Η επίδραση του ενδοειδικού ανταγωνισμού στη φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish, Danio rerio (Hamilton, 1822)

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ Οικολογία Διαχείριση & Προστασία Φυσικού Περιβάλλοντος Η επίδραση του ενδοειδικού ανταγωνισμού στη φαινοτυπική πλαστικότητα του zebrafish, Danio rerio (Hamilton, 1822) ΓΕΩΡΓΙΟΥ ΑΝΑΣΤΑΣΙΑ (Α.Μ.: 405) ΠΑΤΡΑ 2010

Επιβλέπων Καθηγητής Φλυτζάνης Κωνσταντίνος (Αναπληρωτής Καθηγητής Πανεπιστημίου Πατρών) Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή Κουμουνδούρος Γεώργιος (Επίκουρος Καθηγητής Πανεπιστημίου Πατρών) Σφενδουράκης Σπυρίδων (Επίκουρος Καθηγητής Πανεπιστημίου Πατρών) Φλυτζάνης Κωνσταντίνος (Αναπληρωτής Καθηγητής Πανεπιστημίου Πατρών) 2

Περιεχόμενα 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 5 1.1 Ενδοειδικός ανταγωνισμός 6 1.2 Φαινοτυπική πλαστικότητα 12 1.3 Ο υπό εξέταση οργανισμός 14 1.4 Σκοπός της εργασίας 15 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 16 2.1 Πειραματικός σχεδιασμός 17 2.2 Σύσταση και διατήρηση των πειραματικών πληθυσμών 20 2.3 Μελέτη της επιθετικότητας 23 2.4 Μελέτη της αύξησης του σωματικού μεγέθους, της επιβίωσης και της αναλογίας φύλου 24 2.5 Επίδραση των «επιτιθέμενων» ατόμων στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων 24 2.6 Στατιστική ανάλυση 26 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 27 3.1 Μελέτη της επιθετικότητας 28 3.2 Μελέτη της αύξησης του σωματικού μεγέθους, της επιβίωσης και της αναλογίας φύλου 30 3.3 Επίδραση των «επιτιθέμενων» ατόμων στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων 32 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 39 4.1 Επιθετικότητα 40 4.2 Αύξηση σωματικού μέγεθος και αναλογία φύλου 41 4.3 Σχήμα σώματος 42 5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 44 6. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 46 3

Πρόλογος Αρχικά να αναφέρω ότι τα όλα τα πειράματα διεξήχθησαν στο εργαστήριο του κ. Κουμουνδούρου Γεώργιο του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστήμιου Πατρών στα πλαίσια του μεταπτυχιακού διπλώματος ειδίκευσης «Οικολογία Διαχείριση και Προστασία Φυσικού Περιβάλλοντος». Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Φλυτζάνη Κωνσταντίνο και τον κ. Σφενδουράκη Σπύρο για τις παρατηρήσεις στη συγγραφή του κειμένου. Οφείλω να πω ένα μεγάλο ευχαριστώ στον κ. Κουμουνδούρου Γεώργιο ή αλλιώς «αφεντικό» που με δέχθηκε και με εμπιστεύτηκε στο εργαστήριο του, αν και από άλλο τομέα. Με την υπομονή που έδειξε σε ΟΛΕΣ τις απορίες μου. Τον ευχαριστώ για τις συμβουλές και τη βοήθεια που μου έδωσε κατά τη διάρκεια της εργασίας. Κατάφερε να με κάνει να πιστέψω σε έμενα και ότι όλα είναι δυνατά αν έχεις υπομονή και θέληση. Τον ευχαριστώ για όλα. Μέσα στο συγκεκριμένο εργαστήριο μαθαίνεις τη συλλογικότητα και την ομαδικότητα για αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω την Γεώργα Γιάννα, την Γλυνάτση Νομική που ήταν τα πρώτα άτομα που με πλησίασαν και με δέχθηκαν όπως ήμουν. Εκτός από την βοήθεια που μου προσέφερε σαν «ψαρούκλα» που ήμουν, ήθελα να ευχαριστώ την Γιάννα για την υπομονή της και τις πολλές ώρες που περάσαμε μαζί εντός και εκτός εργαστηρίου Χριστούγεννα, Πάσχα, Καλοκαίρι και όχι μόνο. Ένα ευχαριστώ στην Χριστοδουλοπούλου Σταυρούλα για τις συζητήσεις που κάναμε περί ηθολογίας και συμπεριφοράς και μαζί με την Βαγιάννη Γεωργία, Κοκκινιά Παναγιώτη βγάλαμε την συντήρηση των ψαριών, τις δύσκολές ώρες των διακοπών. Όλα τα παιδιά του εργαστηρίου Ζήκος Άρη, Κουναμά Βαλεντίνο, Συμεωνίδη Διονυσία, Φραγκούλη Στέφανο, Χρήστου Μαρία που ο κάθε ένας έδινε διαφορετική νότα μέσα σε αυτό. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένεια μου για την ηθική και υλική βοήθεια που μου προσέφεραν σε όλη τη διάρκεια των σπουδών μου αλλά και για την μεγάλη υπομονή που δείχνουν τα τελευταία τρία χρόνια. Ευχαριστώ πολύ. 4

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 5

1.1 Ενδοειδικός ανταγωνισμός Ανταγωνισμός είναι η αλληλεπίδραση μεταξύ ατόμων, η οποία δημιουργείται από τις απαιτήσεις τους για περιορισμένους πόρους και οδηγεί σε μείωση της επιβίωσης, αύξησης και/ή αναπαραγωγής των ανταγωνιζόμενων ατόμων (Begon 1990). Ο ανταγωνισμός που αναπτύσσεται ανάμεσα σε άτομα που ανήκουν σε διαφορετικά είδη ονομάζεται διαειδικός ανταγωνισμός (interspecific competition), ενώ ο ανταγωνισμός μεταξύ των ατόμων του ίδιου είδους, και συνήθως του ίδιου πληθυσμού, ονομάζεται ενδοειδικός ανταγωνισμός (intraspecific competition) (Pianka 2006). Σε πολλές περιπτώσεις η αλληλεπίδραση μεταξύ των ανταγωνιζόμενων ατόμων είναι έμμεση, και αφορά απλά στη μείωση της διαθεσιμότητας ενός πόρου λόγω της «χρήσης» του από τα υπόλοιπα άτομα του πληθυσμού. Στην περίπτωση δε που ο πόρος είναι περιορισμένος, τότε ο ανταγωνισμός ονομάζεται ανταγωνισμός εκμετάλλευσης ή κατανάλωσης (exploitation ή consumptive competition). Στην περίπτωση του παρεμβολικού ανταγωνισμού (interference competition), η άμεση αλληλεπίδραση των ατόμων αφορά στο ότι ένα άτομο προλαβαίνει ένα άλλο από την κατάκτηση του ενδιαιτήματος και κατά συνέπεια την εκμετάλλευση των πόρων (χώρος, τροφή, ερωτικός σύντροφος) σε αυτό (Begon 1990). Στα ψάρια, ο ανταγωνισμός εκφράζεται με διάφορα πρότυπα επιθετικής συμπεριφοράς. Αυτά περιλαμβάνουν την απειλή (στιγμιαία κατευθυνόμενη κίνηση ενός ατόμου εναντίον άλλου με στόχο τον εκφοβισμό του, και με κατάληξη την υπεράσπιση του περιβάλλοντος χώρου), το κυνήγι (κυνήγι μεταξύ δύο ως τριών ατόμων σε όλο το χώρο, χωρίς σταθερή διαβάθμιση κυριαρχίας), το «χορό» (κυκλική αντιπαράλληλη κίνηση δύο ατόμων, με ταυτόχρονη επίδειξη των πτερυγίων), την ανταπόδοση (στιγμιαία απάντηση στην απειλή άλλου ατόμου) και το «φίλημα» (στιγμιαίο άγγιγμα των ρυγχών, πιθανώς συνοδευόμενο από δάγκωμα) δύο ιχθυδίων (Χριστοδουλοπούλου 2009). Από τα παραπάνω, στο zebrafish έχουν παρατηρηθεί η απειλή, το κυνήγι, η ανταπόδοση και ο χορός (Larson et al. 2006). 6

Τα ψάρια του ίδιου είδους έχουν σε μεγάλο βαθμό παρόμοιες απαιτήσεις για επιβίωση, αύξηση και αναπαραγωγή αλλά όταν οι απαιτήσεις τους αφορούν τους ίδιους πόρους τότε τα άτομα αρχίζουν να γίνονται ανταγωνιστικά και κάποια να στερούνται των πόρων. Οι κύριοι πόροι για τους οποίους μπορεί να ανταγωνίζονται τα άτομα του ίδιου είδους είναι η τροφή, ο χώρος, η κυριαρχία (Webster and Hixon 2000, Larson et al. 2006), η επιλογή συντρόφου, η γονική φροντίδα (Huntingford 1976). Το ποσοστό της παρουσίας των πόρων επηρεάζει το βαθμό της ανταγωνιστικής συμπεριφοράς η οποία εξαρτάται από πολλούς παράγοντες όπως το είδος (Saverino and Gerlai 2008), η ηλικία (Jones 1987), το φύλο (Johnsson et al. 2001), η πυκνότητα (Jones 1987, Paszkowski et al. 1990, Amundsen et al. 2007), η παρουσία ή όχι θηρευτών, η επικράτηση ακραίων συνθηκών, το βάρος (Marks et al. 2005), το κοπάδιασμα (Rubenstein 1978, Jobling and Reinsnes 1986, Jones 1987, Μoretz et al. 2006), η κυριαρχία (Abbott et al. 1985), το ρυθμό; αύξησης (Amundsen et al. 2007). Όλοι οι παραπάνω παράγοντες φαίνεται να αλληλεπιδρούν μεταξύ τους και να εξαρτάται ο ένας από τον άλλον. Ωστόσο θα γίνει μια πρώτη προσπάθεια διαχωρισμού των παραγόντων που επηρεάζουν τον ενδοειδικό ανταγωνισμό. Ανταγωνισμός και κοπάδιασμα Η ένταση του ενδοειδικού ανταγωνισμού δεν είναι τόσο μεγάλη όσο η ένταση του ανταγωνισμού μεταξύ διαφορετικών ειδών, ιδιαίτερα στα άτομα που εμφανίζουν συμπεριφορά κοπαδιάσματος (Larson et al. 2006). Ωστόσο ο ενδοειδικός ανταγωνισμός στα περισσότερα είδη ψαριών είναι πιο εμφανής όταν τα άτομα κοπαδιάζουν. Από τη μια, το κοπάδιασμα βελτιώνει της συνθήκες για εύρεση τροφής, εύρεση συντρόφου και αποφυγή των θηρευτών. Από την άλλη όμως, τα πλεονεκτήματα του κοπαδιάσματος μειώνονται λόγω του συγκριτικά εντονότερου ενδοειδικού ανταγωνισμού (Rubenstein 1978). Στα ψάρια που κοπαδιάζουν, το κοινωνικό περιβάλλον παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και στην έκφραση της συμπεριφοράς, λόγω της επαφής που έχει κάθε άτομο με τα άλλα μέλη του κοπαδιού. Ωστόσο, 7

