ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΚΑΙ ΓΕΩΛΟΓΙΚΗ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΙΖΗΜΑΤΩΝ ΣΕ ΔΕΚΑ ΠΑΡΑΛΙΕΣ ΤΟΥ ΝΟΜΟΥ ΑΧΑΙΑΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΘΑΛΑΣΣΙΑΣ ΓΕΩΛΟΓΙΑΣ & ΦΥΣΙΚΗΣ ΩΚΕΑΝΟΓΡΑΦΙΑΣ Πτυχιακή Εργασία ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΚΑΙ ΓΕΩΛΟΓΙΚΗ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΙΖΗΜΑΤΩΝ ΣΕ ΔΕΚΑ ΠΑΡΑΛΙΕΣ ΤΟΥ ΝΟΜΟΥ ΑΧΑΙΑΣ ΑΘΑΝΑΣΟΠΟΥΛΟΥ Ι. ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ Επιβλέποντες καθηγητές: Βανταράκης Απόστολος Παπαθεοδώρου Γεώργιος Πάτρα, Ιούνιος 2012

Περιεχόμενα Περιεχόμενα................................................................... 2 Σκοπός της εργασίας........................................................... 5 Περίληψη...................................................................... 5 Ευχαριστίες.................................................................... 6 1. Εισαγωγή................................................................... 7 1.1 Οι μικροοργανισμοί στον ανθρώπινο οργανισμό.................................. 7 1.1.1 Βακτήρια.................................................................. 10 1.1.1.1 Χαρακτηριστικά βακτηρίων............................................ 10 1.1.1.1.1 Ονοματολογία βακτηρίων........................................... 11 1.1.1.1.2 Μορφολογία βακτηρίων............................................ 11 1.1.1.1.3 Μέγεθος βακτηρίων................................................. 12 1.1.1.1.4 Διατροφή βακτηριδίων.............................................. 12 1.1.1.1.5 Φυσικοί παράγοντες................................................. 12 1.1.1.1.6 Ανάπτυξη βακτηρίων................................................ 13 1.1.1.2 Είδη βακτηρίων.......................................................... 13 1.1.1.2.1 Ολικά κολοβακτηριοειδή............................................. 13 1.1.1.2.2 Κοπρανώδεις στρεπτόκοκκοι (εντερόκοκκοι)........................ 14 1.1.1.2.3 Escherichia coli (E.Coli).............................................. 15 1.1.1.2.4 Pseudomonas........................................................ 16 1.2 Στοιχεία Γεωλογίας................................................................. 17 1.2.1 Κοκκομετρικό μέγεθος - Κοκκομετρική ανάλυση.............................. 17 1.2.2 Στατιστικές παράμετροι...................................................... 18 1.2.3 Σφαιρικότητα Στρογγύλωση................................................ 19 1.2.4 Τα συμπτώματα μιας «μολυσμένης» παραλίας................................ 23 2. Υλικά και Μέθοδοι.................................................................... 25 2

2.1 Υλικά.............................................................................. 25 2.1.1 Υλικά δειγματοληψίας......................................................... 25 2.1.2 Υλικά μικροβιολογικών αναλύσεων............................................ 25 2.2 Όργανα.......................................................................... 25 2.2.1 Όργανα δειγματοληψίας..................................................... 25 2.2.2 Όργανα μικροβιολογικών αναλύσεων........................................ 25 2.2.3 Όργανα γεωλογικών αναλύσεων............................................. 27 2.3 Παρασκευή θρεπτικών υποστρωμάτων......................................... 28 2.4 Μεθοδολογία.................................................................... 30 2.4.1 Μέθοδος δειγματοληψίας..................................................... 30 2.4.1.1 Περιοχή μελέτης (διαδρομή σημεία δειγματοληψίας)...................... 32 2.4.2 Μέθοδος μικροβιολογικών αναλύσεων........................................ 32 2.4.2.1 Ασηπτικές συνθήκες τεχνική.............................................. 32 2.4.2.2 Αποστείρωση.............................................................. 38 2.4.2.3 Διαδικασία εργαστηριακών μικροβιολογικών αναλύσεων των δειγμάτων.. 40 2.4.2.4 Μικροβιολογικές καλλιέργειες μεθοδολογία............................... 40 2.4.2.5 Μέθοδος ηθομεμβράνης (διήθηση).......................................... 41 2.4.2.6 Μέθοδος διαδοχικών αραιώσεων........................................... 41 2.4.2.7 Ανάπτυξη αποικιών στο θρεπτικό υπόστρωμα............................... 42 2.4.2.7.1 Ολικά κολοβακτηριοειδή................................................ 42 2.4.2.7.1.1 Kovac s test indole (τεστ ινδόλης).................................... 42 2.4.2.7.2 E.coli.................................................................... 43 2.4.2.7.2.1 Test Oxidase (τεστ οξειδασης)........................................ 43 2.4.2.7.3 Εντερόκοκκοι faecalis.................................................... 44 2.4.2.7.3.1 Test esculine (τεστ αισκουλίνης)..................................... 44 2.4.2.8 Απομόνωση μικροοργανισμού από μεικτό πληθυσμό....................... 44 2.4.3 Μέθοδος κοκκομετρικών αναλύσεων........................................... 45 3

2.4.3.1 Υπολογισμός κοκκομετρικού μεγέθους..................................... 45 2.4.3.2 Υπολογισμός κοκκομετρικών στατιστικών παραμέτρων.................... 47 2.4.3.3 Υπολογισμός της σφαιρικότητας και της στρογγύλωσης των κόκκων με τη χρήση στερεοσκοπίου...................................................... 47 3. Αποτελέσματα........................................................................ 49 4 Συζήτηση.............................................................................. 58 Παράρτημα.............................................................................. 60 Βιβλιογραφία........................................................................... 101 4

Σκοπός της εργασίας Η εργασία αυτή έγινε με σκοπό την εκτίμηση της υγειονομικής ποιότητας δέκα παραλιών, που βρίσκονται στο νομό Αχαΐας. Πιο συγκεκριμένα, η συστηματική καταγραφή διαφόρων περιβαλλοντικών παραμέτρων που χαρακτηρίζουν την ποιότητα των ιζημάτων (μικροβιολογικό φορτίο, λιθολογικά και γεωφυσικά χαρακτηριστικά), αποσκοπεί στην απόδοση μια σαφούς εικόνας της περιβαλλοντικής κατάστασης των παραλιών, καθώς και στην δημιουργία μιας χρήσιμης τράπεζας δεδομένων, για τη σχεδίαση μελλοντικών ερευνητικών εργασιών και περιβαλλοντικών παρεμβάσεων. Περίληψη Στόχος της εργασίας αυτής είναι η καταγραφή και αξιολόγηση της ποιότητας δέκα παραλιών του νομού Αχαΐας, καθώς και η σύγκριση των μικροβιολογικών και γεωλογικών στοιχείων που διεξάγονται μέσω μηνιαίων επαναλαμβανόμενων δειγματοληψιών και αναλύσεων. Εβδομήντα δείγματα άμμου συλλέχθηκαν μηνιαία, σε χρονικό διάστημα επτά μηνών και ακολούθησαν αναλύσεις όσον αφορά τα εξής βακτήρια: ολικά κολοβακτηριοειδή, e.coli και εντερόκοκκους. Παράλληλα πραγματοποιήθηκαν γεωλογικές αναλύσεις των δειγμάτων, όσον αφορά το μέγεθος των κόκκων, την σφαιρικότητα, την στρογγύλωση καθώς και τον υπολογισμό των στατιστικών τους παραμέτρων. Ευχαριστίες Κατ αρχήν θα ήθελα να ευχαριστήσω τους επιβλέποντες καθηγητές της πτυχιακής μου κ. Απόστολο Βανταράκη και κ. Γεώργιο Παπαθεοδώρου, για την καθοδήγηση τους και τη βοήθεια τους σε κάθε φάση της δημιουργίας της. Επίσης τα υπόλοιπα μέλη των εργαστηρίων Υγιεινής του τμήματος Ιατρικής και Θαλάσσιας Γεωλογίας και Φυσικής Ωκεανογραφίας του τμήματος Γεωλογίας, ιδιαίτερα δε τη Μαρία Σμαϊλή και τον Μιχάλη Πρεβενιό, η συνεισφορά των οποίων ήταν ιδιαίτερα σημαντική για την επιτυχή ολοκλήρωση της εργασίας αυτής. Τέλος, θέλω να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στην οικογένεια μου για την διαρκή τους υποστήριξη, που επέτρεψε την επιτυχή διεκπεραίωση των σπουδών μου. Αθανασοπούλου Ι. Κωνσταντίνα, Πάτρα, Ιούνιος 2012 5

Εισαγωγή Κεφάλαιο 1 1.1 Οι μικροοργανισμοί στον ανθρώπινο οργανισμό Ως μικροοργανισμοί ή μικρόβια νοούνται εκείνοι οι οργανισμοί από τους οποίους οι περισσότεροι είναι μονοκύτταροι, μικροσκοπικού μεγέθους, μη ορατοί με γυμνό οφθαλμό παρά μόνον με μικροσκόπιο. (Αντωνιάδης, 2000) Οι μικροοργανισμοί έχουν μια ιστορία 3,5-4 δισεκατομμυρίων ετών, με βαθμιαία εξέλιξη, και φαίνεται ότι ήταν η πρώτη μορφή ζωής του πλανήτη. Εκτιμάται ότι η ολική βιομάζα των μικροοργανισμών πάνω στη γη είναι περίπου 25 φορές μεγαλύτερη από την ολική βιομάζα των ζώων. Πάνω στους ζωικούς ιστούς μικροβίων (το ανθρώπινο σώμα περιέχει 10 τρισεκατομμύρια κύτταρα και 100 τρισεκατομύρια μικροοργανισμούς). Αν και παρατηρήθηκαν μικροσκοπικά για πρώτη φορά εδώ και 350 χρόνια, μόλις τα τελευταία 100 χρόνια έχει αναγνωριστεί η αξία της ύπαρξης τους. (Κολιάης, 2001) Συμβατικά οι μικροοργανισμοί διαιρούνται σε: μύκητες μικροφύκη πρωτόζωα βακτήρια ιοί Όπως ειπώθηκε ήδη, ο κόσμος μας είναι γεμάτος μικροοργανισμούς και το ανθρώπινο σώμα (τόσο στο εξωτερικό όσο και στο εσωτερικό) συνυπάρχει με πλήθος μικροοργανισμών οι οποίοι αποτελούν τη φυσική μικροχλωρίδα του, από τη στιγμή της γέννησης του, όσο μέχρι τη στιγμή του θανάτου. (Prescott et al, 1999) Αν και η φυσική μικροχλωρίδα δεν είναι επιβλαβής για τον άνθρωπο και στις περισσότερες περιπτώσεις τον ωφελεί, κάτω από ορισμένες συνθήκες δημιουργούνται μολύνσεις και το ανθρώπινο σώμα ασθενεί. (Oliveira et al, 2008) Η διαφοροποίηση ανάμεσα σε έναν υγειή και έναν ασθενή οργανισμό εξαρτάται από την ισορροπία ανάμεσα στη φυσική άμυνα του σώματος και τη δράση του μικροοργανισμού που προκαλεί την ασθένεια. (Καραγκούνη, 1999) 6

Η Μικροβιολογία αποτελεί έναν επιμέρους κλάδο της επιστήμης της Βιολογίας και μία από τις αναγνωρισμένες ειδικότητες της Ιατρικής, που ασχολείται με τη μελέτη των μικροοργανισμών. Θεμελιώθηκε ως επιστήμη το 19 ο αιώνα από το Louis Pasteur και Robert Koch οι οποίοι εισήγαγαν στη μελέτη των μικροοργανισμών την επιστημονική μεθοδολογία και τον πειραματισμό. Οι εργασίες των δυο αυτών μεγάλων επιστημόνων και άλλων, ανέδειξαν τη σημασία των μικροοργανισμών για την υγεία του ανθρώπου και των ζώων, τη διατήρηση της ισορροπίας των οικοσυστημάτων, την ποιότητα του περιβάλλοντος και τη γεωργία. (Αγγελής, 2007) Εικόνα 1.1: Ο Luis Pasteur (1822-1895), γνωστός ως «Πατέρας της Μικροβιολογίας», ήταν Γάλλος χημικός ο οποίος γοητεύτηκε από τον τομέα της Ιατρικής Μικροβιολογίας. Θεωρείται ο άνθρωπος που κατέστρεψε το δόγμα της αυτόματης γένεσης. Επιπλέον, μελέτησε την αλκοολική ζύμωση, καθώς έλυσε και πολλά προβλήματα στη βιομηχανία όσον αφορά την παραγωγή και αλλοίωση των τροφίμων. Πηγή: πίνακας ζωγραφικής του A.Edelfeld, 1885 Σύμφωνα με την αρχιτεκτονική τους δομή, οι μικροοργανισμοί διακρίνονται και κατατάσσονται σε δυο βασικούς τύπους κυττάρων: προκαρυωτικοί (αρχαία, βακτήρια), οι οποίοι δεν έχουν διαφοροποιημένο πυρήνα. ευκαρυωτικοί (μύκητες, φύκη, πρωτόζωα), οι οποίοι έχουν διαφοροποιημένους πυρήνες με πυρηνικές μεμβράνες. (Fuhrman, 1999) Σε κανέναν από τους δύο τύπους δε μπορούμε να κατατάξουμε τους ιούς εφόσον δε διαθέτουν κυτταρική οργάνωση. Επιπλέον, δε θεωρούνται ζώντες οργανισμοί, αφού δεν είναι ικανά να αυτοδιπλασιάζονται, να αυτοεπιδιορθώνονται ή να διατηρούνται σε κατάσταση ελάχιστης εντροπίας, ενώ πολλαπλασιάζονται ζώντας παρασιτικά μέσα σε κύτταρα-ξενιστές. (Τζάμος, 2007) Είναι γνωστό, ότι ως απόλυτη πηγή ενέργειας για την ύπαρξη ζωής στη γη, θεωρείται ο ήλιος. Τα φυτά και οι φωτοαυτότροφοι οργανισμοί, διοχετεύουν ενέργεια από την ηλιακή ακτινοβολία σε ανθρακικές ενώσεις, που προέρχονται κυρίως από CO 2. Στα φυσικά οικοσυστήματα, η μικροχλωρίδα του εδάφους αποκτά ενέργεια από νεκρές οργανικές ύλες, η οποία προέρχεται από υπολείμματα φυτών ή από συνεισφορά της βιομάζας του εδάφους (ρίζες, ζώα, μικροοργανισμοί) καθ όλη τη διάρκεια της σεζόν. (Buscot, 2005) 7

