בהאבקה והפריה בתפוח Malus domestica מהזן Topred מאת

לימוד גורמים ביולוגיים, אקולוגיים ומולקולריים הקשורים בהאבקה והפריה בתפוח Malus domestica מהזן Topred חיבור לשם קבלת התואר "דוקטור לפילוסופיה" מאת דורון שניידר הוגש לסנאט של אוניברסיטת תל-אביב כסלו תשס"ג דצמבר 2002 א

עבודה זו נעשתה בהדרכת פרופ' דן איזיקוביץ דר' מרטין גולדווי ב

העבודה מוקדשת לדיני רפי ומרטין תודה על הכל ג

תודות אני רוצה להודות באופן מיוחד לדר' המחקר. רפי שטרן על הייעוץ וההכוונה בכל שלבי אני רוצה להודות לוועדה שליוותה את עבודת המחקר, פרופ' אביה זילברשטיין, פרופ' אברהם חפץ ודר' אמיר שרון, על תשומת הלב וההערות המועילות. להילה יהודה, אבי מתתיהו, אסנת שי, גל ספיר וענת זיסוביץ מהמעבדה במי"גל, ליפתח ואקנין, עידית לונדון וורד פיכמן מהמעבדה בתל-אביב תודה על העזרה בעת הצורך. לגארי וורד תודה על בדיקות ה- HPLC. לרמי אברהמי, שולי גל ז"ל, יצחק דאהן ושאר אנשי מטע ברעם, ליובל עוגני ושאר אנשי חוות מתתיהו תודה על שיתוף הפעולה בניסויי השדה. המחקר מומן באמצעות קרן מדען של משרד החקלאות (מספר 596-0186) ומשרד המדע (מספר 1272199) ומלגות מאת אונ' תל-אביב, מועצת-הפירות ומו"פ צפון. ד

תקציר זן התפוחים, Topred בו התמקד המחקר, הינו אחד הואריאנטים של הזן. Delicious ואריאנטים אלה מניבים פרי איכותי הפודה תמורה גבוהה, אך יחד עם זאת פוריותם נמוכה. מטרת העבודה הייתה ללמוד על ההאבקה וההפריה בתפוח, תוך שימת דגש על גורמים אקולוגיים, ביולוגיים ומולקולריים המשפיעים על הפוריות הלקויה של ה- Topred במטעי הארץ. ממצאים מוקדמים הראו כי התאם גנטי חלקי בין Topred והזן המאביק Jonathan מתבטאים בשיעורי חנטה ויבול נמוכים, לעומת מצב של התאם גנטי מלא בין Topred לזן המאביק. Smoothee בעבודה נבדק הקשר בין ההתאם הגנטי לבין כמות האבקה המגיעה לצלקת. בניסוי האבקה ידנית עם עודף אבקה עלו שיעורי החנטה, מכאן שמיעוט אבקה הינו גורם מגביל בקבלת היבול בזן Topred במטעי הארץ. ניתן להתגבר באופן חלקי על המחסור באבקה על-ידי שימוש בזנים מאביקים המתאימים גנטית ל- Topred, ולכן עלה הצורך לקבוע את ההתאם הגנטי בין Topred ליתר הזנים המאביקים במטע. לאחר שבודדו שני אללי S חדשים, S28 מ- Topred ו- S10 מ- Smith, Granny ניתן היה לקבוע כי מבין ארבעת הזנים המקובלים כמאביקים ל- Topred במטע המסחרי רק ה- Jonathan הינו בעל התאם גנטי חלקי, ואילו היתר מתאימים גנטית להפריית. Topred גורם נוסף שנבדק היה יעילות ההאבקה של דבורי הדבש כתלות בתכונות הפרח. תדירות ביקורי הדבורים בפרחי Topred נמצאה דומה ל- Smoothee וגבוהה ביחס ל- Jonathan. לא נמצאו הבדלים בכמות הצוף והרכבו בין הזנים, לעומת זאת מבנה הפרח נמצא שונה. בפרחי Jonathan המרווח שבין בסיס הזירים נושאי האבקנים צר, בעוד שבפרחי Topred ו- Smoothee הוא רחב. כתוצאה מכך רוב הדבורים המבקרות בפרחי Topred (80-90%) ו- Smoothee (-60 90%) אוספות צוף מצד הפרח ( Sideworkers ) ואינן משתתפות בהאבקה, בעוד שבפרחי Jonathan רובן פועלות מחלקו העליון של הפרח.( Topworkers ) הבדל נמצא גם בקוטר פיזור האבקנים. בפרחי Topred הוא צר, בהשוואה לפרחי. Smoothee כתוצאה מכך לדבורים, שאוספות צוף מחלקו העליון של פרח ה- Topred א, ין גישה נוחה לצופנים הממוקמים על מצעית הפרח. יתכן וזו הסיבה לכך שבפרחי Topred נמצא השיעור הגבוה ביותר של דבורים הפועלות כ- Sideworkers. בנוסף, צלקות פרחי Topred נמוכות מהמאבקים ומוסתרות בשל כך, בעוד שבפרחי Smoothee הן בגובה המאבקים. כאשר הצלקות נמוכות מהמאבקים לא קיים מגע טוב בין גוף הדבורה נושא האבקה לבין הצלקות, וכתוצאה מכך חלה ירידה ביעילות ההאבקה באמצעות הדבורים. כך, למרות שתדירות ביקורי הדבורים ב- Topred דומה ל- Smoothee וגבוהה ביחס ל- Jonathan, יעילות האבקה של פרחי Topred נמוכה בהשוואה אליהם. במסגרת העבודה פותח כלי לזיהוי מדויק של ההורות בקרב הצאצאים, באמצעות.PCR בעזרתו נמצא כי ה- Topred בעל אי התאם עצמי מלא, בעוד שה- Smoothee בעל התאם עצמי חלקי ה

(שיעור ההפריה העצמית בפרחי Smoothee בעודף האבקה עצמית היה 12% בלבד). מכאן שהפריה עצמית אינה יכולה להיות הגורם להבדל בפוריות בין Topred ל- Smoothee (2 טון/דונם ו- 5 טון/דונם בממוצע, בהתאמה). בנוסף, הממצאים מצביעים על כך שה- Smoothee חייב לעבור הפריה זרה כדי לשאת יבולים מסחריים. לפיכך אין לטעת אותו כ- block,solid אלא לטעת בסמיכות לו זנים מאביקים. הממצא העיקרי שבאמצעותו ניתן להסביר את ההבדל בפוריות בין הזנים Topred ו- Smoothee הינו כושר החנטה הנמוך של פרחי. Topred הסיבה לכך הינה תקינות נמוכה של פרחים הפוגעת בהפריה ובהתפתחות התקינה של הזרעים. בעקבות ממצאי העבודה שונו הרכבי הזנים המאביקים במטע: הזן Jonathan הוצא משימוש כזן מאביק ל- Topred, ובמקומו הוגבר השימוש בזנים, Smoothee Royal Gala ו- Granny.Smith כמו-כן שונה נוהל ממשק דבורי הדבש במטעים, במטרה להגביר את ההאבקה. יישום שיטות אלה במטעי הארץ הביא לעליה של כ- 30% ביבולי. Topred ו

רשימת קיצורים bp - base pairs BSA - Bovine Serum Albumin ºC Celcius degree cdna - complementary DNA ddh 2 O - double distilled water DNA - deoxyribonucleic acid dntp - deoxynucleoside-5 -triphosphate gr gram GSI - Gametophytic self-incompatibility HPLC High Performance Liquid Chromatography HV Hypervariable Domain IPTG - isopropyl-beta-d-thiogalactopyranoside kb - kilobase kda kilo Dalton l - liter M molar Md Malus domestica min - minute mg milligram ml milliliter mm - millimolar mm - millimeter MW Molecular Weight µg - microgram µl - microliter ng - nanogram nm - nanometer OD - Optical Density ODu OD unit PCR - Polymerase Chain Reaction pi Isoelectic point ז

PPM - Pollen-part mutant Ps Pyrus serotina RNA - ribonucleic acid RNase Ribonuclease RI Refractive Index rpm - revolutions per minute S.E.- Standard Error SSI- Sporophytic self-incompatibility Temp - temperature V volts w/v weight per volume X-gal - 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-d-galactosidase ה.פ. התחלת פריחה ש.פ. - שיא הפריחה ס.פ. - סוף פריחה ח

תוכן העניינים 1 1 1 1 1 2 2 2 3 3 4 5 6 7 7 8 8 9 9 10 12 13 13 13 13 13 14 14 14 14 15 15 15 15 16 1. מבוא.1.1 התפוח domestica) (Malus 1.1.1. הגדרה בוטנית 1.1.2. רקע היסטורי 1.1.3. גידול בעולם 1.1.4. גידול בארץ 1.2. התפתחות פרי התפוח 1.2.1. תהליכי האבקה והפריה 1.2.2. אי התאם עצמי גמטופיטי (GSI) 1.2.2.1. הקדמה.1.2.2.2 האנזים S-RNase 1.2.2.3. גנים נוספים הדרושים לתגובת GSI 1.2.2.4. מודלים לדחיית גרגר אבקה עצמי במנגנון GSI 1.2.3. האבקת פרחי התפוח באמצעות דבורי-דבש mellifera) (Apis 1.2.3.1. הקדמה 1.2.3.2. תדירות ביקורי הדבורים 1.2.3.3. ניידות הדבורים בין הזנים במטע 1.2.3.4. אופן איסוף הגמול מהפרחים 1.2.4. הפריה והתפתחות החנטים בתפוח 1.3. זן התפוח Delicious ופוריותו הנמוכה 1.4. מטרת העבודה 2. חומרים ושיטות 2.1. חומרים ביולוגיים וכימיים 2.1.1. זני התפוח 2.1.2. זן החיידקים 2.1.3. פלסמידים 2.1.4. חומרים כימיים 2.2. ניסויי השדה 2.2.1. המטעים בהם נערכו הניסויים 2.2.2. שלבי התפתחות הפרח 2.2.3. כיוס הפרחים 2.2.4. מועדי הפריחה 2.2.5. האבקה ידנית 2.2.6. רצפטיביות הצלקות 2.2.7. חיוניות גרגרי האבקה ט

16 16 17 17 17 17 18 18 18 18 18 18 18 19 19 19 19 19 19 20 22 22 22 22 23 23 24 24 24 24 26 26 27 28 2.2.8. מבנה הפרח 2.2.9. תכונות הצוף 2.2.10. התנהגות דבורי הדבש mellifera) (Apis 2.2.11. החנטה לאורך חיי הפרח 2.2.12. מספר הזרעים החיוניים במהלך התפתחות החנטים 2.2.13. ניתוחים סטטיסטיים 2.3. ניסויי המעבדה 2.3.1. שיטות עבודה עם צמחים 2.3.1.1. הנבטת הזרעים 2.3.1.2. שימור העלים והעליים 2.3.2. שיטות עבודה עם חיידקים.2.3.2.1 גידול חיידקי E. coli 2.3.2.2. טרנספורמציה לחיידקי E.coli 2.3.3. שיטות עבודה עם DNA רקומביננטי 2.3.3.1. הפקת DNA גנומי מעלים 2.3.3.2. הפקת DNA פלסמידי 2.3.3.3. חיתוך DNA באנזימי הגבלה.2.3.3.4 הרצת DNA בג'ל Agarose 2.3.3.5. ליגציה (PCR) Polymerase Chain Reaction.2.3.3.6 2.3.3.7. שיבוט וריצוף קטעי DNA 2.3.4. פעילות S-RNase בעליים 2.3.4.1. מיצוי החלבונים מהעליים 2.3.4.2. קביעת ריכוז החלבון 2.3.4.3. הרצת החלבונים מהעליים בג'ל נטיבי 2.3.4.4. צביעת הג'ל לפעילות S-RNase 3. תוצאות 3.1. זמינות האבקה במטע להאבקת פרחי Topred והפרייתם 3.1.1. מועדי הפריחה בזנים, Topred Smoothee ו- Jonathan 3.1.2. רצפטיביות צלקות הזנים, Topred Smoothee ו- Jonathan 3.1.3. חיוניות גרגרי האבקה מהזנים המאביקים Smoothee ו- Jonathan 3.1.4. השפעת ההתאם הגנטי באללי S בין Topred לזן המאביק על החנטה לאחר האבקה בעודף 3.1.5. השפעת הזן המאביק על תכונות פרי ה- Topred לאחר האבקה בעודף 3.1.6. ההתאם הגנטי באללי S בין Topred לזנים המאביקים י

