροϋπεροξείδια (ROOH) και το υπεροξυνιτρώδες ανιόν (ONOO - ) (Fuchs και συν. 1997, Halliwell και Gutteridge 2007, Al-Gubory και συν. 2010). Οι δραστικές μορφές οξυγόνου σχηματίζονται με τους ακόλουθους τρόπους: α) Με ομολυτική ή ετερολυτική διάσπαση. Στην περίπτωση αυτή το ζεύγος ηλεκτρονίων (:) του ομοιοπολικού δεσμού, που προέρχεται από την αμοιβαία συνεισφορά ενός ζεύγους ηλεκτρονίων μεταξύ των δύο ατόμων, είτε παραμένει στο ένα μόνο άτομο (ετερολυτική διάσπαση) και σχηματίζονται ιόντα είτε κάθε άτομο διατηρεί το ηλεκτρόνιο που είχε συνεισφέρει, με αποτέλεσμα την παραγωγή δύο ελεύθερων ριζών (ομολυτική διάσπαση). Συνεπώς, αν ως Α:B συμβολίζεται ο 2

ομοιοπολικός δεσμός μεταξύ των δύο ατόμων, στην περίπτωση της ετερολυτικής διάσπασης ισχύει η αντίδραση: Α:B A + +B -, ενώ στην περίπτωση της ομολυτικής διάσπασης ισχύει η αντίδραση Α:B A +B. Η πραγματοποίηση αυτών των αντιδράσεων απαιτεί μεγάλη ποσότητα ενέργειας, όπως είναι αυτή που περιέχεται στην υπεριώδη ακτινοβολία (UV) και στις υψηλές θερμοκρασίες (Παπαγεωργίου 2005). β) Με οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις: Δηλαδή με την προσθήκη ενός ηλεκτρονίου σε ένα κανονικό μόριο (αναγωγή): Α+e - A - ή με την αφαίρεση ενός ηλεκτρονίου από ένα κανονικό μόριο (οξείδωση): Α-e - A + Για την πραγματοποίηση των αντιδράσεων οξειδοαναγωγής δεν απαιτείται η κατανάλωση μεγάλης ποσότητας ενέργειας (Παπαγεωργίου 2005). Στα βιολογικά συστήματα, προφανώς για λόγους εξοικονόμησης ενέργειας, η παραγωγή των ROS γίνεται κατά κανόνα με οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις. Οι αντιδράσεις οξειδοαναγωγής μπορεί να αφορούν μία ελεύθερη ρίζα που ενώνεται με μία ένωση, την οποία μετατρέπει σε ρίζα. Στην περίπτωση αυτή ακολουθεί μία αλυσίδα αντιδράσεων μετάδοσης ριζών που καταλήγει στην αναγέννηση της αρχικής ρίζας (Halliwell και Gutteridge 2007): A +B A+B Εάν, όμως, η ελεύθερη ρίζα αντιδράσει με μία άλλη ρίζα, τα ασύζευκτα ηλεκτρόνιά τους θα ζευγαρώσουν και η ένωση που θα προκύψει δεν θα είναι ελεύθερη ρίζα: A + B Α:B 3

1.2 Παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου στο κύτταρο Το οξυγόνο βρίσκεται στον ατμοσφαιρικό αέρα με τη μορφή του μοριακού οξυγόνου (Ο2) σε ποσοστό 21%. Το 85-90% του συνολικού οξυγόνου που χρησιμοποιούν τα θηλαστικά καταναλώνεται στα μιτοχόνδρια. Από αυτό, το 98% περίπου καταναλώνεται από τους φορείς ηλεκτρονίων της αναπνευστικής αλυσίδας με τη μεταφορά τεσσάρων ηλεκτρονίων στο Ο2, με τελικό προϊόν της αντίδρασης δύο μόρια Η2Ο (Cadenas και Davies 2000): Ο2 +4e- +4H+ 2H2O Η αναπνευστική αλυσίδα αποτελεί σύνολο οξειδοαναγωγικών αντιδράσεων, οι οποίες λαμβάνουν χώρα στα μιτοχόνδρια και χαρακτηρίζεται από ελευθέρωση ενέργειας. Μεγάλο μέρος αυτής της ενέργειας αποθηκεύεται με μετατροπή του αδενοσινοδιφωσφορικού οξέος (ΑDP) σε αδενοσινοτριφωσφορικό οξύ (ATP) μέσω της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης και αποτελεί τη μεγαλύτερη πηγή ΑΤΡ στους αερόβιους οργανισμούς. Το μιτοχόνδριο αποτελείται από μία εξωτερική και μία εσωτερική μεμβράνη, ενώ ανάμεσά τους δημιουργείται το διαμεμβρανικό διάστημα. Οι παράγοντες της αναπνευστικής αλυσίδας βρίσκονται στην εσωτερική επιφάνεια της εσωτερικής μεμβράνης των μιτοχονδρίων, όπου συναντώνται 5 συμπλέγματα (complexes) πρωτεϊνών: η ΝADH αφυδρογονάση (σύμπλεγμα I), η σουκινική (ηλεκτρική) αφυδρογονάση (σύμπλεγμα IΙ), η αναγωγάση του κυτοχρώματος c (σύμπλεγμα IΙΙ), η οξειδάση του κυτοχρώματος (σύμπλεγμα IV) και η συνθάση του ΑΤΡ (σύμπλεγμα V). Εκτός αυτών συναντώνται επίσης, το συνένζυμο Q (CoQ) και το κυτόχρωμα c (Halliwell και Guuteridge 2007). H οξειδάση του κυτοχρώματος έχει ιδιαίτερη δομή, καθώς αποτελείται από τέσσερα οξειδοαναγωγικά κέντρα, δηλαδή δύο μόρια αίμης 4