Οι μύκητες είναι μικρόβια με δομή ευκαρυωτικού κυττάρου και ανάλογη με αυτή των ανώτερων φυτών ή ζώων. Από 100.000 περίπου είδη, τα 100 περίπου είναι παθογόνα για τον άνθρωπο και τα ζώα. Από αυτά, τα συχνότερα είναι αυτά που ανήκουν στο γένος Candida. (Χριστιάς, 1999) Τα φύκη (algae) είναι ευκαρυωτικοί, μονοκύτταροι ή πολυκύτταροι μικροοργανισμοί ικανοί να φωτοσυνθέτουν. Παλαιότερα τα κυανοβακτήρια θεωρούνταν φύκη (blue-green algae), προφανώς εσφαλμένα, δεδομένου ότι είναι προκαρυωτικοί μικροοργανισμοί. Επίσης τα καφέ και κόκκινα φύκη σήμερα θεωρούνται φυτά, επειδή διαθέτουν διαφοροποιημένους ιστούς. (Αγγελής, 2007) Εικόνα 1.2: Διαφορετικά είδη φυκιών Πολλά κυανοβακτήρια, παράγουν τοξίνες. Τα πλέον γνωστά είδη είναι τα Microcystis και Anabaena. Τοξίνες παράγονται από πολλά αλλά όχι όλα τα είδη των κυανοβατηρίων. Οι τοξίνες που παράγονται από το Anabaena είναι γενικά νευροτοξίνες (επηρεάζουν το νευρικό σύστημα) ενώ αυτές που παράγονται από το Mycrocystis είναι ηπατοτοξίνες (επηρεάζουν το συκώτι). Άλλα είδη τοξικών κυανοβακτηρίων δεν είναι τόσο συνήθη. Τοξικά κυανοβακτήρια έχουν αναφερθεί από περιοχές των Η.Π.Α., Καναδά, Αυστραλία, Νέα Ζηλανδία, Ιαπωνία, Κίνα, Νότιο Αφρική και Ευρώπη. (Madigan, 2008) Οι περισσότερες αναφορές δηλητηριάσεων από τοξίνες κυανοβακτηρίων διεθνώς αφορούν κατοικίδια ή εκτρεφόμενα ζώα και υδρόβια πουλιά. Οι λίγες αναφορές που αφορούν ανθρώπους αναφέρονται κυρίως σε μεμονωμένα άτομα ή μικρές ομάδες που ήπιαν νερό που καλυπτόταν από παχύ στρώμα φυκιών. (Αγγελής, 2007) 8

1.1.1 Βακτήρια 1.1.1.1 Χαρακτηριστικά Βακτηρίων Τα βακτήρια είναι μικροσκοπικοί, μονοκύτταροι (1) (σπάνια πολυκύτταροι), προκαρυωτικοί (2) οργανισμοί, που συναντούνται σε κάθε είδους βιότοπο και σε πολύ μεγάλους αριθμούς, πχ εκατομμύρια σε μια σταγόνα σάλιου. Μερικά εξ αυτών είναι αυτότροφα (3) και περιέχουν βακτηριοχλωροφύλλες και βακτηριοβιριδίνη εκτελώντας αναεροβική φωτοσύνθεση. Τη μορφή και τη δράση των βακτηρίων μελετά η Βακτηριολογία. Το όνομα «βακτήρια» (λιγότερο ορθά «βακτηρίδια») προέρχεται από την ελληνική λέξη «βακτηρία» (κοινώς «μπαστούνι»), λόγω του σχήματος που είχαν οι πρώτον παρατηρηθέντες μικροοργανισμοί. (Καραγκούνη, 1999) Εικόνα 1.3: Το βακτήριο pseudomonas aeruginosa (1) Ως κύτταρο νοείται το μικρότερο δομικό συστατικό της έμβιας ύλης, που αποτελείται από μια ομάδα μορίων, που βρίσκονται σε δυναμική αλληλεπίδραση μεταξύ τους. Το κύτταρο διαθέτει μορφολογική, φυσική και χημική οργάνωση και την ικανότητα αφομοίωσης, της ανάπτυξης και της αναπαραγωγής. Οι οργανισμοί αποτελούνται από κύτταρα, ένα ή περισσότερα, και μπορεί να είναι: 1. μονοκύτταροι, δηλαδή αποτελούνται από ένα μικροσκοπικό κύτταρο και είναι ορατοί μόνο με μικροσκόπιο, πχ αμοιβάδα 2. πολυκύτταροι, δηλαδή αποτελούνται από πολλά μικροσκοπικά κύτταρα, πχ φυτά, ζώα (Μπαλής, 1983) ΕΕικόνα 1.4: δομή προκαρυωτικού κυττάρου (2) Στη μικροβιολογία με τον όρο προκαρυωτικά κύτταρα (ή προκαρυώτες) χαρακτηρίζονται τα κύτταρα εκείνα που παρουσιάζουν απλούστερη δομή από αυτή των ευκαρυωτικών και μέγεθος μικρότερο. Εξωτερικά τα προκαρυωτικά κύτταρα διαχωρίζονται από το περιβάλλον με την κυτταρική μεμβράνη, πλην όμως εσωτερικά δεν έχουν οποιοδήποτε άλλο μεμβρανικό σχηματισμό, όπως πχ κυτταρικό πυρήνα. Αντ αυτού το γενετικό τους υλικό που είναι σχεδόν πάντα ένα δίκλωνο κυκλικό μόριο DNA, βρίσκεται σε μια περιοχή του κυττάρου που λέγεται πυρηνοειδές. Επίσης θεωρείται ότι, λόγω της απλότητας της δομής τους, τα προκαρυωτικά κύτταρα εμφανίστηκαν πριν από τα ευκαρυωτικά και ως επί το πλείστον οι προκαρυωτικοί οργανισμοί είναι μονοκύτταροι και ανήκουν στα Βακτήρια και στα Αρχαία. (Madigan, 2008) (3) Ως αυτότροφος ονομάζεται ο οργανισμός εκείνος που μπορεί ο ίδιος να κατασκευάσει τις οργανικές ουσίες εκείνες τις οποίες χρειάζεται για να τραφεί, χρησιμοποιώντας ανόργανα υλικά και ανεξάρτητα από τυχόν άλλες πηγές οργανικών υποστρωμάτων. (Κολιάης, 2001) 9

1.1.1.1.1 Ονοματολογία Βακτηρίων Η ονοματολογία των βακτηρίων, στηρίζεται στο διωνυμικό σύστημα του Λινναίου. Στο όνομα μικροβίου αναφέρεται πρώτα το γένος και στη συνέχεια το είδος. Οι ταξινομικές βαθμίδες, είναι: 1. Στέλεχος (strain): αναφέρεται σε καθαρό καλλιέργημα, προέρχεται από μία μόνο αποικία του μικροβίου. 2. Είδος (species): αναφέρεται σε σύνολο στελεχών με μεγάλο βαθμό ομοιότητας φαινοτυπικών χαρακτήρων 3. Γένος (genus): περιλαμβάνει συγγενή από απόψεως χαρακτήρα είδη. 4. Οικογένεια (family): αποτελείται από ένα ή περισσότερα γένη. 5. Τάξη (order): αποτελείται από μια ή περισσότερες οικογένειες. 6. Ομάδα (group): για βακτήρια που δεν έχουν οριστικά ταξινομηθεί. 7. Ποικιλία: όταν σε ορισμένο είδος παρουσιάζονται μεταβολές που αφορούν αρκετά στελέχη. (Αντωνιάδης, 2000) 1.1.1.1.2 Μορφολογία Βακτηρίων Όσον αφορά τη μορφή, τα βακτήρια έχουν διάφορα σχήματα, όπως: Σφαιρικό (κόκκοι - cocci) Ραβδοειδές (rods) Σπειροειδές (spirilla) Πολυμορφικό (ακαθόριστης μορφής - pleomorphic) (Αγγελής, 2007) Όνομα Βασικό σχήμα Παράδειγμα Κόκκοι (σφαιρικά) Βάκιλοι (επιμήκη) Σπειρίλια 10

1.1.1.1.3 Μέγεθος Βακτηρίων Όσον αφορά το μέγεθος, οι διαστάσεις των βακτηρίων μετριούνται σε μικρόμετρα (μm). Πρόκειται για τους μικρότερους μονοκύτταρους οργανισμούς μεταξύ των έμβιων όντων της φύσης, μετά από τους ιούς και τις συγγενικές ρικέτσιες. Απαντώνται σε οποιοδήποτε περιβάλλον από τους πάγους των πολικών περιοχών μέχρι τις ερήμους των τροπικών περιοχών και από τις κορυφές των υψηλότερων βουνών μέχρι τα βάθη των ωκεανών. Εντοπίζονται πάνω στα σώματα ζώων και φυτών καθώς και στο έδαφος. (Αντωνιάδης, 2000) Μικρόβιο Μέγεθος Είδος κυττάρου Ιοί 0,01-0,25μm Ακυτταρικοί Βακτήρια 0,1-10μm Προκαρυωτικά Μύκητες 2μm- >1m Ευκαρυωτικά Πρωτόζωα 2-1000μm Ευκαρυωτικά 1.1.1.1.4 Διατροφή Βακτηρίων Η διατροφή έχει σκοπό την παροχή απαραίτητων θρεπτικών ουσιών για την παραγωγή ενέργειας, καθώς και για τη σύνθεση κυτταρικών πολυμερών. Ανάλογα την πηγή Cκαι ενέργειας διαχωρίζονται σε: Αυτότροφα: για τη σύνθεση οργανικών ενώσεων χρησιμοποιείται CO 2 Ετερότροφα: ως πηγή C χρησιμοποιούνται οργανικές ενώσεις (Κολιάης, 2001) 1.1.1.1.5 Φυσικοί Παράγοντες 1. Ο 2 : η παρουσία του είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των αεροβίων μικροοργανισμών, ενώ η απουσία του επιβεβλημένη για την ανάπτυξη των αναερόβιων μικροοργανισμών. Ανάλογα τις απαιτήσεις σε Ο 2 για την επιβίωση-πολλαπλασιασμό τους, ταξινομούνται σε: Υποχρεωτικά Αερόβια: χρησιμοποιούν Ο 2 για την ανάπτυξη τους (π.χ. ψευδομονάδες) Δυνητικώς Αναερόβια: αναπτύσσονται με την παρουσία ή την απουσία Ο 2 (π.χ.εντεροβακτηριοειδή) Μικροαερόφιλα: αναπτύσσονται με την παρουσία μικρής συγκέντρωσης Ο 2 (π.χ.στρεπτόκοκκοι) 11

Υποχρεωτικά Αναερόβια: αναπτύσσονται με την απουσία Ο 2. Ανάλογα την αντοχή τους σε Ο 2 : Μέτρια ευαίσθητα σε Ο 2 : επιζούν εκτεθειμένα στον αέρα σε διάστημα από 90 min έως μερικές ημέρες. Εξαιρετικά ευαίσθητα σε Ο 2 : δεν επιζούν εκτεθειμένα στον αέρα για διάστημα μεγαλύτερο των 10 min. (Αντωνιάδης, 2000) 2. Θερμοκρασία ( ο C): η παράμετρος αυτή είναι καθοριστικής σημασίας για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Τα «όρια» - τιμές θερμοκρασίας για την ανάπτυξη τους, χωρίζουν τους μικροοργανισμούς σε: Μεσόφιλα: 10-45 ο C (π.χ. κολοβακτηρίδια, εντερόκοκκοι) Ψυχρόφιλα: (υποχρεωτικώς ψυχρόφιλα) <10 ο C Θερμόφιλα: (υποχρεωτικώς θερμόφιλα) 30 ο -40 ο C 3. ph: Τα παθογόνα βακτήρια αναπτύσσονται σε ουδέτερο ή ελαφρώς αλκαλικό ph (6,5-7,5). 4. Ωσμωτική P (Κολιάης, 2001) 1.1.1.1.6 Ανάπτυξη Βακτηρίων Η «ανάπτυξη των βακτηρίων» είναι ταυτόσημη με την «πληθυσμιακή αύξηση». Σε υγρό θρεπτικό υλικό: Η αρχική στάσιμη φάση αντικατοπτρίζει την προετοιμασία κυττάρου για πολλαπλασιασμό. Η log φάση ανάπτυξης χαρακτηρίζεται από πολλαπλασιασμό μικροβίων, καθόσον μετά από κάθε διαίρεση μικροβιακού κυττάρου, ο αριθμός μικροβίων στο καλλιέργημα διπλασιάζεται. Στη φάση αυτή ο t κυτταρικής διαίρεσης είναι σταθερός και ο αριθμός μικροβίων αυξάνει με γεωμετρική πρόοδο. dn/dt = k*n o όπου: dn η αλλαγή μικροβιακού πληθυσμού k η σταθερά ανάπτυξης Ν ο ο αριθμός μικροβίων (σε γνωστό dt) Ο ρυθμός ανάπτυξης εκφράζεται σε γενεές (διπλασιασμός μικροβίων ανά ώρα) και εξαρτάται από τη θερμοκρασία επώασης του καλλιεργήματος, το θρεπτικό υλικό καλλιέργειας και το μικροβιακό είδος. 12

