ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΖΩΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ, ΙΧΘΥΟΛΟΓΙΑΣ, ΟΙΚΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΚΤΗΝΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΖΩΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ, ΙΧΘΥΟΛΟΓΙΑΣ, ΟΙΚΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΙΩΑΝΝΗ Α. ΚΥΡΚΟΥ Η Πτυχιούχου Κτηνιάτρου ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΧΛΩΡΙ ΑΣ ΚΑΙ Ι ΙΑΙΤΕΡΑ ΤΩΝ VIBRIO SPP. ΣΕ ΙΧΘΥΟΓΕΝΝΗΤΙΚΟΥΣ ΣΤΑΘΜΟΥΣ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ ΚΑΙ ΛΑΒΡΑΚΙΟΥ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑ Α Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2006

ΙΩΑΝΝΗ Α. ΚΥΡΚΟΥ Η ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΧΛΩΡΙ ΑΣ ΚΑΙ Ι ΙΑΙΤΕΡΑ ΤΩΝ VIBRIO SPP. ΣΕ ΙΧΘΥΟΓΕΝΝΗΤΙΚΟΥΣ ΣΤΑΘΜΟΥΣ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ ΚΑΙ ΛΑΒΡΑΚΙΟΥ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑ Α Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στην Κτηνιατρική Σχολή, Τοµέας Ζωικής Παραγωγής, Ιχθυολογίας, Οικολογίας και Προστασίας Περιβάλλοντος Ηµεροµηνία προφορικής εξέτασης: 30.3.2006 Τριµελής Συµβουλευτική Επιτροπή Οµότιµος Καθηγητής Γ. Φώτης, Επιβλέπων Οµότιµος Καθηγητής Ν. Ηλιάδης, Μέλος Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Χρ. Μπάτζιος, Μέλος Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής Εξεταστική Επιτροπή Καθηγητής Χ. Μπάτζιος, Μέλος Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής, Σ. Λέκκας, Εξεταστής Καθηγήτρια, Ε. Χατζοπούλου-Μπουρτζή, Εξεταστής Αν. Καθ. Α. Καµαριανός, Εξεταστής Αν. Καθ. Ε. Χρηστάκη-Σαρρικάκη, Εξεταστής Αν. Καθ. Μ. Κουµπατή-Αρτοποιού, Εξεταστής Επικ. Καθ. Π. Αγγελίδης, Εξεταστής - 2 -

- 3 - Στην οικογένειά µου

Ιωάννης Α. Κυρκούδης Α.Π.Θ ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΧΛΩΡΙ ΑΣ ΚΑΙ Ι ΙΑΙΤΕΡΑ ΤΩΝ VIBRIO SPP. ΣΕ ΙΧΘΥΟΓΕΝΝΗΤΙΚΟΥΣ ΣΤΑΘΜΟΥΣ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ ΚΑΙ ΛΑΒΡΑΚΙΟΥ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑ Α ISBN «Η έγκριση της παρούσης διδακτορικής διατριβής από την Κτηνιατρική Σχολή του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωµών του συγγραφέως»(ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2) - 4 -

ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Πρόλογος.. 8 ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ: ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗΝ ΕΡΕΥΝΑ 1.1. Εισαγωγή στην έρευνα 12 1.2. Βιβλιογραφική ανασκόπηση.. 15 1.2.1. Ταξινόµηση και προέλευση της τσιπούρας και του λαβρακιού 15 1.2.2. Περιβάλλον εκτροφής τσιπούρας και λαβρακιού στην Ελλάδα 18 1.2.3. Μικροβιακή χλωρίδα του πεπτικού συστήµατος της τσιπούρας και του λαβρακιού. 19 1.2.4. Σπουδαιότερα νοσήµατα της τσιπούρας και του λαβρακιού. 22 1.2.5. Ανοσοποιητικό σύστηµα και ανοσοποίηση των ψαριών... 28 1.3. Στόχος της έρευνας. 36 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΙΑΣΤΑΣΕΙΣ ΤΟΥ ΚΛΑ ΟΥ ΕΚΤΡΟΦΗΣ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ ΚΑΙ ΛΑΒΡΑΚΙΟΥ ΚΑΙ ΙΑΡΘΡΩΣΗ ΤΩΝ ΙΧΘΥΟΓΕΝΝΗΤΙΚΩΝ ΣΤΑΘΜΩΝ 2.1. Εισαγωγή.. 39 2.2. Η οικονοµική σηµασία της εκτροφής τσιπούρας και λαβρακιού. 41 2.3. Η εξέλιξη των µεγεθών του κλάδου παραγωγής τσιπούρας και λαβρακιού στην Ελλάδα, την Ευρωπαϊκή Ένωση και τη Μεσόγειο 44 2.4. Η σηµασία της παραγωγής γόνου τσιπούρας και λαβρακιού σε ιχθυογεννητικούς σταθµούς στην Ελλάδα 50 2.5. Προβλήµατα που αντιµετωπίζουν οι ιχθυογεννητικοί σταθµοί στην Ελλάδα 53-5 -

2.6. Οργάνωση ενός τυπικού ιχθυογεννητικού σταθµού τσιπούρας και λαβρακιού στην Ελλάδα.. 55 ΜΕΡΟΣ ΕΥΤΕΡΟ: ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 3.1. Εισαγωγή.. 68 3.2. Σχεδιασµός έρευνας µεθοδολογία. 69 3.3. Έρευνα µικροβιακής χλωρίδας σε ιχθυογεννητικούς σταθµούς τσιπούρας και λαβρακιού.. 71 3.3.1. Προκαταρκτικές δειγµατοληψίες.. 71 3.3.2. Κύριος πειραµατισµός. 75 3.4. Πειραµατική µόλυνση τσιπούρας και λαβρακιού.. 80 3.4.1. Προκαταρκτικός πειραµατισµός σε λαβράκια 80 3.4.2. Προκαταρκτικός πειραµατισµός σε τσιπούρες.... 81 3.4.3. Κύριος πειραµατισµός. 82 3.5. Ανοσοποίηση γόνου µε αυτεµβόλιο έναντι του Vibrio anguillarum 85 3.5.1. Προκαταρκτικός πειραµατισµός µε αυτεµβόλιο σε λαβράκια.. 85 3.5.2. Κύριος πειραµατισµός µε αυτεµβόλιο σε λαβράκια... 88 3.6. Στατιστική ανάλυση 93 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4.1. Εισαγωγή.. 95 4.2. Αποτελέσµατα εκτίµησης της µικροβιακής χλωρίδας 95 4.3. Αποτελέσµατα πειραµατικής µόλυνσης (προκαταρκτικοί πειραµατισµοί και κύριος πειραµατισµός) 110 4.4. Ανοσοποίηση γόνου µε αυτεµβόλιο έναντι του Vibrio anguillarum (προκαταρκτικός και κύριος πειραµατισµός) 120 4.5. Ανακεφαλαίωση.. 127-6 -

ΜΕΡΟΣ ΤΡΙΤΟ ΣΥΖΗΤΗΣΗ. 131 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ... 152 ΠΕΡΙΛΗΨΗ.. 154 SUMMARY... 156 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ. 158 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ. 184-7 -

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Στην Ελλάδα, την τελευταία εικοσιπενταετία η εκτροφή ευρύαλων ψαριών, κυρίως της τσιπούρας και του λαβρακιού, παρουσίασε ραγδαία ανάπτυξη, η οποία αντανακλά τόσο στον αριθµό των µονάδων όσο και τον όγκο παραγωγής ψαριών. Αυτό οφείλεται στις ευνοϊκές συνθήκες του υδάτινου περιβάλλοντος της χώρας και στην ικανοποιητική χρηµατοδότηση από την Ευρωπαϊκή Ένωση που αποτέλεσε σηµαντικό κίνητρο για τους επενδυτές, µε αποτέλεσµα να αυξηθεί θεαµατικά η Ελληνική παραγωγή και να καταλάβει την πρώτη θέση ανάµεσα στις χώρες της Μεσογείου. Η εντατική εκτροφή τσιπούρας και λαβρακιού πραγµατοποιείται τόσο σε χερσαίες εγκαταστάσεις όσο και στην ανοιχτή θάλασσα. Για τον τρόπο αυτόν καλλιέργειας των ευρύαλων ψαριών, που είναι γνωστός και σε άλλες χώρες από παλαιότερα, απαιτείται κατάλληλος χώρος και νερό άριστης ποιότητας. Με την ιχθυοκαλλιέργεια γίνεται προσπάθεια µείωσης του ελλείµµατος της συλλεκτικής αλιείας, η οποία µετά τον δεύτερο παγκόσµιο πόλεµο αδυνατεί να καλύψει τη ζήτηση, λόγω κυρίως της µείωσης των φυσικών αποθεµάτων ψαριών. Η µείωση αυτή οφείλεται κυρίως στην υπεραλίευση, καθώς και στην υποβάθµιση της ποιότητας του υδάτινου περιβάλλοντος από ανθρώπινες δραστηριότητες. Η εντατική εκτροφή τσιπούρας και λαβρακιού είχε ως συνέπεια και την εµφάνιση σοβαρών παθολογικών καταστάσεων, τόσο κατά τη φάση εκτροφής τους στους ιχθυογεννητικούς σταθµούς όσο και κατά τη φάση της πάχυνσής τους. Η θνησιµότητα βακτηριακής αιτιολογίας στους ιχθυογεννητικούς σταθµούς, η οποία διεθνώς µελετήθηκε µόνο αποσπασµατικά, µπορεί να οδηγήσει σε σηµαντικές απώλειες γόνου και µείωση της παραγωγής. Επίσης αποσπασµατικά, έχει µελετηθεί και η εντερική µικροβιακή χλωρίδα των ψαριών, για την οποία είναι λίγα τα βιβλιογραφικά δεδοµένα, σχετικά µε την εγκατάσταση, τον ρόλο και τη σχέση της µε το υδάτινο περιβάλλον εκτροφής. Ένα άλλο σοβαρό θέµα που έχει µελετηθεί επίσης αποσπασµατικά είναι η πρόληψη της θνησιµότητας µικροβιακής αιτιολογίας. Οι περισσότεροι - 8 -