31 31 34 36 37 39 39 39 40 41 42 42 43 44 44 45 46 48 48 49 50 57 67.3.2 האבקת Topred באמצעות דבורי-דבש mellifera) (Apis 3.2.1. מבנה פרחי הזנים, Topred Smoothee ו- Jonathan 3.2.2. תכונות הצוף בפרחי, Topred Smoothee ו- Jonathan 3.2.3. תדירות ביקורי הדבורים בזנים, Topred Smoothee ו- Jonathan 3.2.4. אופן איסוף הגמול מפרחי, Topred Smoothee ו- Jonathan 3.3. רמת ההתאם העצמי ב- Topred לעומת Smoothee 3.3.1. זיהוי אללי S בזנים המצויים במטע Topred בתגובת PCR 3.3.2. קביעת רמת אי ההתאם העצמי ב- Topred על-ידי זיהוי אללי S בצאצאים 3.3.3. החנטה בפרחי Smoothee לאחר האבקה עצמית 3.3.4. מספר הזרעים בפירות Smoothee לאחר האבקה עצמית 3.3.5. קביעת רמת ההתאם העצמי ב- Smoothee על-ידי זיהוי אללי S בצאצאים 3.3.5.1. זיהוי אללי S בצאצאי Smoothee שהתקבלו אחר האבקה עצמית 3.3.5.2. זיהוי אללי S בצאצאי Smoothee שהתקבלו לאחר האבקה עם אבקה מזנים בעלי התאם גנטי חלקי באללי S 3.3.6. האבקה והפריה של פרחי Smoothee במטע Solid block 3.3.6.1. מספר הזרעים בפירות Smoothee ממטע Solid block.3.3.6.2 זיהוי אללי S בצאצאי Smoothee ממטע Solid block 3.3.7. פעילות S-RNase בעליים של פרחי Smoothee 3.4. החנטה וההפריה ב- Topred לעומת Smoothee 3.4.1. החנטה של פרחי Topred ו- Smoothee לאורך חיי הפרח 3.4.2. מספר הזרעים החיוניים במהלך התפתחות חנטי Topred ו- Smoothee 4. דיון 5. רשימת ספרות 6. פרסומים מעבודה זו יא

1. מבוא.1.1 התפוח domestica) (Malus 1.1.1. הגדרה בוטנית התפוח הוא עץ פרי נשיר השייך לסדרת הורדניים,(Rosales) משפחת הורדיים,(Rosaceae) בת- משפחת התפוחיים,(Maloideae) סוג תפוח.(Malus) הרקע הגנטי של התפוח התרבותי ) Malus Borkh. domestica ה) וא בעיקר המין Lickb.,Malus sieversii הגדל בר ביערות דרום קזחסטן ומינים בוטניים נוספים, כגון Mill. Malus sylvestris שמקורו באירופה, Malus baccata Borkh. מסיביר ומינים נוספים מהמזרח הרחוק (צור, 2000). 1.1.2. רקע היסטורי זרעים ושרידי פירות תפוח משנת 5000 לפני הספירה נמצאו בשוויץ, ולכן משערים שהתפוח שימש למאכל אדם עוד בתקופת האבן. ישנן עדויות שהתפוח גדל במצרים בתקופת רעמסס השני (1280 לפני הספירה). ממקורות בספר יהושוע, בהם נזכרים שמות אזורים או ערים על שם תפוח, ניתן להסיק שתפוחים מזנים בעלי דרישות צינון נמוכות גודלו בארץ בתקופת הכיבוש הישראלי (1100 לפני הספירה). בספרות היוונית (300 לפני הספירה) ניתן למצוא תיעוד ראשון של קבוצות תפוח שונות לפי מוצאן וטיב פירותיהן, עם זאת עבודת ההשבחה בתפוח החלה באנגליה רק בשנת 1750. מבין מטרות ההשבחה: מיתון הצמיחה, הבכרה או האפלה, הגברת צבע הפרי האדום בזנים האדומים, עמידות כנגד מחלות ומזיקים, הקדמת גיל ניבה, שיפור גודל הפרי וכושר השתמרות. למרות הניסיונות לקבלת זנים איכותיים, הרוב המכריע של זני התפוח המסחריים הינם זריעים, שנתגלו באקראי (צור, 2000). 1.1.3. גידול בעולם בחצי כדור הארץ הצפוני נפוץ גידול התפוח בין קווי רוחב 33º עד 55º. קו רוחב 33º נחשב כגבול תחתון לגידול מסחרי של התפוח, זאת עקב דרישות הצינון הניכרות של המין לקבלת התעוררות טובה של פקעי העלים והפרחים באביב (צור, 2000; 2002 Erez,.(Dennis, ;2002 היבול העולמי של התפוח נמצא במגמת עליה, הנובעת ברובה מעליה ביבולי התפוח בסין. בשנת 2000 יבול התפוח העולמי עמד על כ- 46 מיליוני טונות, כאשר ארצות הגידול העיקריות הן: סין 20.8, ארצות הברית 4.8, טורקיה 2.5, צרפת 2.2, איטליה 2.2 וגרמניה 1.9 מיליון טון ) Tarrant.(et al., 2001 1

1.1.4. גידול בארץ בישראל כ- 44,000 דונם תפוחים, המניבים כ- 110,000 טון פרי כל שנה. כ- 90% ממטעי התפוח נטועים בצפון הארץ, בגולן ובגליל (צור, 2000). התפלגות הזנים הינה:, Delicious 30% כאשר הוריאנט הנפוץ הינו, Topred, Golden Delicious 40% כאשר הוריאנט הנפוץ הינו, Smoothee והיתר, Jonathan Royal Gala, Granny Smith ואחרים (ישראל דורון, ממ"ר גרעיניים, שה"מ משרד החקלאות). 1.2. התפתחות פרי התפוח 1.2.1. תהליכי האבקה והפריה בצמחים מכוסי זרע (בעלי פרחים) תהליכי האבקה והפריה מוצלחים הינם תנאי הכרחי ליצירת זרעים ולחנטת פירות. בתהליך ההאבקה גרגרי אבקה מועברים לצלקת, ובתהליך ההפריה הגמטה הזכרית מנחשון גרגר האבקה, שנבט בצלקת והתארך לאורך עמוד העלי עד לביצית, מתלכדת עם הגמטה הנקבית (תא הביצה) שבביצית ליצירת העובר. במקרה בו הגמטה הזכרית והנקבית מאותו מקור גנטי תהיה זו הפריה עצמית, שהתרחשה בעקבות האבקה עצמית. במקרה בו הגמטה הנקבית והזכרית אינם מאותו מקור גנטי תהיה זו הפריה זרה, שהתרחשה בעקבות האבקה זרה (1999 al.,.(raven et בפרחים דו-מיניים יש להפריה העצמית יתרון, בשל הקרבה הפיסית בין האבקנים לעליים, מצד שני הפריה זרה מגדילה את השונות הגנטית בצאצאים ומאפשרת שינויים אבולוציוניים רבים יותר (1999 al.,.(raven et מעריכים כי ביותר ממחצית המינים של מכוסי הזרע התפתחו מנגנונים למניעה חלקית או מלאה של הפריה עצמית. חלק מהמנגנונים למניעת הפריה עצמית מבוססים על "הפרדה" של האיברים הזכריים של הצמח מאיבריו הנקביים. הפרדה זו יכולה להתבטא במיקום האיברים או בזמן הבשלתם. מנגנונים אחרים נובעים מגורמים פיזיולוגיים-גנטיים המכונים מנגנונים של אי התאם עצמי Incompatibility).(de Nettancourt, 1977; Clarke and Newbigin, 1993) (Self צמחים בעלי אי התאם עצמי מלא תלויים לחלוטין בהאבקה זרה לשם חנטת פירות. דרישה זו אינה הכרחית עבור צמחים בעלי התאם עצמי חלקי או מלא, בהם יכול להיווצר פרי כתוצאה מהאבקה עצמית. קיימים שני סוגים עיקריים של אי התאם עצמי בצמחים: אי התאם הטרומורפי.(Clarke and Newbigin, 1993) (Homomorphic) ואי התאם הומומורפי (Heteromorphic) במינים בהם קיים אי התאם הטרומורפי, למאבקים ולעליים צורות מורפולוגיות שונות, והפריה יכולה להתרחש רק בין פרחים מצורות מורפולוגיות שונות. אי התאם זה נמצא, לדוגמא, בצמחים ממשפחת הפשתיים.(Linaceae) באי התאם הומומורפי לפרחים מאותו המין צורה מורפולוגית זהה. אי התאם הומומורפי מופיע בשתי צורות: ספורופיטי ) self-incompatibility, Sporophytic (SSI וגמטופיטי GSI) SSI.(Gametophytic self-incompatibility, נקבע על-ידי גנוטיפ הצמח (הספורופיט) ממנו נוצרים גרגרי האבקה. אי התאם זה נמצא, לדוגמא, בצמחים ממשפחת המצליבים.(Brassicaceae) GSI נקבע על-ידי הגמטופיט המצוי בגרגר האבקה. אי התאם זה 2

(Rosaceae),(Solanaceae) נמצא, לדוגמא, בצמחים ממשפחת הסולניים הורדיים והלועניים.(Clarke and Newbigin, 1993) (Scrophulariaceae) 1.2.2. אי התאם עצמי גמטופיטי (GSI) 1.2.2.1. הקדמה Prunus ) ובפירות ורדיים נוספים, ביניהם: דובדבן (Malus domestica) נמצא בתפוח GSI,(avium אגס יפני serotina),(pyrus משמש armeniaca),(prunus שקד dulcis) (Prunus ושזיף יפני salicina) de Nettancourt, 1977; Ishimizu et al., 1998; Yamane et al., ) (Prunus 1999), אך הוא נחקר בעיקר בצמחים ממשפחת הסולניים מהסוגים: סולנום,(Solanum) טבק.(Clarke and Newbigin, 1993) (Lycopersicon) ועגבניה (Petunia) פטוניה,(Nicotina) בצמחים אלה תכונת אי ההתאם עוברת בתורשה של גן יחיד, ולכן מקובלת ההנחה כי היא נקבעת על ידי לוקוס פולימורפי יחיד המכיל מספר גנים. לוקוס זה מכונה לוקוס S, כאשר גנוטיפ ספציפי של לוקוס S מכונה הפלוטיפ denettancourt, 1977; Tanksley and Loaiza-Figueroa, ) S.(1985; McCubbin and Kao, 1999; Ushijima et al., 2001 גרגר אבקה, הנוחת על צלקת עמוד העלי של צמח בעל,GSI נובט בצלקת ומתארך בעמוד העלי לכיוון הביציות. במידה והפלוטיפ S של גרגר האבקה זהה לאחד מאלו המבוטאים בעלי ייעצר גידול נחשון הנביטה בחלקו העליון של עמוד העלי ולא תתרחש הפריה. במידה והפלוטיפ S של גרגר האבקה שונה מאלו המבוטאים בעלי נחשון הנביטה יתארך בעמוד העלי ויתלכד עם תא הביצה (איור 1). Haplotype of pollen איור 1: הצגה סכמטית של דחיית גרגר אבקה במנגנון GSI (Kao and McCubbin, 1996) 3