Στη στάσιμη φάση ανάπτυξης παρατηρείται η ισορροπία του αριθμού ζώντων και νεκρών μικροβίων στο καλλιέργημα. Τέλος, η φάση απόκλισης αντιπροσωπεύεται από μεγαλύτερο αριθμό νεκρών παρά ζωντανών μικροβίων. Σε στερεό θρεπτικό υλικό: Ο πολλαπλασιασμός σε θρεπτικά υποστρώματα είναι περίπου ίδιος με τους μέχρι τώρα περιγραφέντες κανόνες. Οι αποικίες των βακτηρίων αναπτύσσονται μετά άλλοτε άλλο χρόνο, ενώ είναι γνωστό ότι τα ταχέως πολλαπλασιαζόμενα βακτήρια (κολοβακτήρια) αναπτύσσουν μεγάλες αποικίες σε 24 h, ενώ τα βραδέως πολλαπλασιαζόμενα αναπτύσσουν αποικίες μετά από 48 h. Ο σχηματισμός αποικιών εξαρτάται από το είδος, το θρεπτικό υπόστρωμα, τη θερμοκρασία, το ph, κ.α. (Αντωνιάδης, 2000) 1.1.1.2 Είδη Βακτηρίων 1.1.1.2.1 Coliform Bacteria (Ολικά κολοβακτηριοειδή) Τα κολοβακτηρίδια είναι ένας ευρέως χρησιμοποιούμενος βακτηριακός δείκτης της υγειονομικής ποιότητας των τροφίμων και του νερού. Πρόκειται για ραβδοειδούς σχήματος, αρνητικών κατά gram, μη σπορίων, σχηματιζόμενα βακτήρια, που μπορούν να προκαλούν ζύμωση της λακτόζης με την παραγωγή του οξέος και του φυσικού αερίου, όταν επωάζονται στους 35-37 ο C σε 24 έως 48h. Στην ομάδα αυτή συμπεριλαμβάνονται τα γένη (genera) Escherichia, Εικόνα 1.5: coliform bacteria Enterobacter, Citrobacter και Klebsiella. Αυτοί οι οργανισμοί είναι ευρέως διαδεδομένοι στη φύση και πολλοί ενδημούν στα έντερα των θηλαστικών, συμπεριλαμβανομένου του ανθρώπου. Σε ομαλές συνθήκες θεωρούνται μη παθογόνοι, και όλα εκτός από το Escherichia, μπορούν να επιβιώσουν σαν ελεύθερα σαπρόφυτα ή στην εντερική οδό. Τα κολοβακτηρίδια μπορούν να βρεθούν στο υδάτινο περιβάλλον, στο έδαφος και στη βλάστηση. Περιέχονται σε μεγάλες ποσότητες στα κόπρανα των θερμόαιμων ζώων. (Jill Bailey, 2004) 1.1.1.2.2 Κοπρανώδεις Στρεπτόκοκκοι (Εντερόκοκκοι) O Enterococcus faecalis είναι ένα θετικό κατά Gram σφαιρικό ή ωοειδές βακτήριο, μεγέθους <2μm, διατάσσονται κατά ζεύγη ή σχηματίζουν αλυσίδες. Οι αποικίες του είναι βλεννώδεις, χρώματος γκρι-λευκού. Είναι αναερόβιου τύπου και δεν αναπτύσσονται σε θερμοκρασίες 10οC και 45οC, σε ph 9,6. Αποικίζει στο γαστρεντερικό σύστημα του ανθρώπου και άλλων θηλαστικών. (Αντωνιάδης, 1999) 13

Η παρουσία τους στο νερό αποτελεί απόδειξη μόλυνσης του ύδατος µε περιττωματικές ουσίες. Όπως και άλλα είδη του γένους των Εντερόκοκκων, μπορεί να προκαλέσει επικίνδυνες για τη ζωή λοιμώξεις στον άνθρωπο, ιδιαίτερα στους νοσηλευόμενους ασθενείς (όπως μολύνσεις κύστεων, προστατικές μολύνσεις, επιδιδυμικές μολύνσεις και σπανιότερα μολύνσεις καρδιών και νευρικών συστημάτων), καθώς έχουν παρατηρηθεί σε αυτό ιδιαίτερα υψηλά ποσοστά ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά. Είναι προαιρετικά αναερόβιος μικροοργανισμός και μπορεί να προκαλέσει ενδοκαρδίτιδα, καθώς και λοιμώξεις της ουροδόχου κύστης, του προστάτη και της επιδιδυμίδας, όπως και σπανιότερα του νευρικού συστήματος. Αυτό το βακτήριο, ήταν παλαιότερα γνωστό ως Στρεπτόκοκκος faecalis. (Prescott et al, 1999, Καραγκούνη, 1999) Εικόνα 1.6: E. Faecalis Βασίλειο Phylum Κατηγορία Διαταγή Οικογένεια Γένος Είδη Βακτήρια Firmicutes Βάκιλοι Lactobacillales Enterococcaceae Εντερόκοκκος E. faecalis 1.1.1.2.3 Escherichia Coli (E.Coli) Η Escherichia Coli απομονώθηκε για πρώτη φορά από κόπρανα παιδιού το 1881, από το Γερμανό καθηγητή Eserich. Ανήκει στα κολοβακτηριοειδή, συνεπώς είναι μέλος της οικογένειας των εντεροβακτηριοειδών. (Καραγκούνη, 1999) Συγκεκριμένα, πρόκειται για ένα αρνητικό κατά gram, ραβδοειδούς σχήματος κολοβακτήριο (Enterobacteriaceae). Έχει πάχος 0,5μm, μήκος 1-5μm, και τα κύτταρα του μορφή κοκκώδη ή νηματοειδή. Πρόκειται για ένα περίτριχο κινητό μικρόβιο, που έχει όμως και ακίνητα στελέχη. (Αντωνιάδης, 1999) Εικόνα 1.7: E.Coli Η Escherichia Coli αποβάλλεται στο περιβάλλον μέσω των κοπράνων, σε πολύ μεγάλο αριθμό. Η απομόνωση της από δείγματα άμμου, αποδεικνύει πρόσμιξη της άμμου με περιττωματικές ουσίες, υποδηλώνοντας ότι και οποιοσδήποτε άλλος μικροοργανισμός που τυχόν βρίσκεται στο έντερο των ανθρώπων και των ζώων μπορεί να εισχωρήσει στην άμμο και κατ επέκταση και παθογόνοι μικροοργανισμοί. Αν και τα περισσότερα είδη E.coli είναι αβλαβή, ορισμένα μπορεί να προκαλέσουν διάρροια. Στην 14

περίπτωση που βρεθεί σε διπλανά όργανα, όπως η την ουροδόχο κύστη, μπορεί να προκαλέσει ουρολοίμωξη. Το χειρότερο είδος της E.coli μπορεί να προκαλέσει γαστρεντερίτιδα, αιμορραγική κολίτιδα, μετωπιαία κολπίτιδα, κ.α. Η πιθανότητα αυξάνεται σε άτομα μικρής ηλικίας ή αδύνατου ανοσοποιητικού συστήματος. Το μικρόβιο δεν αντέχει σε υψηλές θερμοκρασίες και πεθαίνει όταν ζεσταίνεται στου 70 ο C για αρκετό χρονικό διάστημα, ενώ μπορεί να επιβιώσει στο ψυγείο για αρκετές μέρες υπό κάποιες ορισμένες συνθήκες. (Prescott et al, 1999) Τα είδη της E.coli είναι συγκεκριμένα στο περιβάλλον το οποίο αναπτύσσονται, και μπορούν εύκολα να κατηγοριοποιηθούν στα εργαστήρια. Γι αυτό μπορούμε εύκολα να συμπεράνουμε εάν η μόλυνση προήλθε από ζώο, άνθρωπο ή πτηνό. (Καραγκούνη, 1999) «Έχουν βρεθεί δύο τύποι E.coli στην άμμο. αυτοί που πρόσφατα αποτέθηκαν και αυτοί που έχουν ξεκινήσει να αυξάνονται και να αναπαράγονται. Τα επίπεδα των δυο αυτών πηγών, ποικίλλουν ανάλογα με την εποχή. Πιο συγκεκριμένα, εκείνα που έχουν γίνει αυτόχθονα στην άμμο, τείνουν να είναι πιο άφθονα την καλοκαιρινή περίοδο, όπου τα θρεπτικά συστατικά είναι διαθέσιμα και οι θερμοκρασία ανεβαίνει. Επιπλέον, κατά τις περιόδους μετανάστευσης των πουλιών, παρατηρείται αύξηση εισφοράς των περιττωμάτων τους. Είναι σημαντικό, ότι πολύ λίγα E.coli που υπάρχουν στην παραλία είναι επιβλαβή για τον άνθρωπο, σε αντίθεση με άλλα μικρόβια που τείνουν να υπάρχουν στις ίδιες κατηγορίες αποβλήτων (όπως η σαλμονέλα), θα πρέπει να προκαλούν περισσότερη ανησυχία στους αρμόδιους φορείς υγείας.» (Thompson, 2007) 1.1.1.2.4 Pseudomonas Το Pseudomonas aeruginosa είναι μέλος της οικογένειας Pseudomonadaceae και είναι ένα αρνητικό κατά gram, ραβδοειδές, ελυτροφόρο, μονότριχο βακτήριο. Είναι κινητό με μια ή περισσότερες βλεφαρίδες στους πόλους. Συνήθως ευρίσκεται στα κόπρανα, το έδαφος, το νερό και τα απόβλητα αλλά δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν δείκτης κοπρανώδους μόλυνσης διότι δεν ανευρίσκεται αποκλειστικά στα κόπρανα και τα απόβλητα. Μπορεί να πολλαπλασιαστεί σε πλούσια σε οργανικές ύλες υδάτινα συστήματα και στην επιφάνεια οργανικών υλών που διαβρέχονται από νερό. (Madigan, 2008) Το Pseudomonas aeruginosa είναι ένα περιστασιακό παθογόνο. Οι περισσότερες ασθένειες που προκαλεί στον άνθρωπο δεν προέρχονται από την κατανάλωση του πόσιμου νερού αλλά από την επαφή με αυτό. Νερό μολυσμένο με αυτό το βακτήριο μπορεί να μολύνει τροφές και ποτά που το περιέχουν, τους υποβιβάζει την ποιότητα και μπορεί να αποτελέσουν φορείς παραπέρα μετάδοσης. Στα υγιή άτομα οι ασθένειες που προκαλεί είναι ήπιες και ασήμαντες. Υδατογενείς ασθένειες είναι δερματικές μολύνσεις και ωτίτιδες. Η παρουσία του βακτηρίου αυτού στο πόσιμο νερό είναι δείκτης υποβάθμισης της βακτηριολογικής ποιότητας. (Αντωνιάδης, 1999) 15

1.2 Στοιχεία Γεωλογίας 1.2.1 Κοκκομετρικό μέγεθος - Κοκκομετρική ανάλυση Το κοκκομετρικό μέγεθος (particle size, grain size) ενός κλαστικού πετρώματος αποτελεί τη βάση για να χαρακτηριστεί αυτό ως κροκαλοπαγές (conglomerate), ψαμμίτης (sandstone) ή σχιστή άργιλος (shale). Επί πλέον, το μέγεθος των κλαστικών υλικών που αποτίθεται από το νερό δείχνουν το πόσο μακριά ή κοντά είναι η πηγή προέλευσης τους (source area), αφού αποθέσεις με πολύ χονδρόκοκκο υλικό σημαίνει ότι δεν βρίσκονται πολύ μακρυά από την πηγή της τροφοδοσίας τους. Ακόμη, το μέγεθος (size) και η «ταξιθέτηση» (sorting) των θραυσμάτων του κλαστικού ιζήματος αποκαλύπτουν τα μέσα (agents) και τους τρόπους (modes) μεταφοράς. Κανονικά ρεύματα νερού εναποθέτουν ιζήματα με καλή ταξιθέτηση, όπως άμμοι παραλιών (beach sands) και αμμόλοφοι (dunes sands). Πιο συγκεκριμένα, ι ψηφίτες είναι κομμάτια από πέτρωμα και μεταφέρονται μέσα στο νερό σχεδόν μόνο με κύλιση πάνω στον πυθμένα. Η άμμος είναι μεμονωμένοι κόκκοι ορυκτών και μεταφέρονται με άλματα. Η ιλύς που είναι (α) πολύ μικροί κλαστικοί κόκκοι ορυκτών ή (β) κομμάτια αργιλικών ορυκτών που παράγονται κατά την αποσάθρωση, κινούνται ως αιωρήματα. Τρόποι μέτρησης διαμέτρου κόκκων: Άμεσος τρόπος (μέτρηση κατά Griffits) Έμμεσος τρόπος (κατ όνομα διάμετρος d M, διάμετρος drag d d, διάμετρος από ελεύθερη πτώση d f, διάμετρος από επιφάνεια d s, ειδική από επιφάνεια διάμετρος d us, κ.α.) Μια άλλη σημαντική διάμετρος, είναι η διάμετρος από κόσκινο (sieve diameter, d A ), η οποία εκφράζει το ελάχιστο εύρος ενός ανοίγματος σε σχήμα τετραγώνου μέσα από το οποίο θα περάσει το ακανόνιστο κομμάτι. Η επιλογή της τεχνικής που θα χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό του κοκκομετρικού μεγέθους, γίνεται βάσει της διαμέτρου που άμεσα ή έμμεσα μετράνε. Στους χονδρούς κλαστικούς ιστούς γίνεται χρήση τροταινίας, διαβήτη και κοσκίνων ( d L, d I, d S, d A ). Στους μέτρια χονδρούς ιστούς (άμμοι) γίνεται χρήση κοσκίνων (sieving) και του ιζηματογενούς σωλήνα (sedimentation tube) (d A, d f ). Τέλος στα λεπτά κλαστικά ιζήματα (πηλός, άργιλος) γίνεται χρήση της πιπέτας (d f ). Όροι του κοκκομετρικού μεγέθους που περιγράφουν μόνο το μέγεθος των κόκκων (και όχι άλλες ιδιότητες του, όπως η σύσταση): Ογκόλιθος ή Τρόχμαλος: μια αποκολλημένη πέτρινη μάζα, αποστρογγυλωμένη από την τριβή κατά τη μεταφοράς της. Έχει μέγεθος >256m. Λιθάρι: μια αποκολλημένη πέτρινη μάζα, αποστρογγυλωμένη από την τριβή κατά τη μεταφορά της. Έχει μέγεθος 64-256mm. 16