και δύο ιόντα Cu 2+, καθένα από τα οποία μπορεί να αποθηκεύει ένα ηλεκτρόνιο (Lesnefsky και Hoppel 2006). Ενώ το 98% του Ο2 που καταλήγει στα μιτοχόνδρια μεταβολίζεται από την οξειδάση του κυτοχρώματος και παράγονται δύο μόρια νερού, το υπόλοιπο οξυγόνο (1-2% περίπου) ανάγεται μερικώς κατά τη μεταφορά των ηλεκτρονίων με αποτέλεσμα το σχηματισμό Ο2 -, το οποίο προοδευτικά συσσωρεύεται στα μιτοχόνδρια. Η αναπνευστική αλυσίδα είναι η κύρια πηγή Ο2 - και Η2Ο2 (Davies 2000). Η παραγωγή του Ο2 -, μάλιστα, είναι εντονότερη στα συμπλέγματα Ι και ΙΙΙ (Turrens και Boveris 1980, Turrens 1997). Ένας άλλος τόπος παραγωγής ROS είναι το ενδοπλασματικό δικτυωτό, όπου κυρίαρχο ρόλο διαδραματίζει το κυτόχρωμα Ρ450, το οποίο οξειδώνει ακόρεστα λιπαρά οξέα και χημικούς παράγοντες που δεν απαντώνται φυσιολογικά στον οργανισμό (xenobiotics). Άλλες ενδοκυτταρικές οδοί παραγωγής του Ο2 - είναι αντιδράσεις που καταλύονται από ένζυμα όπως η οξειδάση της ξανθίνης, η λιποοξυγονάση, η κυκλοοξυγονάση και η ΝADPH-οξειδάση των φαγοκυττάρων (Davies 2000, Said και συν. 2004, Cash και συν. 2007, Halliwell και Gutteridge 2007). Εξωκυτταρικές πηγές ROS αποτελούν ο καπνός του τσιγάρου, τα άλατα σιδήρου, η υπεριώδης και ιονίζουσα ακτινοβολία και διάφοροι περιβαλλοντικοί ρύποι (Kohen και Nyska 2002, Boonstra και Post 2004). Το Ο2 -, λόγω της παρουσίας ενός ασύζευκτου ηλεκτρονίου, παρουσιάζει ιδιαίτερη τάση σύζευξης με άλλες ROS με αποτέλεσμα την ανεξέλεγκτη παραγωγή πολλών δραστικών μορφών οξυγόνου. Το Ο2 - εμφανίζει χαμηλή δραστικότητα, ελάχιστο χρόνο ημίσειας ζωής (1 ms) και δεν διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη. Το μεγαλύτερο ποσοστό του Ο2 - μεταβολίζεται σε Η2Ο2 αυθόρμητα, με αργό ρυθμό ή με την καταλυτική δράση της υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD), ένζυμο που βρίσκεται 5

σε μεγάλες ποσότητες στη μιτοχονδριακή ουσία (Griveau και Le Lannou 1997, Rojkind και συν. 2002, Salerno και συν. 2005): 2Ο2 - +2Η Η2Ο2+ Ο2 Η μειωμένη δραστικότητα του Ο2 - παρακάμπτεται από την ταυτόχρονη παρουσία μεταβατικών μετάλλων (Cu 2+, Fe 2+ ) και Η2Ο2, η αντίδραση των οποίων (αντίδραση Haber-Weiss) προκαλεί την παραγωγή της, ιδιαίτερα τοξικής για τα κύτταρα, ρίζας υδροξυλίου ( ΟΗ) (Fuchs και συν. 1997, Halliwell και Gutteridge 2007). Έτσι, παρόλο που το Η2Ο2 δεν είναι ρίζα, δηλαδή δε διαθέτει ασύζευκτα ηλεκτρόνια, μέσω της αντίδρασης Fenton ή Haber-Weiss συμβάλλει στην παραγωγή ρίζας ΟΗ (Fuchs και συν. 1997, Jezek και Hlavata 2005, Gutteridge και Halliwell 2007): Fe 3+ + Ο2 - Fe 2+ + O2 Fe 2+ + H2O2 Fe 3+ + OH + ΟΗ Σε σύγκριση με το Ο2 -, το Η2Ο2 εμφανίζει μεγαλύτερη σταθερότητα, είναι σε θέση να διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη και συνεπώς έχει ένα ρόλο μορίουσηματοδότη (Sharma και Agarwal 1996, Cash και συν. 2007, Halliwell και Gutteridge 2007). Tα ενζυμικά αντιοξειδωτικά συστήματα τα οποία είναι επιφορτισμένα με την απομάκρυνση του Η2Ο2 είναι οι καταλάσες (CAT), οι υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης (GPxs) και οι υπεροξυρεδοξίνες (Halliwell και Gutteridge 2007). Οι παραπάνω ROS εξαιτίας της μικρής δραστικότητάς τους, είναι ικανές να διαχέονται μακριά από το σημείο παραγωγής τους και να οδηγούν στην παραγωγή ρίζας ΟΗ σε διαφορετικά μέρη του κυττάρου, όπου υπάρχει επάρκεια καταλυτικών ιόντων των μεταβατικών μετάλλων (Sharma και Agarwal 1996). Επομένως, η 6

τοξικότητα των Ο2 - και Η2Ο2 μπορεί να επηρεαστεί από τη διαθεσιμότητα και την κατανομή των ιόντων των μεταβατικών μετάλλων (Halliwell and Gutteridge 2007). 1.3 Παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου στο σπέρμα Η κύρια δραστική μορφή οξυγόνου που παράγεται στα σπερματοζωάρια είναι το Ο2 -, το οποίο υπό την επίδραση της SOD μπορεί να μετατρέπεται σε Η2Ο2 (Aitken και Clarkson, 1987, Sharma και Agarwal 1996). Οι δύο κύριες θέσεις παραγωγής ROS είναι η κυτταρική μεμβράνη και τα μιτοχόνδρια. Στην κυτταρική μεμβράνη των σπερματοζωαρίων ο μηχανισμός παραγωγής ROS περιλαμβάνει ένα NADPH οξειδωτικό σύστημα (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Oxidase), παρόμοιο με αυτό των λευκοκυττάρων. Στα μιτοχόνδρια ο μηχανισμός παραγωγής ROS περιλαμβάνει μία διαφοράση του σπέρματος (NADPH: acceptor oxidoreductase), η οποία εντοπίζεται στο μέσο τμήμα της ουράς του σπερματοζωαρίου και συγκαταλέγεται στα ένζυμα της αναπνευστικής αλυσίδας των μιτοχονδρίων (Aitken και συν. 1992, Gavella και Lipovac 1992). Το δεύτερο σύστημα αποτελεί την κύρια πηγή ROS για τα σπερματοζωάρια, από το στάδιο του σπερματοκυττάρου έως το στάδιο του ώριμου σπερματοζωαρίου στην ουρά της επιδιδυμίδας (Sharma και Agarwal, 1996, Griveau και Le Lannou, 1997, Lopes και συν. 1998a). Οι Aitken και Clarkson (1987) υποστήριξαν, αρχικά, ότι στα σπερματοζωάρια του ανθρώπου οι παραγόμενες ROS δεν προέρχονται από τα μιτοχόνδρια, καθώς η αναστολή της λειτουργίας της μιτοχονδριακής μεμβράνης δεν φαινόταν να επηρεάζει την παραγωγή του Ο2 - και του Η2Ο2. Πιο πρόσφατα δεδομένα, όμως, δείχνουν ότι η παραγωγή ROS μέσω της οξειδάσης της κυτταρικής μεμβράνης υπολείπεται αυτής των μιτοχονδρίων. Η τελευταία συμβάλλει κατά κύριο λόγο στην εμφάνιση της οξειδωτικής καταπόνησης στα σπερματοζωάρια του ανθρώπου (Koppers και συν. 7