.1.2.2.2 האנזים S-RNase אפיון האנזים :S-RNase בשנת 1986 בודד לראשונה חלבון תוצר הפלוטיפ S מעמודי עלי של פרחי טבק ועל בסיס רצף החלבון נקבע גם רצף ה- cdna שלו, שנקרא אלל Anderson et al., ) S 1986). בשנת al. 1989 McClure et זיהו כי אללי S בצמחי טבק alata) (Nicotiana מקודדים ל-,RNase ועל-כן הם מכונים.S-RNase מהשוואת רצפי ה- S-RNases, הסיקו כי הם שייכים למשפחה גדולה הנקראת.(Sassa et al., (1996 T2/S-RNase מחקרים נוספים העלו שה-- S 24-30, kda בעלי משקל מולקולרי הנע בין,(pI (8-10.5 הינם חלבונים בסיסיים RNases המתבטאים ביתר ברקמה החוץ תאית של עמוד העלי (1992 Kirch,.(Thompson and המחקר בסולניים היווה את הבסיס לחקר מנגנון GSI ברמה המולקולרית בתפוחים. al. Sassa et (1994) זיהו לראשונה חלבונים תוצרי אללי S בעמוד עלי של פרחי תפוח. רצף cdna של חלבונים אלה נקבע על ידי al. (1995) Broothaerts et ונמצא כי, בדומה לסולניים, אף הם מקודדים ל- -S.RNase עד היום זוהו כ- 29 חלבוני S-RNase שונים מתפוחים, אך רק 17 מהם רוצפו באופן חלקי או מלא ) Sakurai Sassa et al., 1994; Broothaerts et al., 1995; Janssens et al., 1995; et al., 1997; Verdoodt et al., 1998; Boskovic and Tobbut,, 1999; Matsumoto et al.,.(1999a, 1999b; Kitahara et al., 2000, 2002; Van Nerum et al., 2001 תפקיד :S-RNase בשנת al. 1990 McClure et האביקו צמחי טבק alata) (Nicotiana בגרגרי אבקה מסומנים ב-, 32 P ועקבו אחר גורל ה- RNA בנחשוני הנביטה. הם מצאו שמולקולות 32 P- מגרגרי האבקה מפורקות לאחר האבקה עצמית, אך לא לאחר האבקה זרה. 32 P-28S ו- 18S הוצע לפיכך שעצירת נחשון הנביטה במנגנון GSI מתרחשת בעקבות פגיעה בייצור החלבונים בו, על-ידי פרוק מולקולות RNA של גרגר אבקה עצמי. כמו-כן al. (1991) Gray et דיווחו כי נכנסות לגרגרי אבקה של טבק alata) (Nicotiana שהונבטו,in-vitro מולקולות 3 H-S-RNase וכתוצאה מכך ייצור החלבונים בנחשונים מעוכב. נמצא בניסויי gain-of-function ו-- loss-of S-RNase בצמחים טרנסגניים ממשפחת הסולניים, כי ביטוי נורמלי של אנזימי,function פעילים בעמוד העלי הינו תנאי הכרחי לקיום מנגנון Huang et al., 1994; Lee et al., ) GSI al., 1997.(1994; Murfett et al., 1994; McCubbin et ממצאים מצמחים במשפחת הורדיים חיזקו זאת, למשל al. (1997) Sassa et בחנו את ההתאם העצמי באגס היפני serotina) (Pyrus מהזן,Osa-Nijisseiki והציעו כי הוא התקבל בשל החסרת אלל S4 מהגנום. ממחקרים אלה עולה כי בצמחים ממשפחות הסולניים והורדיים אנזימי,S-RNase המבוטאים בעמוד העלי, אחראים על הדחייה הספציפית של גרגר האבקה העצמי, לפיכך מקובלת ההנחה שמנגנון GSI בשתי המשפחות הללו דומה 1996) al.,.(sassa et 4

מבנה :S-RNase ברצף חומצות האמינו של -RNase מS סולניים וורדיים נמצאו חמישה איזורים שמורים, שארבעה מהם משותפים לשתי המשפחות (C5,C1).,C2,C3 האיזורים השמורים C4 מסולניים ו- RC4 מורדיים ממוקמים באיזורים שונים בחלבון. כמו-כן נמצאו ב- S-RNase מסולניים שני איזורים הידרופילים בעלי שונות גבוהה HVa ו- HVb Ioerger et al., ;1991 Tsai ) al., 1992,(et כאשר בורדיים נמצא רק איזור אחד,,HV המקביל לאזור HVa מסולניים (1998b.(Ushijima et al., הבדל נוסף בין הסולניים לורדיים הוא במיקום לוקוס S. בסולניים לוקוס S קרוב לצנטרומר ואורכו מוערך בכ- 1Mb ובורדיים הוא מרוחק מהצנטרומר ואורכו כ-.(McCubbin and Kao, 1999; Ushijima et al., 2001) 70kb באיזורי C2 ו- C3 מצויים שני שיירי היסטידין שמורים, בעלי תפקיד מכריע בפעילות ה- S-RNase. מוטציה בהם מנעה את פעולת האנזים ואיפשרה את שבירת מנגנון אי-ההתאם ) al., Royo et al., 1994; Haung et al., 1997 ;1994). McCubbin et האיזורים בעלי השונות הגבוהה (HV) מכילים חומצות אמינו הידרופיליות ולכן הם ממוקמים בחלק החיצוני של המולקולה ) ;1996 McCubbin, Kao and al., 2001.(Matsuura et משום כך הם מועמדים לרצפים שיזוהו באופן ספציפי על-ידי גרגר האבקה, ויאפשרו את התגובה הספציפית כנגד גרגר אבקה עצמי. תמיכה לכך התקבלה כאשר ספציפיות אלל S11 מסולנום chacoense) (Solanum שונתה לאלל S13 על-ידי מוטציות באיזורים HVa ו- HVb.(Matton et al., 1997, 1999) באגס יפני serotina) (Pyrus נמצאו שני אללי S3, S ו- S5, הנבדלים זה מזה רק באזור.HV מכאן ששינויים באזור זה מספיקים על מנת לשנות את ספציפיות תגובת אי ההתאם (1998 al.,.(ishimizu et יחד עם זאת אין לשלול את האפשרות שבספציפיות התגובה לדחיית גרגר האבקה מעורבים גם אזורים אחרים ב- S-RNase.(Verica et al., 1998) 1.2.2.3. גנים נוספים הדרושים לתגובת GSI נמצאו עדויות למעורבות מספר גנים במנגנון תגובת,GSI לבד מ- S-RNase. (1991) Ai et al. מצאו ביטוי נורמלי של אללי S בצמחי פטוניה hybrida) (Petunia בעלי התאם עצמי. כמו-כן בצמחי עגבניה esculentum) (Lycopersicon בעלי התאם עצמי, שהתקבלו כתוצאה מהעדר פעילות,S-RNase נמצא כי ביטוי נורמלי של אללי S טרנסגניים לא הספיק לרכישת אי התאם עצמי (2002 al.,.(kondo et ממחקרים אלו עולה כי ביטוי נורמלי של מולקולות S-RNase פעילות, בחלל החוץ תאי של עמוד העלי, חיוני לתגובת אי ההתאם אך איננו מספיק, ומניחים כי קיים לפחות גן אחד נוסף מלוקוס S המבוטא בגרגר האבקה וחיוני לתגובת אי ההתאם. לא נשללת האפשרות שבמנגנון GSI משתתפים גורמים נוספים המבוטאים בעמוד העלי ו/או בגרגר האבקה שאינם קשורים ללוקוס.(McClure et al., 2000) S al. (1999) McClure et דיווחו לראשונה על מולקולה הנקראת,HT המצטברת בצלקת ובעמוד העלי וחיונית לדחיית גרגרי אבקה עצמיים בצמחי טבק.(Nicotiana) הם מצאו שהורדת רמת 5

הביטוי של HT בצמחים בעלי אי התאם עצמי על-ידי החדרת אנטיסנס של הגן אפשרה הפריה עצמית, למרות ביטוי נורמלי של.S-RNase בנוסף al. (2002) Kondo et מצאו כי ביטוי לא תקין של מולקולות HT הוא הגורם, ככל הנראה, להתאם עצמי בעגבניה תרבותית ) Lycopersicon.(esculentum מולקולות HT אינן שייכות ללוקוס S ותפקידן איננו ברור. אחת ההשערות היא שהן חיוניות לפעילות S-RNase במנגנון.GSI כאמור מניחים כי קיים גן מלוקוס S המבוטא בגרגר האבקה וחיוני לתגובת אי ההתאם ) Pollen S). ככל הנראה גן זה חיוני לגרגר האבקה כיוון שבכל המחקרים בהם התקבלו גרגרי אבקה מוטנטים היכולים לעבור הפריה עצמית PPM) (Pollen-part mutant, נמצא כי הם דיפלואידים הטרוזיגוטים בלוקוס S. מכיוון שלא התקבלו גרגרי אבקה PPM בעלי חסר בכל לוקוס S, מניחים שהגן Pollen S הכרחי לקבלת גרגר אבקה חיוני (2000 al.,.(golz et אמנם גן זה עדיין לא זוהה, אך בעזרת גרגרי אבקה PPM חיוניים בהם הוכפל לוקוס S בחלקו הצליחו al. ) Golz et 1999 2001,) למפות באופן גס את מיקומו של Pollen S בצמחי טבק alata).(nicotiana 1.2.2.4. מודלים לדחיית גרגר אבקה עצמי במנגנון GSI הוצעו שני מודלים להסבר העיכוב הספציפי של גרגר אבקה עצמי במנגנון :GSI מודל הרצפטור ומודל המעכב (איור 2) (1996 al.,.(dodds et בשני המודלים העיכוב הינו כתוצאה מפירוק מולקולות RNA בגרגר האבקה העצמי, בעקבות חדירת מולקולות S-RNase מעמוד העלי לנחשון הנביטה. ההבדל בין המודלים מתבטא באופן שבו נכנסות מולקולות S-RNase מעמוד העלי לנחשון ובאופן הספציפי שבו הן מופעלות. במודל הרצפטור, גן מלוקוס S מבוטא בגרגר האבקה כרצפטור המצוי על-גבי ממברנת נחשון הנביטה. רצפטור זה מאפשר רק למולקולות S-RNase מהפלוטיפ S של גרגר האבקה כניסה לנחשון הנביטה. מודל המעכב, לעומת זאת, מניח כי מולקולות S-RNase נכנסות לנחשון הנביטה בצורה לא ספציפית, אך בנחשון הנביטה הן פעילות באופן ספציפי. לאופן שבו מתאפשרת הפעילות הספציפית של S-RNase במודל המעכב הוצעו שני מנגנונים: (1) בנחשון מבוטא גן מלוקוס S המעכב את פעילותם של מולקולות,S-RNase לבד ממולקולות S-RNase מהפלוטיפ S של גרגר האבקה. (2) בגרגר האבקה מבוטא מעכב אוניברסלי לכל,S-RNase בנוסף לו מבוטא חלבון תוצר גן מלוקוס S המסיר, או מונע, באופן ספציפי את העיכוב ממולקולות S-RNase מהפלוטיפ S של גרגר האבקה (2000 al.,.(luu et תוצאות ממספר מחקרים תומכות במודל המעכב: (1) ב- al. 1991 Gray et מצאו שמולקולות -S2 ו- S3-RNase מצמחי טבק alata) (Nicotiana נכנסות לגרגרי אבקה נושאי הפלוטיפ S2 שהונבטו,in vitro ומכאן שהכניסה של מולקולות S-RNase לגרגר האבקה איננה ספציפית. (2) al. (2000) Luu et הראו בעזרת נוגדנים ספציפיים כנגד S11-RNase מסולנום chacoense),(solanum כי מולקולות S11-RNase מעמוד העלי של פרחי סולנום נכנסות ומצטברות בציטופלזמה של נחשוני הנביטה בצורה שאיננה ספציפית להפלוטיפ S של גרגר האבקה. (3) al. (1997) Chawla et דיווחו כי גרגרי 6

אבקה דיפלואידים הטרוזיגוטים S1S2 מעגבנית בר peruvianum) (Lycopersicon טטראפלואידית S1S1S2S2 אינם נידחים במנגנון,GSI לעומת גרגרי אבקה דיפלואידים הומוזיגוטים, S1S1 או,S2S2 שנדחו. ההסבר שניתן לממצא זה הוא שבגרגרי אבקה S1S2 מבוטאות מולקולות מעכב מהפלוטיפ S1, המעכבות את מולקולות,S-RNase לבד מ- S1-RNase, ומולקולות מעכב מהפלוטיפ S2 המעכבות את מולקולות,S-RNase לבד מ- S2-RNase. באופן זה כל מולקולות S-RNase מעוכבות בנחשוני הנביטה נושאי הפלוטיפ,S1S2 ונמנעת דחייה על-ידי מנגנון,GSI כאשר מצד שני גרגרי אבקה S1S1 או S2S2 נדחים. ממצאים דומים התקבלו בפטוניה hybrida) (Petunia על-ידי al. (1999) Entani et ו- al..(2001) Golz et Petunia ) מפטוניה DNA עם Two-Hybrid-System ניסו במערכת (2001) Sims and Ordanic (hybrida ל"דוג" מולקולה הקשורה לדחייה הספציפית, כאשר S-RNase משמש כ"חכה". הם אמנם מצאו מולקולה המבוטאת בגרגר האבקה, ונקשרת ברמת ספציפיות גבוהה ל- S-RNase מפטוניה hibrida),(petunia אך ללא ספציפיות אללית. יתכן ומולקולה זו, הנקראת,PhSBP1 היא המעכב האוניברסלי של S-RNase במנגנון.GSI יש לציין כי למרות מאמצים רבים המושקעים במציאת מולקולת,Pollen S העוברת אינטרקציה עם S-RNase וחיונית לדחייה הספציפית של גרגר האבקה העצמי, היא טרם נמצאה. איור 2: מודלים לדחיית גרגר אבקה עצמי במנגנון.GSI מודל המעכב (מימין) ומודל הרצפטור (משמאל) (1996 al., (Dodds et 1.2.3. האבקת פרחי התפוח באמצעות דבורי-דבש mellifera) (Apis 1.2.3.1. הקדמה כתוצאה מתכונת,GSI התפוחים זקוקים להאבקה זרה לשם יצירת זרעים וחנטת פירות. האבקה זרה של פרחי התפוח באמצעות הרוח איננה יעילה, כיוון שהאבקה כבדה והצלקות מוסתרות על- ידי האבקנים (1986 Dennis,,(Blazek, ;1996 Free, ;1964 והיא מתרחשת בעיקר על-ידי 7