πολλές φορές τα άτομα αναγνωρίζουν μέσα στο κοπάδι συγγενικά μέλη με αποτέλεσμα τη μείωση της επιθετικότητας (Μoretz et al. 2006). Στο zebrafish, το κοπάδιασμα είναι ένα έμφυτο χαρακτηριστικό (με 2 έως 10 άτομα σε κάθε ομάδα). Τα άτομα zebrafish προτιμούν να προσεγγίζουν πιο δραστήρια και μεγάλα κοπάδια, ακόμα και αν αυτά εκτίθενται πιο εύκολα σε αρπακτικά, γιατί έτσι απολαμβάνουν τα πλεονεκτήματα του κοπαδιού (Pritchard et al. 2001). Προτιμούν να κοπαδιάζουν με άτομα του ίδιου είδους και όχι με διαφορετικού, ακόμα και αν τα τελευταία επιδεικνύουν συμπεριφορά κοπαδιάσματος (Saverino and Gerlai 2008). Στο zebrafish, το στάδιο στο οποίο ολοκληρώνεται η ανάπτυξη του ουραίου πτερυγίου (postflexion larvae, 7mm SL) θεωρείται σημαντικό για την έναρξη του κοπαδιάσματος. Αν και από πιο νωρίς (preflexion στάδιο, 3,5mm SL) έχουν την ικανότητα να αναγνωρίσουν την τροφή (Kimmel et al. 1995) και να έχουν απόκριση στις σκιές (Easter and Nicola 1996), η πλήρη αποδοχή του φωτός γίνεται μόνο αν φτάσουν στις 12 ημέρες μετά την γονιμοποίηση (dpf) (Branchek and Bremiller 1984). Η επιλογή κοπαδιού με συγκεκριμένα χαρακτηριστικά εκδηλώνεται σε μεγαλύτερα στάδια (στάδιο του ιχθυδίου, 10mm SL, Engeszer et al. 2007). Το ίδιο συμβαίνει και με το είδος που ζει σε κοραλλιογενείς υφάλους Pomacentrus amboinensis, στο οποίο οι αλληλεπιδράσεις ανταγωνισμού φαίνεται να είναι πιο έντονες μεταξύ των μεγάλων ιχθυδίων και των ενηλίκων, ενώ τον πρώτο χρόνο ζωής του δεν υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ των μικρών ιχθυονυμφών και των ενηλίκων (Jones 1987). Ανταγωνισμός και περιβάλλον ανάπτυξης Η γνώση της οντογένεσης και της εμφάνισης μιας συμπεριφοράς μπορεί να προσδιορίσει τις σημαντικές περιόδους για την ανάπτυξή της και να συμβάλλει στην αποτίμηση των περιβαλλοντικών και γενετικών παραγόντων που επάγουν το φαινότυπό της (Engeszer et al. 2007). Λόγω της πλαστικότητας του zefrafish, ακόμα και η επιθετικότητα επηρεάζεται από τους παράγοντες του περιβάλλοντος στο οποίο αναπτύσσονται τα άτομα. Ο Marks (2005) μελέτησε την ένταση της επιθετικότητας στο zebrafish όταν 8

αλλάζει το περιβάλλον ανάπτυξης μετά τη γεννητική ωρίμανση και έδειξε ότι η επιθετικότητα αυξάνεται όταν τα άτομα δεν αλλάξουν περιβάλλον διαβίωσης. Το ίδιο συμβαίνει αν τα ψάρια εγκλιματιστούν στο περιβάλλον το οποίο τους περιμένει μετά το στάδιο της γεννητικής ωρίμανσης. Έτσι όταν το ψάρι παραμείνει στο περιβάλλον ανάπτυξής του η επιθετικότητα είναι μεγαλύτερη από ό,τι όταν αλλάξει περιβάλλον. Με την αύξηση της επιθετικότητας, το ενεργειακό κόστος αυξάνει, με αποτέλεσμα, με την πάροδο του χρόνου να αρχίζει να μειώνει τις δραστηριότητές του και την επιθετική του συμπεριφορά. Η συνύπαρξη κυρίαρχων και υποτελών ενήλικων ατόμων zebrafish για πέντε ημέρες κάνει τη μεταξύ τους σχέση να σταθεροποιείται και να μειώνει τις αλληλεπιδράσεις (Larson et al. 2006). Η ανάπτυξη των νυμφών (ηλικίας 21 dpf) σε περιβάλλον με διαφορετικά στελέχη είχε σημαντική επίδραση στην κοινωνική συμπεριφορά τους, όχι όμως και στα μη κοινωνικά χαρακτηριστικά της συμπεριφοράς (τα επίπεδα ενεργητικότητας, την απόκριση σε θηρευτές, την επαναφορά από μια στρεσογόνο κατάσταση). Μεταξύ των συμπεριφορικών αλλαγών ήταν η αύξηση της συχνότητας τσιμπημάτων (biting) και η μείωση της συνεκτικότητας του κοπαδιού (Moretz et al. 2006). Ανταγωνισμός και πυκνότητα Ένας άλλος σημαντικός παράγοντας που επιδρά στην εμφάνιση του ενδοειδικού ανταγωνισμού, και κατ επέκταση και στην ένταση της επιθετικότητας, είναι η πυκνότητα του πληθυσμού. Ωστόσο δεν υπάρχει συγκεκριμένο πρότυπο της απόκρισης της έντασης της επιθετικότητας στην πληθυσμιακή πυκνότητα. Σε αραιοκατοικημένα περιβάλλοντα ο ανταγωνισμός δεν εμφανίζεται τόσο έντονος όσο στα περιβάλλοντα με μεγαλύτερο αριθμό ατόμων, γεγονός που αποδίδεται στο ότι στις υψηλές πυκνότητες, τα άτομα έρχονται πιο εύκολα σε μεταξύ τους επαφή και τα αποθέματα των πόρων είναι περιορισμένα. Τα παραπάνω συμφωνούν με την εργασία των Caballero and Castro (2003) όπου η ένταση της επιθετικότητας στο Diplodus. sargus cadenati μειώθηκε με την αύξηση της πυκνότητας του πληθυσμού. Στο Diplodus puntazzo, η απόκριση της επιθετικότητας έναντι 9

της αύξησης της πυκνότητας του πληθυσμού ακολούθησε κωδωνοειδές πρότυπο (Χριστοδουλοπούλου 2009) όπως και στα θηλυκά άτομα του Micropterus salmoides κατά την περίοδο της αναπαραγωγής (Fleming and Johansen 1984). Ο αριθμός των «ανταγωνιστών» σε έναν πληθυσμό επιδρά και στο μέγεθος των ατόμων που αποδέχονται την επιθετική συμπεριφορά. Σε μελέτη που έγινε στο είδος Carassius carassius βρέθηκε ότι τα άτομα του πληθυσμού που είχαν έναν «ανταγωνιστή» του ίδιου είδους παρουσίαζαν μεγαλύτερο βάρος από αυτά που είχαν πέντε «ανταγωνιστές» με βάρος ίσο με εκείνο του ενός «ανταγωνιστή». Αντίθετα όταν υπήρχε ένας «ανταγωνιστής» στον πληθυσμό το βάρος έπαιζε σημαντικό ρόλο, με το μεγαλύτερο «ανταγωνιστή» να δρα αρνητικά στην πρόσληψη τροφής από τα υπόλοιπα άτομα (Paszkowski et al. 1990). Η παρουσία των ενήλικων ατόμων Pomacentrus amboinensis φαίνεται να επηρεάζει άμεσα το μέσο μέγεθος των ιχθυδίων στο δεύτερο έτος ζωής τους (Jones 1987). Στο zebrafish η συνολική ποσότητα της κορτιζόλης (αποτελεί δείκτη στρες για τα ψάρια) βρέθηκε να είναι μεγαλύτερη στους πληθυσμούς μεγαλύτερης πυκνότητας σε κατάσταση νηστείας (Ramsay et al. 2006), γεγονός που αποδίδεται στην αύξηση του ανταγωνισμού. Ανταγωνισμός και σωματικό μέγεθος Ο ενδοειδικός ανταγωνισμός συνήθως καταλήγει σε καθιέρωση ιεραρχίας, κατά την οποία τα μεγαλύτερα και πιο επιθετικά άτομα χρησιμοποιούν μεγαλύτερη ποσότητα από τη διαθέσιμη πηγή σε σύγκριση με αυτά που είναι μικρότερα και υποτελή (Webster and Hixon 2000). Πολλές φορές όμως έχει βρεθεί ότι τα άτομα χρησιμοποιούν τη μνήμη, με αποτέλεσμα παρ ότι το μέγεθος των υποτελών ατόμων είναι μεγαλύτερο, τα κυρίαρχα άτομα θυμούνται τη «θέση» τους και τα κυρίαρχα παραμένουν κυρίαρχα (Abbott et al. 1985). Ο ρυθμός αύξησης επηρεάζεται από την πληθυσμιακή πυκνότητα μέσω του ενδοειδικού ανταγωνισμού. Για παράδειγμα, τα άτομα του είδους Savelinus alpinus υπέφεραν στην υψηλή πληθυσμιακή πυκνότητα από το 10