Κροκάλα: ένα θραύσμα πετρώματος, αποστρογγυλοποιημένο από τη δράση του νερού, του ανέμου και του πάγου. Έχει μέγεθος 4-64mm. Ψηφίτης: η ασύνδετη συγκέντρωση κροκάλων, λιθαριών και ογκολίθων. Κροκαλοπαγές: συμπαγής συγκέντρωση ψηφιτών. Λατύπη: η ασύνδετη συγκέντρωση γωνιωδών θραυσμάτων (μεγέθους > άμμου) Λατυποπαγές: συμπαγής συγκέντρωση λατύπων. Άμμος: συγκέντρωση ορυκτών ή κόκκων πετρώματος, μεγέθους 1/16-2mm. 1.2.2 Στατιστικές παράμετροι Οι κοκκομετρικές αναλύσεις στοχεύουν στους παρακάτω λόγους: Να περιγραφούν τα δείγματα σ όρους στατιστικών μετρήσεων Να συγκριθούν δείγματα από όμοια περιβάλλοντα ιζηματογένεσης να ερμηνεύσουν το μέσο (άνεμος, ποτάμι, κ.λ.π.) της μεταφοράς και της απόθεσης Να ερμηνεύσουν τις διαδικασίες (αιώρηση, σύρσιμο, αναπήδηση, κ.λ.π.) της τελικής απόθεσης Να ερμηνεύσουν το περιβάλλον της απόθεσης (αμμώδη παραλία, αμμόλοφο, κ.λ.π.) Ο αριθμητικός μέσος δείχνει τη διακύμανση μεγέθους του υλικού και το ποσό ενέργειας που μεταδόθηκε στο ίζημα και το οποίο εξαρτάται από την ταχύτητα του ρεύματος ή από το στροβιλισμό του μέσου μεταφοράς. (Folk, 1974) Η σταθερή απόκλιση δείχνει την κατανομή της διασποράς γύρω από το μέσο μέγεθος και εκφράζει την ομοιομορφία ή τη διαβάθμιση των ιζημάτων. Η διαβάθμιση εξαρτάται από τη διακύμανση μεγέθους του υλικού με το οποίο τροφοδοτείται το περιβάλλον ιζηματογένεσης, τον τύπο της απόθεσης, από τα χαρακτηριστικά των ρευμάτων και το χρόνο. Ο χαρακτηρισμός των ιζημάτων με βάση το βαθμό ομοιομορφίας όπως διαμορφώνεται από τις τιμές της σταθερής απόκλισης έχει ως εξής: (Folk, 1974) Τιμή (St) Χαρακτηρισμός ιζήματος <0,35 πολύ καλά διαβαθμισμένο 0,35-0,50 καλά διαβαθμισμένο 0,50-0,71 μετρίως καλά διαβαθμισμένο 0,71-1,00 μέτρια διαβαθμισμένο 1,00-2,00 φτωχά διαβαθμισμένο 2,00-4,00 πολύ φτωχά διαβαθμισμένο >4,00 εξαιρετικά φτωχά διαβαθμισμένο 17

Η αποκλειστική ασυμμετρία δείχνει πόσο η κατανομή του μεγέθους των κόκκων πλησιάζει την κανονική κατανομή του Gauss. Μια συμμετρική κατανομή έχει S k =0 και τείνουν σ αυτή τα ιζήματα που προέρχονται από μια πηγή, ενώ αυτά που έχουν πολλές πηγές έχουν έντονη ασυμμετρία. Ο αντίστοιχος βαθμός ασυμμετρίας των ιζημάτων έχει ως εξής: (Folk, 1974) Τιμή (Sk) Χαρακτηρισμός ιζήματος 1,00-0,30 Πολύ θετική ασυμμετρία 0,30-0,10 Θετική ασυμμετρία 0,10-(-0,10) Σχεδόν συμμετρική ασυμμετρία (-0,10)-(-0,30) Έντονα αρνητική ασυμμετρία (-0,30)-(-1,00) Πολύ έντονα αρνητική ασυμμετρία Η κύρτωση είναι μια μέτρηση του βαθμού διαβάθμισης των άκρων μιας κοκκομετρικής καμπύλης σε σχέση με τη διαβάθμιση του κεντρικού τμήματος της. Για κανονικές κατανομές, δηλαδή για ιζήματα με ομοιόμορφη διαβάθμιση σε όλα τα κλάσματα τους, παίρνει την τιμή 1. Για τιμές μεγαλύτερες του 1 οι καμπύλες χαρακτηρίζονται ως λεπτόκυρτες, ενώ για τιμές μικρότερες του 1 πλατύκυρτες. Ο αντίστοιχος χαρακτηρισμός των καμπυλών με βάση την τιμή της κύρτωσης έχει ως εξής: (Folk, 1974) Τιμή (KG) Χαρακτηρισμός ιζήματος <0,67 πολύ πλατύκυρτη 0,67-0,90 πλατύκυρτη 0,90-1,11 Μεσόκυρτη 1,11-1,50 λεπτόκυρτη 1,50-3,00 πολύ λεπτόκυρτη >3,00 εξαιρετικά λεπτόκυρτη 1.2.3 Σφαιρικότητα Στρογγύλωση Σφαιρικότητα (sphericity) είναι η ιδιότητα που μετρά τον βαθμό προσέγγισης ενός κλαστικού κομματιού στο σχήμα μιας σφαίρας, δηλαδή κατά πόσο το κλαστικό κομμάτι μοιάζει με σφαίρα. Υπάρχουν 2 τρόποι μελέτης της σφαιρικότητας: Ο ποσοτικός προσδιορισμός Ο οπτικός προσδιορισμός Στον οπτικό τρόπο μελέτης που θα χρησιμοποιηθεί στην περίπτωση μας, οι παράγοντες που επηρεάζουν τη σφαιρικότητα είναι οι εξής: 18

Η εσωτερική ανισοτροπία (οφείλεται σε στρώσεις, σχισμό, κτλ.) Το αρχικό σχήμα του κομματιού Η τριβή Με την αύξηση της τριβής, η σφαιρικότητα αυξάνεται. (Patro, 1976) Στρογγύλωση (roundness) είναι η ιδιότητα που δείχνει το πόσο κοφτερές (μυτερές) είναι οι κορυφές και οι γωνίες ενός κλαστικού κομματιού. Ο υπολογισμός της σφαιρικότητας και της στρογγύλωσης των κόκκων των δειγμάτων, θα γίνει με τη χρήση ενός κατάλληλου επιστημονικού οργάνου, του στερεοσκοπίου. Θα πρέπει να αναφερθεί το ότι η στρογγύλωση είναι ανεξάρτητη από τη σφαιρικότητα. (Wadell, 1932) Πίνακας 1.1: Σχέση μεταξύ των ορίων των κλάσεων της Wentworth Lane κλίμακας και της κλίμακας (phi-scale). (Krumbein, 1934) 19

G: ψηφίτης (gravel) sg: αμμώδης ψηφίτης (sandy gravel) msg: ιλυώδης αμμώδης ψηφίτης (muddy sandy gravel) mg: ιλυώδης ψηφίτης (muddy gravel) gs: ψηφιτική άμμος (gravely sand) gms: ψηφιτική ιλυώδης άμμος (gravely muddy sand) gm: ψηφιτική ιλύς (gravely mud) (g)s: ελαφρά ψηφιτική άμμος (slightly gravely sand) (g)ms: ελαφρά ιλυώδης άμμος (slightly gravely muddy sand) Πίνακας 1.2: Διάγραμμα ταξινόμησης λιθολογικού χαρακτήρα κατά Folk & Word (1957) και Folk, Andrews & Lewis (1970) (g)sm: ελαφρά ψηφιτική αμμώδης ιλύς (slightly gravely sandy mud) (g)m: slightly gravely mud S: sand Z: πηλός (silt) M: ιλύς (mud) C: άργιλος (clay) ms: muddy sand sm: sandy mud M: mud sz: αμμώδης πηλός (sandy silt) sm: αμμώδης ιλύς (sandy mud) sc: αμμώδης άργιλος (sandy clay) zs: πηλώδης άμμος (silty sand) ms: ιλυώδης άμμος (muddy sand) cs: αργιλώδης άμμος (clayey sand) S: άμμος (sand) Πίνακας 1.3: Διάγραμμα ταξινόμησης λιθολογικού χαρακτήρα κατά Folk & Word (1957) και Folk, Andrews & Lewis (1970) 20

Οι Russell & Taylor (1937) δίνουν έναν οπτικό χάρτη με 5 κλάσεις στρογγύλωσης. Οι κλάσεις αυτές με τις αντίστοιχες στα όρια τιμές στρογγύλωσης είναι: 1. Γωνιώδεις (angular): 0-0,15 2. Υπογωνιώδεις (subangular): 0,15-0,30 3. Υποστρόγγυλοι (subrounded): 0,30-0,50 4. Στρογγυλοί (rounded): 0,50-0,70 5. Πολύ στρογγυλοί (well- rounded): 0,70-1,00 Ο Petti John πρότεινε έναν οπτικό χάρτη με 5 κλάσεις στρογγύλωσης. Οι κλάσεις αυτές με τις αντίστοιχες στα όρια τιμές σφαιρικότητας είναι: 1. Γωνιώδεις (angular): 0-0,15 2. Υπογωνιώδεις (subangular): 0,15-0,25 3. Υποστρόγγυλοι (subrounded): 0,25-0,40 4. Στρογγυλοί (rounded): 0,40-0,60 5. Πολύ στρογγυλοί (well-rounded): 0,60-1,00 (PettiJohn, 1949) Ο Powers πρότεινε τη χρήση ενός χάρτου οπτικής σύγκρισης. Παρουσιάζοντας 6 κλάσεις στρογγύλωσης και 2 κλάσεις σφαιρικότητας σε φωτογραφίες κόκκων, τις συγκρίνει με τον κόκκο και καταγράφει την σχετική ομοιότητα τους. (Powers, 1953) Πίνακας 1.4: σφαιρικότητα κατά Powers (1953) Οι Krumbein & Sloss (1963) πρότειναν ένα οπτικό χάρτη με 5 κλάσεις. Πίνακας 1.5: Οπτικός χάρτης Krumbein & Sloss (1963) 21

1.2.4 Τα συμπτώματα μιας «μολυσμένης» παραλίας Επειδή οι παραλίες και οι αμμοθίνες αλλάζουν πολύ αργά, οι άνθρωποι δεν προσέχουν τι συμβαίνει. Επιπλέον, λόγω του ότι δεν καταλαβαίνουμε πως συμπεριφερόμαστε στους αμμόλοφους και στις παραλίες, συχνά κάνουμε λάθος ενέργειες. Παρά το γεγονός ότι δεν είναι όλες οι παραλίες ικανές να σωθούν, χρέος μας είναι να μάθουμε να εντοπίζουμε εάν μια παραλία είναι υγιής η άρρωστη, τι το προκαλεί και τι μπορούμε να κάνουμε γι αυτο. Οι παραλίες είναι φυσικώς διαφορετικές μεταξύ τους, και επηρεάζονται με διαφορετικούς τρόπους, από τις ίδιες αιτίες. Συνεπώς, μια αναδρομή στην ιστορία της παραλίας είναι απαραίτητη, καθώς μπορεί να μας δώσει χρήσιμες πληροφορίες, πριν προχωρήσουμε σε μια πορεία δράσεων ή συμπερασμάτων. Σε αντίθεση με βραχώδεις γκρεμούς που δεν μπορούν να διορθώσουν τη μορφή τους και επομένως μόνο συρρικνώνονται, οι παραλίες μπορούν να κρατήσουν τη δική τους κατά τη διάρκεια πολλών χιλιάδων ετών. Υγρή παραλία: η ξηρή άμμος, εκτεινόμενη στο μπροστινό μέρος του αμμόλοφου, παρουσιάζεται μόνο στις πολύ υγιείς παραλίες. Το ποσοστό ξηρής άμμου, υποδηλώνει την ποσότητα της άμμου που μετακινείται ελεύθερα στην παραλία. Κυματισμοί στην άμμο: οι κυματισμοί δείχνουν την πορεία της κίνησης της άμμου. Εάν είναι κατακόρυφοι στην ακτογραμμή, η άμμος κινείται κατά μήκος της παραλίας και όχι μέσα στους αμμόλοφους. Ο άνεμος μπορεί να αποκλειστεί από μια απότομη κατωφέρεια, ή από δέντρα ή σπίτια. Οι κυματισμοί είναι σύμπτωμα υγειούς παραλίας, ιδιαίτερα όταν εμφανίζονται παράλληλα στην ακτογραμμή. Κρούστα ξηρής άμμου: κατά μήκος της «υψηλής» γραμμής παλίρροιας, ιδίως όταν υπήρξε κύμα, η άμμος θα πρέπει να έχει στεγνώσει. Σε περίπτωση που δεν θρυμματισθεί από τους επισκέπτες, σημαντική παράμετρο αποτελεί ο σχηματισμός μιας σκληρής κρούστας. Η Εφελκιδοποιημένη άμμος, δεν μπορεί να μετακινηθεί από τον άμμο, γεγονός ανησυχητικό για την υγεία της παραλίας. Η κορυφή της παραλίας δεν ξηραίνεται: 9 ώρες ύστερα από μια υψηλή παλίρροια, στην κορυφή της υγρής παραλίας, η άμμος θα πρέπει να έχει «στεγνώσει» (ακόμα και σε περίπτωση μιας νεφελώδους ημέρας. Όταν η άμμος δεν είναι ξηρή, δεν μπορεί και να μετακινηθεί. Πιθανή και η ύπαρξη πράσινου αφρώδους υλικού, που αποτελεί ένδειξη υψηλής πυκνότητας φυκών. Βρώμικη άμμος: η άμμος της παραλίας πρέπει να φαίνεται καθαρή, ιδιαίτερα όταν είναι ξηρή. Αν είναι λασπώδης, πιθανόν να είναι μολυσμένη είτε από λάσπη, είτε από φύκια. (Η μολυσμένη άμμος δεν στεγνώνει εύκολα, και η αποθήκευση δείγματος της παρουσιάζει έντονη οσμή ύστερα από χρονικό διάστημα 2 εβδομάδων, σε θερμοκρασία δωματίου) Σκληρή άμμος: η άμμος της παραλίας, είτε υγρή είτε ξηρή θα πρέπει να είναι μαλακή. Αντίθετη περίπτωση, αποτελεί ένδειξη ρύπανσης. 22

