ΝΕΑ ΑΝΑΛΟΓΑ ΚΟΥΜΑΡΙΝΩΝ ΜΕ ΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΗ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΚΑΙ ΑΝΤΙΦΛΕΓΜΟΝΩΔΗ ΔΡΑΣΗ Ελένη Καβέτσου, Εύη Χαραλάμπους, Αναστασία Σχινά, Μαρίνα Ρουσσάκη, Αναστασία Δέτση Εργαστήριο Οργανικής Χημείας, Σχολή Χημικών Μηχανικών, Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο, Ηρώων Πολυτεχνείου 9, Ζωγράφου, 15780, Αθήνα, Ελλάδα Θάλεια Λιαργκόβα, Ελένη Ποντίκη, Δήμητρα Χατζηπαυλου- Λιτίνα Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Σχολή Επιστημών Υγείας, Τμήμα Φαρμακευτικής, Τομέας Φαρμακευτικής Χημείας, 54124, Θεσσαλονίκη, Αθήνα ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι κουμαρίνες αποτελούν μια ευρέως γνωστή οικογένεια φυσικών προϊόντων, που παρουσιάζουν πληθώρα βιολογικών δράσεων με αντιπροσωπευτικές την αντιοξειδωτική, την αντικαρκινική, την αντιφλεγμονώδη και την αντιμικροβιακή δράση. Οι λιποξυγονάσες (LO) είναι ένζυμα, τα οποία περιέχουν σίδηρο και στον ανθρώπινο οργανισμό επιτελούν σημαντικό ρόλο για την βιοσύνθεση των λευκοτριενίων. Οι αναστολείς των λιποξυγονάσων, έχουν προσελκύσει την προσοχή ως πιθανοί παράγοντες για τη θεραπεία φλεγμονωδών και αλλεργικών ασθενειών, ενώ παράλληλα το θεραπευτικό τους υπόβαθρο έχει τώρα επεκταθεί σε ορισμένους τύπους καρκίνου, καρδιαγγειακών παθήσεων και παθολογικών καταστάσεων συμπεριλαμβανομένου και του οξειδωτικού στρες. Σκοπός παρούσας εργασίας είναι η σύνθεση νέων κουμαρινικών αναλόγων με δομικές τροποποιήσεις στις θέσεις 3-, 4-, 5- και 7- του κουμαρινικού συστήματος με στόχο να κατασκευαστεί μια μικρή χημική βιβλιοθήκη μορίων για τη μελέτη σχέσης δομής-βιολογικής δράσης, αξιολογώντας την αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση τους μέσω in vitro πειραμάτων. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι κουμαρίνες ή αλλιώς βενζο-α-πυρόνες είναι ετεροκυκλικές οργανικές ενώσεις με δυο εξαμελείς δακτυλίους, ένα άτομο οξυγόνου και ένα γειτονικό σε αυτό καρβονύλιο στην κύρια αλυσίδα και αποτελούν μια πολύ σημαντική κατηγορία ενώσεων φυσικής και συνθετικής προελεύσεως, παρουσιάζοντας πληθώρα βιολογικών δράσεων με αντιπροσωπευτικές την αντιοξειδωτική, την αντιφλεγμονώδη και την αντικαρκινική δράση. Μεγάλος αριθμός τους απαντάται στο φυτικό βασίλειο είτε σε ελεύθερη κατάσταση είτε υπό μορφή παραγώγων τους με σάκχαρα και εμφανίζουν σημαντικό συνθετικό ενδιαφέρον λόγω αξιόλογης βιολογικής δραστικότητας τους. [1], [2], [3] Σχήμα 1. Χημικές δομές κουμαρίνης (2-Η-χρωμεν-2-όνη) και δαφνίνης (κουμαρίνες που απομονώνονται από φυσικές πηγές) Έχουν πραγματοποιηθεί έρευνες προς την κατεύθυνση παραγωγής υδρόξυ κουμαρινών με το υδροξύλιο να βρίσκεται σε διάφορες θέσεις του δακτυλίου. Συγκεκριμένα, έχουν