ιχθυογεννητικοί σταθµοί στη Ελλάδα αντιµετωπίζουν τη θνησιµότητα αυτής της µορφής µε τη χορήγηση αντιβιοτικών που συνήθως γίνεται αλόγιστα και χωρίς τη συνδροµή ειδικευµένων κτηνιάτρων. Όµως, η αλόγιστη αυτή χρήση αντιµικροβιακών παραγόντων, µε όλους τους κινδύνους που εγκυµονεί για την ανάπτυξη ανθεκτικών βακτηριακών στελεχών, µπορεί να αποφευχθεί. Η πρόληψη της θνησιµότητας βακτηριακής αιτιολογίας µε ανοσοποίηση είναι τεκµηριωµένη για τα ενήλικα ψάρια, δεν έχουν γίνει, όµως, επαρκείς έρευνες για τον γόνο και ιδιαίτερα της τσιπούρας και του λαβρακιού. Οι προβληµατισµοί αυτοί συνηγορούν στο να επικεντρωθεί η έρευνά µας σε όλα αυτά τα σοβαρά προβλήµατα, από την έναρξη της εκτροφής της τσιπούρας και του λαβρακιού στον ιχθυογεννητικό σταθµό, µε τη µελέτη της µικροβιακής χλωρίδας και τη σχέση της µε το περιβάλλον εκτροφής. Παράλληλα, χρήζει ιδιαίτερης σηµασίας η µελέτη της επίδρασης των βακτηρίων αυτών στη θνησιµότητα του γόνου της τσιπούρας και του λαβρακιού και η αξιολόγηση της δυνατότητας ανοσοποίησης, µε στόχο την αποφυγή χρήσης αντιβιοτικών. Η έρευνα αυτή πραγµατοποιήθηκε στο Εργαστήριο Ιχθυολογίας της Κτηνιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. και αποτελείται από τρία µέρη: το γενικό µέρος, που περιλαµβάνει την εισαγωγή στην έρευνα και τις διαστάσεις/διάρθρωση του κλάδου εκτροφής τσιπούρας και λαβρακιού και των ιχθυογεννητικών σταθµών και το ειδικό µέρος, που περιλαµβάνει τη µεθοδολογία και τα αποτελέσµατα της δικής µας έρευνας, και τέλος, το τρίτο µέρος, που περιλαµβάνει τη συζήτηση και τα συµπεράσµατα της έρευνας. Θεωρώ καθήκον µου να εκφράσω τις θερµές ευχαριστίες µου στον κ. Γεώργιο Φώτη, διατελέσαντα διευθυντή στο Εργαστήριο Ιχθυολογίας για την έµπειρη καθοδήγηση, την κατανόηση και την πολύτιµη βοήθεια που µου παρείχε καθόλη τη διάρκεια εκπόνησης της έρευνας αυτής. Ευχαριστώ, επίσης, τον κ. Νικόλαο Ηλιάδη, οµότιµο καθηγητή της Μικροβιολογίας, για τη βοήθειά του στην επιλογή της κατάλληλης µικροβιολογικής µεθοδολογίας, τις εποικοδοµητικές παρατηρήσεις του και για την ηθική του συµπαράσταση σε όλες τις φάσεις πραγµατοποίησης της έρευνας. Θα ήθελα, επίσης, να ευχαριστήσω θερµά τον κ. Χρήστο Μπάτζιο, καθηγητή της Οικονοµίας Ζωικής Παραγωγής και της Στατιστικής, για την πολύτιµη βοήθεια που µου παρείχε στον σχεδιασµό της έρευνας και τη στατιστική ανάλυση και αξιολόγηση των αποτελεσµάτων. - 9 -

Ευχαριστώ ιδιαίτερα τον κ. Παναγιώτη Αγγελίδη, επίκουρο καθηγητή, για τη βοήθειά του και τις εύστοχες παρατηρήσεις του κατά τη διάρκεια διεξαγωγής της έρευνας. Επίσης, ευχαριστώ τον κ. Αθανάσιο Ιντζέ, µέλος Ε.Τ.Ε.Π., για την βοήθειά του στην παρασκευή ιστολογικών τοµών. Παράλληλα, θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες µου στους κ.κ. Αντρέα Κυριακού και Γεώργιο Ατταλίδη, φοιτητές της Κτηνιατρικής Σχολής, για την βοήθειά τους στον πειραµατισµό µε αυτεµβόλιο, τόσο κατά την κατασκευή των πειραµατικών εγκαταστάσεων, όσο και κατά τη διενέργεια των εµβολιασµών και των πειραµατικών µολύνσεων. Επιπλέον, πολύτιµη θεωρώ και τη συµβολή των κ.κ. ηµητρίου Κουτσόπουλου, Ιωάννη Τζαβάρα, ηµητρίου Γερονίκου, Ελευθέριου Τριανταφύλλου και Ελένης ελιάκη, στρατιωτικών κτηνιάτρων µικροβιολόγων, σε ότι αφορά τις µικροβιολογικές εξετάσεις, ώστε να γίνει εφικτός ο µικροβιολογικός χειρισµός των δειγµάτων εντός των προβλεπόµενων χρονικών ορίων. Γενικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλο το προσωπικό, καθώς και τους διδάσκοντες στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας για τη βοήθειά τους. Ευχαριστώ, ακόµη, θερµά τον κ. Ιωάννη Χρίστογλου, της εταιρείας Bayer, για την χορήγηση του Baytest από την εταιρεία του. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους κ.κ. Γεώργιο Τοσούνη και Ιωάννη Τοσούνη της Olympos Fish Farm, τους κ.κ. Νικόλαο Πεπονάκη και Ιωάννη Καραπιπέρη των Ιχθυοτροφείων Μαλεσίνας Α.Ε., καθώς και τον κ. Ιωάννη Χορόζογλου, τόσο για την πολύτιµη συνεργασία τους στο στάδιο των δειγµατοληψιών όσο και για τη χορήγηση ιχθυδίων, χωρίς τα οποία θα ήταν αδύνατη η πραγµατοποίηση των πειραµατισµών. Ιωάννης Κυρκούδης - 10 -

ΜΕΡΟΣ ΠΡΩΤΟ ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 11 -

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗΝ ΕΡΕΥΝΑ 1.1. Εισαγωγή στην έρευνα Η εντατική εκτροφή της τσιπούρας και του λαβρακιού, η οποία άρχισε να αναπτύσσεται σταδιακά στη χώρα µας στα µέσα της δεκαετίας του 1980, οδήγησε στην εκδήλωση σοβαρών παθολογικών καταστάσεων, µε αποτέλεσµα να παρουσιάζεται υψηλός δείκτης θνησιµότητας µε οικονοµικές επιπτώσεις στις αποδόσεις (Φώτης και Αγγελίδης 2001). Οι απώλειες, οι οποίες διαπιστώνονται σε πολλές µονάδες στη χώρα µας, παρατηρούνται σε όλη τη διάρκεια του κύκλου εκτροφής και ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια της παραµονής των ψαριών στους ιχθυογεννητικούς σταθµούς. Ειδικότερα, το γεγονός αυτό παρατηρείται σε ιχθύδια µικρής ηλικίας και µάλιστα σε λαβράκια λίγο πριν τη µεταφορά τους σε δεξαµενές πάχυνσης ή σε ιχθυοκλωβούς. Για την αιτιολογία της εκδήλωσης αυτής διατυπώνονται διάφορες απόψεις στη διεθνή βιβλιογραφία. Η θνησιµότητα εµφανίζεται αιφνίδια, κυρίως σε λαβράκια, µε σηµαντικές απώλειες στον πληθυσµό τους, σε σύντοµο σχετικά χρονικό διάστηµα. Τα ψάρια δεν παρουσιάζουν χαρακτηριστικά κλινικά συµπτώµατα, εκτός από την αδυναµία κολύµβησης, η οποία συνοδεύεται από µια ακανόνιστη συµπεριφορά στο νερό. Τελικά, τα νοσούντα ιχθύδια καταλήγουν στον πυθµένα των δεξαµενών εκτροφής, σε πλάγια ή ύπτια θέση µε ανοιχτά τα βραγχιοκαλύµµατα, όπως συµβαίνει κατά την έλλειψη διαλυµένου οξυγόνου στο νερό. Η εκδήλωση του νοσήµατος αυτού αποτελεί συνισταµένη τόσο των παραγόντων «νοσογόνο αίτιο» και «ψάρι» όσο και του περιβάλλοντος. Το περιβάλλον εκτροφής σε σχετικό µαθηµατικό υπόδειγµα αξιολογείται ως παράγοντας ιδιάιτερης σηµασίας (Εικόνα 1.1.). Για τον λόγο αυτόν, οι συνθήκες διαβίωσης για την τσιπούρα και το λαβράκι πρέπει να είναι βέλτιστες, γεγονός που προϋποθέτει - 12 -

άριστη γνώση και κατανόηση της βιολογίας, των διατροφικών συνηθειών και των ιδανικών συνθηκών εκτροφής των ψαριών αυτών. Α=[Ψ]+[Ν]+[Π] 2 Εικόνα 1.1.: Αλληλοεπίδραση νοσογόνου αιτίου, περιβάλλοντος και ψαριού (Φώτης και Αγγελίδης 2001). Παράλληλα µε το περιβάλλον εκτροφής, µεγάλη σηµασία έχει η µικροβιακή χλωρίδα στο έντερο της τσιπούρας και του λαβρακιού. Η µελέτη της µικροβιακής χλωρίδας των προαναφερόµενων ψαριών (τόσο σε υγιή όσο και σε νοσούντα ψάρια) πρέπει να συνδυαστεί µε αυτήν του περιβάλλοντος. Το περιβάλλον, και ειδικότερα η µικροβιακή χλωρίδα του, αποτελεί σηµαντική παράµετρο µελέτης (Vadstein 1997). Στη διεθνή βιβλιογραφία υπάρχουν ελάχιστες δηµοσιεύσεις που αφορούν στον γόνο της τσιπούρας και του λαβρακιού (Gatesoupe 1997a, Grisez et al. 1997), όπου όµως δεν γίνεται συσχετισµός µεταξύ της µικροβιακής χλωρίδας του περιβάλλοντος εκτροφής, µε αυτήν των ψαριών. Βέβαια, η µελέτη της µικροβιακής χλωρίδας, τόσο στο περιβάλλον όσο και στα ψάρια, δεν µπορεί να οδηγήσει από µόνη της στην αντιµετώπιση των σοβαρών περιστατικών θανάτων που παρουσιάζονται στους ιχθυογεννητικούς σταθµούς. Για την αποφυγή τέτοιων γεγονότων, υπάρχει ανάγκη να κατανοηθούν οι µηχανισµοί που προκαλούν τις απώλειες. Αναµφίβολα, η πλήρης αυτή γνώση απαιτεί εκτεταµένη βιβλιογραφική έρευνα και πειραµατισµούς στο εργαστήριο. Στη µείωση της θνησιµότητας, είναι γνωστό, στην Κτηνιατρική επιστήµη, ότι βοηθά η λήψη προληπτικών µέτρων, όπως είναι η εφαρµογή κανόνων υγιεινής, η - 13 -