Απότομη κατωφέρεια σε αμμόλοφο: η ύπαρξη απότομης κατωφέρειας σε αμμόλοφο αποτελεί σύμπτωμα κακής υγείας της παραλίας. Η θάλασσα καταστρέφει αργά τον αμμόλοφο. Σε τέτοιες περιπτώσεις, συχνά η άμμος είναι υγρή και παρατηρείται εμφάνιση και άλλων συμπτωμάτων. Ψηλά κτήρια κοντά στην παραλία: η ύπαρξη ψηλών κτηρίων ή οποιοδήποτε εμποδίου κοντά στην παραλία, επηρεάζει τον άνεμο τόσο μακριά όσο 30 φορές το ύψος του. Ζώνη καταφυγίου κοντά στην παραλία: ανεμοφράκτες έχουν σημαντική επίδραση στην υγεία της παραλίας. Ένα μεγάλο ποσοστό του κόσμου δεν γνωρίζει ότι πολλές από τις δραστηριότητες του είναι καταστροφικές όχι μόνο για τις παραλίες, αλλά σε μεγαλύτερο βαθμό για το χερσαίο και το θαλάσσιο περιβάλλον. Επειδή η κατάρρευση των παραλιών, συνδέεται άμεσα με την ανθρώπινη δραστηριότητα, τα προβλήματα του σήμερα είναι πιθανόν να επιταχυνθούν στο μέλλον. Ωστόσο, υπάρχουν λύσεις που θα μπορούσαν να ακολουθηθούν, προκειμένου να περιοριστεί ή και σε κάποιες περιπτώσεις ακόμα και να λυθεί το πρόβλημα της μόλυνσης που προέρχεται από τον ανθρώπινο παράγοντα. Εκπαίδευση: Η γνώση αποτελεί βασικό κριτήριο για την λήψη οποιαδήποτε απόφασης όσον αφορά την αντιμετώπιση οποιουδήποτε προβλήματος. Συνεπώς, η ενημέρωση και η εκπαίδευση, είτε μέσα στα σχολεία, είτε μέσω εντύπων ή άλλων μέσων ενημέρωσης, είναι απαραίτητη για την ενημέρωση και κατανόηση του προβλήματος από τον κόσμο. Κοπή δένδρων: η ύπαρξη δένδρων κοντά στην παραλία είναι μείζονος ανησυχίας, ιδιαίτερα όταν αυτά είναι φυτεμένα σε κλειστές τάξεις. Η κατάργηση τους θα αποτελούσε μια εύκολη και αποτελεσματική λύση, εξοικονομώντας παραλίες που θα μπορούσαν διαφορετικά να είναι υγιείς. Κατά κανόνα, δενδροστοιχίες δεν θα έπρεπε να τοποθετούνται σε απόσταση τουλάχιστον 300 μέτρων από την υψηλή στάθμη του νερού. Η ύπαρξη διάσπαρτων δένδρων ή θάμνων, δεν αποτελεί ανησυχία, αφού επιτρέπουν στον αέρα να περάσει γύρω από αυτά. Ναυαγοσωστικά σπίτια: σπίτια που βρίσκονται στην άκρη του νερού θα πρέπει να είναι κατασκευασμένοι έτσι ώστε να είναι ευκίνητοι και να μην εμποδίζουν τον άνεμο και μετακινηθούν προς τα πίσω ώστε να παρέχουν ένα μικρότερο προφίλ ανέμου. Επεξεργασία λυμάτων: σε πολλά μέρη λύματα χύνονται στη θάλασσα ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια καταιγίδων, προκαλώντας προβλήματα στη θάλασσα, στην άμμο, και στα ψάρια.. Νόμοι: Εθνικοί και τοπικοί νόμοι πρέπει να προστατεύουν μια ευρεία ζώνη της παραλίας. Έρευνα: πολλές από τις ιδέες και ενέργειες που παρουσιάζονται παραπάνω, πρέπει να υποστηρίζονται από επιστημονική έρευνα. 23

Υλικά και Μέθοδοι Κεφάλαιο 2 2.1 Υλικά 2.1.1 Υλικά δειγματοληψίας Για τη διαδικασία της δειγματοληψίας, είναι απαραίτητα τα παρακάτω υλικά: Στείρες σακούλες δειγματοληψίας Κουτάλι μιας χρήσης Γάντια μιας χρήσης Μονωτική ταινία Παγοκύστες Δοχείο προσωρινής αποθήκευσης και μεταφοράς των δειγμάτων Έντυπο δειγματοληψίας 2.1.2 Υλικά μικροβιολογικών αναλύσεων Για τον εργαστηριακό έλεγχο των δειγμάτων, είναι απαραίτητα τα παρακάτω υλικά: θρεπτικό υλικό Enterococcus selective Agar according to Slanetz and Bartley θρεπτικό υλικό mendo Agar LES, Difco TM θρεπτικό υλικό TBX, θρεπτικό υλικό TTC Agar with Tergitol 7 (αντί για τη χρήση των TBX και Difco TM mendo Agar LES ) Φίλτρα μεμβράνης με διάμετρο πόρων 0,45μm Απεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό 2.2 Όργανα 2.2.1 Όργανα δειγματοληψίας Για τη διαδικασία της δειγματοληψίας, είναι απαραίτητα τα παρακάτω όργανα: Θερμόμετρο Υγρασιόμετρο 2.2.2 Όργανα μικροβιολογικών αναλύσεων Για τον εργαστηριακό έλεγχο των δειγμάτων, καθώς και για την ανάπτυξη μικροοργανισμών, είναι απαραίτητα τα παρακάτω όργανα: Στήλη διήθησης 24

Αποστειρωμένες Φιάλες - Στείρα γυάλινα δοχεία των 300ml Ζυγός (αναλυτικός) Αυτόματη πιπέτα (pipeter), για τη διαδικασία αραίωσης Επωαστικοί κλίβανοι Είναι οι κλίβανοι που χρησιμοποιούνται για την επώαση των καλλιεργειών των μικροοργανισμών. Λειτουργούν με ηλεκτρικό ρεύμα και διατηρούν σταθερή τη θερμοκρασία με ένα θερμοστάτη με απόκλιση ±0,5 ο C. Κλίβανοι Αποστείρωσης Είναι οι κλίβανοι που χρησιμοποιούνται για την αποστείρωση των υλικών και των γυαλικών του εργαστηρίου. α. Κλίβανος ξηρής αποστείρωσης: Χρησιμοποιείται κυρίως για την αποστείρωση γυαλικών. Είναι όμοιος με τον επωαστικό κλίβανο αλλά έχει υψηλότερες θερμοκρασίες (160-200 ο C). Συνήθως αποστειρώνονται στους 171 ο C για 1h. Εικόνα 2.1: Κλίβανος ξηρής αποστείρωσης β. Κλίβανος υγρής αποστείρωσης (αυτόκαυστος κλίβανος): Χρησιμοποιείται για την αποστείρωση των περισσότερων θρεπτικών υποστρωμάτων και αντιδραστηρίων. Εικόνα 2.2: αυτόκαυστο Υδατόλουτρο Συσκευή που αποτελείται από μια λεκάνη με αποσταγμένο νερό. Υπάρχει θερμόμετρο, λυχνία λειτουργίας και διακόπτης με κλίμακα για τη ρύθμιση της θερμοκρασίας η οποία διατηρείται σταθερή με θερμοστάτη. Χρησιμοποιείται για την επώαση των καλλιεργειών των μικροοργανισμών σε δοκιμαστικούς σωλήνες με υγρά θρεπτικά υποστρώματα όταν χρειάζεται να γίνει γρήγορη μετάδοση της θερμοκρασίας. Εικόνα 2.3: Υδατόλουτρο Μικροσκόπιο Ψυγείο ph-μετρο θερμόμετρο λύχνοι Bunsen ζυγός 25

μικροπιπέτες κρίκοι και βελόνες εμβολιασμού σπάτουλες τρυβλία Petri κωνικές και ογκομετρικές φιάλες ογκομετρικοί κύλινδροι δοκιμαστικοί σωλήνες και φιάλες αραιώσεων 2.2.3 Όργανα γεωλογικών αναλύσεων Για τον εργαστηριακό έλεγχο των δειγμάτων, είναι απαραίτητα τα παρακάτω όργανα και υλικά: Ζυγός (αναλυτικός) Κόσκινο Φούρνος Κάναβος διαστάσεων 20x20 cm Στερεοσκόπιο Εικόνα 2.4: Ζυγός Εικόνα 2.5: Κόσκινο Εικόνα 2.6: Φούρνος 26

2.3 Παρασκευή θρεπτικών επιστρωμάτων Θρεπτικό υπόστρωμα είναι κάθε υγρό ή στερεό υλικό που χρησιμοποιείται στο εργαστήριο για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Πρέπει να περιέχει όλα τα απαραίτητα συστατικά για τις θρεπτικές απαιτήσεις των μικροοργανισμών. Για την Παρασκευή τους είναι χρησιμοποιούνται σκόνη και νερό (σε όλα περιέχεται agar δηλαδή εκχύλισμα φυκιών). Στάδιο 1: Slanetz & Bartley (SB), για τους εντερόκοκκους (στους 37 ο C για 48h) Στις οδηγίες δίνεται η πληροφορία ότι σε 1lt αποσταγμένου H 2 O αντιστοιχούν 41,5gr θρεπτικού υλικού SB, βάσει της οποίας θα υπολογιστούν οι αναλογίες των υλικών μου για την δημιουργία της αναγκαίας ποσότητας του θρεπτικού υλικού SB. Στα 1000ml αποσταγμένου H 2 O διαλύονται 41,5gr SB Στα 250ml αποσταγμένου H 2 O διαλύονται x gr SB x = 10,37gr SB Συνεπώς, πρέπει να διαλυθούν 10,37gr SB σε 250ml αποσταγμένου Η 2 0 (προκύπτουν περίπου 25 τρυβλία με θρεπτικό υλικό SB). (ΤΒΧ), για τα E.Coli (στους 44 ο C για 24h) Στις οδηγίες δίνεται η πληροφορία ότι σε 1lt αποσταγμένου H 2 O αντιστοιχούν 31,6gr θρεπτικού υλικού TBX, βάσει της οποίας θα υπολογιστούν οι αναλογίες των υλικών μου για την δημιουργία της αναγκαίας ποσότητας του θρεπτικού υλικού TBX. Στα 1000ml αποσταγμένου H 2 O διαλύονται 31,6gr TBX Στα 250ml αποσταγμένου H 2 O διαλύονται y gr TBX y = 7,9gr TBX Συνεπώς, πρέπει να διαλυθούν 7,9gr SB σε 250ml αποσταγμένου Η 2 0 (προκύπτουν περίπου 25 τρυβλία με θρεπτικό υλικό TBX). Difco TM mendo Agar LES (mendo), για τα ολικά κολοβακτηριοειδή (στους 37 ο C για 48h) Στις οδηγίες δίνεται η πληροφορία ότι σε 1lt αποσταγμένου H 2 O αντιστοιχούν 51gr θρεπτικού υλικού mendo και 20ml (95%)αιθανόλη, βάσει της οποίας θα υπολογιστούν οι αναλογίες των υλικών μου για την δημιουργία της αναγκαίας ποσότητας του θρεπτικού υλικού mendo. Στα 1000ml αποσταγμένου H 2 O διαλύονται 51gr mendo και 20ml (95%) αιθανόλη Στα 250ml αποσταγμένου H 2 O διαλύονται z 1 gr mendo και z 2 ml (95%) αιθανόλη 27

z 1 = 12,75gr mendo και z 2 = 5ml (95%) αιθανόλη Συνεπώς, πρέπει να διαλυθούν 12,75gr SB σε 250ml αποσταγμένου Η 2 0 και 5ml (95%) αιθανόλη (προκύπτουν περίπου 25 τρυβλία με θρεπτικό υλικό SB). Tergitol - 7AGAR with Triphenyltetrarolium Chloride 0,125% (TTC), για τα ολικά κολοβακτηριοειδή και τα E.Coli (πράσινο θρεπτικό υλικό, 18+/-4h). (TCA), για τα E.Coli (με ανακαλλιέργεια των κίτρινων αποικιών που σχηματίστηκαν στο TTC, στους 37 ο C για h). (DEV), για τα ολικά κολοβακτηριοειδή και τα E.Coli (με ανακαλλιέργεια των πορτοκαλί αποικιών που σχηματίστηκαν στο TTC, στους 44 ο C για h). Στάδιο 2: Τοποθετώ τις κωνικές φιάλες στον φούρνο, χωρίς ασημόχαρτο, περίπου για 5 λεπτά, βγάζοντάς τες ανά διαστήματα ενδιάμεσα (όταν αρχίζει να βράζει και να φουσκώνει ) και ανακινώ με τη βοήθεια ενός γαντιού, μέχρι να διαλυθούν οι κόκκοι που καθιζάνουν. Σύμφωνα με τις οδηγίες, δεν πρέπει να ξεπερνάμε τα 5 λεπτά, καθώς και είναι απαραίτητη η χρήση γαντιού. Τέλος, απαγορεύεται η ύπαρξη ασημόχαρτου στο στόμιο της φιάλης καθ όλη τη διάρκεια που αυτή θα βρίσκεται στο φούρνο. Εικόνα 2.7: (α)πορτοκαλί θρεπτικό υλικό SB (β)κίτρινο θρεπτικό υλικό TBX (γ)ροζ θρεπτικό υλικό mendo Στάδιο 3: (ΜΟΝΟ για το TBX) Ύστερα από την παρασκευή του θρεπτικού υλικού TBX σε κωνική φιάλη, κλείνουμε το στόμιο της με πλαστικό ή μεταλλικό καπάκι και αποστειρώνουμε στο αυτόκαυστο σε θερμοκρασία ο C και σε πίεση 1atm και περιμένω να πέσει η πίεση και η θερμοκρασία (~1h). Στάδιο 4: 28