παρασκευασθεί 7 υδροξυ-κουμαρίνες από τις οποίες έχουν ληφθεί θετικά αποτελέσματα ως προς τις δράσεις τους. Η 7-υδροξυκουμαρίνη που είναι γνωστή ως ουμπελιφερόνη απαντάται σε φυτά του γένους Scopoletin. Επιπλέον η φυσική βιοδραστική 7-υδροξυ-6- μεθοξυκουμαρίνη (HMC), απομονώθηκε από το μεθανολικό εκχύλισμα Sempervirens Gelsemium και αποδείχτηκε να κατέχει ισχυρές αντικαρκινικές δυνατότητες ύστερα από in vitro μελέτες. [4] Επίσης, τα οξυ-πρενυλιωμένα φυσικά προϊόντα (ισοπεντενυλοξυ-, γερανυλοξυ- και οι λιγότερο διαδεδομένες φαρνεσυλοξυ-ενώσεις και τα
παράγωγά τους) αντιπροσωπεύουν μια οικογένεια δευτερογενών μεταβολιτών που θεωρούνται για χρόνια ως βιοσυνθετικά ενδιάμεσα των παραγώγων που έχουν πρενυλιωμένο άνθρακα. Μόλις την τελευταία δεκαετία αυτά τα φυσικά προϊόντα έχουν αναγνωριστεί ως ενδιαφέρουσες και βιολογικώς δραστικές φυτοχημικές ενώσεις. Οι πρενυλοξυ-κουμαρίνες αποτελούν δευτερογενείς μεταβολίτες που βρίσκονται συνήθως σε διάφορα φυτά των οικογενειών Rutaceae και Umbelliferae. Ορισμένες από τις κουμαρίνες αυτές παρουσιάζουν αξιόλογες φαρμακευτικές ιδιότητες. Μεταξύ αυτών, η ωραπτένη (7-γερανυλοξυ-κουμαρίνη) που έχει απομονωθεί από τον φλοιό εσπεριδοειδών, αναφέρεται ότι έχει χημειοπροστατευτικές επιδράσεις ενάντια στην χημικώς προκαλούμενη καρκινογένεση και επιπλέον παρουσιάζει αντιοξειδωτική δράση. Τρεις είναι οι τύποι των πρενυλιωμένων σκελετών άνθρακα που έχουν ταυτοποιηθεί: C5 (isopentenyl), C10 (geranyl), C15 (farnesyl). [5] ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Στόχος παρούσας ερευνητικής εργασίας ήταν αρχικά η σύνθεση 7 και 5 υδρόξυ κουμαρινικών παραγώγων που περιέχουν αρωματικό υποκαταστάτη στη θέση 3, και εν συνεχεία μέσω αντιδράσεων αλκυλίωσης, η σύνθεση πρενυλόξυ κουμαρινικών παραγώγων. Η σύνθεση των 7 και 5 υδροξυ-κουμαρίνων 4a-4g πραγματοποιήθηκε αρχικά μέσω αντίδρασης συμπύκνωσης 2,4-διυδροξυ-ακετοφαινόνης (2a), 2,6-διυδροξυ-ακετοφαινόνης (2b) και 2,4-διυδροξυ βενζαλδεϋδης, με χλωρίδια φαινυλοξικών οξέων σε βασικό περιβάλλον, με πολύ χαμηλές όμως αποδόσεις. (Σχήμα 2) Σχήμα 2. Συνθετική πορεία 3-αρυλο-7-υδροξυ και 3-αρυλο-5-υδροξυ κουμαρινών 4a-4g. Λόγω των πολύ χαμηλών αποδόσεων συνθετικής αυτής πορείας ακολουθήθηκε εναλλακτική πορεία δυο σταδίων. Αρχικά πραγματοποιήθηκε αντίδραση συμπύκνωσης κατάλληλα υποκατεστημένης 2-υδροξυακετοφαινόνης ή βενζαλδεϋδης με φαινυλοξικά οξέα 1, παρουσία τριαιθυλαμίνης (Et 3 N) και οξικού ανυδρίτη (Ac 2 O) υπό θέρμανση, οπότε προέκυψαν τα 7- ή 5-ακετυλοξυ- παράγωγα 3a-3g σε ικανοποιητικές αποδόσεις (>70) και χωρίς να απαιτούνται περαιτέρω διεργασίες καθαρισμού. (Σχήμα 3) Σχήμα 3. Αντίδραση σύνθεσης 7-ακετυλοξυ-3-αρυλο- και 5-ακετυλοξυ-3-αρυλο-κουμαρινών 3a-3g.