περιορισμό της τροφής και της ενέργειας που καταναλώνεται λόγω του ενδοειδικού ανταγωνισμού (Jobling and Reinsnes 1986), με αποτέλεσμα τη χαμηλή κατανάλωση τροφής και το χαμηλό ρυθμό αύξησης των ατόμων (Amundsen et al. 2007). Στο ίδιο είδος βρέθηκε ότι ο ρυθμός αύξησης των ατόμων που ήταν σε ομάδα ήταν μικρότερος από εκείνων των ατόμων που διαβίωναν απομονωμένα, γεγονός που αποδόθηκε στην ενέργεια που καταναλώνεται λόγω του ανταγωνισμού. Η παρατήρηση επιβεβαιώνεται και στα είδη που ζουν σε κοραλιογενείς υφάλους (Jones 1987), με τον επιτιθέμενο να είναι μεγαλύτερος ή ίσος από τον αποδέκτη της επίθεσης (Webster and Hixon 2000). Στο είδος Diplodus sargus cadenati η έντασης της επιθετικότητας βρέθηκε να εξαρτάται από το μέγεθος των ιχθυδίων που ανταγωνίζονταν σε συνάρτηση με την εισαγωγή νέων ατόμων του ίδιου είδους. Τα άτομα τα οποία προϋπήρχαν στον πληθυσμό κέρδιζαν τις μάχες από τα άτομα που μόλις εισάγονταν και ήταν μικρότερα ή ίσα. Αντίθετα το ποσοστό των νικών των προϋπαρχόντων ιχθυδίων μειωνόταν όταν τα εισαγόμενα ήταν μεγαλύτερα, ενώ η εκδηλούμενη επιθετικότητα ήταν εντονότερη (Caballero and Castro 1999). Ανταγωνισμός και φύλο Η επίδραση του ενδοειδικού ανταγωνισμού στον καθορισμό του φύλου δεν έχει μελετηθεί επαρκώς. Σε είδη τα οποία αλλάζουν το φύλο τους κατά τη διάρκεια του βιολογικού τους κύκλου (όπως τα διαδοχικά ερμαφρόδιτα είδη του γένους Amphiprion) έχει βρεθεί πως στη περίπτωση που το κυρίαρχο θηλυκό φεύγει από τον πληθυσμό, τη θέση του καταλαμβάνει το μεγαλύτερο από τα άτομα που απομένουν είτε θηλυκό είτε αρσενικό. Σε αυτά τα είδη τα μεγαλύτερα και κυρίαρχα θηλυκά ελέγχουν το φύλο των υποτελών ατόμων με την επιθετική συμπεριφορά τους (Fricke and Fricke 1977, Hattori 1991). 11

1.2. Φαινοτυπική πλαστικότητα Ο όρος φαινοτυπική πλαστικότητα περιγράφει την ιδιότητα ενός γενοτύπου να παράγει διάφορους φαινοτύπους ως απόκριση στις διαφορετικές περιβαλλοντικές συνθήκες. Το σύνολο των φαινοτύπων που παράγεται καλείται «φάσμα αντίδρασης» (reaction norm) (Stearns 1989) (Εικόνα 1). Ο προσδιορισμός των προτύπων αντίδρασης είναι ένας τρόπος για να κατανοήσουμε τη φαινοτυπική ποικιλομορφία στα διάφορα περιβάλλοντα. Τα φάσματα αντίδρασης είναι εξαιρετικής σημασίας προκειμένου να κατανοήσουμε τις αιτίες της φαινοτυπικής ποικιλομορφίας, με την έννοια ότι μεταφράζουν ένα εύρος περιβαλλόντων σε ένα εύρος φαινοτύπων. Ας πάρουμε την υπόθεση δυο διαφορετικών γενοτύπων (1 και 2) (Εικόνα 1). Αν το εύρος του υπό εξέταση περιβάλλοντος καλύπτει μια περιοχή στην οποία τα φάσματα αντίδρασης είναι ριζικά διαφορετικά τότε θα παρατηρηθεί γενετική ποικιλομορφία. Στην περίπτωση όμως που τα φάσματα απόκρισης διασταυρώνονται, τότε αυτά δεν ερμηνεύονται ως αποτέλεσμα διαφορετικής γενετικής σύστασης. Σε έναν πληθυσμό που οι γενότυποι εκδηλώνουν αξιοσημείωτη απόκριση (γενότυπος 2) στις περιβαλλοντικές αλλαγές, το εύρος διακύμανσης του φαινοτύπου θα είναι πιο μεγάλο από ότι σε έναν πληθυσμό με μικρή απόκριση στο περιβάλλον (Thompson 1991). Τα φάσματα αντίδρασης χαρακτηρίζονται από το μέγεθος (amount), τον τύπο (pattern), την ταχύτητα (rapidity) και την αναστρεψιμότητα (reversibility) της μεταβολής του φαινοτύπου (Schlichting and Pigliucci 1998). Όταν οι περιβαλλοντικές μεταβολές ακολουθούνται από φαινοτυπικές μεταβολές σε αναπτυξιακό επίπεδο τότε μιλάμε για αναπτυξιακή πλαστικότητα (developmental plasticity). Είναι φανερό ότι πολλοί περιβαλλοντικοί παράγοντες προκαλούν μεταβολές της οντογένεσης κάποιων χαρακτήρων, χωρίς απαραίτητα να προκαλούν μεταβολή και του ενήλικου φαινοτύπου. Για παράδειγμα η θερμοκρασία μπορεί να επηρεάσει το χρονισμό της ανάπτυξης ενός είδους, χωρίς ωστόσο να επηρεάζει και το φαινότυπο του είδους. Για αυτό η ανάπτυξη είναι πάντα περιβαλλοντικά 12

ευαίσθητη, ενώ το φαινοτυπικό της αποτέλεσμα μπορεί να μην εξαρτάται από το περιβάλλον (Braendle and Filix 2009). Εικόνα 1: Διαγραμματική αναπαράσταση της σχέσης των φασμάτων αντίδρασης με το γενότυπο (1 και 2) και το περιβάλλον (Α και Β) (από Thomson 1991). Τα ψάρια συγκαταλέγονται στους οργανισμούς με τη μεγαλύτερη φαινοτυπική πλαστικότητα. Το φαινόμενο της πλαστικότητας μπορεί να οφείλεται σε βιοτικούς και αβιοτικούς παράγοντες. Η θερμοκρασία ανάπτυξης (Koumoundouros et al. 2001, Georgakopoulou et al. 2007), η συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου, η φωτοπερίοδος και η αλατότητα (Lindsey 1998), η πυκνότητα της τροφής ή η μέθοδος εκτροφής των ψαριών (Koumoundouros et al. 1998), η πυκνότητα των ψαριών (Amundsen 2007), το κοινωνικό περιβάλλον (Μoretz et al. 2006), το περιβάλλον ανάπτυξης (Marks et al. 2005, Carfagnini et al. 2009), η παρουσία «ανταγωνιστών» (Paszkowski et al. 1990), έχει δειχθεί πως επηρεάζουν πλήθος χαρακτήρων, όπως το σχήμα του σώματος, το ρυθμό αύξησης, την κολυμβητική ικανότητα, 13

την αναλογία του φύλου, τα μεριστικά χαρακτηριστικά και την ένταση της επιθετικότητας. 1.3 Ο υπό εξέταση οργανισμός Φύλο: Χορδωτά (Chordata) Κλάση: Ακτινοπτερύγιοι (Actinopterygii) Υποκλάση: Τελεόστεοι (Teleostei) Τάξη: Κυπρινόμορφοι (Cypriniformes) Οικογένεια: Κυπρινοειδή (Cyprinidae) Γένος: Danio Είδος: Danio rerio Εικόνα 2: Συστηματική κατάταξη και εξωτερική μορφολογία του zebrafish. Το zebrafish είναι ένα από τους πιο σημαντικούς οργανισμούςμοντέλα που χρησιμοποιούνται στη γενετική και αναπτυξιακή βιολογία, νευροφυσιολογία και βιοιατρική. Έχει έναν αριθμό χαρακτηριστικών που το κάνουν επιλέξιμο για πειραματικούς χειρισμούς. Είναι μικρό, εύρωστο ψάρι, μπορεί να διατηρηθεί σε εργαστηριακές συνθήκες εύκολα και οικονομικά, ακόμα και σε μεγάλους πληθυσμούς. Τα θηλυκά έχουν τη δυνατότητα να γεννούν κάθε 2-3 μέρες μερικές εκατοντάδες αυγά. Ο βιολογικός κύκλος είναι μικρός (περίπου 3-4 μήνες). Επιπλέον τα αυγά του είναι σχετικά μεγάλα (0,7 mm διάμετρος) και διαφανή. Η ανάπτυξη είναι γρήγορη, με τα σημαντικά όργανα να αναπτύσσονται στις πρώτες 36 ώρες μετά τη γονιμοποίηση. Η νύμφη αναζητά τροφή και δραστηριοποιείται στην αποφυγή θηρευτών (avoidance) εντός των πρώτων 5 dpf (Κimmel et al 1995). 14