χορήγηση ισορροπηµένου σιτηρεσίου και η ανοσοποίηση. Οι περισσότερες ερευνητικές εργασίες που αφορούν στην ανοσοποίηση, αναφέρονται σε ενήλικα ψάρια, ενώ οι σχετικές αναφορές για τον γόνο είναι λίγες. Το γεγονός αυτό καθιστά αναγκαία την περαιτέρω διερεύνηση της ανοσοποίησης των ιχθυδίων. Η παρούσα έρευνα αποσκοπεί στη µελέτη της µικροβιακής χλωρίδας του γόνου της τσιπούρας και του λαβρακιού σε έναν τυπικό ιχθυογεννητικό σταθµό, καθώς και στη διερεύνηση των αιτίων θνησιµότητας του γόνου. Παράλληλα, γίνεται προσπάθεια πρόληψης, εµβολιάζοντας τον γόνο µε αυτεµβόλιο. Η έρευνα αυτή απαρτίζεται από τρία µέρη. Στο πρώτο µέρος (γενικό µέρος) περιλαµβάνονται δύο κεφάλαια. Το πρώτο κεφάλαιο περιλαµβάνει την εισαγωγή της παρούσας έρευνας, όπου περιγράφονται η ταξινόµηση και η προέλευση της τσιπούρας και του λαβρακιού, καθώς και το περιβάλλον εκτροφής τους. Ακόµη, παρουσιάζονται βιβλιογραφικά δεδοµένα ως προς τη µικροβιακή χλωρίδα, τα σπουδαιότερα νοσήµατα της τσιπούρας και του λαβρακιού, καθώς και το ανοσοποιητικό σύστηµα των ψαριών και τις δυνατότητες ανοσοποίησής τους. Το δεύτερο κεφάλαιο περιγράφει εν συντοµία τις διαστάσεις του κλάδου εκτροφής τσιπούρας και λαβρακιού, καθώς και τη διάρθρωση των ιχθυογεννητικών σταθµών. Αναλύεται η οικονοµική σηµασία της εκτροφής τσιπούρας και λαβρακιού, η εξέλιξη των µεγεθών του κλάδου, η σηµασία παραγωγής γόνου τσιπούρας και λαβρακιού στην Ελλάδα, καθώς και τα προβλήµατα που αντιµετωπίζουν οι ιχθυογεννητικοί σταθµοί στη χώρα µας. Ακόµη, περιγράφεται η τυπική οργάνωση ενός ιχθυογεννητικού σταθµού στην Ελλάδα. Στο δεύτερο µέρος (ειδικό µέρος) περιλαµβάνονται το τρίτο και το τέταρτο κεφάλαιο. Ειδικότερα, στο τρίτο κεφάλαιο (υλικά και µέθοδοι) περιγράφεται η µεθοδολογία που χρησιµοποιήθηκε για τη µελέτη της µικροβιακής χλωρίδας, τις πειραµατικές µολύνσεις, την παρασκευή του αυτεµβολίου, καθώς και την εκτίµηση της αποτελεσµατικότητάς του. Σηµειώνεται ότι, για κάθε φάση πειραµατισµού υπάρχουν προκαταρκτικοί και κύριοι πειραµατισµοί. Τέλος, παρατίθεται η µεθοδολογία της στατιστικής ανάλυσης και αξιολόγησης των πειραµατικών δεδοµένων. Στο τέταρτο κεφάλαιο, παρουσιάζονται τα αποτελέσµατα εκτίµησης της µικροβιακής χλωρίδας, των πειραµατικών µολύνσεων, καθώς του πειραµατισµού µε αυτεµβόλιο. Στο τρίτο µέρος (συζήτηση) αξιολογούνται τα πειραµατικά αποτελέσµατα πάνω στη µικροβιακή χλωρίδα, τις πειραµατικές µολύνσεις, καθώς και η - 14 -

αποτελεσµατικότητα του αυτεµβολίου. Τέλος, παρουσιάζονται τα συνολικά συµπεράσµατα της έρευνας. 1.2. Βιβλιογραφική ανασκόπηση 1.2.1. Ταξινόµηση και προέλευση της τσιπούρας και του λαβρακιού Η ταξινόµηση της τσιπούρας (Sparus aurata, Linnaeus, 1758) έχει ως εξής (UNESCO 1986): 1. Υπέρκλαση: Ψάρια 2. Κλάση: Οστεϊχθύες (Osteichthyes) 3. Υπόκλαση: Ακτινοπτερύγιοι (Actinopterygii) 4. Ανθυπόκλαση: Τελεόστεοι (Teleostei) 5. Οικογένεια: Σπαριδών (Sparidae) 6. Γένος: Sparus 7. Είδος: Τσιπούρα (Sparus aurata) Στη βιβλιογραφία η τσιπούρα αναφέρεται ως Gilthead seabream (En), Dorade royale (Fr), Pargo dorado (Sp). Σύνηθες συνώνυµο Chrysophrys aurata (UNESCO 1986). Το σώµα της τσιπούρας είναι επίµηκες, πλευρικά πιεσµένο και σχετικά ευρύ, µε κτενοειδή λέπια, ενώ η περιοχή γύρω από τους ρώθωνες, οι υποκογχικές περιοχές και η τριγωνική µοίρα της µετωπιαίας χώρας στερούνται λεπιών. Ο χρωµατισµός της είναι γκρι-ασηµί, µε µια σκούρα κηλίδα στην αρχή της πλάγιας γραµµής, η οποία καλύπτει το άνω τµήµα του βραγχιακού επικαλύµµατος και υπογραµµίζεται από µία ερυθρά περιοχή. Μεταξύ των οφθαλµών υπάρχει µία κιτρινόχρωµη ζώνη, που ορίζεται από δυο σκοτεινόχρωµες ζώνες. Κυρίως στα ενήλικα άτοµα, υπάρχει µία επιµήκης µαύρη γραµµή στο µέσο του ραχιαίου πτερυγίου, ενώ το ουραίο πτερύγιο στα άκρα του εµφανίζει σκούρο χρωµατισµό. Η πλάγια γραµµή φέρει 73-85 λέπια - 15 -

µέχρι τη βάση της ουράς. Το ραχιαίο πτερύγιο είναι ενιαίο, µε 11 ακανθώδεις και 13-14 µαλακές ακτίνες. Τα θωρακικά πτερύγια είναι µακριά και οξύληκτα. Τα κοιλιακά πτερύγια βρίσκονται ακριβώς πίσω από τα θωρακικά. Το εδρικό πτερύγιο έχει 3 ακανθώδεις και 11-12 µαλακές ακτίνες. Η τσιπούρα φέρει 4-6 κυνόδοντες και στις δύο σιαγόνες προς τα εµπρός και πίσω τους 2-4 σειρές δοντιών που προοδευτικά αµβλύνονται όπως οι γοµφίοι, µε τις δύο εξωτερικές σειρές να είναι πιο ισχυρές. Το µήκος του ψαριού είναι συνήθως 30-35 cm, ενώ µπορεί να φτάσει τα 50-70 cm (FAO 1973, UNESCO 1986). Η τσιπούρα είναι ευρύαλο και ευρύθερµο είδος. Εντοπίζεται συχνότερα σε ιλλώδεις ή ιλλοαµµώδεις ακτές, σε ζώνες µε Posidonia (φύκος). Τα νεαρά ιχθύδια εντοπίζονται σε βάθος ως 30 m και τα ενήλικα άτοµα σε βάθος ως 150 m, ενώ εισέρχονται και σε υφάλµυρα ύδατα. Είναι ψάρια που ζουν µόνα τους ή σε µικρές οµάδες. Ελεύθερα, αναπαράγονται από τον Οκτώβριο ως τον εκέµβριο (Κλαουδάτος και Αποστολόπουλος 1984, UNESCO 1986). Στις λιµνοθάλασσες, τα µεγάλα ψάρια εισέρχονται αρχές άνοιξης και παραµένουν για 6-7 µήνες. Αυτό συµβαίνει ταυτόχρονα µε την είσοδο του γόνου στη λιµνοθάλασσα. Στη συνέχεια, τα ενήλικα ψάρια την εγκαταλείπουν για να ωοτοκήσουν ή για να βρουν καταφύγιο σε βαθύτερα και θερµότερα νερά (Κλαουδάτος και Αποστολόπουλος 1984). Είναι είδος πρώτανδρο ερµαφρόδιτο. Τα αρσενικά είναι γενετικά ώριµα τον πρώτο µε δεύτερο χρόνο της ζωής τους, σε µήκος 20-30 cm, ενώ τα θηλυκά τον δεύτερο µε τρίτο χρόνο της ζωής τους και σε µήκος 33-40 cm (UNESCO 1986). Όσον αφορά στο βάρος, άτοµα 200 g είναι συνήθως όλα αρσενικά, ενώ στη συνέχεια αλλάζουν φύλο. Έτσι, στον πέµπτο χρόνο της ζωής τους εµφανίζονται ως οµοιογενής πληθυσµός θηλυκών (Χώτος και Ρογδάκης 1992). Η περίοδος φυσικής αναπαραγωγής στη Μεσόγειο είναι µεταξύ Οκτωβρίου και εκεµβρίου (Pillay 1990). Κατά κύριο λόγο είναι σαρκοφάγο ψάρι που τρέφεται µε µαλάκια (κυρίως µύδια), καρκινοειδή και ψάρια, ενώ κατά δεύτερο λόγο είναι φυτοφάγο (Christophilogiannis 1993). Τα ιχθύδια τρέφονται µε ζωοπλαγκτόν, κυρίως µε µικρού µεγέθους καρκινοειδή και πολύχαιτους (UNESCO 1986, Χώτος και Ρογδάκης 1992). Η τσιπούρα απαντάται συχνά στη Μεσόγειο, ενώ σπάνια εµφανίζεται στη Μαύρη θάλασσα και στον Ατλαντικό (UNESCO 1986, Christophilogiannis 1993). Ο γόνος της τσιπούρας εµφανίζεται, κυρίως, Σεπτέµβριο µε Οκτώβριο, σε ακτές µε ιλοαµµώδεις βυθούς (Κλαουδάτος και Αποστολόπουλος 1984, Klaoudatos and Conides 1996). - 16 -