חרקים מאביקים (1964.(Free, מאחר וההאבקה באמצעות חרקים מאביקים מקומיים אינה מספקת, דבורי-דבש משמשות כחרק המאביק העיקרי במטעי התפוח ) ;1976 McGregor,.(Dennis, 1979; Mayer et al., 1985 1.2.3.2. תדירות ביקורי הדבורים יעילות ההאבקה של פרחים באמצעות דבורים מושפעת מתדירות הביקורים. תדירות זו תלויה בגורמי משיכה שונים בפרח ביניהם ריח, גודל, צבע, צורה, דרכי צוף על עלי הכותרת, נפח הצוף, הרכב הסוכרים בצוף וכמות האבקה (1989 Griffin,.(Sedgley and גורמים אלו עלולים להשפיע על פעילות הדבורים, ולמשוך אותם דווקא לפריחה המתחרה שמחוץ למטע. כך למשל מבדיקת מלכודות אבקה, מכוורות שהוצבו במטעי תפוח בארצות הברית, נמצא כי פריחת שן הארי officinale),(taraxacum החרדל (Sinapis) והתלתן הזוחל repens) (Trifolium התחרו עם פריחת התפוח על ביקורי הדבורים (1993 Free,.(Jay, ;1986 גורם נוסף שעלול לפגוע ביעילות האבקה של התפוח על-ידי הדבורים הינו מזג האוויר. תפוחים גדלים באזורי אקלים ממוזגים בהם מזג האוויר בעונת הפריחה עלול להיות קיצוני ולמנוע פעילות דבורים. למשל מידות חום מתחת ל-,12-14ºC גשם ורוח הם תנאים שאינם מתאימים לפעילות דבורי-דבש ולכן פוגעים בהאבקה באמצעותן 2000) Bosch,.(Dennis, 1979; Vicens and בניסיון להתגבר על המכשולים שהוזכרו נבחנה האפשרות להעלות את מספר הכוורות במטע התפוח, ואכן התקבלה עליה בתדירות ביקורי הדבורים בפרחים, וכתוצאה מכך עלו שיעורי החנטה והיבול ) Kurennoi (and Kurennoi, 1976; Brain and Landsberg, 1981 1.2.3.3. ניידות הדבורים בין הזנים במטע לשם השגת האבקה זרה יעילה ישנה חשיבות לא רק לתדירות ביקורי הדבורים בפרחים, אלא גם לניידותן בין הזנים. מחקרים בתפוחים הראו ששיעור החנטה בזן המואבק יורד, ככל שהמרחק בינו לבין הזן המאביק גדל ) Blazek, Roberts, 1945; Free and Spencer-Booth, 1964a; Soltesz, 1997 (1996) Brookfield et al..(1996; הראו שבתפוחים מהזן Braeburn עם עליית המרחק מהזן המאביק קטן מספר הזרעים בפירות. מאחר שהאבקה בלתי מספקת קשורה במספר זרעים נמוך בפרי, הם הסיקו כי ההאבקה באמצעות הדבורים יורדת ככל שגדל המרחק מהזן המאביק. יתכן והסיבה לכך נובעת מהעובדה שהזנים במטע נטועים בשורות, ודבורה היוצאת מהכוורת לחפש מזון נוטה לעבוד לאורך השורה, ופחות בין השורות ) and Free, ;1960 Free.(Spencer-Booth, 1964b; Mayer, 1984; Mayer et al., 1989; Jackson and Clarke, 1991; כדי להבטיח האבקה זרה מספקת, נהוג לטעת את שורות הזנים לסירוגין, ואף לטעת עצים מזנים מאביקים בתוך השורות עצמן (1993 Free,.(Mayer and Lundon, ;1988 יחד עם זאת ישנם מחקרים המצביעים על כך שקיים מעבר אבקה בין הדבורים בכוורת, ולכן מתבצעת האבקה זרה טובה גם ללא נטיעת זנים כפי שהוזכר לעיל ) and Degrandi-Hoffman,,1984 ;1986 Free.(Williams, 1972 נראה שתופעה זו, גם אם היא קיימת, איננה מספיקה לשם האבקה זרה ברמה מסחרית. 8

1.2.3.4. אופן איסוף הגמול מהפרחים דבורים אוספות מפרחי התפוח צוף ואבקה. איסוף האבקה נעשה ישירות מהמאבקים, כלומר מהחלק העליון של הפרח,( Topworker ) ואילו צוף יכול להיאסף הן על-ידי החדרת החדק מהחלק העליון של הפרח ( Topworker ) והן מצידו.( Sideworker ) דבורים הפועלות כ- Topworkers הן היעילות בהאבקה, הן באות במגע עם המאבקים ועם הצלקות ויכולות בצורה זו להאביק את הצלקות באבקה שנדבקה לגופן מפרחים אחרים. לעומתן Sideworkers לוקחות רק חלק קטן ביותר בהאבקה, מאחר והסיכוי למגע בין גופן למאבקים והצלקות נמוך Roberts, 1945; ;Robinson and Fell, 1981; Mayer et al., 1985; Free, 1993; Thomson ) Goodell,, 2001.(and מבין הדבורים הפועלות כ- Topworkers יעילות אוספות האבקה בהאבקה היא הגבוהה יותר. הן נושאות על גופן כמות רבה של גרגרי אבקה, אשר חיוניותם גבוהה בהשוואה לדבורים אוספות הצוף ) 1983; al., Free and Williams, 1972; Klungness et Goodell, 2001.(Thomson and בנוסף לכך אוספות האבקה מבלות פחות זמן בכל פרח, ולכן מבקרות מספר פרחים רב יותר בהשוואה לאוספות הצוף (1960.(Free, המסקנה מכל הנאמר לעיל היא שעל מנת להגביר את יעילות ההאבקה של פרחי התפוח באמצעות הדבורים יש צורך לפעול למען הגדלת שיעור הדבורים אוספות האבקה על חשבון אוספות הצוף. מבין אוספות הצוף יש להגדיל את שיעור ה- Topworkers על חשבון ה- Sideworkers. במטע התפוח רק כ- 20% מהדבורים אוספות אבקה (1984.(Mayer, ניתן להעלות שיעור זה על- ידי הצבת מלכודות אבקה בכניסה לכוורת, שתפקידן לקלוט את שקי האבקה המלאים מרגלי הדבורים השבות לכוורת. בשיטה זו הדבורים נאלצות לאסוף יותר אבקה מהדרוש, כיוון שחלק מהאבקה שנאספת מגיעה למלכודות האבקה ולא לכוורת. ניתן להעלאת את שיעור הדבורים נושאות אבקה זרה במטע גם באמצעות הצבת "מפיצי אבקה" ביציאה מהכוורת ) and Jaycox.(Owen, 1965 בשיטה זו דבורים היוצאות מהכוורת עוברות ב"מפיץ האבקה" וכתוצאה מכך הן מתאלחות באבקה המצויה בו. גם הצבת לוחות לבד בפתח הכוורת, כך שהדבורה נאלצת להתחכך בהם, מביאה לידי כך שאבקה מועברת מגוף הדבורים השבות לכוורת לאלה היוצאות ממנה (1999 al.,,1998.(hatjina et את שיעור ה- Topworkers ניתן להעלות על-ידי הצבה מדורגת של הכוורות במטע במהלך הפריחה. כך למשל הצליחו al. (2001) Stern et להעלות את שיעור הדבורים הפועלות כ- Topworkers בפרחי Delicious על-ידי הצבת מחצית מהכוורות בתחילת הפריחה והצבת יתר הכוורות בשיא הפריחה. 1.2.4. ההפריה והתפתחות החנטים בתפוח למזג האוויר בזמן הפריחה השפעה על החנטה. טמפרטורה מתחת ל- 12ºC בזמן הפריחה עלולה לגרום לירידה בשיעורי החנטה בתפוחים, לא רק בשל ירידה בפעילות הדבורים, אלא גם בשל הירידה בקצב התארכות נחשוני הנביטה והתנוונות שק העובר לפני שגרגר האבקה מגיע אליו. (1959) Shoemaker and Teskey דיווחו כי בטמפרטורות 16-27ºC שיעור נביטת גרגרי אבקת 9

תפוח אופטימלית. בטמפרטורות גבוהות או נמוכות יותר נביטת גרגר האבקה והתארכותו מעוכבות. בתפוח שיעור הפרחים המתפתח לחנטים נע בדרך-כלל בין 10-30%. יתר הפרחים נושרים שבוע עד שבועיים לאחר נשירת עלי הכותרת. חנטים קטנים, בעיקר אלו עם מספר זרעים נמוך, מוסיפים לנשור במשך עוד מספר שבועות. גל נוסף של נשירת חנטים, הידוע כ-"נשירת יוני", מתרחש 4-6 שבועות לאחר הפריחה. נשירה נוספת מתרחשת סמוך לקטיף ועוצמתה תלויה בעיקר בזן ובתנאי מזג-אויר (2000 Mayer,.(Dennis, ;1986 Delaplane and נשירת החנטים מקטינה אמנם את מספר הפירות, אך היא מאפשרת לשאר החנטים להתפתח לפירות גדולים יותר. היא ואף מעודדת התמיינות פרחים טובה יותר לשנה העוקבת, כך שהסרוגיות מופחתת ) and Buban.(Faust, 1982; Monselise and Goldschmidt, 1982 1.3. זן התפוח Delicious ופוריותו הנמוכה המחקר התמקד בזן, Topred שהינו הואריאנט הנפוץ ביותר של הזן Delicious במטעי הארץ. הזן Delicious מקורו בנצר משתיל של הזן, Bellflower שהתגלה בארצות הברית בשנת 1872. הזן נוטה למוטציות ועד היום ידועים בעולם כ- 180 ואריאנטים שונים שלו, כאשר 15 מהם הם זנים מסחריים (צור, 2000). זנים אלו נחשבים איכותיים ופודים תמורה גבוהה ביותר, אך הם סובלים מבעיות פוריות חמורות, המוכרות בכל הארצות המגדלות אותם (1979.(Dennis, (1947) Roberts בדק את החנטה ב- 24 זני תפוח בארצות הברית, מתוכם רק שני זנים חנטו ברמה נמוכה מזו של. Delicious לפי נתונים ממטעי ארצות הברית, בשנים 1946-76 יבול Delicious היה נמוך בכ- 50% בהשוואה לזן Delicios, Golden וב- 25-57% בהשוואה ל- Jonathan.(Dennis, (1979 גם במטעי הארץ סובל ה- Delicious והוריאנטים שלו מיבולים רב שנתיים נמוכים העומדים על כ- 2 טון/דונם, כאשר היבול הרב שנתי של הזנים האחרים גבוה יותר: Delicious Golden והואריאנטים שלו כ- 5 טון/דונם, Jonathan כ- 3 טון/דונם ו- Smith Granny כ- 5 טון/דונם (ישראל דורון, ממ"ר גרעיניים, משרד החקלאות). מחקרים רבים בזן Delicious ובזני תפוח אחרים מצביעים על גורמים גנטיים, ביולוגיים ואקולוגיים התורמים לפוריות הלקויה, רובם מתמקדים בשלבי ההאבקה וההפריה: אי התאם עצמי גמטופיטי: זני, Delicious שלא כמו זנים אחרים, למשל Delicious, Golden נחשבים בעלי אי התאם עצמי מלא. לפיכך קיימת תלות מוחלטת באספקה של אבקה זרה וחיונית, שתצליח להפרות את ביציות הפרחים (1979.(Dennis, מזג-אויר בזמן הפריחה: (1952) Lu and Roberts מצאו חנטה גבוהה של Delicious בתנאי מזג אוויר בהם הלילות קרירים (טמפרטורה ממוצעת של (7ºC והימים חמים (טמפרטורה ממוצעת של (25ºC במהלך הפריחה. טמפרטורות לילה קרירות דרושות לשם האטת תהליך הזדקנות הפרח, 10