Τα τελικά προϊόντα των υδροξυ-κουμαρινών 4a-4g (Σχήμα 4) ελήφθησαν σε δεύτερο στάδιο ύστερα από αντίδραση απακετυλίωσης των αρχικών μορίων 3a-3g παρουσία υδραζίνης σε διαλύτη μεθανόλη στους 25oC με ικανοποιητικότερες αποδόσεις (>80), πλεονεκτώντας σημαντικά προηγούμενης μεθόδου σύνθεσης υδρόξυκουμαρινών. Σχήμα 4. Αντίδραση σύνθεσης απακετυλιωμένων κουμαρινών 4a-4g. Για την περαιτέρω διερεύνηση του τρόπου που επηρεάζει η δομή τη βιολογική δράση, πραγματοποιήθηκαν τροποποιήσεις στα κουμαρινικά παράγωγα 4a, 4b, 4d, 4e και 4f με αποτέλεσμα 5 νέα παράγωγα 5a, 5b, 5d, 5e και 5f, τα οποία προέκυψαν κατόπιν αποπροστασίας των μεθοξυ-ομάδων του αρωματικού δακτυλίου θέσης 3 των αρχικών κουμαρινικών παραγώγων. Μέσω των παραγώγων 5c, 5d, 5e διερευνήθηκε επιπλέον και η επίδραση παρουσίας κατεχολικού συστήματος στη βιολογική δράση των μορίων. Συγκεκριμένα, για την αποπροστασία μεθοξυ-ομάδας, τα κατάλληλα παράγωγα, κατεργάστηκαν με διάλυμα BBr 3 σε άνυδρο διχλωρομεθάνιο, προκύπτοντας τα νέα μόρια 5a, 5b, 5d, 5e και 5f (Σχήμα 5). Σχήμα 5. Αντίδραση αποπροστασίας κουμαρινών 5a,5b,5d,5e. Προκειμένου να συντεθούν τα πρενυλοξυ κουμαρινικά παράγωγα χρησιμοποιήθηκαν δυο κουμαρίνες, η 7υδρόξυ κουμαρίνη και η 4-μεθυλο-7-υδροξυ κουμαρίνη. Η σύνθεση 7-υδροξυ-4-μεθυλο-κουμαρίνης 6b πραγματοποιείται μέσω συμπύκνωσης ρεσορκινόλης με τον ακετοξικό αιθυλεστέρα υπό την επίδραση πυκνού θειϊκού οξέος, σύμφωνα με την αντίδραση Pechmann. Εν συνεχεία τα πρενυλοξυ-κουμαρινικά παράγωγα, 7a-7d, ελήφθησαν μέσω αντίδρασης αλκυλίωσης, με το γερανυλο-βρωμίδιο ή το φαρνεζυλ-βρωμίδιο σε βασικό περιβάλλον. (Σχήμα 6)
Σχήμα 6. Σύνθεση πρενυλοξυ-κουμαρινών 7a-7d. H αντιοξειδωτική δράση των νέων μορίων αξιολογήθηκε in vitro με βάση την ικανότητα δέσμευσης σταθερής ελεύθερης ρίζας DPPH και την αναστολή λιπιδικής υπεροξείδωσης του λινολεϊκού οξέος που επάγεται από τη ρίζα AAPH ενώ, ως ένδειξη πιθανής αντιφλεγμονώδους δράσης τους, μελετήθηκε η ικανότητά τους αναστέλλουν τη δράση φυτικής λιποξυγονάσης από σόγια (LO). Τα αποτελέσματα που προέκυψαν παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Παρασκευάστηκαν συνολικά 25 κουμαρινικά παράγωγα υψηλής καθαρότητας και αποδόσεων, τα οποία περιέχουν διάφορους υποκαταστάτες στον βενζοπυρανικό δακτύλιο του κουμαρινικού συστήματος, πολλά από τα οποία είναι άγνωστα στην διεθνή βιβλιογραφία. Οι ενώσεις ταυτοποιήθηκαν δομικά μέσω φασματοσκοπίας πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) και φασματοσκοπίας μάζας (ESI-MS) και αξιολογήθηκαν για την αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση τους. Αναφορικά με την αντιοξειδωτική δράση των νέων μορίων, η πλειοψηφία των αναλόγων που συντέθηκαν παρουσίασαν ικανοποιητική αναστολή υπεροξείδωσης του λινελαϊκού οξέος. Όπως παρατηρείται το παράγωγο το οποίο είχε την καλύτερη αλληλεπίδραση με την ελεύθερη ρίζα DPPH ήταν η κουμαρίνη 5b, που διαθέτει κατεχολικό σύστημα στον αρωματικό δακτύλιο θέσης 3. Όπως φαίνεται η φυσική κουμαρίνη ουμπελιφερόνη 6a παρουσιάζει