Η ταξινόµηση του λαβρακιού [Dicentrarcus labrax, (Linnaeus, 1758)] έχει ως εξής (UNESCO 1986): 1. Υπέρκλαση: Ψάρια 2. Κλάση: Οστεϊχθύες (Osteichthyes) 3. Υπόκλαση: Ακτινοπτερύγιοι (Actinopterygii) 4. Ανθυπόκλαση: Τελεόστεοι (Teleostei) 5. Οικογένεια: Σερανιδών (Serranidae) 6. Γένος: Dicentrarchus 7. Είδος: Λαβράκι (Dicentrarcus labrax) Στη βιβλιογραφία το λαβράκι αναφέρεται ως European seabass (En), Bar commun (Fr), Branzino (It), Lubina (Sp). Συνήθη συνώνυµα: Morone labrax, Labrax lupus (UNESCO 1986). Το λαβράκι είναι ψάρι µεσαίου ως µεγάλου µεγέθους, µε σώµα µάλλον επίµηκες. Το στόµα του είναι αιχµηρό και προεξέχει ελαφρά. Εµφανίζει µικρά δόντια στις σιαγόνες και τον ουρανίσκο, ενώ δεν έχει κυνόδοντες, σε αντίθεση µε την τσιπούρα. Το ραχιαίο πτερύγιο είναι διπλό, µε το πρώτο τµήµα του να φέρει 8-10 σκληρές ακτίνες, ενώ το δεύτερο 1 σκληρή και 11-14 µαλακές ακτίνες. Τα λέπια του είναι µικρά. Το ουραίο πτερύγιο είναι µέτρια διχαλωτό. Η πλάγια γραµµή είναι εκτεταµένη, αλλά δεν φτάνει µέχρι την ουρά. Το βραγχιακό επικάλυµµα αποτελείται από 2 πλατιά οστά. Το εκτρεφόµενο λαβράκι, Dicentrarchus labrax, πρέπει να διαφοροποιείται από το Dicentrarchus punktatus, το οποίο δεν είναι κατάλληλο για εκτροφή. Στο Dicentrarchus labrax τα δόντια στoν ουρανίσκο διατάσσονται σε σχηµατισµό ηµισελήνου, ενώ στο Dicentrarchus punktatus σε σχηµατισµό τόξου. Το µήκος του είναι συνήθως 50 cm, ενώ µπορεί να φτάσει τα 100 cm (FAO 1973, UNESCO 1986, Coves et al. 1991). Η βιολογία του λαβρακιού µοιάζει µε αυτήν της τσιπούρας. Το λαβράκι αλιεύεται σε ακτές ή λιµνοθάλασσες της Μεσογείου και του Ανατολικού Ατλαντικού - 17 -

(FAO 1973, UNESCO 1986). Παρουσιάζει προτίµηση σε ιλοαµµώδεις πυθµένες κοντά σε ανθρωπογενείς δραστηριότητες, γιατί σε αυτές τις περιοχές βρίσκει τους κατάλληλους για την διατροφή του βενθικούς οργανισµούς (Conides and Klaoudatos 1996). Είναι είδος ευρύαλο, ευρύθερµο µε αυγά πελαγικά. ιατρέφεται µε δίθυρα µαλάκια, ψάρια και γαρίδες (UNESCO 1986). Είναι, σε αντίθεση µε την τσιπούρα, γονοχωριστικό είδος (FAO 1973). Οι γεννήσεις ξεκινούν τον Νοέµβριο και ο γόνος του λαβρακιού εµφανίζεται κατά οµάδες σε ακτές τους µήνες Νοέµβριο µε Ιανουάριο (Κλαουδάτος και Αποστολόπουλος 1984). Πιθανή αιτία της εµφάνισης γόνου σε ακτές είναι η µειωµένη αλατότητα (εκβολές ποταµών) και η αφθονία τροφής (ζωοπλαγκτόν) (Κλαουδάτος και Αποστολόπουλος 1984, Κονίδης 1992). Ο γόνος του λαβρακιού, όµως, φαίνεται να εµφανίζει υψηλότερα ποσοστά επιβίωσης σε αλατότητες 30-35 ο / οο ( Κλαουδάτος και Τσέβης 1993). 1.2.2. Περιβάλλον εκτροφής τσιπούρας και λαβρακιού στην Ελλάδα Για την εγκατάσταση ενός ιχθυογεννητικού σταθµού τσιπούρας και λαβρακιού, αρχικά, απαιτούνται η εξασφάλιση των απαραίτητων αδειών από τις κατά τόπους κρατικές υπηρεσίες, καθώς και η παροχή γλυκού και θαλασσινού νερού άριστης ποιότητας. Η επιλογή του χώρου πρέπει να γίνει µε ιδιαίτερη προσοχή και έπειτα από στενή παρακολούθηση της ποιότητας του νερού από ειδικούς επιστήµονες, για τουλάχιστο ένα χρόνο. Οι σηµαντικότερες παράµετροι που µελετούνται είναι η θερµοκρασία, το διαλυµένο οξυγόνο, η τιµή ph και η αλατότητα (Κουσουρής και συν 1995, Φώτης και Αγγελίδης 2001). Οι υψηλές θερµοκρασίες του περιβάλλοντος για την πάχυνση είναι ιδιαίτερα επιθυµητές. Οι βέλτιστες θερµοκρασίες για την ανάπτυξη της τσιπούρας και του λαβρακιού είναι 23-25ºC (Κουσουρής και συν 1995). Με αυτές τις θερµοκρασίες, το επιθυµητό εµπορεύσιµο βάρος των 350 g (Α ποιότητα) επιτυγχάνεται στους 12-16 µήνες για τα ιχθύδια τσιπούρας και στους 18-20 µήνες για τα ιχθύδια λαβρακιού (Πνευµατικάτου 2000). Αντίθετα, το κλίµα της περιοχής δεν επηρεάζει ιδιαίτερα τη λειτουργία ενός ιχθυογεννητικού σταθµού, καθόσον πρόκειται για κλειστού τύπου κτιριακές εγκαταστάσεις, αλλά οι υψηλές θερµοκρασίες του νερού εκτροφής είναι επιθυµητές, καθόσον µειώνεται έτσι το κόστος θέρµανσης του νερού εκτροφής, ειδικά τους - 18 -

χειµερινούς µήνες. Η ποιότητα που πρέπει να έχει το νερό εκτροφής δίνεται στον πίνακα 1.1. Πίνακας 1.1.: Ποιότητα του νερού στις θαλάσσιες ιχθυοκαλλιέργειες (Χώτος και Ρογδάκης 1992, Κουσουρής και συν 1995). Παράµετρος Επιτρεπόµενα όρια ιαλυµένο οξυγόνο > 6 mg/l ph 7,9-8,2 Αλατότητα 28-38 Νιτρώδη (ΝΟ - 2 ) < 0,1 mg/l NO 2 -N Συνολική πίεση αερίων στο νερό < 20 mm Hg ιοξείδιο του άνθρακα (CO 2 ) < 10 mg/l Υδρόθειο (H 2 S) < 1 µg/l H 2 S Υπολειµµατικό χλώριο < 1 µg/l Μέταλλα Κάδµιο (Cd) < 3 µg/l Χρώµιο (Cr) < 25 µg/l Χαλκός (Cu) < 3 µg/l Σίδηρος (Fe) < 100 µg/l Υδράργυρος (Hg) < 0,1 µg/l Μαγγάνιο (Mn) < 25 µg/l Νικέλιο (Ni) < 5 µg/l Μόλυβδος (Pb) < 4 µg/l Ψευδάργυρος (Zn) < 25 µg/l 1.2.3. Μικροβιακή χλωρίδα του πεπτικού συστήµατος της τσιπούρας και του λαβρακιού Είναι γνωστό ότι η ύπαρξη µικροβίων στις υδατοκαλλιέργειες δεν µπορεί να αποφευχθεί. Το δέρµα, τα βράγχια και η πεπτική οδός αποικίζονται από προσαρµοσµένους, στα όργανα αυτά, µικροοργανισµούς. Η εντερική χλωρίδα στα πρώτα στάδια ανάπτυξης του γόνου έχει µελετηθεί από λίγους ερευνητές. Η διαδικασία εγκατάστασης µικροοργανισµών στο έντερο είναι πολύπλοκη διαδικασία. Η µικροβιακή χλωρίδα των νυµφών, πιθανώς, επηρεάζεται από εκείνη του νερού - 19 -