2008, Aitken και συν. 2012α). Μάλιστα, στην παραγωγή ROS των σπερματοζωαρίων συμμετέχει και το σύστημα της οξειδάσης της ξανθίνης, ένα βασικό ένζυμο στον καταβολισμό των πουρινών (Aitken και συν. 1993, O Flaherty και συν. 1999). Στο εκσπερμάτισμα, κύρια πηγή δραστικών μορφών οξυγόνου είναι τα λευκοκύτταρα (ουδετερόφιλα και μακροφάγα), που φυσιολογικά απαντώνται σε αυτό σε μικρές ποσότητες. Ο όρος λευκοκυτταροσπερμία, σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας, αναφέρεται σε συγκεντρώσεις λευκοκυττάρων στο πλάσμα του σπέρματος, που ξεπερνούν το 1x10 6 /ml (World Health Organization-WHO, 1999). Άλλη πηγή ROS αποτελούν τα ανώριμα σπερματοζωάρια, τα ώριμα που εμφανίζουν μορφολογικές ή λειτουργικές ανωμαλίες (Garrido και συν. 2004, Agarwal και συν. 2006), καθώς και τα νεκρά σπερματοζωάρια (Shannon και Curson 1972, Bansal και Bilaspuri 2009). Ειδικότερα, το αυξημένο ποσοστό σπερματοζωαρίων με παραμένον κυτταροπλασματικό σταγονίδιο (cytoplasmic droplet) σχετίζεται με αυξημένες ποσότητες ROS στο εκσπερμάτισμα. Σύμφωνα με τους Gomez και συν. (1996), εάν κατά τη διάρκεια της σπερμιογένεσης απελευθερώνονται από το σπερματικό επιθήλιο σπερματοζωάρια με περίσσεια κυτταροπλάσματος που δεν αποβάλλεται στην επιδιδυμίδα, τότε εμφανίζονται στο εκσπερμάτισμα πολλά ανώριμα, ακατάλληλα για γονιμοποίηση, σπερματοζωάρια. Οι ROS που παράγονται από αυτά τα ανώριμα, μη φυσιολογικά κύτταρα επηρεάζουν τα φυσιολογικά σπερματοζωάρια, που βρίσκονται σε στενή επαφή μαζί τους. Μάλιστα, η παρουσία σε περίσσεια του ενζύμου αφυδρογονάση της 6-φωσφορικής γλυκόζης, στο πλεονάζον κυτταρόπλασμα συμβάλλει στην αυξημένη παραγωγή ROS, όπως θα εξηγηθεί παρακάτω (Agarwal και Allamaneni 2006). 8

1.4 Φυσιολογικός ρόλος των δραστικών μορφών οξυγόνου Οι δραστικές μορφές οξυγόνου αλληλεπιδρούν με πληθώρα μορίων του κυττάρου. Παρά το γεγονός ότι περισσότερος λόγος γίνεται για τους κινδύνους που εγκυμονεί η παραγωγή τους σε έναν κυτταρικό πληθυσμό, οι ROS διαδραματίζουν ιδιαίτερο ρόλο σε διάφορες φυσιολογικές διεργασίες. Για παράδειγμα, τα φαγοκύτταρα παράγουν σημαντικές ποσότητες ROS μέσω της NADPH οξειδάσης, η οποία εντοπίζεται στην πυρηνική και την κυτταρική μεμβράνη τους. Στην περίπτωση αυτή, η παραγωγή Ο2 - και του Η2Ο2 είναι «σκόπιμη», καλείται «αναπνευστική έκρηξη» και εξυπηρετεί την καταστροφή ξένων σωματιδίων ή μικροοργανισμών (Davies 2000, Kohen και Nyska 2002, Παπαγεωργίου 2005). Επιπρόσθετα, οι ROS εμπλέκονται σε μηχανισμούς ρύθμισης της έκφρασης γονιδίων, στη δράση αυξητικών παραγόντων, αλλά και ως ένα βαθμό στη διαδικασία της απόπτωσης (Ford και συν. 2004). Όπως προαναφέρθηκε, αυξημένες ποσότητες ROS παράγονται και στο σπέρμα, ιδιαίτερα από σπερματοζωάρια νεκρά ή με μορφολογικές ανωμαλίες, αλλά και από λευκοκύτταρα. Οι Aitken και συν. (1989) πρότειναν για πρώτη φορά ότι μικρές συγκεντρώσεις ROS είναι απαραίτητες για τη διάτρηση της διαφανούς ζώνης του ανθρώπινου ωαρίου από το σπερματοζωάριο. Άλλες μελέτες υποστηρίζουν ότι, στον άνθρωπο, η παρουσία μικρής συγκέντρωσης Η2Ο2 στο περιβάλλον των σπερματοζωαρίων προάγει την ενεργοποίηση (capacitation) των σπερματοζωαρίων, την αντίδραση του ακροσώματος (acrosome reaction) και την αλληλεπίδραση και συγχώνευση των δύο γαμετών (de Lamirande και Gagnon 1993, Aitken και Fischer 1994, O Flaherty και συν. 1999). Η ενεργοποίηση και η αντίδραση του ακροσώματος, είναι πολύπλοκες διαδικασίες, οι οποίες ελέγχονται και ρυθμίζονται από πολλούς παράγοντες (Visconti 2009). Η διατήρηση της ακεραιότητας του ακροσώματος και η 9

ομοιοστασία των πρωτεολυτικών ενζύμων του είναι βασικές προϋποθέσεις για την επιτυχή γονιμοποίηση. Μάλιστα, η ακεραιότητα του ακροσώματος αποτελεί σημαντικό προγνωστικό δείκτη της γονιμοποιητικής ικανότητας του σπερματοζωαρίου (Oura και Toshimori 1990). Ανάλογες παρατηρήσεις διατυπώθηκαν και σε κατεψυγμένα σπερματοζωάρια ταύρου, σύμφωνα με τις οποίες οι ROS και ειδικά το Ο2 - είναι απαραίτητα και συμμετέχουν στις διαδικασίες της ενεργοποίησης και της αντίδρασης του ακροσώματος (O Flaherty και συν. 2007). Μάλιστα, η επώαση σπερματοζωαρίων σε συνθήκες κατάλληλες για την ενεργοποίηση και την αντίδραση του ακροσώματος (παρουσία ιόντων ασβεστίου, διττανθρακικών ιόντων, αλβουμίνης και CO2) επάγει την παραγωγή του Ο2 - (de Lamirande και Gagnon 1995, de Lamirande και συν. 1997, Rivlin και συν. 2004). Οι ROS που παράγονται κατά τη διαδικασία της ενεργοποίησης/αντίδρασης ακροσώματος, δρουν στα σπερματοζωάρια είτε άμεσα, με την επαγωγή της φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών σε υπολείμματα τυροσίνης (de Lamirande και συν. 1997, Αitken και συν. 1998) και τον πολυμερισμό της ακτίνης, (καταστάσεις που επάγουν την υπερενεργοποίηση των σπερματοζωαρίων) είτε έμμεσα, με τη ρύθμιση της δραστικότητας ενζύμων, όπως η φωσφολιπάση A2 (Phospholipase A2, PLA2), που βρίσκεται στην κυτταρική μεμβράνη (O Flaherty και συν. 1999). Οι Rivlin και συν. (2004) μελέτησαν το φαινόμενο της ενεργοποίησης σε σπερματοζωάρια ταύρου και πρότειναν έναν άμεσο μηχανισμό, σύμφωνα με τον οποίο το Η2Ο2 ενεργοποιεί την αδενυλική κυκλάση της κυτταρικής μεμβράνης, η οποία προκαλεί την ενδοκυτταρική αύξηση του camp, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της πρωτεϊνικής κινάσης Α (PKA), η οποία με τη σειρά της επάγει τη φωσφορυλίωση πρωτεϊνών σε υπολείμματα τυροσίνης. 10