Το zebrafish είναι ένα μικρό ενδημικό ψάρι της νότιας Ασίας και εξαπλώνεται στην Ινδία, το Μπανγκλαντές, το Νεπάλ, το Μιανμάρ και το Πακιστάν. Ανήκει στη οικογένεια των κυπρινοειδών (Εικόνα 2). Τους φυσικούς πληθυσμούς του είδους αυτού τους συναντάμε σε ήρεμα ή στάσιμα νερά τάφρων, καναλιών ή ποταμών. Ευδοκιμεί σε χαμηλής στάθμης νερά (με βάθος 30 cm), χωρίς σκιά, με βλάστηση και λασπώδες υπόστρωμα. Λόγω της περιοχής, το εύρος της θερμοκρασίας στο οποίο διαβιεί είναι από 6 ο C το χειμώνα έως 38 ο C καλοκαίρι. Το zebrafish θεωρείται παμφάγο αφού τρέφεται με ζωοπλαγκτόν, έντομα και φυτοπλαγκτόν (Spence et al. 2008). Το είδος είναι ωοτόκο, με ασύγχρονη ωρίμανση των γονάδων και χωρίς γονική φροντίδα των απογόνων. Η εκκόλαψη λαμβάνει χώρα μέσα στις 48-72 hpf σε θερμοκρασία 28 ο C. Μετά την 3 η dpf έως την 20 η dpf έχει ολοκληρωθεί η ανάπτυξη της νύμφης και αρχίζει η διαφοροποίηση των γονάδων. Η ολοκλήρωση της διαφοροποίησης των γονάδων και ο φυλοκαθορισμός συμβαίνουν από την 30 η έως την 50 η dpf, ενώ τα άτομα ωριμάζουν γεννητικά 10-12 εβδομάδες μετά τη γονιμοποίηση (Westerfield 1995). Το zebrafish ανήκει στα αδιαφοροποίητα γονοχωριστικά είδη τα οποία αρχικά αναπτύσσουν ωοθηκικό ιστό. Παρουσιάζει «ερμαφροδιτισμό ιχθυδίου», με μια περίοδο πριν από την τελική διαφοροποίηση του φύλου, κατά την οποία τα άτομα έχουν ιστούς και των δυο γονάδων (Devlin and Nagahama 2002). 1.4 Σκοπός της εργασίας Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να μελετήσει την επίδραση της έντασης του ενδοειδικού ανταγωνισμού στο στάδιο της νυμφικής φάσης στη συμπεριφορά, στο ρυθμό αύξησης, στο σχήμα του σώματος και στην αναλογία φύλου των ενηλίκων ψαριών Danio rerio. 15

2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 16

2.1 Πειραματικός σχεδιασμός Για τον έλεγχο της επίδρασης της έντασης του ενδοειδικού ανταγωνισμού στην ανάπτυξη του zebrafish, συστάθηκαν τέσσερις πληθυσμοί με 200 «αμυνόμενα» άτομα (ηλικίας περίπου 17 ημερών μετά τη γονιμοποίηση, dpf) ο καθένας, και με κανένα, ένα, τρία ή πέντε «επιτιθέμενα» άτομα (ηλικίας περίπου 32 dpf) (Εικόνα 1). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε τρεις επαναλήψεις (Πίνακας 1, 2). Κάθε πειραματική επανάληψη διήρκησε 50dpf. Μετά το τέλος εφαρμογής των διαφορετικών πειραματικών συνθηκών, τα «επιτιθέμενα» άτομα αφαιρέθηκαν από τους πληθυσμούς. Ακολούθως, οι πληθυσμοί των «αμυνόμενων» ατόμων διατηρήθηκαν υπό κοινές συνθήκες μέχρι την ενηλικίωσή τους (Εικόνα 2). Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων εξετάσθηκε η αύξηση του σωματικού μεγέθους, η επιβίωση και η συμπεριφορά των πειραματικών πληθυσμών. Επίσης εξετάσθηκε η επίδραση της έντασης του ενδοειδικού ανταγωνισμού κατά τη νυμφική φάση, στην αναλογία φύλου και στο σχήμα του σώματος των ενήλικων zebrafish. 200 zebrafish (5,6-6,6mm) 200 zebrafish + (5,6-6,6mm) (12,7-13,3mm) 200 zebrafish + (5,6-6,6mm) (12,6-13,3mm) 200 zebrafish (5,6-6,6mm) + (12,8-13,8mm) Εικόνα 1: Σύσταση των πειραματικών πληθυσμών. Εντός παρενθέσεων δίνεται το εύρος του σωματικού μεγέθους (TL για της νύμφες και FL για τα μικρά ιχθύδια) από τις τρείς επαναλήψεις, κάθε κατηγορίας ατόμων. 17

Πίνακας 1. Ηλικία, αριθμός και μέγεθος των ατόμων στις διαφορετικές πειραματικές συνθήκες (1, 2, 3, 4) και επαναλήψεις (Α, Β, Γ). A, «αμυνόμενα» άτομα. Ε, «επιτιθέμενα» άτομα. Ν, αριθμός ατόμων σε κάθε πληθυσμό. TL, ολικό μέγεθος σώματος. FL, μεσουραίο μέγεθος σώματος. dpf, ημέρες μετά τη γονιμοποίηση. n, μέγεθος δείγματος εκτίμησης των μέσων TL (νύμφες), FL (μικρά ιχθύδια). Δίνεται το μέσο TL, FL (±SD). Επανάληψη Πληθυσμός A1 A2 Α A3 A4 Κατηγορία TL, FL Ηλικία ατόμων N (mm) (dpf) n Α 200 5,6+0,7 17 30 Ε 0 Α 200 5,6+0,7 17 30 Ε 1 12,7 32 Α 200 5,6+0,7 17 30 Ε 3 12,7+0,4 32 Α 200 5,6+0,7 17 30 Ε 5 12,8+0,4 32 Β Γ Β1 Β2 Β3 Β4 Γ1 Γ2 Γ3 Γ4 Α 200 6,6+0,7 15 30 Ε 0 Α 200 6,6+0,7 15 30 Ε 1 13,2 30 Α 200 6,6+0,7 15 30 Ε 3 13,1+0,4 30 Α 200 6,6+0,7 15 30 Ε 5 13,1+0,6 30 Α 200 5,9+0,5 18 30 Ε 0 Α 200 5,9+0,5 18 30 Ε 1 13,4 35 Α 200 5,9+0,5 18 30 Ε 3 13,3+0,7 35 Α 200 5,9+0,5 18 30 Ε 5 13,8+0,5 35 18

Πίνακας 2. Ηλικία, αριθμός και μέγεθος των ατόμων στις διαφορετικές πειραματικές συνθήκες (1, 2, 3, 4) και επαναλήψεις (Α, Β, Γ). A, «αμυνόμενα» άτομα. Ε, «επιτιθέμενα» άτομα. Ν, αριθμός ατόμων σε κάθε πληθυσμό. FL, μεσουραίο μέγεθος σώματος. dpf, ημέρες μετά τη γονιμοποίηση. n, μέγεθος δείγματος εκτίμησης των μέσων FL. Δίνεται το μέσο FL (±SD). Επανάληψη Πληθυσμός A1 A2 Α A3 A4 Κατηγορία TL, FL Ηλικία ατόμων N (mm) (dpf) n Α 132 15,7+2,7 50 50 Ε 0 Α 114 18,0+2,7 50 50 Ε 1 22,6 65 Α 118 17,7+2,6 50 50 Ε 3 26,8+0,9 65 Α 119 16,4+2,5 50 50 Ε 5 19,2+1,5 65 Β Γ Β1 Β2 Β3 Β4 Γ1 Γ2 Γ3 Γ4 Α 86 13,9+2.7 50 50 Ε 0 Α 93 14,1+2,3 50 50 Ε 1 25,4 65 Α 86 13,1+2,4 50 50 Ε 3 25,3+2,8 65 Α 98 12,9+1,9 50 50 Ε 5 24,2+1,7 65 Α 84 15,9+2,5 50 50 Ε 0 Α 128 16,0+2,6 50 40 Ε 1 25,2 67 Α 100 15,6+2,7 50 50 Ε 3 25,4+0,5 67 Α 100 16,6+2,7 50 40 Ε 5 25,5+1,6 67 19

Εικόνα 2: Πειραματικός σχεδιασμός που εφαρμόστηκε. Τα διαφορετικά στάδια αναφέρονται στα «αμυνόμενα» άτομα. Με το πρότυπο της τριπλής γραμμής δίνεται η περίοδος εφαρμογής των διαφορετικών συνθηκών και της έντασης του ενδοειδικού ανταγωνισμού. Δίνεται το εύρος του μήκους σε κάθε στάδιο ανάπτυξης. 2.2 Σύσταση και διατήρηση των πειραματικών πληθυσμών Όλοι οι πειραματικοί πληθυσμοί, προήλθαν από κοινό απόθεμα αυγών που λήφθηκε από την τρίτη γενεά κοινού αποθέματος γεννητόρων «άγριου τύπου» (ZF WT2 F5, Wageningen Agricultural University, The Netherlands). Η διατήρηση και η εκτροφή των νυμφών και των ενήλικων ψαριών πραγματοποιήθηκε βάσει μεθοδολογίας που περιγράφεται στο «The Zebrafish Book» (Westerfield 1995). Διαχείριση γεννητόρων Οι πειραματικοί πληθυσμοί προήλθαν από γεννήτορες που διατηρούνταν σε ενυδρεία χωρητικότητας 8L (2-4 άτομα ανά λίτρο) σε αυτοματοποιημένο σύστημα εκτροφής zebrafish, ZebTEC (Aquatics Zebrafish Housing System, Techniplast, Italy). Η θερμοκρασία του συστήματος διατηρείτο στους 28 ο C (± 1 C), η φωτοπερίοδος ήταν 14 ώρες φώς/ 10 ώρες σκοτάδι και το ph ήταν 7 με 7,5. Η συγκέντρωση των νιτρωδών και αμμωνιακών ιόντων δεν ξεπερνούσε τα 0,1 mg/l. Ο κορεσμός του νερού σε οξυγόνο κυμαινόταν από 80% έως 95%. Η ανανέωση του νερού ήταν ίση με 100% h-1. 20