Τοποθετώ τις φιάλες με τα υλικά SB, TBX, mendo, σε νερό θερμοκρασίας ~50 ο C και περιμένω έως ότου έρθουν σε θερμική ισορροπία. Στάδιο 5: Καίω-Αποστειρώνω το στόμιο της φιάλης και μοιράζω προσεκτικά το θρεπτικό υλικό στα τρυβλία petri. Στάδιο 6: Καταγράφω επάνω στα τρυβλία το όνομα του υλικού, στη συνέχεια τα σφραγίζω με αλουμινόχαρτο (αφού πρώτα έχουν παγώσει και έχουν ελεγχτεί για τη στειρότητα τους μακροσκοπικά και στο φούρνο με επώαση δείγματος στους 37 ο C για 24-48h) και τα τοποθετώ στο ψυγείο έως ότου τα χρησιμοποιήσω. Επεξεργασία και δημιουργία κατάλληλων νερών Για το δείγμα 1 χρειαζόμαστε: 300ml H2O(πυκνό) + 270ml H2O (1/100) δηλαδή, χρειάζομαι συνολικά 840ml Η2Ο. Για το 1 δείγμα χρειάζομαι 840ml H 2 O Για τα 10 δείγματα χρειάζομαι x ml H 2 O x = 8,4lt H 2 O Συνεπώς, χρειάζονται 8,4lt αποσταγμένου και αποστειρωμένου H2O για την διαδικασία ανάλυσης των 10 δειγμάτων. 2.4 Μεθοδολογία 2.4.1 Μέθοδος δειγματοληψίας Ο τρόπος λήψης ενός δείγματος για την μικροβιακή και πετρολογική μελέτη ενός ιζήματος, ονομάζεται δειγματοληψία (sampling). Το δείγμα πρέπει να είναι αντιπροσωπευτικό έτσι ώστε τα αποτελέσματα που θα προκύψουν από την ανάλυση του, για κάποια ιδιότητα, να έχουν καθολική ισχύ για ολόκληρο τον πληθυσμό του ιζήματος. Κατά τη διάρκεια κάθε δειγματοληψίας, είναι απαραίτητη η τήρηση ορισμένων κανόνων, όσον αφορά τον τρόπο επιλογής των δειγμάτων. Πιο συγκεκριμένα, θα πρέπει να γίνεται με ακρίβεια και προσοχή τόσο η χρήση των οργάνων ώστε να παίρνουμε ορθές πληροφορίες, όσο και η μεθοδολογία που θα ακολουθούμε ώστε τα δείγματα να είναι αντιπροσωπευτικά. 29

Η μέθοδος δειγματοληψίας που εφαρμόζεται είναι η εξής: Καθορισμός των σημείων που θα γίνει η δειγματοληψία Μέτρηση της θερμοκρασίας του αέρα και της υγρασίας (με τα κατάλληλα διαθέσιμα όργανα) Συλλογή περίπου 100 gr δείγματος από την επιφάνεια της άμμου (με τη χρήση ενός κουταλιού μιας χρήσης) και μεταφορά σε αποστειρωμένο σάκο δειγματοληψίας. Για να θεωρούνται αξιόπιστα τα αποτελέσματα μιας μικροβιολογικής ανάλυσης προϊόντος θα πρέπει το δείγμα που εξετάζεται να πληρεί κάποιες προϋποθέσεις, όπως να είναι αντιπροσωπευτικό, και ο χειρισμός του δείγματος να ελαχιστοποιεί τις μικροβιολογικές μεταβολές κατά τη διάρκεια της μεταφοράς, αποθήκευσης και κατεργασίας μέχρι την ανάλυση, έτσι ώστε να μην μεταβληθεί το μικροβιολογικό του φορτίο από τη χρονική στιγμή της δειγματοληψίας. Σφράγισμα του δείγματος με μονωτική ταινία Τοποθέτηση του δείγματος στο δοχείο με τις παγοκύστες Καταγραφή των δεδομένων και των συμπερασμάτων, στο έντυπο δειγματοληψίας (φυσικοχημικές παράμετροι του δείγματος, παρατηρήσεις που αφορούν το μέρος δειγματοληψίας), με τη βοήθεια κατάλληλων συσκευών (υγρασιόμετρο, θερμόμετρο, GPS) Μεταφορά των δειγμάτων στο εργαστήριο για τον απαραίτητο έλεγχο και αναλύσεις 30

2.4.1.1 Περιοχή μελέτης (διαδρομή σημεία δειγματοληψίας) Στον χάρτη 4.1 παρουσιάζονται οι θέσεις δειγματοληψίας των 10 παραλιών του νομού Αχαΐας. Στη συνέχεια ακολουθούν αποτελέσματα μικροβιολογικής εξέτασης του νερού για την χρονική περίοδο Φεβρουαρίου-Αυγούστου 1. Παραλία Καλογριάς 2. Παραλία Νηφορεϊκων - παλιό camping 3. Παραλία Ροίτικων 4. Παραλία Ροίτικων - Lido 5. Παραλία Πλαζ 6. Παραλία Μποζαίτικων - ξενοδοχείου Το Τζάκι 7. Παραλία Ρίου - ξενοδοχείο Porto Rio 8. Παραλία Δημορηγόπουλου 9. Παραλία Αγ. Βασιλείου 10. Παραλία Αλυκών (Αίγιο) Εικόνα 2.8 : Διαδρομή - Σημεία δειγματοληψίας 31

Σημείο Δειγματοληψίας 1 ο - παραλία Καλογριάς Εικόνα 2.9: παραλία Καλογριάς Ως πρώτο σημείο της δειγματοληψίας ορίστηκε η παραλία της Καλογριάς, στο δήμο Λαρισού του νομού Αχαΐας. Πρόκειται για μια αμμώδη παραλία, μεγάλης έκτασης, αποτελούμενη από θίνες, κοντά σε δασώδη περιοχή. Κατά την διαδρομή σε αυτήν συναντάμε ξενοδοχειακές μονάδες καθώς και πολλές καντίνες κατά τη διάρκεια του καλοκαιριού. Κατά τη χειμερινή περίοδο δεν την επισκέπτεται πολύς κόσμος, σε αντίθεση με την καλοκαιρινή περίοδο που αποτελεί χώρο αναψυχής για πολύ κόσμο. Σημείο Δειγματοληψίας 2 ο - παραλία Νηφορεϊκων Ως δεύτερο σημείο της δειγματοληψίας ορίστηκε η παραλία Νηφορεϊκων, στο δήμο Δύμης του νομού Αχαΐας, προς την περιοχή που βρισκόταν το παλιό camping. Μια παραλία αποτελούμενη από λεπτόκοκκη και μεσόκκοκη άμμο, κοντά σε ξενοδοχειακή μονάδα καθώς και σε καφετέρια. Εικόνα 2.10: παραλία Νηφορεϊκων 32

Σημείο Δειγματοληψίας 3 ο -παραλία Ροιτίκων Εικόνα 2.11: παραλία Ροιτίκων Ως τρίτο σημείο της δειγματοληψίας ορίστηκε η παραλία Ροιτίκων, στο δήμο Παραλίας του νομού Αχαΐας. Η παραλία αυτή βρίσκεται σε κατοικήσιμη περιοχή και ακριβώς κάτω από οδόστρωμα. Χαρακτηριστικό της γνώρισμα είναι ότι κατά την χειμερινή περίοδο «ξεβράζει» φύκη, καθώς και αρκετές είναι οι φορές που ανεβαίνει η στάθμη της σημαντικά, έτσι ώστε η γύρω περιοχή να κινδυνεύει από πλημμύρες. Σημείο Δειγματοληψίας 4 ο - παραλία μπροστά από το κέντρο διασκεδάσεως Lido Ως τέταρτο σημείο της δειγματοληψίας ορίστηκε η παραλία κάτω από το κέντρο ψυχαγωγίας Lido, στο δήμο Ροιτίκων του νομού Αχαΐας. Η παραλία αυτή αποτελείται από χονδρόκκοκη άμμο καθώς και από πολλά φύκη. Βρίσκεται κάτω από οδόστρωμα και η ποσότητα σκουπιδιών που υπάρχουν σε αυτήν είναι μεγάλη. Εικόνα 2.12: παραλία μπροστά από το κέντρο διασκεδάσεως Lido 33

Σημείο Δειγματοληψίας 5 ο - παραλία Αλυκής Η παραλία Αλυκής είναι η πέμπτη παραλία που επιλέχθηκε για την δειγματοληψία, βρίσκεται στο δήμο Αιγίου, στο νομό Αχαΐας. Πρόκειται για μια παραλία λίγα χιλιόμετρα έξω από το κέντρο του Αιγίου, κοντά σε κατοικήσιμη περιοχή, σε εστιατόρια καθώς και σε ξενοδοχειακή μονάδα. Ωστόσο το ποσοστό των λουόμενων κατά την καλοκαιρινή περίοδο είναι μεγάλο, και των περαστικών κατά την χειμερινή περίοδο αρκετά σημαντικό. Εικόνα 2.13: παραλία Αλυκής Σημείο Δειγματοληψίας 6 ο παραλία Αγ. Βασιλείου Έκτη κατά σειρά επιλέχθηκε η παραλία Αγ. Βασιλείου για τη δειγματοληψία, που βρίσκεται στο δήμο Ρίου του νομού Αχαΐας. Πρόκειται για το σημείο που βρίσκεται μπροστά από εστιατόρια και καφετέριες όπου κατά την καλοκαιρινή περίοδο καταγράφεται σημαντική αύξηση της ανθρώπινης δραστηριότητας σε σχέση με τη χειμερινή περίοδο. 34

Σημείο Δειγματοληψίας 7 ο - παραλία Δημορηγόπουλου Εικόνα 2.14: παραλία Δημορηγόπουλου Δημορηγόπουλου Ως έβδομο σημείο της δειγματοληψίας ορίστηκε η παραλία του Δημορηγόπουλου, στο δήμο Ρίου του νομού Αχαΐας. Πρόκειται για μια παραλία μεγάλης έκτασης κοντά σε εστιατόρια, καφετέριες, κέντρα διασκεδάσεως. Το σημείο της παραλίας που έγινε η δειγματοληψία βρίσκεται κάτω από εργοστάσιο πετρελαίου καθώς στη θάλασσα σταματούν πολλά πετρελαιοφόρα πλοία. Σημείο Δειγματοληψίας 8 ο - παραλία κατάντη του ξενοδοχειακού συγκροτήματος «Porto Rio» Κάτω από τη ξενοδοχειακή μονάδα - casino «Porto Rio» στο δήμο Ρίου του νομού Αχαΐας, επιλέχθηκε το όγδοο σημείο δειγματοληψίας. Πρόκειται για ένα σημείο όπου καθ όλη τη διάρκεια του χρόνου δέχεται λύματα από τις αποχετεύσεις της μονάδας. Εικόνας 2.15: παραλία μπροστά από το ξενοδοχείο «Porto Rio» 35

Σημείο Δειγματοληψίας 9 ο - παραλία κατάντη της ξενοδοχειακής μονάδας «Το τζάκι» Το ένατο σημείο που επιλέχθηκε για τη δειγματοληψία είναι η παραλία κάτω από τη ξενοδοχειακή μονάδα «Το τζάκι», στο δήμο Πατρέων του νομού Αχαΐας. Πρόκειται για έναν κόλπο μπροστά από το ξενοδοχείο όπου μόνο κατά την καλοκαιρινή περίοδο συναντάμε κόσμο κυρίως μεγάλης ηλικίας με μικρά παιδιά. Σημείο Δειγματοληψίας 10 ο - παραλία Πλαζ Εικόνα 2.16: παραλία Πλαζ Το τελευταίο σημείο που επιλέχθηκε για τη δειγματοληψία είναι η παραλία της Πλαζ, στο δήμο Πατρέων του νομού Αχαΐας. Πρόκειται για μια μεγάλης έκτασης, ανοιχτή παραλία, που αποτελείται από λεπτόκοκκη έως μεσόκκοκη άμμο. Κατά τη χειμερινή περίοδο υπάρχουν αθλητικές εγκαταστάσεις σε αυτήν, ενώ κατά την καλοκαιρινή περίοδο λειτουργούν καντίνες, κέντρα διασκέδασης και το ποσοστό των λουόμενων είναι μεγάλο καθ όλη την διάρκεια της ημέρας, και αποτελείται από άτομα όλων των ηλικιών. 36