ואילו טמפרטורות יום גבוהות חיוניות לפעילות הדבורים ולנביטת גרגר האבקה והתארכותו בעמוד העלי עד להגעתו לביצית לפני התנוונותה. אורך חיי הביצית: (1930) Dorsey חקר לראשונה את הקשר שבין התפתחות הביציות בפרחי תפוח לחנטה. הוא הבחין בניוון מוקדם של שק העובר בפרחי, Delicious בהשוואה לזנים אחרים החונטים בצורה טובה. (1954) Hartman and Howlett הבחינו כי כ- 15% מביציות Delicious החלו להתנוון כבר בשלב האנטזיס. שיעור הביציות המנוונות גדל לאורך חיי הפרח והגיע לכ- 25-30% בפרחים שנאספו 48-72 שעות לאחר האנטזיס, 60% בפרחים שנאספו 96 שעות לאחר האנטזיס ו- 80% מהפרחים שנאספו 120 שעות לאחר האנטזיס. בהתאמה לכך שיעורי החנטה בפרחי Delicious ירדו עם התקדמות חיי הפרח. הם הסיקו כי תנאי האבקה טובים בזמן פתיחת הפרחים הם גורם הכרחי לקבלת יבול Delicious גבוה, כיוון שהזמן מנחיתת גרגר האבקה על הצלקת ועד להפריית הביצית הוא 72 שעות לפחות. יעילות ההאבקה באמצעות דבורי-דבש: al. (1985) Mayer et טען שתדירות של כ- 20-25 ביקורי דבורים לעץ לדקה דרושה להאבקת. Delicious תדירות גבוהה זו של ביקורים נקבעה לאור השיעור הנמוך של הדבורים הפועלות כ- Topworkers, בהשוואה לזנים אחרים כמו Golden Robinson.(Roberts, 1945; Mayer, 1984; Mayer et al., 1985) ו- Jonathan Delicious (1979) הראה שמבנה פרחי Delicious שונה מרוב זני התפוח בכך שקיים מרווח רחב בין בסיסי האבקנים המאפשר איסוף צוף מצד הפרח בקלות. מהשיעור הגבוה של הדבורים הפועלות כ- Sideworkers בפרחי Delicious ניתן להסיק כי טכניקת איסוף הצוף מהצד, ללא מגע באבקנים, דורשת פחות אנרגיה מהדבורים, והן משתמשות בה כאשר הדבר ניתן ) and Kuhn.(Ambrose, 1982 (1945) Roberts הבחין כי בפרחי Delicious עמודי העלי קצרים מהאבקנים והצלקות מוסתרות. כתוצאה מכך נפגעת יעילות ההאבקה של דבורים הפועלות כ-, Topworkers כיוון שלא קיים מגע טוב בין גוף הדבורה נושא האבקה לצלקות. השפעת הזן המאביק: דווח כי בתנאי הארץ רמת היבול בזן Topred תלויה בהתאם הגנטי עם הזן המאביק. נמצא כי הזן המאביק Jonathan הוא בעל התאם גנטי חלקי עם הזן, Topred כיוון שלשניהם אלל S משותף. כתוצאה מכך רק מחצית מגרגרי האבקה של ה- Jonathan (אלו הנושאים את אלל S שאיננו משותף בין הזנים) יכולים להפרות את ביציות. Topred בתנאי ההאבקה בישראל ירידה זו, של 50% בגרגרי האבקה המתאימים גנטית להפריה, גרמה לירידה בחנטה וביבול Topred.(Goldway et al., 1999) 11

1.4. מטרת העבודה מטרת העבודה הייתה ללמוד על האבקה והפריה בתפוח, תוך שימת דגש על גורמים אקולוגיים, ביולוגיים ומולקולריים המשפיעים על פוריות הלקויה של Topred (ואריאנט של הזן ( Delicious במטעי הארץ. בעבודה נלמדו תכונות הפרח, האבקה באמצעות דבורים, השפעת מקור האבקה, לימוד ההפריה העצמית וכושר החנטה וההפריה. המחקר נערך במקביל גם בזני התפוח המסחריים Smoothee (ואריאנט של הזן Delicious ( Golden ו- Jonathan המשמשים הן כמודל לזנים פוריים ביחס ל- Topred והן כזנים תורמי אבקה לזן. Topred 12

2. חומרים ושיטות 2.1. חומרים ביולוגיים וכימיים 2.1.1. זני התפוח זני התפוח ששימשו בעבודה הינם זנים מסחריים דיפלואידים, 34=2n.(Dennis, (1986 מקור הזנים מפורט להלן: : Topred התגלה בארצות הברית בשנת 1954, מקורו במוטציה בזן, Shotwell שהוא - בזן הזן Delicious התגלה כ"חזיר" (סור) עצמו התקבל ממוטציה בזן. Delicious Bellflower בשנת 1872 בארצות הברית. Golden 1958 ממוטציה בזן הזריע התקבל בארצות הברית בשנת : Smoothee -,Delicious אשר הוא עצמו התגלה בשנת 1905 בארצות הברית. Esopus התקבל בארצות הברית בשנת 1826 כזריע מיקרי מהזן האימהי : Jonathan -.Spitzenberg Smith : Granny התקבל באוסטרליה בשנת 1868 כזריע מיקרי, כנראה מהזן האימהי -. French Crab Gala : Royal התקבל בניו זילנד בשנת 1973 ממוטציה בזן. Gala הזן Gala עצמו - התקבל מהכלאה בין הזנים Red Kidd s Orange ו- Delicious Golden בניו זילנד בשנת.1934.( Ryugo, 1988; Ferree, 1998; Morgan and Richards, 1993) 2.1.2. זן החיידקים E. coli, DH5α supe44 lacu169 (φ80lacz M15) hsdr17 reca1 enda1 gyra96 thi-1 rela1 (Sambrook et al., 1989) תאור הפלסמיד פלסמיד באורך 3 kb לשיבוט תוצרי PCR בעל קצוות (Promega) Poly T פלסמיד pgem-t המכיל את הרצף הגנומי בין אזורים C2-C5 של הגן ל-.(Acc. No. AF239809) Granny Smith מהזן (S10 (אלל S10-RNase פלסמיד pgem-t המכיל את הרצף הגנומי בין אזורים C2-C5 של הגן ל-.(Acc. No. AF201748) Toprted מהזן (S28 (אלל S28-RNase 2.1.3. פלסמידים שם הפלסמיד pgem-t psg290 psg291 13

2.1.4. חומרים כימיים החומרים הכימיים מחברת,Sigma אלא אם צוין אחרת. החומרים להכנת המצעים מחברת.Difco 2.2. ניסויי השדה 2.2.1. המטעים בהם נערכו הניסויים הניסויים נערכו בגליל העליון במטע קיבוץ ברעם, שניטע בשנת 1989, במטע חוות מתתיהו הסמוך לקיבוץ ברעם (חוות מטעים השייכת למו"פ צפון), שניטע בשנת 1992 ובמטע Smoothee ללא זנים מאביקים block) (Solid בקיבוץ יפתח, שניטע בשנת 1989. שלושת המטעים נטועים על כנת חשבי 13-4. המרחקים בין העצים 4X2 מטר (125 עצים לדונם). 2.2.2. שלבי התפתחות הפרח שלבי התפתחות הפרח נקבעו לפי המורפולוגיה של הפרח, עמדת עלי הכותרת, וצבע הצלקות. ארבעת שלבי הפרח מתוארים בתמונה 1 ובטבלה 1. מצב האבקנים 4 3 2 שלב הפרח: 1 תמונה 1: שלבי התפתחות הפרח טבלה 1: שלבי התפתחות הפרח תאור השלב שלב הפרח פרח בשלב ה"בלון". האבקנים סגורים והצלקות ירוקות. 1 פרח בשלב האנטזיס. עלי הכותרת פרושים, האבקנים פתוחים והצלקות ירוקות. 2 פרח בו עלי הכותרת החלו לנשור, האבקנים פתוחים והצלקות ירוקות. 3 פרח ללא עלי-כותרת, בו האבקנים פתוחים והצלקות ירוקות. 4 14

2.2.3. כיוס הפרחים לניסויים בהאבקה מבוקרת (האבקה ידנית והאבקה ספונטנית), חיוניות גרגרי אבקה, רצפטיביות הצלקות ותכונות הצוף כויסו ענפים פורחים בתחילת הפריחה ברשתות פלסטיק (30% צל, 15 (mesh (תמונה.(2 תמונה 2: ענפים פורחים מכויסים בתחילת הפריחה 2.2.4. מועדי הפריחה התחלת הפריחה נקבעה במועד בו הפרחים החלו להיפתח (פרחים בסוף שלב 1), שיא הפריחה נקבע במועד בו מרבית הפרחים פתוחים (פרחים בשלב 2 ו- 3) וסוף הפריחה נקבע במועד בו במרבית הפרחים עלי הכותרת נשרו (פרחים בשלב 3 ו- 4). 2.2.5. האבקה ידנית פרחים מכויסים הואבקו ידנית בעודף אבקה. ההאבקה התבצעה על-ידי חיכוך אבקני הפרח המאביק בצלקות הפרח המואבק. אבקה מפרחים טריים משלב 2 שימשה להאבקה. חיוניות גרגרי האבקה, ששימשו בכל ניסויי ההאבקה הידנית, הייתה גבוהה מ- 50%. 2.2.6. רצפטיביות הצלקות פרחים מכויסים בשלבים 2 1, ו- 3 הואבקו ידנית בעודף אבקה (סעיף 2.2.5.). 24 שעות לאחר ההאבקה הצלקות נאספו והועברו לתמיסת שימור (Amresco) Histochoice TM עד לבדיקה. הצלקות נשטפו שלוש פעמים במים, רוככו 5 שעות בתמיסת 8M, NaOH נשטפו שוב שלוש 15

פעמים במים ונצבעו למשך שעה ב-.(Martin, (1959 1% aniline blue מספר גרגרי האבקה שנבטו בצלקת נבדק בעזרת מיקרוסקופ אור, כאשר דרגת רצפטיביות הצלקות נקבעה לפי הסולם המפורט בטבלה 2. טבלה 2: סולם דרגות הרצפטיביות דרגת הרצפטיביות 0 1 2 3 4 מספר גרגרי האבקה שנבטו בצלקת 0 1-50 51-100 101-200 >200 2.2.7. חיוניות גרגרי האבקה חיוניות גרגרי האבקה נבדקה בפרחים מכויסים. אבקנים מחמישה פרחים אקראיים הועברו ל-. 3X10-6 M Ca(NO 2X10-3 3 ) 2 ו- M H 3 BO 3,10% sucrose תמיסת הנבטה, שהכילה: 1ml התערובת עורבבה היטב ודוגמאות של 200µl ממנה (שהכילו רק תמיסת הנבטה וגרגרי-אבקה) הועברו לבאריות. חיוניות גרגרי האבקה נקבעה בעזרת מיקרוסקופ אור, על-פי שיעור הנביטה של 100 גרגרי-אבקה, לאחר הדגרה של כשעה בטמפרטורת החדר. 2.2.8. מבנה הפרח מבנה הפרח נבדק בפרחים בשלב 2. קוטר הפרח, קוטר פיזור האבקנים וגובה המאבקים והצלקות מבסיס הפרח נמדדו בעזרת קליבר דיגיטלי בעל סקלה של ±0.1. mm עבור מדידת המרווח בין בסיסי זירי האבקנים, רקמת זירי אבקנים קובעה בתמיסת formalin-acetic-acid ויובשה בעזרת סדרת תמיסות בריכוזים עולים של.ethanol הפרחים כוסו בשכבה דקה של זהב ונסרקו במיקרוסקופ אלקטרוני סורק מסוג (Japan).JEOL 840 A המרווחים בין בסיסי זירי האבקנים נמדדו מתוך התמונות שנסרקו, בגובה של 20µm מבסיסם. 2.2.9. תכונות הצוף נפח הצוף, ריכוז הסוכרים הכללי בו וכן הרכב הסוכרים בצוף נבדקו בפרחים מכויסים בשלב 2. דיגום הצוף ובדיקתו התבצעו ברצף עבור כל הזנים. נפח הצוף: נפח הצוף נקבע בעזרת קפילרה של,(Sigma) 1µl שהוחדרה לאזור הצופנים בבסיס הפרח, מבלי לנתקו מהעץ. 16