Οι γεννήτορες τρέφονταν δυο φορές πρωί και βράδυ με βιομηχανική τροφή (Brine Shrimp Flakes By Ocean Nutrition). Όταν επρόκειτο να πάρουμε αυγά, τοποθετούνταν μετά το βραδινό τάισμα τα ειδικά δοχεία για εναπόθεση των αυγών (γεννήστρες). Η ωοτοκία ελάμβανε χώρα το πρωί μια ώρα μετά την έναρξη του φωτισμού. Τα αυγά εμβαπτίζονταν για πέντε λεπτά σε διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου (3 %) για να απαλλαχθούν από την ενδεχόμενη ύπαρξη μυκήτων. Επώαση αυγών και εκτροφή νυμφών Οι πειραματικοί πληθυσμοί κάθε επανάληψης συστάθηκαν από έναν αρχικά ενιαίο πληθυσμό «αμυνόμενων» ατόμων, και από έναν αρχικά ενιαίο πληθυσμό «επιτιθέμενων» ατόμων. Για τον πληθυσμό των «επιτιθέμενων» ατόμων, πάρθηκαν αυγά τα οποία τοποθετήθηκαν σε επωαστήρες αφού προηγουμένως είχαν εμβαπτιστεί σε υπεροξείδιο του υδρογόνου. Μετά την επώαση των αυγών 2-3 ημέρες dpf, άρχισε η εκτροφή των νυμφών στους επωαστήρες μέχρι την ηλικία των 17 dpf. Ύστερα μεταφέρθηκαν σε ενυδρεία χωρητικότητας 10 λίτρων για την ανάπτυξη τους μέχρι την 32 dpf. Για τον πληθυσμό των «αμυνόμενων» ατόμων, τοποθετήθηκαν γεννήστρες στις 17 dpf του πρώτου πληθυσμού. Τα αυγά αυτά χωρίστηκαν σε τέσσερις επωαστήρες (πυκνότητα 400 αυγά) σε κοινό ενυδρείο χωρητικότητας 100 λίτρων. Οι πληθυσμοί αυτοί διατηρήθηκαν μέχρι την ηλικία των 15 dpf στους επωαστήρες και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε ένα κοινό απομονωμένο κλειστό σύστημα ανανέωσης νερού. Τοποθετήθηκαν σε τέσσερα ενυδρεία χωρητικότητας 10 λίτρων το καθένα, που χαρακτηρίζουν και τις τέσσερις διαφορετικές συνθήκες του πειράματος. Σε κάθε ενυδρείο τοποθετήθηκαν, από τα «αμυνόμενα» άτομα, 200 νύμφες μήκους περίπου 6mm και αφέθηκαν για εγκλιματισμό 6 ώρες. Μετά τις 6 ώρες τοποθετήθηκαν 1, 3, 5 μικρά ιχθύδια, μήκους από 12,6 έως 13,8mm του πρώτου πληθυσμού σε κάθε ενυδρείο αντίστοιχα. Το ένα ενυδρείο χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας (control) και δεν είχε κανένα άτομο του πρώτου πληθυσμού (Εικόνα 1). Από τη στιγμή έναρξης του πειράματος 21

και μετά από δύο ώρες το πρωινό και απογευματινό τάισμα, ο κάθε πληθυσμός βιντεοσκοπείτο για 15 λεπτά, δύο φορές την εβδομάδα. Οι ιχθονύμφες διατηρούνταν στους επωαστήρες σε κοινό ενυδρείο 100 λίτρων με θερμοκρασία 28 ο C, φωτοπερίοδο 14 ώρες φώς /10 ώρες σκοτάδι, και το pη ήταν 7 με 7,5. Η συγκέντρωση των νιτρωδών και αμμωνιακών ιόντων δεν ξεπερνούσε τα 0,1 mg/l. Ο κορεσμός του νερού σε οξυγόνο κυμαινόταν από 80% έως 95%. Ο ρυθμός ανανέωσης του νερού στο ενυδρείο των νυμφών και των νεαρών ιχθυδίων, ήταν ίσος με 100% h-1. Οι ιχθονύμφες στους επωαστήρες άρχισαν να τρέφονται με πρώτιστα του γένους Paramecium sp. μετά την εκκόλαψή τους (3-4 dpf), τέσσερις φορές την ημέρα τις εξής ώρες: 9:00, 12:00, 15:00 και 19:00. Η συγκέντρωση των Paramecium ήταν 10000 άτομα/l. Περίπου 15 dpf άρχισε η χορήγηση ναυπλίων Artemia sp. που βρίσκονταν στο στάδιο Instar I μαζί με Paramecium sp. Όσο προχώραγε η ανάπτυξη και το μήκος των νυμφών αυξανόταν, τα πρώτιστα αποκόπηκαν από το διαιτολόγιο των ιχθυονυμφών και μετά το στάδιο της μεταμόρφωσης (25-30 dpf) χορηγείτο βιομηχανική τροφή (Brine Shrimp Flakes By Ocean Nutrition) και Artemia τρεις φορές την ημέρα τις ώρες 9:00, 14:00, 19:00. Η χορήγηση της τροφής στα διάφορα στάδια εξαρτιόταν και από το μήκος των ατόμων σε κάθε χρονική περίοδο. Στις 17 dpf («αμυνόμενων» ατόμων) οι ιχθυονύμφες και τα μικρά ιχθύδια («επιτιθέμενα» άτομα) είχαν μεταφερθεί στο νέο κοινό κλειστό σύστημα ανανέωσης και κυκλοφορίας του νερού. Οι συνθήκες που επικρατούσαν στο νέο σύστημα ήταν οι ίδιες με αυτές του συστήματος που βρίσκονταν πριν. Εκτροφή ιχθυδίων Μετά τις 50 dpf των «αμυνόμενων» ατόμων (Εικόνα 2), τα «αμυνόμενα» μεταφέρονταν σε κλειστό σύστημα κυκλοφορίας και ανανέωσης νερού για 3 με 4 μήνες μέχρι την τελική διαφοροποίηση του φύλου. Τα ενυδρεία που χρησιμοποιούνταν ήταν χωρητικότητας 10 λίτρων. Η θερμοκρασία ήταν 28 ο C, η φωτοπερίοδος ήταν 14 ώρες φως/10 ώρες σκοτάδι και το pη κυμαινόταν από 7 μέχρι 7,5. Η συγκέντρωση των αμμωνιακών και 22

των νιτρωδών ιόντων ήταν μικρότερη του 0,1mg/L. Ο κορεσμός του νερού σε οξυγόνο κυμαινόταν από 80 ως 95%. Σε κάθε πληθυσμό, η ανανέωση του νερού ήταν ίση με 100% h-1, ενώ το σύνολο του κλειστού συστήματος υποβαλλόταν σε 50% εβδομαδιαία ανανέωση του νερού. Το νερό των ενυδρείων, προερχόταν από το νερό του αστικού δικτύου επεξεργασμένο με σύστημα ανάστροφης ώσμωσης (reverse osmosis). Η διατροφή τους γινόταν με βιομηχανική τροφή δυο φορές την ημέρα, τις ώρες 9:00 και 19:00. 2.3 Μελέτη της επιθετικότητας Για τη μελέτη της επίδρασης της επιθετικότητας ο κάθε πληθυσμός βιντεοσκοπείτο ξεχωριστά (SONY DCR-DVD505), δυο φορές την ημέρα, δυο ώρες μετά το τάισμα (δηλαδή 11:00 και 17:00) έτσι ώστε να έχει επέλθει κορεσμός της πείνας και να έχει εξαλειφθεί η επιθετικότητα λόγω έλλειψης τροφής. Η κάθε λήψη διαρκούσε 15 λεπτά και η έναρξη της βιντεοσκόπησης γινόταν με τηλεχειριστήριο για να μην ενοχλούνται τα ψάρια. Από τα 15 λεπτά της κάθε λήψης γινόταν παρατήρηση των 10 τελευταίων λεπτών για να αποκλειστεί η πιθανή επίδραση της παρουσίας του ανθρώπου. Μετριόταν ο αριθμός των επιθέσεων των «επιτιθέμενων» ψαριών έναντι των «αμυνόμενων» σε κάθε συνθήκη αλλά και ο αριθμός των επιθέσεων μεταξύ των «επιτιθέμενων» ατόμων στις συνθήκες που υπήρχαν τα 3 και 5 «επιτιθέμενα» ψάρια. Ο αριθμός των επιθέσεων των διαφορετικών συνθηκών χωρίστηκε σε τέσσερις κλάσεις με βάση το μήκος των «αμυνόμενων» ατόμων. Η ομαδοποίηση των δεδομένων έγινε σε κλάσεις εύρους 3 mm η κάθε μια. Οι κλάσεις ήταν οι εξής: 1 η κλάση 6,5-9,5 mm 2 η κλάση 9,5-12,5 mm 3 η κλάση 12,5-15,5 mm 4 η κλάση 15,5-18,5 mm. 23

2.4 Μελέτη της αύξησης του σωματικού μεγέθους, της επιβίωσης και της αναλογίας φύλου Για τη μελέτη της αύξησης του σωματικού μεγέθους και της επιβίωσης από τη στιγμή έναρξη του πειράματος μέχρι την ηλικία των 50 dpf, γινόταν δειγματοληψία 30 ατόμων από κάθε συνθήκη κάθε 10 ημέρες. Τα άτομα αφού πρώτα αναισθητοποιούνταν (ethylenglycolmonophenylether, σε συγκέντρωση ~0,15-0,25 ml/l) φωτογραφίζονταν ατομικά και με τη βοήθεια το λογισμικού tpsdig (έκδοση 1.37) τοποθετούνταν δυο σημεία για τη μέτρηση του ολικού μεγέθους του σώματος των νυμφών (TL) και του μεσουραίου μήκους (FL) των ιχθυδίων και των ενηλίκων. Από τα 30 άτομα τα 20 διατηρούνταν σε φορμαλδεΰδη και τα υπόλοιπα 10 σε υγρό άζωτο. Ο προσδιορισμός της επιβίωσης γινόταν από τον αριθμό των ατόμων στην αρχή του πειράματος, στις 50 dpf και στις 150-190 dpf. Για τον προσδιορισμό του φύλου χρησιμοποιήθηκαν τα ενήλικα ψάρια ηλικίας περίπου 150-190 dpf. Τα ψάρια αναισθητοποιούνταν, φωτογραφίζονταν και ζυγίζονταν. Ύστερα γινόταν μακροσκοπικός και μικροσκοπικός έλεγχος των γονάδων (Εικόνα 2). 2.5. Επίδραση των «επιτιθέμενων» ατόμων στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων Η μελέτη της επίδρασης των διαφορετικών συνθηκών στο σχήμα του σώματος έγινε στα ενήλικα «αμυνόμενα» άτομα (150-190 dpf). Επιλέχθηκαν όλα τα άτομα που δεν εμφάνιζαν καμία παραμόρφωση στο σχήμα του σώματος (Πίνακας 3). Η ανάλυση έγινε με τη μέθοδο της γεωμετρικής μορφομετρίας. Η γεωμετρική πληροφορία που λαμβάνεται κατά την ανάλυση ενός σχήματος με την παραπάνω μέθοδο, είναι ανεξάρτητη των διαφορών λόγω θέσης, μεγέθους και περιστροφής. Τα ψάρια αφού πρώτα αναισθητοποιούνταν (ethylenglycolmono-phenylether, σε συγκέντρωση ~0,15-0,25 ml/l), φωτογραφίζονταν ατομικά και με τη βοήθεια του λογισμικού tpsdig (έκδοση 1.37) τοποθετούνταν 14 ομόλογα μορφομετρικά σημεία σε αντίστοιχες διακριτές περιοχές (Εικόνα 3). Όλα τα μορφομετρικά σημεία δέχονταν επεξεργασία με το λογισμικό πρόγραμμα ΙΜΡ 24