Σύμφωνα με τον έμμεσο μηχανισμό ενεργοποίησης, η δραστικότητα της PLA2 αυξάνεται εξαιτίας της ενδοκυτταρικής αύξησης ιόντων ασβεστίου ή εξαιτίας της συσσώρευσης λιπιδικών υδροϋπεροξειδίων στη μεμβράνη των σπερματοζωαρίων (Bennet και συν. 1987, Goldman και συν. 1992). Μάλιστα τα δύο φαινόμενα, της ενεργοποίησης/αντίδρασης ακροσώματος και της λιπιδικής υπεροξείδωσης, είναι αλληλένδετα. Ήπια λιπιδική υπεροξείδωση προδιαθέτει τα σπερματοζωάρια σε ενεργοποίηση/αντίδραση ακροσώματος (da Silva 2006), καθώς η παρουσία ελεγχόμενων συγκεντρώσεων λιπιδικών υδροϋπεροξειδίων προκαλεί αύξηση της ρευστότητας των κυτταρικών μεμβρανών και υποβοηθά τη συγχώνευση των γαμετών κατά τη διαδικασία της γονιμοποίησης (de Lamirande και συν. 1997). Σε αυτό το σημείο, αξίζει να αναφερθεί ότι η ίδια η διαδικασία της κατάψυξης/απόψυξης, παρά τα πλεονεκτήματα που προσφέρει, προκαλεί μεταβολές στη διάταξη των λιπιδίων και των πρωτεϊνών της κυτταρικής μεμβράνης των σπερματοζωαρίων. Οι μεταβολές αυτές επηρεάζουν την προοδευτική κίνηση και τη γονιμοποιητική ικανότητα των σπερματοζωαρίων (da Silva 2006), ενώ παράλληλα είναι δυνατόν να προκαλέσουν πρόωρη ενεργοποίηση/αντίδραση ακροσώματος, μακριά από το σημείο της γονιμοποίησης (Cormier και Bailey 2003, Neild και συν. 2003). Τέλος, στη διαδικασία της in vitro γονιμοποίησης, η παρουσία μικρών συγκεντρώσεων ROS φαίνεται ότι προάγει την ωρίμανση και την ομαλή ανάπτυξη των ωοκυττάρων, ενώ θεωρείται πιθανή η συμβολή τους στην παρεμπόδιση της πολυσπερμίας (Attaran και συν. 2000). 11

1.5 Τεχνικές προσδιορισμού των δραστικών μορφών οξυγόνου Συνήθως ο προσδιορισμός των ολικών δραστικών μορφών οξυγόνου πραγματοποιείται µε τη χρήση της λουμινόλης (luminol). H ουσία αυτή διαπερνά τη μεμβράνη και οξειδώνεται ενδοκυτταρικά από κάθε είδος δραστικής μορφής οξυγόνου (de Lamirande και Gagnon 1995, Sharma και Agarwal 1996, Michael και συν. 2009). Μία άλλη ουσία που έχει χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό των ROS είναι η λουσιγενίνη (lucigenin) (Aitken και συν. 1992). Από την άλλη πλευρά, οι Dalvit και συν. (2005) πρότειναν τον προσδιορισμό των ROS με τη χρήση της χρωστικής ουσίας DCFHDA (2-7 -Dichlorofluorescin diacetate) και φθορισμόμετρου. Η DCFHDA έχει χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό του H2O2 με εφαρμογή της κυτταρομετρίας ροής (flow cytometry) (Dominguez-Rebolledo και συν. 2010, Mahfouz και συν. 2010). Με τη μέθοδο αυτή προσδιορίζεται και το Ο2 - με τη χρήση της χρωστικής ουσίας DHE (dihydroethidium). Η μέθοδος της κυτταρομετρίας ροής χαρακτηρίζεται από ταχύτητα, επαναληψιμότητα, ικανότητα παράλληλου προσδιορισμού πολλών και διαφορετικών παραμέτρων, με τη χρήση της κατάλληλης κάθε φορά φθορίζουσας ουσίας, ενώ δίνει τη δυνατότητα εξαγωγής ασφαλών συμπερασμάτων, ακόμη και με μικρό αριθμό κυττάρων (π.χ. αξιολόγηση σπέρματος ατόμων με ολιγοζωοσπερμία) (Evenson και συν. 1980). Τέλος, η οξειδωτική καταπόνηση ενός κυτταρικού πληθυσμού είναι δυνατόν να διαπιστωθεί είτε μέσω του προσδιορισμού ουσιών-δεικτών, όπως είναι η μηλονική διαλδεΰδη (MDA) και η 8-υδροξυ-2 -δεοξυγουανοσίνη (8-ΟΗdG), που παράγονται από την τοξική επίδραση των ROS στα λιπίδια και στις αζωτούχες βάσεις του DNA αντίστοιχα, είτε με τη μέτρηση της αντιοξειδωτικής ικανότητας ενός κυτταρικού πληθυσμού (προσδιορισμός της ανηγμένης γλουταθειόνης-gsh, προσδιορισμός της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας κλπ.) (Kohen και Nyska 2002). 12

2. ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ 2.1 Μηχανισμός πρόκλησης οξειδωτικής βλάβης στο κύτταρο Οι αερόβιοι οργανισμοί (ζώα, φυτά, κάποια βακτήρια) έχουν ανάγκη το οξυγόνο για να οξειδώσουν τον άνθρακα και το υδρογόνο των θρεπτικών συστατικών και, μέσω των αντιδράσεων αυτών, να παράγουν την απαραίτητη για την επιβίωσή τους θερμική και χημική ενέργεια (Freeman και Crapo 1981). Ωστόσο, τα κύτταρα,0 που ζουν κάτω από αερόβιες συνθήκες, υφίστανται το «παράδοξο οξυγόνου» (Davies 1995, Makker και συν. 2009), σύμφωνα με το οποίο, το οξυγόνο αν και είναι απαραίτητο για τις μεταβολικές αντιδράσεις του κυττάρου, μπορεί να συμβάλλει, ακόμη και σε μικρές συγκεντρώσεις, στην παραγωγή τοξικών για το κύτταρο δραστικών μορφών οξυγόνου. Οι Gershman και Gilbert (1954) υποστήριξαν πρώτοι ότι η τοξικότητα του οξυγόνου οφείλεται στις ROS που παράγονται κατά το μεταβολισμό του, και όχι στο οξυγόνο αυτό καθεαυτό. Από την άλλη μεριά, το κύτταρο προκειμένου να διατηρήσει την ομοιοστασία του διαθέτει μία σειρά αντιοξειδωτικών συστημάτων που είναι επιφορτισμένα με την προάσπιση της λειτουργικής και δομικής ακεραιότητας του κυττάρου. Το οξειδωτικό στρες αντανακλά την ανισορροπία μεταξύ της παραγωγής ROS και της ικανότητας των κυττάρων να τις αδρανοποιήσουν ή να επιδιορθώσουν τις βλάβες που προκαλούνται (de Lamirande και Gagnon 1995, Gutteridge 1995, Davies 2000). Σύμφωνα με τους Halliwell και Gutteridge (2007) το οξειδωτικό στρες προκύπτει στις εξής δύο περιπτώσεις: α) Αυξημένη παραγωγή ROS, όπως συμβαίνει στις περιπτώσεις έκθεσης του οργανισμού σε υψηλές συγκεντρώσεις οξυγόνου, σε χρόνιες φλεγμονώδεις παθήσεις που συνοδεύονται από αυξημένη δραστηριότητα των κυττάρων με φαγοκυτταρική δραστηριότητα (π.χ. ρευματοειδής και ψωριασική αρθρίτιδα, νόσος του Crohn) 13

καθώς και σε παρουσία τοξικών ουσιών του περιβάλλοντος. Ανάλογα με την κάθε περίπτωση, οι ίδιες οι τοξικές ουσίες μπορεί είτε να συμπεριφέρονται σαν δραστικές ρίζες, π.χ. ΝΟ2, ή να μεταβολίζονται σε δραστική ρίζα, π.χ. το παρασιτοκτόνο τετραχλωράνθρακας, είτε να μειώνουν τη δράση αντιοξειδωτικών μηχανισμών ή να εμπλέκονται σε οξειδοαναγωγικά φαινόμενα που καταλήγουν στο σχηματισμό δραστικών ριζών, π.χ. το ζιζανιοκτόνο παρακουάτ. β) Ένδεια αντιοξειδωτικών παραγόντων ή ενζύμων εξαιτίας μεταλλάξεων στα γονίδια που τα κωδικοποιούν ή εξαιτίας μειωμένης πρόσληψης αντιοξειδωτικών ουσιών, σε περίπτωση υποσιτισμού ή μη ισορροπημένης διατροφής. Ο σχηματισμός των ROS σε κύτταρα και ιστούς είναι δυνατόν να οδηγήσει σε μία πληθώρα πρωτογενών αντιδράσεων και βλαβών στο μικροπεριβάλλον των μεμβρανών. Μεταξύ αυτών συγκαταλέγονται η λιπιδική υπεροξείδωση, η βλάβη και καταστροφή του DNA (Sikka και συν. 1995, Agarwal και συν. 2003, del Valle 2011), η οξείδωση πρωτεϊνικών μορίων (Slater 1984, Kohen και Nyska 2002), οι τροποποιήσεις στη δομή των μιτοχονδρίων και συνεπώς η εξάντληση των αποθεμάτων ATP (de Lamirande και Gagnon 1992), και, τέλος, η απόπτωση των κυττάρων (Moustafa και συν. 2004, Lozano και συν. 2009). Στις παραπάνω καταστάσεις τα κύτταρα αντιδρούν με διάφορους τρόπους που εξαρτώνται τόσο από το είδος του κυττάρου, όσο και από τη σοβαρότητα της καταπόνησης (Halliwell και Gutteridge 2007). Οι προστατευτικοί μηχανισμοί του κυττάρου περιλαμβάνουν άμεσες και έμμεσες αντιδράσεις στη βλαπτική επίδραση των ROS. Το κύτταρο επιστρατεύει αντιοξειδωτικούς παράγοντες, όπως ένζυμα, χηλικούς παράγοντες και αντιοξειδωτικές ουσίες διατροφικής προέλευσης, ενώ παράλληλα επιδιορθώνει μέσω ειδικών ενζύμων τις προκαλούμενες βλάβες (Sies 1993, Makker και συν. 2009). Επιπρόσθετα, η διπλή στιβάδα των φωσφολιπιδίων της 14

κυτταρικής μεμβράνης, ενισχυμένη με πρωτεϊνικής φύσεως μόρια, είναι σε θέση να αποσοβεί τους σοβαρούς κινδύνους από την παραγωγή των ROS (Kohen και Nyska 2002) στο περιβάλλον του κυττάρου. 2.1.1 Κατακερματισμός του DNA Οι τοξικές ιδιότητες των ROS οφείλονται στην ικανότητά τους να αντιδρούν με κάθε στοιχείο του κυττάρου. Όσον αφορά στα στοιχεία του DNA, οι ROS είναι τοξικές τόσο για τις αζωτούχες βάσεις, όσο και για τα μόρια δεσοξυριβόζης (Sikka και συν. 1995, Halliwell και Gutteridge 2007, Aitken και Koppers 2011). Η επίδραση των ROS στο γενετικό υλικό μπορεί να αποτελέσει εφαλτήριο μεταλλάξεων, καρκινογένεσης αλλά και του γήρατος. Η καταστροφή του DNA πιθανόν να σχετίζεται με σφάλματα στην αντιγραφή, με την αστάθεια του γονιδιώματος και με την ενεργοποίηση μηχανισμών που εμπλέκονται στην καρκινογένεση (Buonocore και συν. 2010). Η οξείδωση των σουλφυδρυλικών ομάδων της πολυπεπτιδικής αλυσίδας των ενζύμων της πολυμεράσης έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια της δραστικότητάς τους. Ο κυτταρικός θάνατος επέρχεται εφόσον οι βλάβες από την οξειδωτική καταστροφή του DNA δεν επιδιορθωθούν πριν από την ολοκλήρωση της διαδικασίας της αντιγραφής (Μarnett 2000). Η καταστροφή προκαλείται κατά κύριο λόγο από τη δράση των ριζών ΟΗ, οι οποίες παράγονται απευθείας επάνω στο DNA, με αποτέλεσμα τα αντιοξειδωτικά συστήματα του κυττάρου να μην είναι σε θέση να τις αντιμετωπίσουν (Halliwell και Gutteridge 2007). Το Η2Ο2, μέσω της αντίδρασης Fenton, οδηγεί στην παραγωγή ριζών ΟΗ,οι οποίες αυξάνουν τις διασπάσεις του DNA (Twigg και συν. 1998, Halliwell και Gutteridge 2007). Τα μεταβατικά μέταλλα που είναι συνδεδεμένα με το αρνητικά φορτισμένο DNA επάγουν την αντίδραση αυτή (Gutteridge και Halliwell 2007). Ανάλογες βλάβες προκαλούνται και στο 15