εκτροφής, από τη µικροβιακή χλωρίδα της επιφάνειας του αυγού που προέρχεται από το νερό, καθώς και από αυτή της «ζωντανής τροφής» (ζωοπλαγκτόν). Η παραγωγή ικανού αριθµού νυµφών και ιχθυδίων στις υδατοκαλλιέργειες παρουσιάζει δυσκολίες, λόγω του υψηλού ποσοστού θνησιµότητας, κυρίως, στο χρονικό διάστηµα µεταξύ απορρόφησης του λεκιθικού σάκου και των πρώτων σταδίων διατροφής. Αρκετές έρευνες συσχετίζουν τα βακτήρια µε τα προβλήµατα που υπάρχουν στην παραγωγή ιχθυδίων ευρύαλων ψαριών (Ishimaru et al. 1996, Ringo 1999 Βαρβαρίγγος 1999, Diggles et al. 2000, Πράπας και συν. 2000, Villamil et al. 2003a). Η σταθερότητα της χλωρίδας έχει ιδιαίτερη σηµασία επειδή αυτή εµποδίζει την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασµό των παθογόνων βακτηρίων που θα µπορούσαν να προκαλέσουν θνησιµότητα. Ο µηχανισµός αναστολής της ανάπτυξης των παθογόνων βακτηρίων αποδίδεται στην παραγωγή ουσιών µε αντιµικροβιακή δράση από στελέχη της χλωρίδας. Στις νύµφες δεν είναι δυνατή η καταστροφή των βακτηρίων, µέσω της χολής και των όξινων εκκρίσεων του στοµάχου, εξαιτίας της ανωριµότητας του πεπτικού συστήµατος (Ringo 1999, Grisez et al. 1997). Σύµφωνα µε τους Skjermo and Vadstein (1993), τα τροχόζωα (rotifer, Branchionus spp.) περιέχουν περίπου 5Χ10 3 βακτήρια ανά άτοµο. Αν µια νύµφη καταναλώνει 100 τροχόζωα ηµερησίως, τότε αυτό αντιστοιχεί σε έναν βακτηριακό πληθυσµό της τάξης του 5Χ10 5 ηµερησίως ανά νύµφη, έναν ιδιαίτερα υψηλό αριθµό βακτηρίων. Ο Gatesoupe (1989) κατάφερε, µε την προσθήκη αντιβιοτικών στο νερό εκτροφής, να αυξήσει την επιβίωση των νυµφών. Με το πείραµά του αυτό, αποδεικνύει ότι ο «έλεγχος» της µικροβιακής χλωρίδας µε την προσθήκη αντιβιοτικών µπορεί να επηρεάσει την επιβίωση του γόνου. Τα βιβλιογραφικά δεδοµένα σχετικά µε την εγκατάσταση της µικροβιακής χλωρίδας στις νύµφες και τα ιχθύδια είναι λίγα (Olafsen 2001). εν έχει διευκρινιστεί ακόµη αν η µικροβιακή χλωρίδα στο έντερο των ψαριών είναι σταθερή σε όλες τις ηλικίες τους ή αν αυτή επηρεάζεται από το υδάτινο περιβάλλον τους (Ringo and Birkbeck 1999). Οι νύµφες, αµέσως µετά την εκκόλαψη, έχουν στο έντερό τους µικρό αριθµό βακτηρίων. Αυτό έχει αποδειχτεί για το ιαπωνικό φαγκρί (Pagrus major), την ιαπωνική τσιπούρα (Acanthopagrus schlegeli), το καλκάνι (Scophthalmus maximus), καθώς και για την ιππόγλωσσα του Ατλαντικού (Hippoglossus hippoglossus) (Muroga et al. 1987, Munro et al. 1994, Bergh at al.1994). - 20 -

Βακτήρια που αποµονώθηκαν από το έντερο υγιών νυµφών θαλασσινών ψαριών παρουσιάζονται στον πίνακα 1.2., παρακάτω: Πίνακας 1.2. Μικροβιακή χλωρίδα εντέρου ψαριών θαλάσσας. Είδος ψαριού Βακτήρια που αποµονώθηκαν Βιβλιογραφική πηγή Γάδος, Gadus morhua Aeromonas spp., Pseudomonas spp., Cytophaga / Flexibacter spp., Lactobaccillus spp. Strom & Ringo (1993) Ιππόγλωσσα, Ατλαντικού Hippoglossus hippoglossus Γλώσσα, Solea solea Cytophaga / Flexibacter / Flavobacterium, spp., Vibrio / Aeromonas spp. Cytophaga / Flexibacter spp., Pseudomonas spp., Pseudoalteromonas spp., Photobacterium spp., V.splendidus, V.salmonicida, V.alginolyticus, V.tubiashii like, Halomonas like Pseudomonas / Alcaligenes spp., Vibrio / Aeromonas spp., Moraxella spp., Enterobacteriaceae, Flavobacterium / Cytophaga spp., Coryneforms Bergh et al. (1994) Verner-Jeffreys et al. (2003) Campbell&Buswell (1983) Καλκάνι, Scophthalmus maximus Ιαπωνικό φαγκρί, Pagrus major Vibrionaceae V.alginolyticus, Aeromonas spp. V.alginolyticus, V.natriegenes, V.anguillarum, V.fluvialis, V.pelagius, Aeromonas caviae, Acinetobacter spp. Aeromonas spp.,vibrio spp., Enterobacteriaceae, Cytophaga spp., Micrococcus spp., Staphylococcus spp., Coryneforms Aeromonas spp., Vibrio spp., Pseudomonas spp., Enterobacteriaceae, Cytophaga spp. Nicolas et al. (1989) Gatesoupe (1990) Munro et al. (1993) Ringo et al. (1996) Muroga et al. (1987) Ιαπωνική τσιπούρα, Acanthopagrus schlegeli Λαβράκι, Dicentrarchus labrax Aeromonas spp., Vibrio spp., Pseudomonas spp., Enterobacteriaceae, Cytophaga spp. Vibrio spp., Acinetobacter spp., Moraxella spp., Enterobacteriaceae Acinetobacter spp., Citrobacter spp., Flavobacterium spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., Vibrio spp. Muroga et al. (1987) Gatesoupe et al. (1997) Grisez et al. (1997) Τσιπούρα, Sparus aurata Acinetobacter spp., Citrobacter spp.,flavobacterium spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., Vibrio spp. Grisez et al. (1997) - 21 -

Σύµφωνα µε τους Muroga et al. (1987), η εντερική µικροβιακή χλωρίδα στις νύµφες και τα ιχθύδια για το ιαπωνικό φαγκρί και την ιαπωνική τσιπούρα επηρεάζεται από το περιβάλλον (ζωντανή τροφή και νερό εκτροφής). Οι Nicolas et al. (1989) παρατήρησαν διαφορές στη µικροβιακή χλωρίδα νυµφών καλκανιού, όταν στην τροφική αλυσίδα άλλαξε το είδος του χρησιµοποιούµενου µικροφύκους. Οι Grisez et al. (1997) υποστηρίζουν ότι η µικροβιακή χλωρίδα στην τσιπούρα και στο λαβράκι εξαρτάται από τη γεωγραφική τοποθεσία του ιχθυογεννητικού σταθµού, χωρίς όµως να διερευνάται η µικροβιακή χλωρίδα στο περιβάλλον διαβίωσης των ψαριών. 1.2.4. Σπουδαιότερα νοσήµατα της τσιπούρας και λαβρακιού Η εντατικοποίηση της εκτροφής τσιπούρας και λαβρακιού οδήγησε σε πλήθος παθολογικών καταστάσεων (Φώτης και Αγγελίδης 2001). Οι σχετικές βιβλιογραφικές αναφορές είναι αποσπασµατικές και αφορούν κυρίως στα ενήλικα ψάρια. Λοιµώδη νοσήµατα που αφορούν την τσιπούρα και το λαβράκι παρουσιάζονται στον πίνακα 1.3. Άλλα νοσήµατα που εµφανίζονται στις εκτρεφόµενες τσιπούρες και στα λαβράκια είναι η επιθηλιοκύστη (Chlamydia spp.) και η προσβολή από µύκητα του γένους Ichthyophonus (Rodgers and Furones 1998). Οι Sarusic και Lisac (1987) αναφέρουν κάποιο σύνδροµο που σχετίζεται µε την έλλειψη βιταµίνης C. Λαβράκια βάρους 100-150 γραµµαρίων εµφάνιζαν ακανόνιστη κολύµβηση στην επιφάνεια του νερού, οπότε σε µερικά λεπτά, ακολουθούσε βύθιση στον πυθµένα του κλωβού. Σε ιστολογική εξέταση τα ψάρια εµφάνιζαν µυϊκή ατροφία και κατάγµατα των σπονδύλων κοντά στην κεφαλή. Στην τσιπούρα εµφανίζεται και το «σύνδροµο του χειµώνα». Στους κλωβούς εκτροφής, όταν στο θαλασσινό νερό επικρατούν χαµηλές θερµοκρασίες (κάτω των 12ºC), διαπιστώνεται αυξηµένη θνησιµότητα, ενώ δε συµβαίνει το ίδιο σε υψηλότερες θερµοκρασίες (15-23ºC). Από τα ασθενή ψάρια έχουν αποµονωθεί βακτήρια των γενών Aeromonas, Pseudomonas, βακτήρια της οικογένειας των Enterobacteriaceae, καθώς και ιοί (Domenech et al. 1999). Ιστολογικά, παρατηρείται λιπώδης εκφύλιση του ήπατος, ατροφία των νησίδων του παγκρέατος και αύξηση των βλεννογόνων κυττάρων στο εντερικό επιθήλιο. Το νόσηµα αποδίδεται σε καταστολή του ανοσοποιητικού συστήµατος σε χαµηλές θερµοκρασίες (Tort et al. 1998a,1998b). - 22 -