(CoordGen6d), με τη βοήθεια του οποίου κάθε σχήμα μεταφράζεται (translation), περιστρέφεται (rotation), και αντικατοπτρίζεται (reflection) ώστε τα δύο σημεία της βασικής γραμμής να τοποθετηθούν στις συντεταγμένες 0,0 και 1,0. Έτσι παράγεται μια μέση διαμόρφωση η οποία αποτελεί ένα μέτρο σύγκρισης ή αλλιώς ένα σχήμα αναφοράς. Παράλληλα καθορίζεται το γεωμετρικό από το κεντροειδές μέγεθος. Οι γεωμετρικές διαμορφώσεις όμως βρίσκονται σε έναν πολυδιάστατο χώρο και είναι δύσκολη η χρήση των παραδοσιακών πολυπαραγοντικών μεθόδων. Για αυτόν το λόγο, υπολογίζεται ο πίνακας βαρύτητας (weight matrix) (TpsRelw, έκδοση 1.37), ο οποίος μας δίνει τις νέες μεταβλητές (partial warps) των ατόμων που βρίσκονται πλέον μέσα στον ευκλείδειο χώρο. Τελικά, οι διαφορές στη μορφολογία του σχήματος δίνονται με τα πλέγματα παραμόρφωσης (deformation grids) ή με διανυσματικά διαγράμματα. Εικόνα 3: Θέση των 14 ομόλογων μορφομετρικών σημείων για την ανάλυση του σχήματος. (1) Άκρο του ρύγχους, (2) βάση του πρόσθιου άκρου του ραχιαίου πτερυγίου, (3) βάση του οπίσθιου άκρου του ραχιαίου πτερυγίου, (4) βάση του πρώτου λεπιδοτριχίου του ουραίου πτερυγίου, (5) μέσο της βάσης του ουραίου πτερυγίου, (6) βάση του τελευταίου λεπιδοτριχίου του ουραίου πτερυγίου, (7) βάση του οπίσθιου άκρο του εδρικού πτερυγίου, (8) βάση του πρόσθιου άκρου του εδρικού πτερυγίου, (9) βάση του πρόσθιου άκρου του κοιλιακού πτερυγίου, (10) βάση του βραγχιακού επικαλύμματος, (11) οπίσθιο άκρο βραγχιακού επικαλύμματος, (12) εγγύς ως προς το ρύγχος σημείο του οφθαλμού, (13) σημείο τομής της ευθείας που διέρχεται από τα σημεία 1 και 12, (14) κάτω άκρο γναθικού οστού. 25

2.6 Στατιστική ανάλυση Στη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό Statistica (v. 7.0) Σε κάθε περίπτωση γινόταν έλεγχος για να διαπιστωθεί αν οι διασπορές ήταν ομοιογενείς. Στην περίπτωση που οι διασπορές ήταν ομοιογενείς (το Levene s test έδινε p>0,05) εφαρμοζόταν ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), διαφορετικά πραγματοποιούσαμε τις μη παραμετρικές δοκιμές Kruskal-Wallis και Mann-Whitney U-test. Για να βρούμε την επίδραση των «επιτιθέμενων» ατόμων στο μήκος (50dpf) των «αμυνόμενων», πραγματοποιήσαμε one-way Αnova ενώ ο έλεγχος της σημαντικότητας του διαφορετικού αριθμού των «επιτιθέμενων» ατόμων στον αριθμό επιθέσεων των «επιτιθέμενων» και «αμυνόμενων» ατόμων έγινε με μη παραμετρική δοκιμή. Όσον αφορά το σχήμα του σώματος, οι διαφορές παρατηρήθηκαν με μη παραμετρικό έλεγχο (MANOVA) και αναπαραστάθηκαν με τη μέθοδο της γεωμετρικής μορφομετρίας. Τέλος, οι διαφορές στην αναλογία φύλου ελέχθησαν με G-test. Πίνακας 3: Αριθμός (n) των ενήλικων θηλυκών και αρσενικών που χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη της επίδρασης του αριθμού των «επιτιθέμενων» ατόμων στο σχήμα του σώματος των «αμυνόμενων» ατόμων. W, βάρος (+SD) και FL, μεσουραίο μήκος (+SD). 1 η επανάληψη Συνθήκη n W (mg) FL (mm) n W (mg) FL (mm) 0 39 361,3+108,1 29,4+2,2 43 254,4+43,3 28,6+1,2 1 32 334,3+110,8 29,5+2,5 56 264,5+57,1 28,9+2,0 3 40 363,7+101,8 29,9+2,2 53 247,6+64,6 28,5+2,2 5 38 365,0+114,8 30,2+2,1 40 265,4+43,3 29,0+1,5 3 η επανάληψη 0 26 485,9+125,5 30,7+1,6 40 349,8+46,4 30,1+1,5 1 41 525,6+154,4 31,6+2,6 50 346,8+56,6 30,1+1,8 3 40 490,6+97,6 32,1+2,0 30 334,4+52,2 30,6+1,5 5 27 556,1+144,1 32,2+2,4 40 360,4+90,9 30,4+1,6 26

3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 27

3.1 Μελέτη της επιθετικότητας Από το διαχωρισμό των ατόμων στις τέσσερις κλάσεις δεν βρέθηκαν στατιστικές σημαντικές διαφορές στις επιθέσεις των «επιτιθέμενων» έναντι των «αμυνόμενων» ατόμων στις κλάσεις 6,5-9,5 mm, 12,5-15,5 mm, 15,5-18,5 mm. Σημαντικές διαφορές βρέθηκαν μόνο στην κλάση 9,5-12,5 mm. Στην 1 η και 2 η επανάληψη (κλάση 9,5-12,5 mm) ο αριθμός των επιθέσεων βρέθηκε να διαφέρει στις συνθήκες με τα ένα και τρία «επιτιθέμενα» άτομα (p<0,05). Στην 3 η επανάληψη, διαφορά στον αριθμό των επιθέσεων, βρέθηκε ανάμεσα στα ένα και πέντε «επιτιθέμενα» άτομα (p<0,05) (Eικόνα 4). Όπως παρατηρείται και στην εικόνα 4, τα άτομα παρουσιάζουν μια τουλάχιστον φορά κατά τη διάρκεια της ανάπτυξής τους σημαντική επίδραση της έντασης της επιθετικότητας. Επίσης, είναι φανερό ότι στις κλάσεις 12,5-15,5 mm και 15,5-18,5 mm η διασπορά είναι μεγαλύτερη από τις κλάσεις με μικρότερο μέγεθος σώματος. Από την ανάλυση δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στις διαφορετικές ώρες της ημέρας (πρωί-απόγευμα) που γινόταν η βιντεοσκόπηση (p>0,05). Αντίστοιχα, διαφορές στην ένταση των επιθέσεων μεταξύ των «επιτιθέμενων» ατόμων δεν βρέθηκαν σε καμία από τις τέσσερις κλάσεις αλλά ούτε και μεταξύ των διαφορετικών χρονικών περιόδων (πρωίαπόγευμα) (p>0,05). 28

Εικόνα 4:Επίδραση των «επιτιθέμενων» στην ένταση των επιθέσεων των «αμυνόμενων» (μέση τιμή +SE) για κάθε κλάση. Οι μέσοι όροι με το ίδιο γράμμα διέφεραν στατιστικώς σημαντικά. Εντός παρενθέσεως δίνεται ο αριθμός των παρατηρήσεων για κάθε συνθήκη. Στην πρώτη, δεύτερη και τρίτη σειρά γραφημάτων δίνονται τα αποτελέσματα της πρώτης, δεύτερης και τρίτης πειραματικής επανάληψης αντίστοιχα. Στην τελευταία σειρά, δίνεται το σύνολο των αποκρίσεων και για τις τρείς πειραματικές επαναλήψεις. 29