μιτοχονδριακό DNA, οι οποίες έχουν συσχετιστεί με την εκδήλωση ποικίλων εκφυλιστικών νόσων και με την εμφάνιση του γήρατος (Minowa και συν. 2000). 2.1.2 Απόπτωση Η απόπτωση (apoptosis), δηλαδή ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος, είναι μία φυσιολογική και μη φλεγμονώδης εξεργασία με ιδιαίτερη σημασία για τη διατήρηση της ομοιοστασίας στα διάφορα βιολογικά συστήματα, αφού περιορίζει τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Kerr και συν. 1972). Η απόπτωση χαρακτηρίζεται από ευδιάκριτα μορφολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά, όπως είναι η συρρίκνωση του πυρήνα, η μετάθεση της φωσφατιδυλοσερίνης (Phosphatidylserine, PS) από το εσωτερικό στο εξωτερικό πέταλο της κυτταρικής μεμβράνης και η αύξηση του κατακερματισμού του DNA και τελικά του κυττάρου (Kerr και συν. 1972, Μignotte και Vayssiere 1998, Lozano και συν. 2009). Η απόπτωση είναι ένα αρκετά πολύπλοκο φαινόμενο, στο οποίο ο ρόλος των μιτοχονδρίων θεωρείται κεντρικός (Wang 2001). Πληθώρα ερεθισμάτων, όπως οι ορμόνες, διάφορες κυτταροκίνες, οι ROS κ.ά. είναι σε θέση να επάγουν το μηχανισμό της απόπτωσης. Ανεξάρτητα από το ερέθισμα, με την έναρξη της διαδικασίας οι πόροι των μιτοχονδρίων ανοίγουν, το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΔΨm) μειώνεται και απελευθερώνονται στο κυτταρόπλασμα προ-αποπτωτικοί παράγοντες, οι οποίοι ενεργοποιούν πρωτεΐνες που ανήκουν στην οικογένεια των κασπασών (cysteinyl aspartate-specific proteases-caspases) (Ravagnan και συν. 2002). Οι τελευταίες, με την αποδόμηση των πρωτεϊνών του κυττάρου, ενισχύουν το σήμα της απόπτωσης με τελικό στάδιο την ενεργοποίηση ενδονουκλεασών που διασπούν το DNA (Kerr και συν. 1972, Murphy και Martin 2003). 16

Ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της πρώιμης φάσης της απόπτωσης είναι η απώλεια της δομικής ασυμμετρίας της κυτταρικής μεμβράνης (Harrison και Gadella 1995). Τα φωσφολιπίδια της κυτταρικής μεμβράνης διατάσσονται ασύμμετρα μεταξύ των δύο μονών στιβάδων της, με τη φωσφαριδυλοσερίνη (phosphatidylserine-ps) να εντοπίζεται φυσιολογικά στην εσωτερική. Η μετάθεσή της στην εξωτερική μονή στιβάδα έχει χαρακτηριστεί ως πρώιμος δείκτης απόπτωσης (Vance και Steenbergen 2005). Οι δραστικές μορφές οξυγόνου προκαλούν την έναρξη της διαδικασίας της απόπτωσης (Gorczycka και συν. 1993, Sikka και συν. 1995, Agarwal και συν. 2006, Lozano και συν. 2009) με την απελευθέρωση από τα μιτοχόνδρια του κυτοχρώματος c και την ενεργοποίηση στo κυτταρόπλασμα διαφόρων κασπασών (Bao και Shi 2007). Παράλληλα, οι ROS που απελευθερώνονται στο κυτταρόπλασμα προάγουν το σχηματισμό νέων δραστικών μορφών από γειτονικά μιτοχόνδρια, αυξάνοντας δραματικά τα επίπεδά τους στο κύτταρο. Με αυτό τον τρόπο, το κύτταρο οδηγείται σε καταστροφή καθώς όλα τα δομικά στοιχεία του εκτίθενται στη βλαπτική επίδραση των ROS (Zorov και συν. 2006). 2.1.3 Λιπιδική υπεροξείδωση Η μεμβράνες που περιβάλλουν τα κύτταρα και διάφορα κυτταρικά οργανίδια (μιτοχόνδρια, υπεροξεισωμάτια, λυσσοσωμάτια) περιέχουν μεγάλες ποσότητες πολυακόρεστων λιπαρών οξέων (poly-unsaturated fatty acids, PUFAs), τα οποία οξειδώνονται πολύ εύκολα (Zini και συν. 2010). Ως PUFAs ορίζονται τα λιπαρά οξέα που περιέχουν δύο ή περισσότερους διπλούς δεσμούς άνθρακα (-CH=CH-). Ο λόγος για τον οποίο τα PUFAs είναι περισσότερο ευάλωτα στη δράση των ROS είναι η παρουσία των διπλών δεσμών. Όσο περισσότερους διπλούς δεσμούς έχει ένα λιπαρό 17

οξύ τόσο πιο εύκολη είναι η απόσπαση από αυτό ενός ατόμου υδρογόνου, αφού ελαττώνεται η ισχύς του δεσμού άνθρακα-υδρογόνου (Gutteridge και Halliwell 2007). Το έναυσμα για την έναρξη της λιπιδικής υπεροξείδωσης μπορεί να είναι ένας οποιοσδήποτε παράγοντας, αρκεί αυτός να έχει την ικανότητα να αποσπάσει ένα άτομο υδρογόνου. Τέτοιοι παράγοντες είναι οι εξής: η ρίζα του υπεροξειδικού ανιόντος (Ο2 - ), η ρίζα υδροξυλίου ( ΟΗ), η υδροϋπεροξειδική ρίζα (ΗΟ2 ), η υπεροξειδική ρίζα (RΟO ), η αλκοξειδική ρίζα (RO ) και η ρίζα ΝΟ. Τα στάδια της λιπιδικής υπεροξείδωσης, της ποιοτικής δηλαδή υποβάθμισης των PUFAs, είναι η έναρξη (initiation), η διάδοση (propagation) και ο τερματισμός (termination) (Παπαγεωργίου 2005, Halliwell και Gutteridge 2007). Στο πρώτο στάδιο, την έναρξη, ένα άτομο υδρογόνου της μεθυλικής ομάδας της ανθρακικής αλυσίδας αποσπάται από το PUFΑ με αποτέλεσμα το σχηματισμό αλκυλορίζας. Η αντίδραση περιγράφεται ως εξής: LH + Χ L + XH όπου LH το ακόρεστο λιπαρό οξύ και L η αλκυλορίζα (Slater 1984, Halliwell και Chirico 1993, Abuja και Albertini 2001). Στο στάδιο της διάδοσης οι αλκυλορίζες αντιδρούν με το οξυγόνο σχηματίζοντας λιποϋπεροξειδικές ρίζες (LOO ). Επιπρόσθετα, οι αλκυλορίζες είναι σε θέση να αποσπάσουν από γειτονικά PUFAs άτομα υδρογόνου προκαλώντας, έτσι, τη δημιουργία μίας νέας αλκυλορίζας, μίας λιπιδικής ρίζας και ενός λιπιδικού υδροϋπεροξείδιου. Η αντίδραση περιγράφεται ως εξής: L + Ο2 LOO LOO + LΗ L + LOOH 18