Πίνακας 1.3.: Τα σηµαντικότερα νοσήµατα που έχουν αναφερθεί για την τσιπούρα και το λαβράκι στην Ελλάδα και γενικότερα στη Μεσόγειο (Athanasopoulou 1992, 1999, 2002, Alvarez-Pellitero et al. 1995, Christophilogiannis 1993, Colorni 1998, Rodgers & Furones 1998, Βαρβαρίγγος 1999, Φώτης και Αγγελίδης 2001, Zorrilla et al. 2003, Βαγιάνου και συν. 2004). ΙΟΓΕΝΗ ΝΟΣΗΜΑΤΑ Είδος ψαριού Οικογένεια Iridoviaridae Λεµφοκύστη (Iridovirus) Τσιπούρα, Λαβράκι Οικογένεια Nodaviridae Ιογενής εγκεφαλίτιδα και αµφιβληστροειδίτιδα (Nodavirus) Λαβράκι Οικογένεια Rhabdoviridae Μολυσµατική νέκρωση των αιµοποιητικών οργάνων (Rhabdovirus) Λαβράκι ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ Παστερέλλωση (Photobacterium damselae var. piscicida) Τσιπούρα, Λαβράκι ονακίωση (Vibrio spp.) Τσιπούρα, Λαβράκι Προσβολή από Aeromonas spp. Τσιπούρα, Λαβράκι Προσβολή από Flexibacter spp. Τσιπούρα, Λαβράκι Μυκοβακτηρίωση (Mycobacterium spp.) Λαβράκι Νοκαρδίωση (Nocardia spp.) Λαβράκι Προσβολή από Streptococcus spp. Λαβράκι Προσβολή από Pseudomonas spp. Τσιπούρα, Λαβράκι Προσβολή από Piscirickettsia-like µικροργανισµούς Λαβράκι ΕΝ ΟΠΑΡΑΣΙΤΩΣΕΙΣ Κοκκίδια Προσβολή από Eimeria spp. Τσιπούρα, Λαβράκι Μυξοσπορίδια Προσβολή από Ceratomyxa spp. Τσιπούρα, Λαβράκι Προσβολή από Kudoa spp. Τσιπούρα Προσβολή από Myxidium leei Τσιπούρα Προσβολή από Sphaerospora spp. Λαβράκι Προσβολή από Leptotheca spp. Τσιπούρα Μικροσπορίδια Προσβολή από Clugea spp. Τσιπούρα ΕΞΩΠΑΡΑΣΙΤΩΣΕΙΣ Μαστιγοφόρα προτόζωα Προσβολή από Amyloodinium ocellatum Τσιπούρα, Λαβράκι Προσβολή από Ichtyobodo spp. Τσιπούρα, Λαβράκι Αµοιβάδες Προσβολή από Paramoeba spp. Τσιπούρα Βλεφαριδοφόρα προτόζωα Προσβολή από Cryptocaryon irritans Τσιπούρα, Λαβράκι Προσβολή από Trichodina spp. Τσιπούρα, Λαβράκι Μονογενή τρηµατώδη Προσβολή απόdactylogyrus spp. Τσιπούρα, Λαβράκι Προσβολή από Diplectanum aqueans Λαβράκι Προσβολή από Furnestia echeneis Τσιπούρα Προσβολή από Microcotyle chrysophrii Τσιπούρα, Λαβράκι Αρθρόποδα Προσβολή από Caligus minimus Τσιπούρα, Λαβράκι Προσβολή από Ceratothoa oestroides Τσιπούρα, Λαβράκι Προσβολή από Ergasilus spp. Τσιπούρα, Λαβράκι Προσβολή από Lernanthropus kryoneri Τσιπούρα, Λαβράκι - 23 -

Σε νύµφες και ιχθύδια τσιπούρας και λαβρακιού εµφανίζονται σκελετικές δυσµορφίες (κύφωση, λόρδωση, σκολίωση, έλλειψη βραγχιακού επικαλύµµατος κ.α.) που οφείλονται σε γενετικούς, διατροφικούς ή περιβαλλοντικούς παράγοντες (Andrades et al. 1996, Koumoundouros et al. 1997). Αναφέρεται ακόµη, ότι οι δυσµορφίες αυτές οφείλονται σε ακραίες θερµοκρασίες κατά την επώαση των αυγών (Polo et al. 1990). Επίσης, η εµφάνιση σκελετικών δυσµορφιών αποδίδεται και στην έλλειψη των βιταµινών, όπως οι βιταµίνες Α ή C (Merchie 1997, Takeuchi et al. 1998). Άλλοι ερευνητές (Chatain and Dewavrin 1989, Coves et al. 1991, Chatain and Gushemann 1990, Andrades et al. 1996) αναφέρουν ότι κύριο αίτιο για την εµφάνιση σκελετικών δυσµορφιών και συχνότερα λόρδωσης αποτελεί η έλλειψη νηκτικής κύστης. Κατά τον εµπλουτισµό των ζωοπλαγκτονικών οργανισµών, που χρησιµοποιούνται ως τροφή για τις νύµφες και τα ιχθύδια, σχηµατίζεται ένα στρώµα ελαίου στην επιφάνεια του νερού των δεξαµενών εκτροφής. Το εν λόγω στρώµα αποτρέπει την αρχική κατάποση αέρα και τον σχηµατισµό λειτουργικής νηκτικής κύστης. Όµως, οι Boglione et al. (1995) παρατήρησαν ότι ιχθύδια λαβρακιού µε λειτουργική νηκτική κύστη παρουσίαζαν λόρδωση σε υψηλά ποσοστά και ότι η µέθοδος της επίπλευσης (Coves et al. 1991) που διαχωρίζει τα ιχθύδια µε λειτουργική νηκτική κύστη δεν εξασφάλιζε το διαχωρισµό των ψαριών µε σκελετικές δυσµορφίες. Οι Divanach et al. (1997) αποδίδουν την ύπαρξη ιχθυδίων µε σκελετικές δυσµορφίες σε αυξηµένη ταχύτητα των ρευµάτων νερού. Συγκεκριµένα, ταχύτητα ρευµάτων νερού µεγαλύτερη από 10 cm/sec στις δεξαµενές εκτροφής προκαλεί σκελετική παραµόρφωση µηχανικής αιτιολογίας. Σε νεαρές νύµφες (7-30 ηµερών) παρατηρούνται το σύνδροµο των «τοιχωµάτων» και το σύνδροµο του «µηνίσκου». Οι νύµφες συγκεντρώνονται στα τοιχώµατα των δεξαµενών εκτροφής, όταν τα ρεύµατα νερού είναι έντονα ή όταν δηµιουργούνται αντανακλάσεις στα τοιχώµατα των δεξαµενών, λόγω δυνατού φωτισµού που προσελκύει τις νύµφες, εξαιτίας του θετικού φωτοτροπισµού που έχουν (Χώτος και Ρογδάκης 1992, Κεντούρη 2000). Επιπλέον, στις νύµφες παρατηρούνται υπερτροφία της χοληδόχου και της νηκτικής κύστης, καθώς και λίθοι στην ουροδόχο κύστη (Χώτος και Ρογδάκης 1992, Κεντούρη 2000). Η παρουσία λίθων στην ουροδόχο κύστη στην τσιπούρα µπορεί να σχετίζεται µε την ασιτία και συµβάλλει στη µειωµένη επιβίωση των νυµφών (Yufera et al. 1996). Όµως, για το ιαπωνικό φαγκρί (Pagrus auratus), τον κρανιό - 24 -

(Argyrosomus hololepidotus) και το ψάρι Macquaria novemaculeata αναφέρεται ότι η µειωµένη επιβίωση των νυµφών δεν οφείλεται στην ύπαρξη ουρόλιθων, η δηµιουργία των οποίων σχετίζεται µε την κακή ποιότητα του νερού εκτροφής (υψηλό ph, αυξηµένη περιεκτικότητα του νερού σε χλώριο) µε αποτέλεσµα την συσσωµάτωση του ασβεστίου, του φωσφόρου και του µαγνησίου που αποτελούν τα βασικά συστατικά των κρυστάλλων (Nowak και Battaglene 1996). Εικόνα 1.2.: Κανιβαλισµός σε ιχθύδια λαβρακιού. Σε µεταµορφωµένα ιχθύδια λαβρακιού µετά τις 60 ηµέρες από την εκκόλαψη εµφανίζεται κανιβαλισµός (Εικόνα 1.2.), που µπορεί να οδηγήσει σε υψηλά ποσοστά απωλειών, σε περίπτωση που υπάρξουν δευτερογενείς βακτηριακές επιπλοκές. Για την αντιµετώπιση του κανιβαλισµού συστήνεται συχνή χορήγηση τροφής στα ψάρια και αυξηµένη ανανέωση του νερού στη δεξαµενή εκτροφής. Ακόµη, ιδιαίτερη σηµασία έχει η οµοιοµορφία, όσο αφορά στο µέγεθος των ψαριών, και για τον λόγο αυτόν συστήνεται η διαλογή, η οποία βέβαια καταπονεί τα ψάρια (Φώτης και Αγγελίδης 2001). Ιδιαίτερη σηµασία πρέπει να δίνεται και στις φυσικοχηµικές παραµέτρους του θαλασσινού νερού που χρησιµοποιείται για την εκτροφή. Υψηλές τιµές του ph αυξάνουν τη µη ιονισµένη µορφή της αµµωνίας, µε αποτέλεσµα την προσβολή του αναπνευστικού επιθηλίου των βραγχίων, που µπορεί να φτάσει µέχρι την πλήρη νέκρωση (Φώτης και Αγγελίδης 2001). Επίσης, πρέπει να εξετάζεται η συνολική πίεση των διαλυµένων στο νερό αερίων, όπως και για τα ψάρια του γλυκού νερού. Ο υπερκορεσµός του νερού σε αέρια προκαλεί τη νόσο των φυσαλίδων, ενώ µπορεί να απολήξει µέχρι και στον θάνατο των ψαριών, λόγω ρήξης του λεκιθικού σάκου ή από «εµβολή» (Φώτης και Αγγελίδης 2001). Οι Batzios et al. (1998), για την πέστροφα, - 25 -

αναφέρουν ότι το νόσηµα έχει δυσµενείς επιδράσεις στην αύξηση των ψαριών και εκτιµούν τις επιδράσεις αυτές µε τη χρήση µαθηµατικού µοντέλου. Τα σπουδαιότερα λοιµώδη νοσήµατα που παρουσιάζονται σε ιχθυογεννητικούς σταθµούς τσιπούρας και λαβρακιού στην Ελλάδα, αλλά και διεθνώς, παρουσιάζονται στον πίνακα 1.4. Πίνακας 1.4.: Τα σηµαντικότερα λοιµώδη νοσήµατα σε ιχθυογεννητικούς σταθµούς τσιπούρας και λαβρακιού. Νόσηµα Αιτιολογία Ευπάθεια Βιβλιογραφικές αναφορές Λεµφοκύστη Ιός (iridovirus like) Τσιπούρα, λαβράκι Βαρβαρίγγος (1999) Φώτης και Αγγελίδης (2001) Ιογενής εγκεφαλοπάθεια και αµφιβληστροειδοπάθεια Ιός (nodavirus) Λαβράκι Breuil et al. (1991) Munday and Nakai (1997) Skliris and Richards (1998) Breuil and Romestand (1999) Φώτης και Αγγελίδης (2001) ονακίωση Βακτήρια του γένους Vibrio Τσιπούρα, λαβράκι Grisez et al. (1997) Βαρβαρίγγος (1999) Πράπας και συν. (2000) Φώτης και Αγγελίδης (2001) Παστερέλλωση Βακτήριο Photobacterium damselae subsp. piscicida Τσιπούρα, λαβράκι Toranzo et al. (1991) Noya et al. (1995a,b) Βαρβαρίγγος (1999) Φώτης και Αγγελίδης (2001) Magarinos et al. (1992b) Μυξοβακτηρίωση Βακτήριο Flexibacter maritimus Τσιπούρα, λαβράκι Bernadet (1998) Magarinos et al. (1995) Φώτης και Αγγελίδης (2001) Η δονακίωση αποτελεί το σηµαντικότερο και συχνότερο νόσηµα που εµφανίζεται σε όλες τις φάσεις εκτροφής της τσιπούρας και του λαβρακιού στην Ελλάδα (Βαρβαρίγγος 1999, Πράπας και συν. 2000, Φώτης και Αγγελίδης 2001). Η δονακίωση, διεθνώς, οφείλεται κυρίως στους ορότυπους Ο1 και Ο2 του Vibrio anguillarum (συν. Listonella anguillarum), (Mac Donnell και Collwell 1985). Στους ιχθυογεννητικούς σταθµούς στην Ελλάδα εµφανίζεται ο ορότυπος Ο1 (Βαρβαρίγγος 1999). - 26 -