הרכב הסוכרים בצוף: דגימות של 3µl צוף נשמרו עד לשימוש ב- 300µl 70% ethanol ב- 4ºC (בשנת 1999), או ב- ddh 2 O 300µl ב- -20ºC (בשנים 2000 ו- 2001). הרכב הסוכרים בצוף נקבע באנליזת HPLC עם אינדיקטור RI וקולונת (Bio-Rad).(300X7.6mm) HPX-87H Aminex אלוציה, של דוגמא בנפח 20µl שהוזרקה, התבצעה בעזרת תמיסת 0.01N H 2 SO 4 בקצב של 1-.0.8ml*min זיהוי הסוכרים נעשה לפי Retention time של סטנדרטים של סוכרים ידועים. ריכוז הסוכרים הכללי בצוף: ריכוז הסוכרים הכללי בצוף נמדד ישירות מהפרח בעזרת רפרקטומטר ידני מסוג,Stanly and Bellingham שכויל כנגד תמיסות sucrose בריכוזים שונים (בשנת 1999), או שחושב מסכום ריכוזי הסוכרים, שהתקבלו באנליזת HPLC (בשנים 2000 ו-.(2001.2.2.10 התנהגות דבורי-הדבש mellifera) (Apis תדירות הביקורים: כוורות דבורי-דבש, ממכוורת קיבוץ דן, הוצבו במטע בשני שלבים. בתחילת הפריחה הוצבה כוורת אחת לכל 4 דונם, בשיא הפריחה הוכפל מספר הכוורות, לכוורת לכל 2 דונם. תדירות הביקורים נצפתה במועדים שונים במהלך הפריחה, ונקבעה על-פי מספר הדבורים שביקרו בעץ בדקה. כדי להשוות בין הזנים, נצפו עצים אחידים מבחינת גיל, גודל, שלב הפריחה ועוצמתה. התצפיות נערכו ברצף לכל הזנים, כאשר בכל אחד מהזנים נצפו 10 עצים בכל מועד. אופן איסוף הגמול מהפרחים: הגמול, אבקה או צוף, ואופן איסופו, Topworkers או, Sideworkers מפרחי התפוח על-ידי הדבורים נבדק. שיעור ה- Topworkers נקבע מכלל דבורי הדבש שפעלו בפרחים, הן כ- Topworkers והן כ- Sideworkers. שיעור הדבורים אוספות האבקה נקבע מכלל דבורי הדבש, שנצפו אוספות צוף ו/או אבקה מהפרחים. הבדיקות נערכו במהלך הפריחה, כאשר בכל בדיקה נצפו בכל אחד מהזנים 50 דבורים אקראיות, שביקרו בפרחים בשלב 2. תוצאות הניסוי נותחו סטטיסטית בניתוח דו גורמי ללא אינטרקציה. 2.2.11. החנטה לאורך חיי הפרח ענפים פורחים מהזן הנבדק כויסו בתחילת הפריחה. בשיא הפריחה פרחים בשלבים 2 1, ו- 3 מהענפים הללו הואבקו ידנית בעודף אבקה. הניסוי נערך בבלוקים באקראי, כאשר כל אחד מעצי הניסוי מהווה בלוק, בו הואבקו 50 פרחים מכל שלב. כושר החנטה נקבע לפי שיעורי החנטה, חמישה שבועות לאחר ההאבקה. 2.2.12. מספר הזרעים החיוניים במהלך התפתחות החנטים במהלך התפתחות החנטים נבדק בהם מספר הזרעים החיוניים על-ידי חצייתם, עגולים, בהירים ומלאים נחשבו חיוניים. כאשר זרעים 2.2.13. ניתוחים סטטיסטיים 17

הניסויים נערכו לרוב באקראיות גמורה, אלא אם צוין אחרת. כל הנתונים נותחו למובהקות סטטיסטית לפי מבחן תחום מרובה של,Duncan לאחר ניתוח השונות וטרנספורמציה של נתונים אחוזיים ל-.(SAS, 1990) Arcsin 2.3. ניסויי המעבדה 2.3.1. שיטות עבודה עם צמחים 2.3.1.1. הנבטת זרעים הנבטת הזרעים נעשתה לפי (1975). Janick and Moore הזרעים הוצאו מהפירות מיד לאחר הקטיף, נשטפו במים, נשתלו במצע Vermiculite (אגריקל) אינרטי, שטופל כנגד פיטריות עם Merpan50 (מכתשים), והוכמנו ב- 4 C. לאחר חודשיים הזרעים הועברו לגידול בחממה ב-.20 C 2.3.1.2. שימור העלים והעליים עלים צעירים מעצים בוגרים ועלים מזרעים שנבטו, נשטפו היטב במים, יובשו ונשמרו ב- 70 C- עד לשימוש. עליים נותקו מפרחים טריים בשלב 2 והוקפאו מיידית ב- 70 C- עד לשימוש. 2.3.2. שיטות עבודה עם חיידקים.2.3.2.1 גידול חיידקי E. coli מצע LB מעוקר שימש לגידול חיידקי 10gr/l Bacto Tryptone, 5gr/l yeast extract) E. coli ו- 1.5% Bacto.100mg/l ampicillin הכיל בנוסף גם ampicillin עם LB מצע.(10gr/l NaCl Agar הוסף כדי לקבל מצע מוצק. חיידקים במצב סטציונרי, שגדלו במצע נוזלי ב- 37 C בטלטול למשך הלילה, נשמרו ב- 70 C- לאחר הוספת 30% glycerol לתרבית..2.3.2.2 טרנספורמציה לחיידקי E. coli טרנספורמציה לחיידקי.E coli קומפוטנטים נעשתה בשיטת אלקטרופורציה על-פי Sambrook al. 50µl (1989). et חיידקים קומפוטנטים, להם הוספו 1µl מתגובת הליגציה (סעיף 2.3.3.5.), הודגרו למשך דקה בקרח. התערובת הועברה למבחנת אלקטרופורציה (EquiBio) וה- DNA הוחדר לחיידקים על-ידי מתח חשמלי של 2500V, במכשיר מתוצרת,Easyject Plus D2000 מודל 350V. התערובת הועברה למבחנה שהכילה 1ml מצע LB ללא ampicillin והודגרה שעה ב- 37ºC וגודלו ב-,100mg/l ampicillin המכילות LB החיידקים הושקעו ונזרעו על צלחות.37ºC למשך לילה. 5mg IPTG ו- 1mg X-gal הוספו לצלחות במידת הצורך. 18

19

2.3.3. שיטות עבודה עם DNA רקומביננטי 2.3.3.1. הפקת DNA גנומי מעלים 70 C-, עלים, שנשמרו ב- 100-200mg (1987). Doyle and Doyle גנומי מעלים הופק לפי DNA נכתשו במכתש ועלי בנוכחות חנקן נוזלי. האבקה הכתושה הורחפה ב- 700µl בופר הפקה המכיל: 20mM,2% hexadecyltrimethylammonium bromide [CTAB],100mM Tris ph 8 1% polyvinylpyrolidone,1.4m NaCl,ethylenediaminetetra acetic acid [EDTA] ph 8.1% 2-mercaptoethanol ו- [PVP] MW=40000 התערובת הודגרה 30 דקות ב- 65 C, תוך כדי ערבוב מפעם לפעם. לאחר קירור לטמפרטורת החדר, נערכו שני מיצויים עם (24:1).chloroform:octanol ה- DNA הושקע בעזרת ethanol והומס במים. 2.3.3.2. הפקת DNA פלסמידי הפקת DNA פלסמידי נעשתה עם (GIBCOBRL),Concert Rapid Gel Extraction System לפי הוראות היצרן. 2.3.3.3. חיתוך DNA באנזימי הגבלה DNA פלסמידי נחתך באנזימי הגבלה (Roche) על פי הוראות היצרן. DNA 1µg פלסמידי נחתך ב- 10unit אנזים למשך שעה וחצי. נפח הריאקציה.15µl.2.3.3.4 הרצת DNA בג'ל Agarose הרצת DNA נעשתה במכשיר (Bio-Rad),Mini Sub Cell GT בג'לים של 0.8-1.2% Agarose (בהתאם לגודל קטעי ה- DNA ) המכילים.0.5mg/ml ethidium bromide הג'ל הורץ בבופר TAE EDTA) (40mM Tris-acetate, 1mM במתח של.(Sambrook et al., 1989) 100V לפני הרצת הדגימות הוסף להם 1/6 נפח בופר הטענה, המכיל 40% sucrose ו- 0.25%. bromophenol blue בתום ההרצה הג'ל צולם במכשיר (Stratagene).Eagle Eye II לשם קביעת גודל קטעי ה-,DNA הדגימות הורצו במקביל לסמני גודל ידועים: λ-dna חתוך באנזימי ההגבלה Hind III ו- RI X174,(Roche) Eco חתוך ב- HaeIII.(Roche) 2.3.3.5. ליגציה ליגציה בין קטע DNA לפלסמיד נעשתה בעזרת האנזים (Roche) T4 DNA Ligase על-פי הוראות היצרן. לתגובת הליגציה נלקחו 25ng פלסמיד, ויחס המולקולות היה שלוש מולקולות מחדר על כל מולקולת פלסמיד. הליגציה נערכה ב- 4 C למשך הלילה. 20

.2.3.3.6 תגובת (PCR) Polymerase Chain Reaction התערובת לתגובת ה- PCR הכילה בנפח 50µl את המרכיבים הבאים:,(Roche) מכל אחד מה- dntp 200µΜ,1.5mM MgCl 2,5µl Taq buffer X10,20ng DNA.ddH 2 O ו- (Promega) 2.5unit Taq polymerase במידה והקטע המוגבר יועד לריצוף נעשה שימוש ב- 2unit Taq polymerase Expand High.(Roche) Fidelity תגובות ה- PCR נערכו במכשיר (Stratagene).Robocycler Gradient 96 בטבלה 3 נתונים תנאי תגובת ה- PCR ובטבלאות 4 ו- 5 מפורטים רצפי התחלים וזוגות התחלים ששימשו בעבודה. התחלים סונטזו בחברת,BTG רחובות. חלק מהתחלים סונטז לפי al. (1995) Broothaerts et ו-. al (1995), Janssens et שאר התחלים תוכננו על סמך רצפי הגנים מבנק הגנים. תחלים לאללי S10 ו- S28 תוכננו על-סמך רצפים שנקבעו בעבודה זו. No. of cycles 1 28 1 Temp ( C) 94 Annealing Temp. 72 94 Annealing Temp. 72 94 Annealing Temp. 72 טבלה 3: תנאי תגובת ה- PCR Time (min.) 5 2 3 1 1 1 1 1 5 21

טבלה 4: תחלים ששימשו לתגובות PCR Primer Nucleotide sequence (5 3 ) Position in S gene *OWB122 (S2- GTTCAAACGTGACTTATGCG Nucleotides 296- sense) 315 *OWB123 GGTTTGGTTCCTTACCATGG Nucleotides 588- (S2-antisense) 607 S3sd GAACAAAT/CATTATTCAATGG Nucleotides 38-57 S3sd1 CACGGT/ATTGTGGCCTTC Nucleotides 230-247 S3ad GCAAAG/TAG/CT/CGACCTCAAC Nucleotides 630-647 S3-sense GCAAAACTACAATCTTGAACC Nucleotides 277-297 *OWB145 TAGAATTCATTTGCTAGGGACATC Within S3 allele (S3-antisense) GATC intron S5-sense CAAGTGCCAAACGAAGAATGG Nucleotides 397-417 S5-antisense CATAACTGCGTTCTTCTCATCC Nucleotides 653-674 **OWB126 GCCTTCAGACTCGAATGGACA Nucleotides 44-64 (S7-sense) **OWB127 TGGCATTTACAATATCTACC Nucleotides 344- (S7-antisense) 363 **OWB154 CAGCCGGCTGTCTGCCACTT Nucleotides 130- (S9-sense) 149 **OWB155 CGGTTCGATCGAGTACGTTG Nucleotides 309- (S9-antisense) 328 S10-sense CAAGGATCCTCCTGCCAAG Nucleotides 27-45 S10-antisense CCAGAAGACCAAATGATTGG Nucleotides 335-354 S28-sense GAAATATGGCAGCCCAGTTG Nucleotides 218-237 S28-antisense CACCAATGACCTGTTTTGCC Nucleotides 434-453 *Broothaerts et al., 1995 **Janssens et al., 1995 Accession number U12199 U12200 U19791 U19792 U19793 AF239809 AF201748 22