όπου LOOH τα λιπιδικά υδροϋπεροξείδια (Slater 1984, Halliwell και Chirico 1993, Abuja και Albertini 2001). Από το σημείο αυτό ξεκινά μια σειρά αλυσιδωτών αντιδράσεων έως ότου καταναλωθούν όλα τα συστατικά. Τα λιπιδικά υδροϋπεροξείδια απομακρύνονται σε κάποιο βαθμό από τους εκκαθαριστές ελεύθερων ριζών, όπως είναι η GPx και η οξειδάση της γλουταθειόνης. Ωστόσο, με την παρουσία μεταβατικών μετάλλων σχηματίζονται αλκοξυλικές και υπεροξειδικές ρίζες. Το στάδιο αυτό σηματοδοτεί τον τερματισμό της λιπιδικής υπεροξείδωσης. Η αντίδραση περιγράφεται ως εξής: LOO + LOO L=O + LOH + Ο2 L + L L-L LOO + L L=O + LOH όπου L=O και L-L τα προϊόντα της λιπιδικής υπεροξείδωσης (Slater 1984, Abuja και Albertini 2001). Οι αντιδράσεις αυτές δεν μπορούν να συνεχίζονται ατέρμονα, αφού κάποια στιγμή οι ρίζες αυτές είτε θα αντιδράσουν μεταξύ τους είτε θα αντιμετωπίσουν τη δράση κάποιου αντιοξειδωτικού παράγοντα είτε θα αντιδράσουν με κάποια πρωτεΐνη, την οποία θα τροποποιήσουν οξειδωτικά (Parcker 1997, Παπαγεωργίου 2005). Όπως προαναφέρθηκε, από το μεταβολισμό των λιπιδικών υδροϋπεροξειδίων προκύπτει πληθώρα προϊόντων, όπως εποξείδια, κορεσμένες ή ακόρεστες αλδεΰδες και κετόνες. Μεταξύ αυτών ιδιαίτερη θέση κατέχει η μηλονική διαλδεΰδη (malondialdeyde, MDA). Πρόκειται για μία κορεσμένη διαλδεΰδη, αρκετά τοξική για τα κύτταρα, με μεταλλαξιογόνο δράση όταν αντιδρά με το DNA (Halliwell και Chirico 1993). Η MDA χρησιμοποιείται ως δείκτης μέτρησης της λιπιδικής υπεροξείδωσης. 19

Κατά τη λιπιδική υπεροξείδωση πραγματοποιούνται σημαντικές μεταβολές στις κυτταρικές μεμβράνες και στη λειτουργία των κυττάρων. Μειώνεται η ρευστότητα της κυτταρικής μεμβράνης λόγω της οξείδωσης των PUFAs, ενώ οι συνδεδεμένες πρωτεΐνες και οι αντιοξειδωτικές ουσίες χάνουν τη δραστικότητά τους (Dobretsov και συν. 1977). Επιπρόσθετα, αυξάνεται η διαπερατότητα της κυτταρικής μεμβράνης και διαταράσσεται η συγκέντρωση των ιόντων μέσα και έξω από τα κύτταρα, καθώς μεταβάλλεται η λειτουργία αντλιών νατρίου/καλίου (Να + /Κ + - ΑΤPάση) και ασβεστίου (Ca ++ -ΑΤΡάση) (Comporti 1993). Τα τελικά αλδεϋδικά προϊόντα της λιπιδικής υπεροξείδωσης αντιδρούν με άλλα δομικά συστατικά του κυττάρου, όπως είναι οι πρωτεΐνες και το DNA, και μεταβάλλουν τη δομή τους (Summerfield και Tappel 1981). Η λιπιδική υπεροξείδωση έχει συσχετιστεί με πληθώρα νοσημάτων, όπως η αθηροσκλήρωση, ο σακχαρώδης διαβήτης, η χρόνια νεφρική ανεπάρκεια, η ρευματοειδής αρθρίτιδα, το σύνδρομο ισχαιμίας/επαναιμάτωσης των νεφρών, της καρδιάς, του ήπατος, του εντέρου, του εγκεφάλου κ.ά. (Abuja και Albertini 2001). Επιπλέον, υποστηρίζεται ότι η απώλεια της ρευστότητας της κυτταρικής μεμβράνης οδηγεί σε πρόωρη γήρανση του κυττάρου (Παπαγεωργίου 2005). 2.1.4 Οξείδωση των πρωτεϊνών Οι πρωτεΐνες είναι ιδιαίτερα ευάλωτες στις ROS. Μάλιστα, βιβλιογραφικά δεδομένα υποστηρίζουν ότι δεν είναι τα λιπίδια και το DNA, αλλά τα πρωτεϊνικά μόρια που δέχονται πρώτα την επιβλαβή δράση των ROS (Du και Gebicki 2004). Συνεπώς, η οξειδωτική βλάβη των πρωτεϊνών προκαλείται είτε άμεσα, είτε έμμεσα εξαιτίας της παρουσίας των τελικών προϊόντων της λιπιδικής υπεροξείδωσης (MDA, κ.ά.), τα οποία αλληλεπιδρούν με τις σουλφυδρυλικές ομάδες των πρωτεϊνών. Τα 20