Άλλα βακτήρια που προκαλούν δονακίωση σε νύµφες θαλάσσιων ψαριών (καλκάνι, Colistium nudipinuis) είναι τα Vibrio splendidus biovar I και Vibrio campellii (Diggles et al. 2000). Οι Villamil et al. (2003a) αναφέρουν ότι ένα στέλεχος του είδους Vibrio pelagius προκαλεί εντερίτιδα µε υψηλή θνησιµότητα σε νύµφες και ιχθύδια καλκανιού (Scophthalmus maximus). Για την παθογόνο δράση του Vibrio pelagius, υπεύθυνη θεωρείται µία µεταλλοπρωτεάση. Η µεταλλοπρωτεάση αυτή έχει κοινή δοµή, όσον αφορά στο αµινοτελικό άκρο της στα Vibrio pelagius, Vibrio anguillarum, Vibrio cholerae, Vibrio proteolyticus και Vibrio vulnificus (Farto et al. 2002). Το Vibrio splendidus biovar I και το Vibrio pelagius biovar I αναφέρονται ως παθογόνα και για τα ενήλικα ψάρια (Santos et al. 1997). Οι Ishimaru et al. (1996) αποµόνωσαν και το νέο είδος, Vibrio ichthyoenteri, από νύµφες της ψευτουπόγλωσσας (Paralichthys olivaceus) που παρουσίαζαν εντερίτιδα. Το νόσηµα εµφανίζεται συνήθως µετά από ακραίες τιµές θερµοκρασίας και γενικότερα σε δυσµενείς συνθήκες του περιβάλλοντος (Φώτης και Αγγελίδης 2001). Οι Balebona et al. (1995) αναφέρουν ότι αυξηµένες τιµές του ph και της αλατότητας προδιαθέτουν στην εκδήλωση του νοσήµατος γιατί αυξάνεται η ικανότητα προσκόλλησης των δονακίων στο δέρµα. Στη «ζωντανή» τροφή, η παρουσία παθογόνων στελεχών του Vibrio anguillarum έχει τεκµηριωθεί (Grisez et al. 1997, Verdonck et al. 1997). Πειραµατικά, η «ενσωµάτωση» του Vibrio anguillarum στη «ζωντανή» τροφή προκαλεί το νόσηµα σε νύµφες και ιχθύδια καλκανιού (Grisez et al. 1996). Ένα άλλο σηµαντικό νόσηµα που παρατηρείται στους ιχθυογεννητικούς σταθµούς τσιπούρας και λαβρακιού στην Ελλάδα είναι η παστερέλλωση (Βαρβαρίγγος 1999, Πράπας και συν. 2000, Φώτης και Αγγελίδης 2001). Το νόσηµα οφείλεται στο βακτήριο Pasteurella piscicida (Inglis et al. 1993). Πιο πρόσφατες έρευνες, όµως, στις οποίες χρησιµοποιήθηκαν µοριακές τεχνικές, κατατάσσουν την Pasteurella piscicida στην οικογένεια Vibrionaceae, δηλαδή στην οικογένεια των Vibrio. Το νέο όνοµα που προτείνεται για το βακτήριο αυτό είναι Photobacterium damselae subsp. piscicida (Holt et al. 1994, Gauthier et al. 1995). Στη διεθνή βιβλιογραφία βέβαια, χρησιµοποιείται ακόµη η ονοµατολογία Pasteurella piscicida, για ιστορικούς λόγους. Τα υπόλοιπα νοσήµατα που αναφέρονται στον πίνακα 1.4. παρουσιάζονται σποραδικά σε ιχθυογεννητικούς σταθµούς στην Ελλάδα (Βαρβαρίγγος 1999, Πράπας και συν. 2000, Φώτης και Αγγελίδης 2001). - 27 -

1.2.5. Ανοσοποιητικό σύστηµα και ανοσοποίηση των ψαριών Το ανοσοποιητικό σύστηµα των ψαριών, και ειδικότερα των τελεόστεων (Teleostei), στα οποία συµπεριλαµβάνονται η τσιπούρα και το λαβράκι, δεν παρουσιάζει µεγάλες διαφορές από αυτό των θηλαστικών. Τόσο στα θηλαστικά όσο και στα ψάρια είναι ενεργοί παρόµοιοι ειδικοί και µη ειδικοί µηχανισµοί, χυµικής και κυτταρικής ανοσίας έναντι των παθογόνων βακτηρίων. Στον πίνακα 1.5. παρουσιάζεται συνοπτικά η αντιστοιχία αυτή. Σηµειώνεται, βέβαια, ότι για τα ψάρια ορισµένοι από τους µηχανισµούς αυτούς αποτελούν ακόµη και σήµερα αντικείµενο έρευνας (Ellis 1999). Πίνακας 1.5.: Μηχανισµοί ανοσίας στα ψάρια και τα θηλαστικά (Κοπτόπουλος 1993, Ellis 1999). Ψάρια Θηλαστικά Χυµική ανοσία + + Μη ειδική ανοσία + + Τρανσφερίνη + + Αντιπρωτεάσες +? Λεκτίνες (Αιµοσυγκολλητίνες) + ιακρίνονται σε C και S τύπο Λυσίνες + + α) Αντιβακτηριακά πεπτίδια +? β) Πρωτεάσες +? γ) C-reactive πρωτεΐνη + + δ) Συµπλήρωµα (ACP) + + ε) Λυσοζύµη + + Ιστόνες + + Ειδική ανοσία + + Αντισώµατα IgM IgA, IgD, Ig E, IgG, IgM Συµπλήρωµα(CCP) + + Κυτταρική ανοσία + + Μη ειδικοί µηχανισµοί + + Μακροφάγα κύτταρα + + Ουδετερόφιλα κύτταρα + + Τ-λεµφοκύτταρα? + Ειδικοί µηχανισµοί + + Ενεργοποιηµένα µακροφάγα κύτταρα + + Τ-λεµφοκύτταρα + + - 28 -

Μη ειδική χυµική ανοσία Τρανσφερίνη Ο σίδηρος στους ιστούς των ψαριών είναι πολύ ισχυρά συνδεδεµένος µε την τρανσφερίνη και µόνο βακτήρια που έχουν την ικανότητα να αποσπούν στη φύση τον σίδηρο από την τρανσφερίνη µπορούν να πολλαπλασιαστούν και να προκαλέσουν νόσηµα (Bullen and Griffiths 1987). Η δυνατότητα ενός παθογόνου βακτηρίου να αποσπά τον σίδηρο από την τρανσφερίνη µπορεί να περιοριστεί από τον γενετικό πολυµορφισµό της τρανσφερίνης, λόγω του ότι από ορισµένους γενότυπους τρανσφερίνης, ο σίδηρος αποσπάται δύσκολα (Winter et al. 1980). Αντιπρωτεάσες Πολλά βακτήρια παράγουν τοξίνες µε πρωτεολυτική δράση, που προσβάλλουν τις πρωτεΐνες των ιστών, ώστε να χρησιµοποιήσουν τις πρωτεΐνες αυτές ως πηγή αµινοξέων. Το πλάσµα του αίµατος των ψαριών περιέχει ουσίες κατά των βακτηριακών πρωτεασών, όπως η α 1- αντιπρωτεάση και η α 2 -µακρογλοβουλίνη. Η Aeromonas salmonicida παράγει πρωτεάση, η οποία αναστέλλεται από την α 2 - µακρογλοβουλίνη της ιριδίζουσας πέστροφας (Ellis 1987). Λεκτίνες Είναι πρωτεΐνες που συνδέονται µε σάκχαρα που υπάρχουν στο κυτταρικό τοίχωµα των βακτηρίων (Arason 1996). Η ύπαρξή τους έχει διαπιστωθεί στην ωοθήκη, στη βλέννα και στον ορό πολλών ειδών ψαριών. Στα σολοµοειδή έχει αποδειχθεί ότι οι λεκτίνες αναστέλλουν την ανάπτυξη του Vibrio anguillarum (Voss et al. 1978). Οι Itami et al. (1993) απέδειξαν για το ψάρι Plecoglossus altivelis ότι η λεκτίνη συνδέεται µε τον λιποπολυσακχαρίτη του κυτταρικού τοιχώµατος του Vibrio anguillarum. Λυσίνες α) Αντιβακτηριακά πεπτίδια. Έχουν βρεθεί στο δέρµα κυπρίνων (Lemaitre et al. 1996). Επίσης, έχουν βρεθεί στον εντερικό ιστό νυµφών στο φάσι (Pleuronectes americanus) (ηλικίας 13 ηµερών από την εκκόλαψη) και πιστεύεται ότι παίζουν ρόλο στην προστασία του εντερικού επιθηλίου στις νύµφες (Ellis 2001). β) Πρωτεάσες. Υπάρχουν στην βλέννα της πέστροφας, όπου έχει βρεθεί ότι καταστρέφουν νεκρά κύτταρα Vibrio anguillarum (Hjelmeland et al. 1983). - 29 -