3.2 Μελέτη της αύξησης του σωματικού μεγέθους, της επιβίωσης και της αναλογίας φύλου Σωματικό μέγεθος Τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης έδειξαν ότι ο αριθμός των «επιτιθέμενων» ατόμων επέδρασε σημαντικά στο μήκος σώματος των «αμυνόμενων» στην ηλικία των 50 dpf (p<0,05) (Εικόνα 5). Η απόκριση του FL έναντι του εξεταζόμενου παράγοντα δεν αποδείχθηκε ενιαία και στις τρεις πειραματικές επαναλήψεις. Στην πρώτη και δεύτερη επανάληψη, ωστόσο, ήταν εμφανής η αρνητική συσχέτιση του FL των «αμυνόμενων» ατόμων με τον αριθμό των «επιτιθέμενων» στο εύρος συνθηκών 1-5 (Εικόνα). Εικόνα 5:Επίδραση των επιθέσεων στο μεσουραίο μήκος (FL) των «αμυνόμενων» ατόμων στις 50 dpf (μέση τιμή + 2SE). Οι μέσοι όροι με το ίδιο γράμμα διέφεραν στατιστικώς σημαντικά. Εντός παρενθέσεως βρίσκεται ο αριθμός των παρατηρήσεων για κάθε συνθήκη. Επιβίωση Το ποσοστό των ατόμων που επιβίωσε από τη στιγμή έναρξης του πειράματος (17 dpf) μέχρι την λήξη των πειραματικών συνθηκών (50 dpf) φαίνεται στο ραβδόγραμμα Α, ενώ η επιβίωση μετά το τέλος των πειραματικών συνθηκών έως την ήμερα που καθορίστηκε το φύλο φαίνεται στο ραβδόγραμμα Β (Εικόνα 6, Πίνακας 4). Η επιβίωση είναι μεγαλύτερη στα ιχθύδια (50-170 dpf) από ό,τι στις νύμφες και τα μικρά ιχθύδια (17-50 dpf), ενώ μεταξύ των συνθηκών δεν παρατηρούνται διαφορές. 30

Εικόνα 6: Συχνότητα επιβίωσης «αμυνόμενων» ατόμων στις διαφορετικές συνθήκες κατά τη διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας και μέχρι την ενηλικίωση (μέση τιμή+sd). Πίνακας 4: Συχνότητα επιβίωσης των «αμυνόμενων» ατόμων στις 50 dpf και στις 170dpf. Δίνεται η μέση συχνότητα επιβίωσης (+SD) όλων των πειραματικών επαναλήψεων, για κάθε συνθήκη. % Επιβίωσης % Επιβίωσης Συνθήκη 50 dpf 150 dpf 0 50,3+13,6 86,1+9,1 1 50,8+8,8 86,9+8,4 3 50,7+8,0 75,6+25,4 5 52,8+5,8 69,2+19,3 Αναλογία φύλου Η επεξεργασία των αποτελεσμάτων δεν έδειξε στατιστικώς σημαντική διαφορά της αναλογίας φύλου μεταξύ των διαφορετικών πειραματικών συνθηκών που εφαρμόσθηκαν (p>0,05, G-test).Το ποσοστό των θηλυκών ατόμων στην πρώτη επανάληψη ήταν 42%, 35%, 40%, 43% για τις συνθήκες κανένα, ένα, τρία, πέντε «επιτιθέμενα» άτομα (Εικόνα 7). Η δεύτερη επανάληψη έδωσε 33%, 46%, 50%, 43% για της αντίστοιχες συνθήκες, ενώ η τρίτη πειραματική επανάληψη έδωσε 39%, 43%, 43%, 40%. 31

Εικόνα 7: Επίδραση των «επιτιθέμενων» ατόμων στην αναλογία φύλου ενήλικων ατόμων του zebrafish. Δίνονται οι συχνότητες (%) αρσενικών, θηλυκών και αδιαφοροποίητων ατόμων στις τρεις επαναλήψεις καθώς και οι μέσες τιμές τους (+SD). (M) αρσενικά άτομα, (F) θηλυκά άτομα και (?) αδιαφοροποίητα άτομα. 3.3 Επίδραση των «επιτιθέμενων» ατόμων στο σχήμα του σώματος των ενήλικων αρσενικών και θηλυκών ατόμων Τα αποτελέσματα της μορφομετρικής ανάλυσης έδειξαν ότι η ένταση του ενδοειδικού ανταγωνισμού κατά το νυμφικό στάδιο, επιδρά σημαντικά στο σχήμα του σώματος των ενήλικων zebrafish, τόσο των θηλυκών (1 η επανάληψη: p<0,05, Wilks λ=0,073, 2 η επανάληψη: p<0,05, Wilks λ=0,300) όσο και των αρσενικών (1 η επανάληψη: p<0,05, Wilks λ=0,099, 2 η επανάληψη: p<0,05, Wilks λ=0,340) (Πίνακας 5, Εικόνα 8 και 9). 32

Πίνακας 5: Τετράγωνο των αποστάσεων Mahalanobis μεταξύ των ομάδων κάθε επανάληψης. 0, 1, 3, 5 «επιτιθέμενα» άτομα., Θηλυκά άτομα., αρσενικά άτομα. 0 13,2 p<0,001 1 η επανάληψη 3 η επανάληψη 1 3 5 1 3 5 13,1 9,3 3 4,7 p<0,001 p<0,001 p=0,070 p=0,005 1 24,1 p<0,001 18,7 p<0,001 3 3,2 p=0,002 0 20,9 p<0,001 3,4 p<0,001 1 21,3 p<0,001 3,2 p=0,003 22,1 p<0,001 3 2,9 p=0,002 1,9 p=0,045 4,3 p=0,001 5,8 p<0,001 6,9 p<0,001 2,9 p=0,193 5,2 p<0.001 3,5 p=0.034 1,7 p=0,185 3,1 p<0,001 2,9 p=0,003 Στην πρώτη πειραματική επανάληψη, οι κύριες διαφορές σχήματος εκφράστηκαν κατά μήκος της πρώτης κανονικής μεταβλητής (CV1), η οποία ερμήνευσε το 67,6 (θηλυκά άτομα) ως 85,0% (αρσενικά άτομα) της συνολικής διακύμανσης σχήματος. Ο κατά μήκος της CV1 διαχωρισμός των ομάδων στα θηλυκά άτομα, αφορούσε στη διαφοροποίηση του πληθυσμού με ένα «επιτιθέμενο» άτομο από εκείνους με τρία και πέντε. Στα αρσενικά άτομα, ο κατά μήκος της CV1 διαχωρισμός αφορούσε στη διαφοροποίηση της ομάδας με ένα «επιτιθέμενο» άτομο από τις υπόλοιπες ομάδες (Εικόνα 8). Η δεύτερη επανάληψη δεν μας έδωσε ικανοποιητικό αριθμό ατόμων για να εφαρμόσουμε την ανάλυση της γεωμετρικής μορφομετρίας. Στην τρίτη πειραματική επανάληψη οι κύριες διαφορές σχήματος εκφράστηκαν κατά μήκος της πρώτης κανονικής μεταβλητής (CV1), η οποία ερμήνευσε το 50,5% (θηλυκά άτομα) ως 71,5% (αρσενικά άτομα) της συνολικής διακύμανσης σώματος. Στα θηλυκά άτομα, ο κατά μήκος της CV1 διαχωρισμός των ομάδων αφορούσε στη διαφοροποίηση του πληθυσμού με τρία και πέντε «επιτιθέμενα» άτομα από εκείνον με ένα «επιτιθέμενο» άτομο 33

(Εικόνα 9). Στα αρσενικά άτομα, ο κατά μήκος της CV1 διαχωρισμός των ομάδων αφορούσε στα άτομα με ένα «επιτιθέμενο» άτομο από αυτά με τρία. Τα διαγράμματα συνιστωσών δυνάμεων της πρώτης και τρίτης επανάληψης δείχνουν ότι η προκαλούμενη από το διαφορετικό αριθμό των «επιτιθέμενων» ατόμων διαφοροποίηση του σχήματος κατά μήκος της CV1, διαχωρίζει τους πληθυσμούς των θηλυκών με τρία και πέντε «επιτιθέμενων» ατόμων από τους πληθυσμούς με ένα «επιτιθέμενο» άτομο. Ο διαχωρισμός γίνεται ως προς τα εξής χαρακτηριστικά: Πρόσθια μετατόπιση της πρόσθιας βάσης κοιλιακού πτερυγίου (πρώτη, τρίτη επανάληψη), Οπίσθια και ραχιαία μετατόπιση της βάσης του βραγχιακού επικαλύμματος (πρώτη επανάληψη), κοιλιακή μετατόπιση της βάσης του βραγχιακού επικαλύμματος (τρίτη επανάληψη) (Εικόνα 10, 11). Τα διαγράμματα συνιστωσών δυνάμεων της πρώτης και τρίτης επανάληψης για τα αρσενικά δείχνουν ότι η προκαλούμενη από το διαφορετικό αριθμό των «επιτιθέμενων» ατόμων διαφοροποίηση του σχήματος κατά μήκος της CV1, διαχωρίζει τους πληθυσμούς στην πρώτη επανάληψη με ένα «επιτιθέμενο» άτομο από τις υπόλοιπες συνθήκες και στην τρίτη επανάληψη διαχωρίζει τα άτομα του πληθυσμού με ένα από αυτά με τρία «επιτιθέμενα» άτομα. Ο διαχωρισμός γίνεται ως προς τα εξής χαρακτηριστικά: Οπίσθια μετατόπιση της πρόσθιας βάσης του κοιλιακού πτερυγίου (πρώτη επανάληψη), πρόσθια μετατόπιση της πρόσθιας βάσης του κοιλιακού πτερυγίου (τρίτη επανάληψη) (Εικόνα 10, 11). 34

Εικόνα 8: Διασπορά των διαφορετικών συνθηκών (0, 1, 3, 5 «επιτιθέμενα» άτομα), της 1 ης επανάληψης, κατά μήκος των κανονικών μεταβλητών (CV1, CV2, CV3) για τα θηλυκά (F) και αρσενικά (M) «αμυνόμενα» άτομα. Δίνεται η μέση τιμή (+ 2SE). Εντός παρενθέσεως δίνεται το ποσοστό της συνολικής διακύμανσης που εκφράζει η κάθε συνιστώσα. 35

Εικόνα 9: Διασπορά των διαφορετικών συνθηκών (0, 1, 3, 5 «επιτιθέμενα» άτομα), της 3 ης επανάληψης, κατά μήκος των κανονικών μεταβλητών (CV1, CV2, CV3) για τα θηλυκά (F) και αρσενικά (M) «αμυνόμενα» άτομα. Δίνεται η μέση τιμή (+ 2SE). Εντός παρενθέσεως δίνεται το ποσοστό της συνολικής διακύμανσης που εκφράζει η κάθε συνιστώσα. 36