βιολογικά συστήματα διαθέτουν επιδιορθωτικά ένζυμα που αποκαθιστούν την οξειδωτική βλάβη. Ωστόσο, όταν η τελευταία είναι εκτεταμένη, οι πρωτεΐνες μετουσιώνονται, αναγνωρίζονται από τα πρωτεολυτικά συστήματα του κυττάρου και αποδομούνται. Η οξειδωτική βλάβη των πρωτεϊνών του κυττάρου εγκυμονεί δυσμενείς συνέπειες για τη λειτουργικότητα των υποδοχέων και τη δραστικότητα πολλών ενδοκυτταρικών ενζύμων, με αποτέλεσμα τη διαταραχή της λειτουργίας του κυττάρου (Halliwell και Gutteridge 2007). 2.1.5 Διαταραχή της παραγωγής ATP Η διαταραχή της παραγωγής του ATP από την επίδραση αυξημένης συγκέντρωσης ROS μπορεί να οφείλεται στην αδρανοποίηση της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης και της γλυκολυτικής οδού μέσω της αναστολής της δράσης του ενζύμου αφυδρογονάση της 3- φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (G3PDH) (Hyslop και συν. 1988, O Flaherty και συν. 1999). Στην περίπτωση αυτή τα ενδοκυτταρικά ποσά ATP μειώνονται, με συνέπεια τη λειτουργική αποδιοργάνωση του κυττάρου. 2.2 Η επίδραση της οξειδωτικής βλάβης στο σπέρμα 2.2.1 Κινητικότητα Τα σπερματοζωάρια διαθέτουν μεγάλο αριθμό μιτοχονδρίων, προκειμένου να εξασφαλιστεί η ενέργεια που απαιτείται για την ενεργοποίηση και τη μεταφορά τους στο γεννητικό σωλήνα του θηλυκού, με τελικό προορισμό τον ωαγωγό. Η παρουσία δυσλειτουργικών μιτοχονδρίων μπορεί να προκαλέσει την παραγωγή από αυτά υψηλών επιπέδων ROS, τα οποία επηρεάζουν τη φυσιολογική λειτουργία των σπερματοζωαρίων (Wang και συν. 2003). Από την άλλη μεριά, τα σπερματοζωάρια με λειτουργικές διαταραχές παράγουν μεγάλες ποσότητες ROS που μπορεί να 21

προκαλέσουν δυσλειτουργία στα μιτοχόνδρια. Τα φαινόμενα φαίνεται ότι είναι αλληλένδετα, με τελικό αποτέλεσμα τη μειωμένη φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών του αξονήματος, την ταχεία διάσπαση του ATP (Alvarez και Storey 1992, Agarwal και Allamaneni 2006) και τη μειωμένη κινητικότητα των σπερματοζωαρίων (Armstrong και συν. 1999, Agarwal και συν. 2006). Παράλληλα, εξαιτίας της λιπιδικής υπεροξείδωσης που προκαλείται, μειώνεται η ρευστότητα της κυτταρικής μεμβράνης των σπερματοζωαρίων (Aitken 1995, de Lamirande και Gagnon 1995). Μία άλλη πιθανή αιτία της μειωμένης κινητικότητας των σπερματοζωαρίων είναι η μείωση της δραστικότητας του ενζύμου αφυδρογονάση της 6-φωσφορικής γλυκόζης (G6PD), που προκαλείται από τη συσσώρευση δραστικών μορφών οξυγόνου, όπως το H2O2. Το ένζυμο G6PD ρυθμίζει τη ροή της γλυκόζης στο δρόμο των φωσφορικών πεντοζών και ταυτόχρονα την παραγωγή ΝΑDPH (Makker και συν. 2009) στο σπερματοζωάριο. Συνεπώς, η μείωση της δραστικότητας του ενζύμου G6PD επιφέρει διαταραχές στην παραγωγή του NADPH, του οποίου η ενδοκυτταρική συγκέντρωση μειώνεται (Griveau και συν. 1995), με αποτέλεσμα αρχικά να διαταράσσεται η ροή ηλεκτρονίων στην αναπνευστική αλυσίδα (de Lamirande και Gagnon 1992) και τελικά να μειώνεται η παραγωγή ΑΤΡ. Επιπλέον, εξαιτίας της μειωμένης δραστικότητας του G6PD αναστέλλεται η ανακύκλωση της οξειδωμένης μορφής της γλουταθειόνης (GSSG) σε GSH και έτσι μειώνεται η αντιοξειδωτική προστασία του σπερματοζωαρίου (Saleh και Agarwal 2002). Υπενθυμίζεται ότι η αναγωγή της GSSG απαιτεί την απρόσκοπτη διαθεσιμότητα ΝΑDPH (Sharma και Agarwal 1996). Τελικά, με τη μείωση του ενδοκυτταρικού ATP, η κινητικότητα των σπερματοζωαρίων μειώνεται, ενώ η πτώση της αντιοξειδωτικής άμυνας καθιστά τα σπερματοζωάρια ακόμα πιο ευάλωτα στην οξειδωτική καταπόνηση (Αgarwal και συν. 2006). 22

2.2.2 Ζωτικότητα Η ζωτικότητα των σπερματοζωαρίων συνδέεται άρρηκτα με τη γονιμότητα (Januskauskas και συν. 2003, Kasimanickam και συν. 2006). Όπως προαναφέρθηκε, τα σπερματοζωάρια είναι πλούσια σε PUFAs, γεγονός που τα καθιστά ιδιαίτερα ευάλωτα στην επίδραση των ROS. Είναι ευρέως γνωστό ότι τα σπερματοζωάρια των θηλαστικών που έχουν υποβληθεί σε διαδικασία κατάψυξης/ απόψυξης παρουσιάζουν μειωμένη γονιμοποιητική ικανότητα, η οποία αποδίδεται, μεταξύ άλλων, στη δραματική αύξηση των ενδοκυτταρικών επιπέδων των ROS (Bilodeau και συν. 2000, Michael και συν. 2009). Μάλιστα, η μείωση της δραστικότητας δύο σημαντικών αντιοξειδωτικών ενζύμων, της GPx και της SOD, ως επακόλουθο της διαδικασίας της κατάψυξης στα βοοειδή, ενισχύει ακόμη περισσότερο την προκαλούμενη λιπιδική υπεροξείδωση (Chatterjee και Gagnon 2001). Από την τελευταία επηρεάζεται σε έντονο βαθμό η ζωτικότητα των σπερματοζωαρίων (Βennet και συν. 1987, Alvarez και Storey 1992, Goldman και συν. 1992). Επιπρόσθετοι επιβαρυντικοί παράγοντες είναι και η παρουσία μορφολογικά ανώμαλων σπερματοζωαρίων (Shannon και Wishwannath 1995), πρωτοπλασματικών σταγονιδίων (Saleh και Agarwal 2002) και η απομάκρυνση του πλάσματος του σπέρματος. Έτσι, ο κυτταρικός θάνατος αποδίδεται, κατά κύριο λόγο, στην τοξική επίδραση του Η2Ο2, μέσω των παραγόμενων λιπιδικών υδροϋπεροξειδίων (Agarwal 2005). Στην πράξη, το αποτέλεσμα της οξειδωτικής καταπόνησης εκφράζεται με τη μείωση της ζωτικότητας και τη διαταραχή της λειτουργίας των σπερματοζωαρίων που επιβιώνουν (Alvarez και Storey 1992, Chatterjee και Gagnon 2001). Υπολογίζεται ότι η ζωτικότητα του βόειου σπέρματος μετά τη διαδικασία της κατάψυξης/απόψυξης κυμαίνεται περίπου στο 50 % (Januskauskas και συν. 2003, Felipe-Perez και συν. 2008). 23