γ) C-reactive πρωτεΐνη. Αντιδρά µε την φωσφορυλοχολίνη, βασικό συστατικό του κυτταρικού τοιχώµατος βακτηρίων, µυκήτων και παρασίτων. Αντιδρά και συνδέεται σταθερά µε τον C-πολυσακχαρίτη συστατικό του τοιχώµατος του Streptococcus pneumomiae. Η σύνδεση εξαρτάται από την παρουσία ιόντων ασβεστίου, µε αποτέλεσµα να ενεργοποιηθεί το συµπλήρωµα και συνεπώς οι λυτικοί και φαγοκυτταρικοί µηχανισµοί. Η C-reactive πρωτεΐνη έχει ανιχνευθεί στον ορό, στη βλέννα του δέρµατος και στην ωοθήκη (Yano 1996). Στην πέστροφα έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιεί το συµπλήρωµα και προκαλεί φαγοκυττάρωση του Vibrio anguillarum (Nakanishi et al. 1991). δ) Συµπλήρωµα. Αποτελεί σύνολο πρωτεϊνών του ορού µε ιδιαίτερη σηµασία για την άµυνα. Τα τελεόστεα εµφανίζουν τόσο την κλασσική (Classic Complement pathway, CCP) όσο και την εναλλακτική οδό ενεργοποίησης (Alternative Complement Pathway, ACP) του συµπληρώµατος (Yano 1996). Ο ACP ενεργοποιείται ανεξάρτητα από την παρουσία αντισωµάτων, και για τα ψάρια είναι πιο συχνός και έντονος σε σχέση µε τα θηλαστικά (Yano 1996). Λιποπολυσακχαρίτες που βρίσκονται στην επιφάνεια των Gram αρνητικών βακτηρίων ενεργοποιούν άµεσα τον ACP, µε αποτέλεσµα τη λύση του βακτηριακού κυττάρου. Παρόλα αυτά, ορισµένα βακτήρια εµφανίζουν αντοχή µετά την έκθεσή τους σε ορό. Τα συστατικά του κυτταρικού τοιχώµατος βακτηρίων ενεργοποιούν δύο παράγοντες. Αρχικά ο C5a προσελκύει ουδετερόφιλα και µακροφάγα. Αυτά τα κύτταρα διαθέτουν υποδοχείς για τον παράγοντα C3b που συνδέεται σε βακτήρια και τα καθιστά έτσι πιο ευάλωτα στη φαγοκυττάρωση (Ellis 1999, 2001). ε) Λυσοζύµη. Είναι ένζυµο που υδρολύει το Ν-ακετυλοµουραµικό οξύ και τη Ν- ακετυλογλυκοζαµίνη, που αποτελούν βασικά συστατικά του κυτταρικού τοιχώµατος των βακτηρίων. Η λυσοζύµη έχει ανιχνευθεί στη γλώσσα, σε µονοκύτταρα και ουδετερόφιλα κύτταρα (Murray and Fletcher, 1976). Σύµφωνα µε τον Grinde (1989), η λυσοζύµη στα ψάρια εµφανίζει δύο τύπους, τον Ι και τον ΙΙ. Η λυσοζύµη των θηλαστικών δεν µπορεί να δράσει έναντι των Gram αρνητικών βακτηρίων από µόνη της, αλλά χρειάζεται και το συµπλήρωµα για να δράσει στο εσωτερικό του κυτταρικού τοιχώµατος των Gram αρνητικών βακτηρίων. Αντίθετα, η λυσοζύµη τύπου Ι, στην πέστροφα, δρα άµεσα έναντι Gram αρνητικών βακτηρίων, όπως η Pasteurella piscicida και το Vibrio anguillarum (Ellis 1999, Villamil et al. 2003b). - 30 -

Ιστόνες Είναι κατιονικές πρωτεΐνες που µοιάζουν µε τις ιστόνες που υπάρχουν στο θύµο των µοσχαριών. Βρέθηκαν στο σπέρµα του γάδου (Gadus morhua) και αναστέλλουν την ανάπτυξη του Vibrio anguillarum, όταν χορηγηθούν per os (από το στόµα) σε ιχθύδια (Pedersen et al. 2004). Ειδική χυµική ανοσία Αντισώµατα Τα βακτήρια προσκολλούνται στα επιθήλια µε ειδικές πρωτεΐνες, τις συγκολλητίνες. Αντισώµατα έναντι των πρωτεϊνών αυτών αποτρέπουν την προσκόλληση των βακτηρίων. Βλεννογόνοι που εκκρίνουν τέτοια αντισώµατα στα ψάρια είναι αυτοί των βραγχίων και του εντέρου. Στα ψάρια όµως, υπάρχει µόνο η τετραµερής ανοσοσφαιρίνη Μ (στα θηλαστικά είναι πενταµερής), ενώ λείπει η Α που είναι ανθεκτική στην πρωτεόλυση στον στόµαχο και στο έντερο. Στο λαβράκι έχει βρεθεί ότι, η ανοσοσφαιρίνη Μ έχει µοριακό βάρος 854-890 kda (1Da=Dalton=η µάζα ενός ατόµου Η) (Bourmaud et al. 1995, Palenzuela et al. 1996, Bakopoulos et al. 1997) και στην τσιπούρα 830 kda (Palenzuella et al. 1996). Τα αντισώµατα, επίσης, µπορεί να εξουδετερώνουν τοξίνες ή να αποτρέπουν την είσοδο των βακτηρίων στο κύτταρο ξενιστή. Ορισµένα βακτήρια, όµως, όπως η Pasteurella piscicida (Photobacterium damsela variation piscicida), µπορούν να εισέλθουν σε κύτταρα που δεν είναι ικανά για φαγοκυττάρωση (Skarmeta et al 1995, Magarinos et al. 1996). Έτσι, αποφεύγουν την επίδραση των αµυντικών µηχανισµών. Κλασσική οδός ενεργοποίησης του συµπληρώµατος Τα αντισώµατα που είναι συνδεµένα µε την επιφάνεια των βακτηρίων ενεργοποιούν το συµπλήρωµα. Αυτός ο µηχανισµός φαίνεται ότι κυρίως ενεργοποιείται για την προστασία από τον ορότυπο O1 του Vibrio anguillarum (Ellis 1999). Μη ειδικοί κυτταρικοί µηχανισµοί ανοσίας Τα φαγοκύτταρα, κυρίως τα ουδετερόφιλα και τα µακροφάγα, παίζουν σηµαντικό ρόλο στην άµυνα κατά των βακτηρίων (Ellis 1999, Do Vale et al. 2002). Τα κύτταρα αυτά φαγοκυτταρώνουν τα βακτήρια και τα καταστρέφουν µε την απελευθέρωση ενεργών ριζών οξυγόνου (respiratory burst), υπεροξείδιο του υδρογόνου και ανιόντα υδροξυλίου που έχουν βακτηριοκτόνο δράση (Secombes - 31 -

1996). Επιπλέον, τα ουδετερόφιλα περιέχουν µυελοϋπεροξειδάση (MPO) στα κοκκία του κυτταροπλάσµατος (Afonso et al. 1997). Η µυελοϋπεροξειδάση, παρουσία ιόντων αλογόνου και νερού, αδρανοποιεί τα βακτήρια µε αλογόνωση του κυτταρικού τοιχώµατος και µε την παραγωγή βακτηριοκτόνων ιόντων αλογόνου (Klebanoff και Clark 1978). Τα ουδετερόφιλα και τα µακροφάγα περιέχουν λυσοζύµη και υδρολυτικά ένζυµα στα λυσοσωµάτιά τους. Τα µακροφάγα των ψαριών παράγουν και οξείδιο του αζώτου, το οποίο στα θηλαστικά µπορεί να σχηµατίσει νιτρικά υπεροξείδια και ρίζες υδροξυλίου (Secombes et al. 1996, Acosta et al. 2003). Το οξείδιο του αζώτου (NO) έχει άµεση αντιµικροβιακή δράση (Villamil et al 2003b). Ειδικοί µηχανισµοί κυτταρικής ανοσίας Τα ενεργοποιηµένα µακροφάγα παρουσιάζουν αυξηµένη παραγωγή ελεύθερων ριζών οξυγόνου και κατά συνέπεια αυξηµένη βακτηριοκτόνο ικανότητα. Η ενεργοποίηση µπορεί να γίνει µε διάφορους τρόπους, αλλά κυρίως µε τον παράγοντα ενεργοποίησης των µακροφάγων (πιθανά την ιντερφερόνη γ) που παράγεται από τα Τ- λεµφοκύτταρα, τα οποία ενεργοποιούνται από το αντιγόνο (Ellis 2001). Μηχανισµοί προστασίας έναντι του Vibrio anguillarum Ειδικότερα, όσο αφορά στο Vibrio anguillarum, τα εµβόλια του εµπορίου περιλαµβάνουν τους ορότυπους Ο1 και Ο2 που είναι και οι πιο σηµαντικοί για την εµφάνιση δονακίωσης παγκοσµίως (Sorensen and Larsen 1986, Toranzo et al. 1990, Myhr et al. 1991, Pedersen et al. 1999). Παθογόνα στελέχη Vibrio anguillarum του ορότυπου Ο1 και Ο2 είναι ανθεκτικά σε ορό που δεν περιέχει αντισώµατα (Toranzo et al. 1983). Έχει αποδειχθεί ότι ορός που περιέχει αντισώµατα αδρανοποιεί στελέχη του ορότυπου Ο1, όχι όµως τα στελέχη του ορότυπου Ο2 (Ellis 1999). Όταν δεν υπάρχουν ειδικά αντισώµατα και οι δύο ορότυποι δεν προκαλούν στην πέστροφα ενεργοποίηση του συµπληρώµατος, ενώ µόνο για τον ορότυπο Ο1 ενεργοποιείται το συµπλήρωµα παρουσία ειδικών αντισωµάτων. Στελέχη του ορότυπου Ο2 σε άνοσο ορό δεν προκαλούν ενεργοποίηση του συµπληρώµατος (Boesen et al. 1999). Τα Ο αντιγόνα στελεχών του ορότυπου Ο2 έχουν µεγαλύτερο µοριακό βάρος από εκείνα των στελεχών του ορότυπου Ο1 που είναι ευαίσθητα σε άνοσο ορό (Boesen et al. 1999). Όταν στελέχη του ορότυπου Ο2 αναπτύσσονται σε υποστρώµατα µε γλυκόζη, τότε τα στελέχη αυτά γίνονται ευαίσθητα σε άνοσο ορό, γεγονός που σχετίζεται µε την παραγωγή µικρότερων - 32 -