2.4.2 Μέθοδος μικροβιολογικών αναλύσεων 2.4.2.1 Ασηπτικές συνθήκες - τεχνική Οι μικροοργανισμοί υπάρχουν παντού, στο έδαφος, στο νερό, στα τρόφιμα, στο σώμα μας και σε όλα τα αντικείμενα. Σε κάθε μικροβιολογική μελέτη, είναι απαραίτητη η λήψη κάποιων μέτρων προστασίας του ερευνητή καθώς και των μικροοργανισμών που μελετώνται, για την αποφυγή της επιμόλυνσης από άλλους μικροοργανισμούς των γύρω επιφανειών ή του περιβάλλοντος. Η διαδικασία που χρησιμοποιείται για την εξασφάλιση στειρότητας καθώς και για τη μείωση της μόλυνσης, κατά τη διάρκεια εφαρμογής διαφόρων μεθόδων μεταφοράς των μικροοργανισμών, ονομάζεται ασηπτική τεχνική. Για την ορθή εφαρμογή της απαιτούνται οι ακόλουθες προϋποθέσεις: Απολύμανση του εργαστηριακού χώρου Αποστείρωση των μέσων μεταφοράς των μικροοργανισμών (λαβίδες, κλπ) Χρήση αποστειρωμένων εργαστηριακών μέσων και υλικών (θρεπτικά υποστρώματα, κενά τρυβλία Petri, δοκιμαστικοί σωλήνες, κλπ) Συνεχής λειτουργία του λύχνου Bunsen κατά τη διάρκεια της εργασίας, έτσι ώστε να διατηρηθούν οι συνθήκες αποστείρωσης, λόγω της δημιουργίας στοιχειώδους αποστειρωμένου χώρου. Δημιουργεί ένα ανοδικό ρεύμα θερμού αέρα στην περιοχή, μειώνοντας την πιθανότητα των αερομεταφερόμενων μικροοργανισμών. Σωστός χειρισμός εργαστηριακών μέσων και υλικών Ορθός χειρισμός δοκιμαστικών σωλήνων Κρατώντας τον δοκιμαστικό σωλήνα υπό γωνία με το αριστερό χέρι, αφαιρούμε το κάλυμμα χωρίς να αφεθεί κάτω και περνάμε το στόμιο του σωλήνα από τη φλόγα του λύχνου Bunsen για σύντομο χρονικό διάστημα (πριν και μετά από τη μεταφορά υλικού). Ορθός χειρισμός τρυβλίων Τα κενά αποστειρωμένα τρυβλία ή τα τρυβλία με καλλιέργειες μικροοργανισμών, πρέπει να παραμένουν πάντα κλειστά. Για το χρονικό διάστημα που απαιτείται να ανοιχτούν, παραμένουμε κοντά στη φλόγα του λύχνου Bunsen, κρατώντας το καπάκι με το άνοιγμα προς τα κάτω. (Σαμολαδά, 2011) 2.4.2.2 Αποστείρωση Ως αποστείρωση ορίζουμε την πλήρη καταστροφή των βλαστικών μορφών και σπορίων των μικροοργανισμών, με συνέπεια την απώλεια της ικανότητας αναπαραγωγής τους όλων όσων υπάρχουν σ ένα αντικείμενο ή χώρο. Η καταστροφή των ενζύμων ή προϊόντων του μικροβιακού μεταβολισμού (τοξίνες) είναι άμεσα συνδεδεμένη με τον τρόπο αποστείρωσης που θα χρησιμοποιηθεί. Οι τρόποι αποστείρωσης: Α. Θερμότητα 37

Η ύπαρξη και ανάπτυξη ενός μικροοργανισμού βασίζεται σε ένα σύνολο χημικών αντιδράσεων, οι οποίες επηρεάζονται με την μεταβολή της θερμοκρασίας. Συνεπώς, θερμοκρασίες μεγαλύτερες της μέγιστης θερμοκρασίας κάθε μικροοργανισμού, οδηγούν στον θάνατο του. 1. Ξηρή θερμότητα: κατά την μέθοδο αυτή αποστείρωσης, το κύτταρο των μικροοργανισμών αφυδατώνεται, τα συστατικά του κυττάρου οξειδώνονται, και στη συνέχεια, ακολουθεί ο θάνατος τους. Εφαρμόζεται σε αντικείμενα ανθεκτικά στις υψηλές θερμοκρασίες ή στις απότομες μεταβολές της θερμοκρασίας. Με φλόγα Bunsen: σε κρίκο ή βελόνα εμβολιασμού, στόμιο δοκιμαστικού σωλήνα. Με ξηρό κλίβανο (ανακυκλούμενου θερμού αέρα), σε θερμοκρασία 160 ο c για μια ώρα: σε γυαλικά και μεταλλικά αντικείμενα. Με ανάφλεξη ύστερα από βύθιση των αντικειμένων σε αλκοόλη: σε λαβίδες, σπάτουλες Με υπέρυθρη ακτινοβολία: σε μικρά αντικείμενα (λαβίδες σύριγγες κλπ) 2. Υγρή θερμότητα: εφαρμόζεται σε αντικείμενα από καουτσούκ, θρεπτικά υποστρώματα, καθώς και σε ανεπιθύμητες μικροβιακές καλλιέργειες. Ατμός υπό πίεση: γίνεται σε ειδική συσκευή που ονομάζεται αυτόκαυστο (autoclave). Με τη χρήση κορεσμένου ατμού, προκαλείται η θανάτωση των μικροοργανισμών κάτω από συνθήκες υψηλής υγρασίας και θερμοκρασίας (θ >121 ο C), επιτυγχάνοντας έτσι την αποστείρωση. Η λειτουργία του στηρίζεται στο ότι ο ατμός υπο πίεση που παράγεται (λόγω μη δυνατότητας εξόδου) αποκτά θερμοκρασίες μεγαλύτερες του βραστού νερού (121 ο σε πίεση 1,06 kg/cm 2 ). Οι ατμοί πρέπει να είναι ξηροί, δηλ. ελεύθεροι σταγονιδίων. Το αυτόκαυστο αποτελείται από ένα ανοξείδωτο λέβητα με διπλά τοιχώματα που γεμίζει με κορεσμένο ατμό και διατηρεί την επιθυμητή θερμοκρασία και υγρασία για ορισμένο χρόνο. Πάνω στο καπάκι του αυτόκαυστου υπάρχει μια βαλβίδα ασφαλείας, μια κάνουλα αποχέτευσης και ένας μετρητής δύο παραμέτρων (πίεσης και θερμοκρασίας). Έτσι, κατά τη διάρκεια της λειτουργίας, υπάρχει συνεχής και σαφής παρακολούθηση της πίεσης και της θερμοκρασίας. Για να αποστειρώσουμε στο αυτόκαυστο ακολουθούμε τα παρακάτω βήματα: 1.Ελέγχουμε εάν υπάρχει η απαιτούμενη ποσότητα νερού. 2.Τοποθετούμε το υλικό που θα αποστειρώσουμε (κωνικές φιάλες, δοκιμαστικούς σωλήνες κ.α.) 3.Κλείνουμε το καπάκι 4.Ρυθμίζουμε το θερμοστάτη στην επιθυμητή θερμοκρασία, ανοίγουμε τη βαλβίδα του αέρα και το διακόπτη του ρεύματος. 5.Όταν η πίεση αρχίσει να ανεβαίνει και το μανόμετρο δείχνει 0,4 kg/cm2 κλείνουμε τη βαλβίδα εξαγωγής εντελώς κα την ανοίγουμε κατά το ½. Όταν το μανόμετρο δείξει 0,6kg/cm2 κλείνουμε εντελώς την βαλβίδα εξαγωγής αέρα. 6.Όταν το μανόμετρο δείξει 1-1,1kg/cm2 κρατάμε τον απαιτούμενο χρόνο (15-20 ). 7.Όταν η αποστείρωση τελειώσει κλείνουμε τον διακόπτη του ρεύματος, αφήνουμε να πέσει η πίεση στο 0 και ανοίγουμε το αυτόκαυστο. 38

Κλασματική αποστείρωση Βρασμός Β. Χημικές ουσίες Γ. Διήθηση με ηθμούς Δ. Ακτινοβόληση (Σαμολαδά, 2011) 2.4.2.3 Διαδικασία εργαστηριακών μικροβιολογικών αναλύσεων των δειγμάτων Η μέθοδος εργαστηριακού ελέγχου των δειγμάτων που εφαρμόζεται είναι η εξής: Ζύγισμα 10g δείγματος Ανάμειξη του δείγματος κάθε τρυβλίου με 100ml απεσταγμένο και αποστειρωμένο νερό, σε αποστειρωμένες γυάλινες φιάλες των 250ml Ανάδευση (τουλάχιστον 50 φορές) Τοποθέτηση του φίλτρου μεμβράνης στη στήλη διήθησης Αποστείρωση τη διηθητικής στήλης και τοποθέτηση διηθητικών φίλτρων PALL (47mm) διαμέτρου πόρων 0,45μm, με τη βοήθεια αποστειρωμένης λαβίδας Τοποθέτηση διηθητικών φίλτρων σε τρυβλία petri με θρεπτικά υποστρώματα Τοποθέτηση τρυβλίων Petri σε φούρνους θερμοκρασίας 37ο C και επώαση για 18h και 48h αντίστοιχα. Καταμέτρηση των αποικιών των μικροβίων και προσδιορισμός του αποτελέσματος σε cfu/g, ύστερα από το τέλος της περιόδου επώασης 2.4.2.4 Μικροβιολογικές καλλιέργειες - Μεθοδολογία Για τον μικροβιολογικό έλεγχο του εδάφους μιας σειράς παραλιών του νομού Αχαΐας, ελήφθησαν δείγματα και εξετάστηκαν ως προς την παρουσία ολικών κολοβακτηριδίων, κολοβακτηριδίων κοπράνων (E.Coli) και κοπρανωδών στρεπτόκοκκων (εντερόκοκκων). Η μέθοδος ανάλυσης που χρησιμοποιήθηκε ήταν η μέθοδος μεμβρανών. Σε ορισμένα δείγματα τα οποία είχαν μεγάλο βακτηριακό φορτίο (στην έξοδο του βιολογικού καθαρισμού) προηγήθηκε η μέθοδος των διαδοχικών αραιώσεων. 39

2.4.2.5 Μέθοδος ηθομεμβράνης (διήθηση) Εικόνα 2.17: Αποικίες E.Coli (μέθοδος μεμβρανών) Η διήθηση του δείγματος γίνεται διαμέσου της ηθομεμβράνης. Οι ηθομεμβράνες έχουν πολύ μικρούς πόρους και δεν επιτρέπουν στα βακτηριακά κύτταρα να διάλεθουν διαμέσου αυτών. Οι ηθμοί τοποθετούνται στην επιφάνεια στερεών θρεπτικών υποστρωμάτων και επωάζονται έως ότου σχηματιστούν ευδιάκριτες αποικίες. Η καταμέτρηση τους δείχνει τον αριθμό των μικροοργανισμών του αρχικού δείγματος. 2.4.2.6 Μέθοδος διαδοχικών αραιώσεων Η μέθοδος των διαδοχικών αραιώσεων πραγματοποιείται με σκοπό την απομόνωση ενός μικροοργανισμού, σε καθαρή καλλιέργεια. Κατά τις διαδοχικές αραιώσεις το αρχικό εμβόλιο (με τη χρήση πιπέτας), αραιώνεται σε μια σειρά δοκιμαστικών σωλήνων/δοχείων. Μετά από κάθε αραίωση ο δοκιμαστικός σωλήνας θα περιέχει το 1/10 κυττάρων, σε σχέση με τον ακριβώς προηγούμενο. Κατόπιν, δείγματα από κάθε αραίωση εμβολιάζονται σε τρυβλία Petri όπου σχηματίζονται αποικίες και είναι δυνατό να καταμετρηθούν. Αραίωση 1/10: Στα 100ml τα 10ml είναι του δείγματος μου. Συνεπώς, το νέο δείγμα (σε δοχείο 300ml) θα αποτελείται από αποσταγμένο H2O και 30ml του αρχικού δείγματος (Δ1). Αραίωση 1/100: Στα 100ml το 1ml είναι του δείγματος μου. Συνεπώς, το νέο δείγμα (σε δοχείο 300ml) θα αποτελείται από αποσταγμένο H2O και 30ml του αραιωμένου δείγματος 1/10 (Δ2). 270ml αποστειρωμένο και 270ml αποστειρωμένο και Στα 100ml δείγματος βρέθηκαν x ολικά κολοβακτηριειδή / E.coli / Εντερόκοκκοι Στο 1ml δείγματος βρέθηκαν y ολικά κολοβακτηριειδή / E.coli / Εντερόκοκκοι y = x / 100 40