Εικόνα 10: Διαγράμματα συνιστωσών δυνάμεων που δείχνουν τις αλλαγές στο σχήμα του σώματος στις ακραίες τιμές (-, +, Χ3) για τις κανονικές μεταβλητές (CV1, CV2, CV3), στις διαφορετικές πληθυσμιακές συνθήκες για τα θηλυκά και αρσενικά άτομα, της πρώτης επανάληψης. 37

Εικόνα 11: Διαγράμματα συνιστωσών δυνάμεων που δείχνουν τις αλλαγές στο σχήμα του σώματος στις ακραίες τιμές (-, +, Χ3) για τις κανονικές μεταβλητές (CV1, CV2, CV3), στις διαφορετικές πληθυσμιακές συνθήκες για τα θηλυκά και αρσενικά άτομα, της τρίτης επανάληψης. 38

4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 39

4.1 Επιθετικότητα Από τα αποτελέσματα φαίνεται ότι δεν υπάρχει πλήρης επαναληψιμότητα μεταξύ των τριών πειραματικών επαναλήψεων. Ωστόσο, μέχρι την οντογενετική περίοδο των 9,5-12,5 mm FL, στις πρώτες δύο πειραματικές επαναλήψεις παρατηρήθηκε ένα πρότυπο σύμφωνα με το οποίο οι επιθέσεις των τριών και πέντε «επιτιθέμενων» ατόμων κατά των «αμυνόμενων» είναι περισσότερες από ό,τι οι επιθέσεις του ενός «επιτιθέμενου» ατόμου. Αξιοσημείωτο επίσης είναι ότι μέχρι τα 9,5-12,5 mm FL η διακύμανση του μέσου αριθμού επιθέσεων εμφανίζεται μικρή, ενώ μετά τα 12,5-18,5 mm FL γίνεται μεγάλη. Τέλος, χαρακτηριστικό επίσης είναι το ότι στο εύρος μήκους από 12,5-18,5 mm ο αριθμός των επιθέσεων αυξάνει. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι υπάρχουν οντογενετικές αλλαγές της απόκρισης στον εξεταζόμενο παράγοντα. Η επιθετικότητα φαίνεται ότι ασκείται από τα «επιτιθέμενα» άτομα στην κλάση 9,5-12,5 mm ή/και ότι απλά γίνεται δεκτική από τα «αμυνόμενα» άτομα σε αυτήν την οντογενετική περίοδο. Οι Marks et al. (2005) έδειξαν ότι η επιθετικότητα του zebrafish αυξάνεται όταν τα άτομα μεταφερθούν σε περιβάλλον ίδιο με αυτό που αναπτύχθηκαν. Επίσης παρατηρείται αύξηση της επιθετικότητας αν τα άτομα έχουν εγκλιματιστεί στο περιβάλλον που τους περιμένει. Οι Hatziathanasiou et al. (2002) έδειξαν ότι στο λαβράκι (Dicentrarchus labrax) η επιθετικότητα στις νύμφες εμφανίζεται μειωμένη, ενώ κατά το στάδιο της μεταμόρφωσης αρχίζει να αυξάνεται και οδηγεί σε κανιβαλισμό. Στη συναγρίδα (Dentex dentex), η επιθετικότητα φαίνεται να εμφανίζεται κατά την έναρξη της μεταμόρφωσης και μπορεί να εξελιχθεί σε κανιβαλισμό. Αυτή η αύξηση της επιθετικότητας δείχνει τη διαφοροποίηση των διατροφικών συνηθειών (Koumoundouros 1998). Σε είδη όπως το μυτάκι (Diplodus puntazzo), η ανάπτυξη επιθετικότητας συμπίπτει με την αλλαγή του τρόπου διαβίωσης (Χριστοδουλοπούλου 2009). Σύμφωνα με τον Jones (1987), στο είδος Pomacentrus amboinensis αναπτύσσονται εντονότερες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ενηλικών και των ιχθυδίων, από ό,τι μεταξύ ενηλίκων και ιχθυονυμφών. 40

Τα παραπάνω ενισχύουν τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας, υποδεικνύοντας παράλληλα την ανάγκη επανάληψης των πειραμάτων στην οντογενετική περίοδο των 9,5-12,5 mm FL με περισσότερες πειραματικές επαναλήψεις. 4.2 Αύξηση σωματικού μέγεθος και αναλογία φύλου Όπως και στην περίπτωση της συμπεριφοράς, έτσι και στην περίπτωση της αύξησης του σωματικού μεγέθους τα αποτελέσματα της τρίτης πειραματικής επανάληψης διέφεραν από τις άλλες δύο. Από τα αποτελέσματα της πρώτης και δεύτερης επανάληψης δείχθηκε ότι οι ακραίες πυκνότητες των «επιτιθέμενων» ατόμων επηρέασαν αρνητικά το ρυθμό αύξησης των «αμυνόμενων» ατόμων. Μια πιθανή αιτία είναι ότι τα «επιτιθέμενα» άτομα είχαν μεγαλύτερη ικανότητα στη σύλληψη της τροφής από τα «αμυνόμενα». Στο χρυσόψαρο (Carassius carassius), τα άτομα του πληθυσμού που είχαν έναν «ανταγωνιστή» του ίδιου είδους παρουσίαζαν μεγαλύτερο βάρος από αυτά που είχαν πέντε «ανταγωνιστές», γιατί οι «ανταγωνιστές» φάνηκε να είναι πιο ικανοί στη διεκδίκηση της τροφής από τα υπόλοιπα άτομα του πληθυσμού (Paszkowski et al. 1990). Επιπρόσθετα, ο μικρός ρυθμός αύξησης στον πληθυσμό με περισσότερα «επιτιθέμενα» άτομα (παρούσα εργασία) θα μπορούσε να αποδοθεί στη μικρότερη, κατά άτομο, διαθεσιμότητα τροφής. Στο Savelinus alpinus βρέθηκε να υπάρχει αρνητική σχέση ανάμεσα στο ρυθμό αύξησης και την πληθυσμιακή πυκνότητα (Jobling and Reinsnes 1986). Εναλλακτικά ή συμπληρωματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας ως προς το ρυθμό σωματικής αύξησης θα μπορούσαν να αποδοθούν στην αύξηση των επιπέδων κορτιζόλης των «αμυνόμενων» ατόμων λόγω του στρες που προκαλείται από την πίεση που δέχονται από τα «επιτιθέμενα» άτομα. Η κορτιζόλη που απελευθερώνεται κατά την έκθεση του οργανισμού (ιριδίζουσα πέστροφα) σε ένα στρεσσογόνο παράγοντα για μεγάλο χρονικό διάστημα, φαίνεται να επιδρά αρνητικά στο ρυθμό αύξησης (Pickering 1992, Van Weerd and Komen 1998). Στο zebrafish έχει βρεθεί ότι σε μεγάλες πυκνότητες πληθυσμού, τα επίπεδα στρες αυξάνουν (Ramsay et al. 2006). 41

Σε ιεραρχημένες κοινωνίες τα κυρίαρχα άτομα μεγαλώνουν καλύτερα από τα υποτελή ακόμα και αν έχουν την ίδια πρόσβαση στην τροφή. Αυτό σχετίζεται με το υψηλό ενεργειακό κόστος των υποτελών ατόμων (Abbott and Dill 1989, αναφορά από Pottinger 2006). Όσον αφορά στην αναλογία φύλου, έχει βρεθεί ότι σε πολλά είδη γονοχωριστικών ψαριών αυτή επηρεάζεται από περιβαλλοντικές συνθήκες όπως η θερμοκρασία του νερού (Pavlidis et al. 2000, Koumoundouros et al. 2002), πυκνότητα (Hattori 1991), το ph (Rubin 1985, Romer and Beisenherz 1996). Σε μερικά μάλιστα ερμαφρόδιτα είδη, έχει δειχτεί ότι η πυκνότητα και η κοινωνική οργάνωση της ομάδας ελέγχουν τον φυλοκαθορισμό των υπολοίπων. Για παράδειγμα στο Thalassoma bifasciatum η απομάκρυνση των αρσενικών ατόμων από την ομάδα δίνει τη δυνατότητα στα πιο μεγάλα θηλυκά να αναστρέψουν το φύλο τους σε αρσενικά (Warner and Swearer 1991). Επιπλέον, στο ίδιο είδος, τα ιχθύδια που έχουν αναπτυχθεί σε απομόνωση διαφοροποιούνται σε θηλυκά, ενώ αντίθετα όταν ένα άτομο αναπτύσσεται σε ομάδα διαφοροποιείται σε αρσενικό (Munday et al. 2006). Στο γένος Amphiprion (κυρίαρχο της ομάδας είναι το θηλυκό) αν το θηλυκό εξαφανιστεί από την ομάδα για οποιονδήποτε λόγο, τότε τη θέση του την παίρνει το αμέσως επόμενο μεγαλύτερο άτομο της ομάδας. Το άτομο αυτό διατηρεί τη θέση του με την εκδήλωση επιθετικής συμπεριφοράς (Fricke and Fricke 1977). Σύμφωνα με τα παραπάνω το zebrafish ως γονοχωριστικό είδος με ερμαφροδιτισμό ιχθυδίου και με τη διαφοροποίηση του φύλου να συμβαίνει από τις 20-30 dpf στους 28 o C (Takahashi 1977) θα μπορούσε να επηρεάζεται από περιβαλλοντικούς και κοινωνικούς παράγοντες. Στην παρούσα εργασία, ελέγχθηκε η υπόθεση της εξάρτησης του φυλοκαθορισμού ενός γονοχωριστικού είδους (zebrafish) από κοινωνικούς παράγοντες, αλλά τα αποτελέσματα την απέρριψαν. 4.3 Σχήμα σώματος Η επίδραση των βιοτικών και αβιοτικών παραγόντων των πρώιμων οντογενετικών σταδίων στο σχήμα σώματος των ενήλικων ψαριών δεν έχει 42