πολύ καλή αντιφλεγμονώδη δράση ενώ η προσθήκη του μεθυλίου στο προϊόν 6b οδηγεί σε μη δραστικό προϊόν. Αντίθετα στην περίπτωση των πρενυλόξυ αναλόγων τα 4-μέθυλο ανάλογα 7b και 7d εμφανίζουν πολύ πιο ισχυρή αναστολή δράσης λιποξυγονάσης από σόγια αντίθετα με τα μη μεθυλιωμένα στη θέση 4, 7a και 7c. Σημαντικό συμπέρασμα από τα αποτελέσματα μελέ βιολογικής δράσης των νέων ενώσεων είναι ότι το ανάλογο 5b παρουσιάζει ιδιαίτερα αξιόλογη συνδυασμένη αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση, συγκρίσιμη ή και μεγαλύτερη από τις ενώσεις αναφοράς. Τα αποτελέσματα αξιολόγησης οδηγούν σε χρήσιμα συμπεράσματα για τη σχέση δομής-βιολογικής δράσης και προκύπτουν 3 μόρια οδηγοί 5b, 6a και 3g, σε καθαρή μορφή και με υψηλές αποδόσεις, με συνδυασμένη καλή αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση καθώς και 2 πρενυλόξυ ανάλογα που έχουν πολύ καλή αντιφλεγμονώδη δράση. Πίνακας 1. Αποτελέσματα in vitro αξιολόγησης αντιοξειδωτικής και αντιφλεγμονώδους δράσης των νέων μορίων. Προϊ όν Αλληλεπίδρ αση με την ελεύθερη ρίζα DPPH() 20/60 min Αναστολή υπεροξείδω σης του λινελαϊκού οξέος ( ) Ικανότητα αναστολής λιποξυγονά σης από σόγια Προϊ όν Αλληλεπίδρ αση με την ελεύθερη ρίζα DPPH() 20/60 min Αναστολή υπεροξείδω σης του λινελαϊκού οξέος ( ) Ικανότητα αναστολής λιποξυγονά σης από σόγια (IC 50 μμ) (IC 50 μμ) 3a 16.2/65.27 64.10 28.4 4g 3.6/10.1 65.9 7.3
3b 7/6 27 15 5a 1.9/1.7 No 32.8 3c 4/6 No 16 5b 84.87/88.80 99.3 96.5 3d 7.5/no 16.6 no 5d 12.8/10.3 18.6 14.1 3e 2.6/no 4.5 15.9 5e 3.3/2.6 78.2 43.2 3f no/no 26 10.4 5f 25.8/25.4 No 12.7 3g no/no 87.7 81.3 6a ½ 92 100 (ΙC50 (57.5μΜ) = 41μM) 4a Νο/Νο 59.6 18.5 6b No/no 93 no 4b Νο/2.52 88.4 43.6 7a 45/47 92 4 4c Νο/14.29 12.8 7.4 7b 31/4 47 77 (IC50= 76μΜ) 4d 12.8/10.3 18.6 14.1 7c 26/6 52 44 4e 8.86/3.52 60.0 5.2 7d 21/no 20 78 (ΙC50 = 65μM) 4f 1.78/87.3 60.20 28.3 Trolο x 63 4g 3.6/10.1 65.9 7.3 5a 1.9/1.7 No 32.8 NDG A 84.0/83.0 40μΜ/83.7 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ [1]. Richard O'Kennedy, R.Douglas Thornes. Coumarins-Biology, Applications nad Mode of Action. s.l. : JOHN WILEY & SONS, 1997. [2]. Marina Roussaki, Christos A. Kontogiorgis, Dimitra Hadjipavlou-Litina, Stylianos Hamilakis, Anastasia Detsi, A novel synthesis of 3-aryl coumarins and evaluation of their antioxidant and lipoxygenase inhibitory activity, Bioorg. Med. Chem. Lett, 2010, 20, 3889-3892 [3]. Marina Roussaki, Konstantinos Zelianaios, Eleni Kavetsou, Stylianos Hamilakis, Dimitra Hadjipavlou- Litina, Christos Kontogiorgis, Thalia Liargkova, Anastasia Detsi, «Structural modifications of coumarin derivatives: Determination of antioxidant and lipoxygenase (LOX) inhibitory activity, Bioorg. Med. Chem. 2014, 22, 6586-6594 [4]. Khuda-Bukhsh A.R., Bhattacharyya SS, Paul S., Poujedaini N.,. J. Chin. Integr. Med.,. (2010), 8(9): 853-862. [5]. Kariyone T, Matsuno T, Studies on the constituents of orange oil. I. On the structure of auraptene, Pharm. Bull, 1953, 1, 19-22.