S-allele Specific primers טבלה 5: זוגות התחלים ששימשו לתגובות PCR Annealing Temp ( C) S10 * S3sd + S3ad 50 S28 * S3sd1 + S3ad 54 S2 # OWB122 + OWB123 52 S3 # S3s + OWB145 54 S5 # S5s + S5as 58 S7 # OWB126 + OWB127 60 S9 # OWB145 + OWB155 60 S10 # S10s + S10as 60 S28 # S28s + S28as 60 * תחלים לריצוף האללים. # תחלים לזיהוי האללים. 2.3.3.7. שיבוט וריצוף קטעי DNA רצף ה- DNA נקבע ביחידה לאנליזת DNA באוניברסיטת ירושלים, בעזרת מכשיר מסוג Abi,(PE Bio System) Prism 377 DNA לאחר שהקטעים הוגברו בתגובת,PCR שובטו לפלסמיד ועברו טרנספורמציה ל- E-coli. (Promega) pgem-t 2.3.4. פעילות S-RNase בעליים 2.3.4.1. מיצוי החלבונים מהעליים הפקת החלבונים מהעליים נעשתה לפי al. (1998). Burgos et 10 עליים, שנשמרו ב-,-70ºC נכתשו במכתש ועלי בנוכחות חנקן נוזלי. האבקה הכתושה עורבבה עם 0.5ml תמיסת מיצוי שהכילה:,0.1% sodium metabissulphite,10% sucrose,30% dimethyl sulfoxide 0.2%.0.05% Triton X-100 ו- 3-10 (Bio-Rad Pharmalyte ph התערובת סורכזה ב-,4ºC במהירות 14,000rpm למשך שעה. הנוזל העליון, שהכיל את החלבונים המסיסים, הוקפא ב- -70ºC עד לשימוש. 2.3.4.2. קביעת ריכוז החלבון ריכוז החלבון נקבע על פי al. 800µl (1976). Bradford et מיצוי חלבון, שנמהל פי 100-400 ב-,ddH 2 O עורבב עם 200µl תמיסת (Bio-Rad) Bradford Reagent בטמפרטורת החדר. הבליעות 23

של התמיסות נקראו בספקטרופוטומטר (7800 (Jasco, model באורך גל.590nm ריכוז החלבון נקבע על פי עקומת כיול של דגימות BSA בריכוזים.5-20µg/ml 2.3.4.3. הרצת החלבונים מהעליים בג'ל נטיבי החלבונים, שמוצו מהעליים, הופרדו בג'ל נטיבי בהתאם לנקודה האיזואלקטרית שלהם.(pI) הג'ל הכיל: 4% Ampholyte Bio-,10% sucrose,(sigma) 7.5% acrylamide/bis-acrylamide 0.04% ammonium persulfate (Bio- ו- (Bio-Rad) 15µl TEMED,(Bio-Rad) Lyte 3/10.Rad) תמיסות של 0.04M DL-glutamic acid ו- 0.1M NaOH שימשו כבופר אנודה ובופר הקטודה, בהתאמה. הרצת הדוגמאות התבצעה במערכת ג'לים מסוג (Bio-Rad) Mini-Protean II ב- C 4. שלבי ההרצה: דרך הג'ל הועבר מתח של 50V למשך 30 דקות. לאחר מכן 30µg חלבון הוטענו בכל בארית, כאשר לדוגמת החלבון הוסף חצי הנפח של בופר הטענה (הכולל,300µl glycerol 375µl תמיסת מיצוי (סעיף 2.3.4.1.) ו-.(325µl ddh 2 O המשך הרצת הדוגמאות בג'ל כללה את השלבים הבאים: 65V שעה, 100V שעה, 130V שעה ו- 175V שעה. 2.3.4.4. צביעת הג'ל לפעילות S-RNase צביעת הג'ל נעשתה ב- 37ºC תוך כדי טלטול לפי (1996). Boskovic and Tobutt הג'ל הודגר 10 דקות בתמיסת שטיפה, שהכילה 0.1M sodium acetate ו- 0.1M KCl וטוטרה ל- ph 5.8 עם 50mg RNA לאחר מכן הוא הודגר במשך 30 דקות בתמיסה טרייה שהכילה.acetic acid Sigma) (cat.7125 מומסים ב- 50ml תמיסת שטיפה. בהמשך הג'ל הודגר שוב בתמיסת שטיפה למשך 10 דקות, קובע עם תמיסת 7% acetic acid למשך דקה, נצבע במשך 2 דקות על-ידי תמיסת 0.2ml acetic acid,80mg toludine blue O ו- 50ml ddh 2 O ונשטף מספר פעמים ב- Flour-S TM התגלו. לבסוף הג'ל צולם במכשיר הבהירים עד שפסי פעילות ה- S-RNase ddh 2 O.(Bio-Rad) MultiImager הפעילות היחסית של האנזים S-RNase בעלי חושבה בתוכנת המחשב (Bio-Rad) Quantity One לפי עוצמת פס הפעילות שלו (הצפיפות האופטית של פס הפעילות מוכפלת בשטחו ) 2.((ODu*mm ערכי הפעילות היחסית של האנזים שהתקבלו הן בתחום בו קיים יחס ישר בינן לבין כמות החלבון הכללית שהוטענה. 24

3. תוצאות 3.1. זמינות האבקה במטע להאבקת פרחי Topred והפרייתם 3.1.1. מועדי הפריחה בזנים, Topred Smoothee ו- Jonathan מאחר שהזן Topred בעל אי-התאם עצמי הוא זקוק להאבקה זרה כדי לחנוט, ולכן תלוי בפריחה חופפת של זנים תורמי אבקה (1979.(Dennis, הזנים Smoothee ו- Jonathan מקובלים כזנים מאביקים ל- Topred במטע המסחרי, ולכן מועדי הפריחה שלהם נצפו בהשוואה לפריחת. Topred בשנים 2001 1999, ו- 2002 התצפיות נערכו במטע ברעם, ובשנת 2000 במטע חוות-מתתיהו (טבלה 6). תנאי ההאבקה בעונות הפריחה השתנו משנה לשנה. בשנים 1999 ו- 2001 התנאים היו טובים, הפריחה נמשכה כשבועיים ומזג האוויר במשך היום התאים לפעילות הדבורים (טמפרטורות ממוצעות 24ºC ו-,17ºC בהתאמה וללא גשם). כמו-כן פריחת צמחי הבר, המתחרה על ביקורי הדבורים, הייתה דלילה. בשנת 2000 משך הפריחה היה קצר בשל גשם שירד בתאריך 20/4 והשיר את עלי הכותרת מהפרחים. בשנה זו אף פריחת צמחי הבר שפעה. בשנת 2002 הפריחה אמנם הייתה ממושכת, אך ברוב הזמן מזג האוויר היה קר וגשום (טמפרטורה ממוצעת,14ºC גשם בתאריכים 31/3-4/4) ולא התאים לפעילות דבורים. למרות השינויים במזג האוויר, במועדי הפריחה ובאורכה, פריחתם של הזנים, Topred Smoothee ו- Jonathan חפפה בכל השנים שנבדקו. טבלה 6: מועדי פריחה בזנים, Topred Smoothee ו- Jonathan 2002 2001 2000 1999 הזן ס.פ ש.פ ה.פ ס.פ ש.פ ה.פ ס.פ ש.פ ה.פ ס.פ ש.פ *ה.פ 18/4 10/4 4/4 7/4 2/4 29/3 20/4 17/4 15/4 2/5 22/4 17/4 Topred 18/4 10/4 30/3 9/4 2/4 29/3 23/4 17/4 15/4 2/5 20/4 14/4 Smoothee 18/4 10/4 4/4 7/4 2/4 29/3 23/4 17/4 15/4 28/4 18/4 14/4 Jonathan *התחלת פריחה (ה.פ.), שיא הפריחה (ש.פ.), סוף פריחה (ס.פ.). 3.1.2. רצפטיביות צלקות הזנים, Topred Smoothee ו- Jonathan לכושר קליטת גרגרי האבקה על-ידי הצלקת חשיבות רבה, כיוון שרצפטיביות צלקות נמוכה עלולה להפחית את יעילות ההפריה וכתוצאה מכך לפגוע ברמת היבול. צלקות מפרחים מכויסים בשלבים שונים, שהואבקו בעודף אבקה והועברו לאחר 24 שעות לתמיסת קיבוע, נצבעו ב-.(Martin, (1959 aniline blue דרגת הרצפטיביות נקבעה לכל צלקת 25

בעזרת מיקרוסקופ אור, לפי מספר גרגרי האבקה שנבטו בה (סעיף 2.2.6.). ממוצע דרגות הרצפטיביות, של 3-6 צלקות המצויות בכל פרח, שימש לניתוח הסטטיסטי. לשם השוואת רצפטיביות הצלקות בין הזנים Topred ו- Jonathan, שימשה אבקת Smoothee להאבקה, כיוון שגרגרי-אבקה מזן זה אינם נושאים הפלוטיפ S הקיים בזנים המואבקים, ולכן הם בעלי התאמה גנטית מלאה. לשם השוואת רצפטיביות צלקות Topred ו- Smoothee, מחצית מהפרחים הואבקו באבקת Jonathan והיתר באבקת Smith. Granny באופן זה כמות גרגרי האבקה המתאימים להפריית פרחי שני הזנים הייתה מאוזנת, כיוון של- Jonathan התאם גנטי חלקי עם Topred (שניהם נושאים אלל S9), ול- Smith Granny התאם גנטי חלקי עם Smoothee (שניהם נושאים אלל S3). יתר הפלוטיפי S מהזנים המאביקים אינם מצויים ב- וב- Smoothee. Topred מהתוצאות המסוכמות בטבלה 7 עולה כי רצפטיביות צלקות פרחי Topred גבוהה בהשוואה לזנים Smoothee ו- Jonathan, אף כי לא תמיד באופן מובהק. Cultivar Topred Jonathan טבלה 7: דרגת רצפטיביות הצלקות בשלבי התפתחות הפרח השונים רצפטיביות צלקות פרחי Topred לעומת Jonathan א. Stage of flower 1 2 3 0.9 A 2.3 A 2.3 A n=10 S.E.=0.15 n=11 S.E.=0.26 n=8 S.E.=0.37 0.9 A 1.3 B 1.7 A n=9 S.E.=0.2 n=9 S.E.=0.10 n=9 S.E.=0.37 ב. רצפטיביות צלקות פרחי Topred לעומת Smoothee Cultivar Topred Smoothee 1 1.3 A n=10 S.E.=0.2 0.8 B n=9 S.E.=0.1 Stage of flower 2 2.6 A n=10 S.E.=0.2 2.1 A n=9 S.E.=0.3 3 3.1 A n=9 S.E.=0.3 2.6 A n=9 S.E.=0.2 n מציין את מספר הפרחים שנבדקו. ערכים באותה עמודה, המלווים באותיות שונות, נבדלים זה מזה באופן מובהק.(P=0.05) 26