2.4.2.7 Ανάπτυξη αποικιών στο θρεπτικό υπόστρωμα 2.4.2.7.1 Ολικά κολοβακτηριοειδή Στο τρυβλίο με θρεπτικό υλικό mendo: Οι μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται είναι τα ολικά κολοβακτηρίδια, αναγνωρίσιμα με τη μορφή έντονα γυαλιστερών πράσινων αποικιών. Επίσης, μπορούν να αναπτυχθούν ψευδομονάδες, έχοντας τη μορφή κόκκινων αποικιών. Στο τρυβλίο με το θρεπτικό υλικό DEV: Οι μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται είναι τα ολικά κολοβακτηριοειδή και τα E.Coli, αναγνωρίσιμα με τη μορφή αποικιών. 2.4.2.7.1.1 Kovac s test indole (τεστ ινδόλης) Το test indole γίνεται όταν χρησιμοποιήσω το θρεπτικό υλικό DEV. Πρόκειται για μια βιοχημική δοκιμή που πραγματοποιείται σε είδη βακτηρίων ώστε να καθορίσει την ικανότητα του οργανισμού να χωρίζει ινδόλη από το αμινοξύ τρυπτοφάνη. Όπως πολλές βιοχημικές εξετάσεις για τα βακτήρια, τα αποτελέσματα ενός test Oxidase υποδεικνύονται από μια αλλαγή στο χρώμα μετά από αντίδραση με ένα πρόσθετο αντιδραστήριο. Ένα θετικό αποτέλεσμα αποδεικνύεται από το σχηματισμό ενός θετικοί στην ινδόλη μικροοργανισμοί εμφανίζουν κόκκινο-ιώδους δακτυλίου στην επιφάνεια του ζωμού. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα φαίνεται κίτρινο. Ανάμεσα στα βακτήρια που είναι θετικά στο τεστ ινδόλης είναι και το E.Coli που μας ενδιαφέρει στην περίπτωση μας. Συνεπώς, σε συνδυασμό με το τεστ οξειδάσης: Είδος Μικροοργανισμού Test Oxidase Test Indole E.Coli - + Coliform Bacteria - - - + +/- 41

2.4.2.7.2 E.Coli Στο τρυβλίο με θρεπτικό υλικό TBX: Οι μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται είναι οι E.Coli, αναγνωρίσιμοι με τη μορφή ανοιχτών πράσινων αποικιών. Επίσης, μπορούν να αναπτυχθούν ψευδομονάδες, έχοντας τη μορφή κίτρινων αποικιών. Στο τρυβλίο με το θρεπτικό υλικό TTC: Οι μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται είναι τα E.Coli, αναγνωρίσιμοι με τη μορφή κίτρινων αποικιών και τα ολικά κολοβακτηριοειδή με E.Coli, με τη μορφή πορτοκαλί αποικιών. Στο τρυβλίο με το θρεπτικό υλικό TCA: Οι μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται είναι τα E.Coli, αναγνωρίσιμοι με τη μορφή αποικιών. 2.4.2.7.2.1 Test Oxidase (τεστ οξειδάσης) Το τεστ Oxidase γίνεται όταν χρησιμοποιήσω το θρεπτικό υλικό TCA. Είναι μια σημαντική διαδικασία που πρέπει να πραγματοποιείται σε όλα τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια που πρέπει να προσδιοριστούν. Κατά τη διαδικασία της εξέτασης ακολουθούνται τα παρακάτω βήματα: 1. Ανοίγουμε τη θήκη του BBL DrySlide Oxidase και αφαιρούμε τον απαιτούμενο αριθμό πλακών (δεν επανατοποθετούμε μια χρησιμοποιημένη BBL DrySlide Oxidase στη θήκη). 2. Με τη χρήση αποστειρωμένης λαβίδας, επιλέγουμε απομονωμένες Εικόνα 2.18: αποτελέσματα του τεστ οξειδασης αποικίες (ανεπτυγμένες στο θρεπτικό υλικό TCA) από την καλλιέργεια που θα εξεταστεί. 3. Επιχρίσουμε τον μικροοργανισμό απευθείας πάνω στην περιοχή αντίδρασης της πλάκας/μεμβράνης. 4. Εξετάζουμε την περιοχή αντίδρασης για τυχόν εμφάνιση σκούρου μωβ χρώματος εντός 20 sec. Αγνοούμε την ανάπτυξη χρώματος μετά από 20 sec. Αντίδραση Οξειδάσης Όνομα Χρωματική απόκριση Escherichia Coli - Άχρωμη έως γκρι Οι θετικοί στην οξειδάση μικροοργανισμοί εμφανίζουν μωβ ή σκούρο χρώμα εντός 20 sec. Οι αρνητικοί στην οξειδάση μικροοργανισμοί δεν εμφανίζουν χρωματική μεταβολή ή εμφανίζουν μεταβολή σε ανοιχτό γκρι εντός της περιόδου εξέτασης των 20 sec. 42

2.4.2.7.3 Εντερόκοκκοι faecalis Στο τρυβλίο με θρεπτικό υλικό SB: Οι μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται είναι οι εντερόκοκκοι, αναγνωρίσιμοι με τη μορφή κόκκινων αποικιών. Στη συνέχεια απαιτείται το test esculine για τη διάκριση των εντερόκοκκων faecalis (που εμάς ενδιαφέρει) από τα υπόλοιπα είδη. Στο τρυβλίο με θρεπτικό υλικό BEA: Οι μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται είναι μόνο οι εντερόκοκκοι faecalis, αναγνωρίσιμοι με τη μορφή σκούρου καφέ αποικιών. 2.4.2.7.3.1 Test Esculine (τεστ αισκουλίνης) Το esculine agar είναι ένα εκλεκτικό διαφορικό άγαρ που χρησιμοποιείται για τη διαφοροποίηση των μελών του γένους Enterococcus από τους στρεπτόκοκκους. Οι εντερόκοκκοι υδρολύουν την αισκουλίνη σε προϊόντα που αντιδρούν με το κιτρικό άλας σιδήρου στο μέσο για την παραγωγή αδιάλυτων ιόντων σιδήρου, με αποτέλεσμα την παραγωγή μαύρων δακτυλίων. Γι αυτό το λόγο, κάθε φορά πριν καταμετρήσουμε τις αποικίες των εντερόκοκκων στο τρυβλίο με θρεπτικό υπόστρωμα SB, απαιτείται η μεταφορά της μεμβράνης (των πυκνών δειγμάτων) σε τρυβλίο με bile esculine agar (BEA), μιας και στο SB αναπτύσσονται όλοι οι εντερόκοκκοι, ενώ στο BEA αναπτύσσονται μόνο οι εντερόκοκκοι faecalis. Η μεταφορά γίνεται με αποστειρωμένη λαβίδα και στη συνέχεια τα τρυβλία τοποθετούνται σε διακριβωμένο κλίβανο για 2h (στα 45 λεπτά γίνεται ο πρώτος έλεγχος). 2.4.2.8 Απομόνωση μικροοργανισμού από μεικτό πληθυσμό Καθαρή καλλιέργεια είναι εκείνη κατά την οποία όλοι οι μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται είναι απόγονοι του ίδιου μικροοργανισμού, δηλαδή οι αποικίες που έχουν αναπτυχθεί, προέρχονται από τον πολλαπλασιασμό ενός μικροβιακού κυττάρου. Η απομόνωση ενός μικροοργανισμού σε καθαρή καλλιέργεια από μεικτό πληθυσμό μπορεί να πραγματοποιηθεί συνδυάζοντας διάφορες μικροβιακές μεθόδους όπως: Αραίωση του δείγματος με το εκλεκτικό θρεπτικό υπόστρωμα σε τρυβλίο Petri Διασπορά των μικροβιακών κυττάρων στην επιφάνεια στερεοποιημένου εκλεκτικού θρεπτικού υποστρώματος (επίστρωση) Μέθοδο παράλληλων γραμμών σε τρυβλία Petri με στερεό θρεπτικό υπόστρωμα Κατά τη διαδικασία του εμβολιασμού, μεταφέρουμε σε κατάλληλο στερεοποιημένο υπόστρωμα μια αποικία μικροοργανισμών, τόσο Εικόνα 2.19: εμβολιασμός προσεκτικά ώστε να μη χαραχθεί η επιφάνεια του υποστρώματος και σε ασηπτικές συνθήκες, χρησιμοποιώντας τον κρίκο εμβολιασμού. Σχηματίζοντας παράλληλες ή ελικοειδής γραμμές πάνω 43

στο υπόστρωμα με τον κρίκο εμβολιασμού (ο οποίος σύρεται στην επιφάνεια), επιτυγχάνουμε μέσω της προοδευτικής απομάκρυνσης των βακτηριακών κυττάρων μεταξύ τους, την απόθεση απομονωμένων κύτταρων στην επιφάνεια του θρεπτικού υποστρώματος και δημιουργία αποικιών. (Κουτσουμάνης, 2011) 2.4.3 Μέθοδος κοκκομετρικών αναλύσεων Η μέθοδος εργαστηριακού ελέγχου των δειγμάτων που εφαρμόζεται είναι η εξής: Επιλογή ποσότητας δείγματος Ξήρανση του δείγματος, για να μην έχει φυσική υγρασία (1 ον για να μην τη μετρήσω στο κόσκινο και 2 ον δεν περνάει από το κόσκινο εάν έχει φυσική υγρασία) Ζύγισμα της ποσότητας του δείγματος που επιλέγω να κοσκινίσω Τοποθετώ το δείγμα στο κατάλληλο κόσκινο (στο ανώτερο πιάτο), αφού πρώτα έχω τοποθετήσει στη συσκευή τα πιάτα με τη σειρά το ένα πάνω στο άλλο (προς τα πάνω τα πιάτα με μεγαλύτερο εύρος των ανοιγμάτων σχήματος τετραγώνου μέσα στα οποία θα περάσει το ακανόνιστο κομμάτι) και το βάζω σε λειτουργία για 3 λεπτά Ζύγισμα κάθε πιάτου μαζί με το υλικό που έχει κρατηθεί στον πάτο από το κοσκίνισμα, αφού πρώτα γίνει καταγραφή του βάρους που έχει κάθε πιάτο άδειο Καταγραφή του ποσοστού απώλειας του υλικού που τυχόν υπήρξε, μετά το κοσκίνισμα 2.4.3.1 Υπολογισμός κοκκομετρικού μεγέθους Η διαδικασία ανάλυσης του κοκκομετρικού μεγέθους σ ένα κλασικό ιστό (π.χ. με κόσκινα) ονομάζεται κοκκομετρική ανάλυση (grain size analysis). Τα γραφικά ή αριθμητικά αποτελέσματα της ανάλυσης, παρέχουν την κοκκομετρική κατανομή του ιζήματος. Όλες οι μέθοδοι ανάλυσης ξεκινούν με ένα ζυγισμένο δείγμα και καταλήγουν στον προσδιορισμό των επιμέρους βαρών για συγκεκριμένα διαστήματα διαμέτρου (σε mm ή σε Ø). Στον παρακάτω πίνακα δίνεται ένα παράδειγμα σχετικά με τα αποτελέσματα μιας κοκκομετρικής ανάλυσης. Διάμετρος (mm) Ø (-log2(δ)) Βάρος Δείγματος (gr) Βάρος (%) Αθροιστικό (%) 4-2,0 1318,77 58,23 58,23 2-1,0 558,16 24,65 82,87 1 0,0 330,83 14,61 97,48 0,5 1,0 55,59 2,45 99,94 0,25 2,0 1,11 0,05 99,99 0,125 3,0 0,21 0,01 100,00 0,063 4,0 0,05 0,00 100,00 0,045 4,5 0,02 0,00 100,00 Πίνακας 2.1: Κοκκομετρική ανάλυση με κόσκινα σε δείγμα άμμου από την αμμώδη παραλία στην περιοχή του ξενοδοχείου Porto Rio. 44

Αθροιστικό βάρος δείγματος (%) Βάρος Δείγματος (%) Ο πίνακας 3 είναι πίνακας συχνοτήτων. Στην 1 η, 2 η στήλη είναι οι κλάσεις της κοκκομετρικής κλίμακας κατά Krumbein-Udden-Wentworth (σε mm και σε Ø αντίστοιχα). Στην 3 η στήλη είναι η συχνότητα κάθε κλάσης, δηλαδή το βάρος του δείγματος σε κάθε κόσκινο συγκεκριμένης διαμέτρου. Στην 4 η στήλη είναι η εκατοστιαία συχνότητα, και στην 5 η στήλη η αθροιστική εκατοστιαία συχνότητα. Τα δεδομένα κάθε κοκκομετρικής ανάλυσης (π.χ. πίνακας 3), απεικονίζονται με διαγράμματα, όπως είναι: Το ιστόγραμμα Το πολύγωνο συχνότητας Το πολύγωνο αθροιστικής εκατοστιαίας συχνότητας Ιστόγραμμα (histogram): στην παρακάτω εικόνα παριστάνεται το ιστόγραμμα των δεδομένων του πίνακα 3. 60,00 40,00 20,00 0,00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 διάμετρος (mm) Πίνακας 2.2: Ιστόγραμμα, με βάση των δεδομένων του πίνακα 3. Στο παραπάνω ιστόγραμμα ο άξονας x αποτελείται από τις τιμές διαμέτρου του κάθε κόσκινου που χρησιμοποιείται, και στον άξονα y τα αντίστοιχα βάρη % των δειγμάτων που μένουν στο κάθε κόσκινο. Θα πρέπει να αναφερθεί, ότι το ιστόγραμμα είναι μια απλή απεικόνιση, και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ερμηνεία μιας οποιασδήποτε στατιστικής παραμέτρου. Επί πλέον, το σχήμα του εξαρτάται από την εκλογή του ανοίγματος των κοσκίνων, δηλαδή η επιλογή διαφορετικών σετ κοσκίνων στο ίδιο δείγμα θα μας δώσει διαφορετικό ιστόγραμμα. Καμπύλη αθροιστικής επί τοις % συχνότητας (cumulated frequency percent): Πρόκειται για την πιο συχνά χρησιμοποιούμενη γραφική παράσταση. 0,00 20,00 40,00 60,00 Σ 80,00 100,00 0,01 0,1 1 διάμετρος (mm) 10 Πίνακας 2.3: Καμπύλη αθροιστικής επί τοις % συχνότητας, με βάση τα δεδομένα του πίνακα 3. 45