3.1.3. חיוניות גרגרי האבקה מהזנים המאביקים Smoothee ו- Jonathan חיוניות גבוהה של-גרגרי אבקה מזנים תורמי אבקה הינה תנאי הכרחי להאבקה יעילה של פרחי. Topred חיוניות גרגרי האבקה מהזנים, Smoothee ו- Jonathan, המקובלים כזנים מאביקים מסחריים ל- Topred, נבדקה בשלבי התפתחות הפרח השונים, ונקבעה על-פי שיעור הנביטה של 100 גרגרי האבקה, לאחר שעה בתמיסת הנבטה. חיוניות גרגרי האבקה הגבוהה ביותר התקבלה ביום פתיחת המאבקים (פרחים בשלב 2). כ- -70 80% מגרגרי האבקה משלב זה נבטו בתמיסת ההנבטה. בשני הזנים התקבלה מגמה של ירידה בחיוניות גרגרי האבקה לאורך חיי הפרח (טבלה 8). 8: טבלה חיוניות גרגרי האבקה מהזנים התפתחות הפרח השונים (% נביטה) Smoothee Stage of flower (1999) Stage of flower (2000) ו- Jonathan בשלבי Year Cultivar Smoothee Jonathan 2 68 B n=6 S.E.=3 77 A n=5 S.E.=2 3 50 B n=5 S.E.=1 70 A n=5 S.E.=2 4 65 A n=3 S.E.=1 59 B n=3 S.E.=2 2 70 A n=5 S.E.=2 76 A n=6 S.E.=2 3 68 A n=5 S.E.=1 59 B n=5 S.E.=2 4 55 A n=5 S.E.=3 32 B n=4 S.E.=2 n מציין את מספר החזרות בניסוי. ערכים באותה עמודה, המלווים באותיות שונות, נבדלים זה מזה באופן מובהק.(P=0.05) 3.1.4. השפעת ההתאם הגנטי באללי S בין Topred לזן המאביק על החנטה לאחר האבקה בעודף מטרת הניסוי הייתה לברר האם לרמת ההתאם הגנטי באללי S בין הזן Topred לזנים המאביקים השפעה על שיעור החנטה בתנאים של האבקה בעודף אבקה. פרחי Topred מכויסים הואבקו ידנית בעודף אבקת, Jonathan לו התאם גנטי חלקי עם Topred (בשני הזנים מבוטא אלל S9), או בעודף אבקת, Smoothee לו התאם גנטי מלא עם Topred (לשני הזנים אין אלל S משותף). לביקורת פרחי Topred הואבקו גם בעודף אבקה עצמית. הניסוי נערך בבלוקים באקראי בכ- 10 עצים, שכל אחד מהם מהווה בלוק. בכל עץ שימש 27

ענף אחד לכל טיפול. בכל אחד מהענפים הואבקו 40 פרחים בשלבים שונים. אחוזי החנטה נקבעו חמישה שבועות לאחר ההאבקה. התוצאות מובאות בטבלה 9 ומהן עולה כי לא התקבלה ירידה בשיעור החנטה של פרחי Topred שהואבקו בעודף אבקת, Jonathan בהשוואה לאלו שהואבקו בעודף אבקת. Smoothee בביקורת שבה הואבק Topred עם עודף אבקה עצמית התקבלו רק פירות בודדים. הזרעים בפירות אלה נבחנו בהמשך ונמצא שהם למעשה תוצאה של הפריה זרה עם אבקה שחדרה לפרחים המכויסים שבניסוי (טבלה 18). טבלה 9: חנטת פרחי Topred לאחר האבקה ידנית בעודף אבקת Smoothee ו- Jonathan ועודף אבקה עצמית Source of pollen % Fruit-set Smoothee Jonathan Topred (Self pollination) 1999 7.7 A n=9 S.E.=1.7 12.9 A n=9 S.E.=4.2 0.6 B n=9 S.E.=0.4 2000 7.5 A n=10 S.E.=2.7 8.4 A n=10 S.E.=2.2 0 B n=11 S.E.=0 הניסוי נערך בבלוקים באקראי (כל עץ מהווה בלוק), כאשר n מציין את מספר הבלוקים. ערכים באותה עמודה, המלווים באותיות שונות, נבדלים זה מזה באופן מובהק (0.05=p). 3.1.5. השפעת הזן המאביק על תכונות פרי ה- Topred לאחר האבקה בעודף פירות Topred שהתקבלו לאחר האבקה ידנית עם עודף אבקה מהזנים Smoothee או Jonathan (סעיף 3.1.4.) נבדקו, על מנת לבחון האם לזן המשמש כמקור אבקה השפעה על משקל הפרי המתקבל ועל מספר הזרעים בו. מתוצאות הניסוי לא ניתן לראות השפעה של הזן המאביק על תכונות פרי ה- Topred שנבדקו (טבלה 10). בשנת 1999 התקבלו מעט מאוד פירות מכל טיפול ולכן הנתונים לא נותחו סטטיסטית. 28

טבלה 10: השפעת הזן המאביק על תכונות פרי ה- Topred לאחר האבקה ידנית בעודף אבקה Source of pollen Smoothee Jonathan 1999 3.5 n=4 S.E.=1.5 5.2 n=5 S.E.=1.8 No. of seeds/fruit 2000 8.7 A n=17 S.E.=0.5 8.4 A n=18 S.E.=0.2 1999 131.4 n=4 S.E.=8.7 114.8 n=6 S.E.=20.3 Fruit weight (gr) 2000 126.7 A n=21 S.E.=4.8 142.0 A n=21 S.E.=7.3 n מייצג את מספר הפירות שהתקבלו ונבדקו, מתוך 400 פרחים שהואבקו בכל טיפול. ערכים באותה עמודה, המלווים באותיות שונות, נבדלים זה מזה באופן מובהק (0.05=P). 3.1.6. התאם גנטי באללי S בין Topred לזנים המאביקים התאם גנטי חלקי בין הזן Topred לזן תורם האבקה עלול להשפיע על הפוריות ) et Goldway,(al., 1999 לכן הייתה חשיבות לאפיון אללי S מהזן Topred ומהזנים המאביקים אותו. מבין שני אללי S של הזן Topred אופיין אחד,,(Goldway et al., (1999 S9 והשני, S28, אופיין לראשונה בעבודה זו. בעבודות קודמות זוהו אללי ה- S מהזנים המאביקים המקובלים של Broothaerts et al., 1995; Janssens et al., ) Granny Smith מלבד אלל אחד מהזן, Topred al., 1997,S10,(1995; Sakurai et אשר זוהה בעבודה זו. קטעי S10 ו- S28 שובטו מ- DNA גנומי של Smith Granny ו- Topred, בהתאמה, בעזרת תחלים מרצפי DNA ההומולוגים לרצפים שמורים באיזורי C2 ו- C5 של S-RNase מתפוחים Primers ).( Universal רצף הבסיסים של אללי S10 ו- S28 נקבע לאחר שהקטעים שהוגברו שובטו לפלסמיד (Promega) pgem-t (איור 3). מ- S10 שובט קטע באורך 603 בסיסים, ומ- S28 שובט קטע בן 527 בסיסים. קטעים אלו הכילו את האינטרון הנישא ב- S-RNase מצמחים ממשפחת הורדיים.(Rosaceae) מיקום האינטרון זוהה לפי השוואה עם רצפי אללי S מבנק הגנים, שמקורם ב- c-dna, וכן לפי רצפי 5 -GU ו-- 3 נמצא כי האינטרון מ- S10.(Lorkovic et al., (2000 בקצות האינטרונים של גנים צמחיים AG מכיל 147 בסיסים, וזה של S28 מכיל 169 בסיסים. בהשוואה בין האקסונים של אללי S10 ו- S28 לאקסונים מאללי S בבנק הגנים התקבלה דרגת הדמיון הגבוהה ביותר לאקסונים של אלל S4 מאגס יפני, 83% ו- 94%, בהתאמה. דרגת הדמיון של האקסונים משני האללים לאקסונים מיתר אללי S מתפוחים הייתה כ- 80%. בהשוואה לאללי S שרוצפו מהגנום (המכילים אינטרון) נמצא כי לאינטרון של S10 דרגת דמיון גבוהה ביותר לאינטרון מאלל S9 שבודד בעבודה זו,(bankit508771) 92% דמיון, ואילו לאינטרון של S28 דרגת הדמיון הגבוהה ביותר לאינטרון מאלל S4 מאגס יפני serotina),(pyrus 96% דמיון. 29

1 50 MdS10 ---------- ---------- ------c--- ---------- c--------- MdS28 ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ PsS4 -ta------- ---------- ------t--c ------a--- a--------- MdS3 -t-----g-- ---------- ------t--- ---------- a--------- Consensus GCCTGCAACT CTAATCCTAC TCCTTG-AAG GATCCTCCTG -CAAGTTGTT C2 51 100 MdS10 ---------- -----a---- --------t- ---ctt---c -------tct MdS28 ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~-- ------g-a- PsS4 ---------- ---------- --------a- ---------- ------g-a- MdS3 ---------t ---------- -------tgt t------ag- -----c--g- Consensus TACGGTTCAC GGTTTGTGGC CTTCAAAC-G GAATGGACCT GACCCAAA-A -----------C2------------- 101 150 MdS10 tc-------- ---------t -cg------c -------t-- ---------c MdS28 ---------- --t-caa--- --tt------ -------a-- ---------g PsS4 ---------c ---------- --tt------ -------a-- ---------g MdS3 -------a-c -----t-t-- --c-----a- c-...... Consensus AATGCAAGAA TACAACCATG AA-CCTCAGA AGGTAAT-TT ATTAATAAT- ----HV-----------* 151 200 MdS10 ---------- ---------- -----a--........ MdS28 ---------- ---------- -----t---- t--t------ -a-a---t-- PsS4 ---------- ---------- -----t---- c--g------ -.-t---c-- MdS3............... Consensus AGATAGTCAA TATTGTTTAT TTCAT-TATG -AC-TGTGTA T-A-ATA-AT 201 250 MdS10 c--------- -g-------- ---------- --ta------ ---------- MdS28 t--------- -a-------- ---------- --ct---g-- ---------- PsS4 t------g-- -ag------- ---------- --ct------ ---------- MdS3............... Consensus -ACATATACT C-ACATAGAT TTTCATGCAC GC--GTGCAA ATATTACAAT 251 300 MdS10 ----aa--c- ---------- ----t----- ---t------ ---------- MdS28 ----tt--a- ---------- ----g----- ---a------ ---------- PsS4 ----tt--a- ---------- ----g----- ---a------ ---------- MdS3............... Consensus TAAT--AA-A TTTAATCATG AATT-TTTCT ATT-TATAAT TATATTGTCA 301 350 MdS10 -------c-- --c-a----- ---------- ---------- ------t--- MdS28 ---------- --g------- ---------- ---------- ---------- PsS4 ---------- --ga------ ---------- ---------- -----t---- MdS3.---ac---- c-ta------ --c------- ---------a ---------- Consensus GATAGGAAAT AT-GCAGCCC AGTTGGAAAT TATTTGGCCG AACGTACTCA *------HV-------- 351 400 MdS10 --------a- ----t-g-t- ------a--- --------aa ---------- MdS28 -------t-- ---------- ------g-a- g-g------t ---------- PsS4 ------g--- ---------- ------g-a- g-g------t ---------- MdS3 ------ag-c -----c-c-- ------cg-- ---------g t--------- Consensus ATCGAACCGA TCATGTAGGC TTCTGG-ATA AACAGTGGC- CAAACATGGC --------C3------- 401 450 MdS10 -g-------- ------t--- ---t-----a --a--a---- --g----t-- MdS28 -----c---- ---------- --g------- ---------- -a-------- PsS4 ---------- ---------- ---------- --------t- -a-------- MdS3 ---------- -c-------- -gc------- ---------- ---gc----- Consensus ACCTGTGGGT ATCCCACAAT AAAGGACGAC ATGCATTACT TTAAAACAGT ----C3-- 451 500 MdS10 ---------- -------t-- ---------- -------a-- ---------- MdS28 ---------- ---------c ---------- --------c- --t---g--- PsS4 ---------- ---------c ---------- --------c- ---------- 30

MdS3 ----g----- ---------- ---------- t--------- ---------- Consensus AATCAAAATG TACATAACCA AGAAACAAAA CGTCTCTGAA ATCCTCTCAA ----------RC4--------- 501 550 MdS10 g---c----- ---------- ---------- --------ac ---a---a-- MdS28 ------t--- -c-----a-c ---c------ --t--tt--t ---t----a- PsS4 ------c--- -c-----a-c -----t---- --t---t--t ---t----a- MdS3 -------a-- ---------- aa----tt-- ---------a c--c-----g Consensus AGGCGAAGAT TAAACCGGAG GGGAAAAACA GGACACGGG- GGA-ATTGTA ----------RC4---- 551 600 MdS10 --c------- ---t------ ---------- -c-------- ---------- MdS28 ---------c ---g-g---- ---------- ---------t -------t-- PsS4 ---------c ---g-g---a --------c- ---------t ---------- MdS3 ---------- --caa----t -g--t---a- ---------- --------a- Consensus AATGCCATAA GCA-TAGTAC CAACAATATG AAACCAAAAC TCAAGTGCCA 601 628 MdS10 ---------- g--...---- t------- MdS28 --------c- a----~~~~~ ~~~~~~~~ PsS4 --------c- a----g---- c------- MdS3 g--c------ ca--t---...------- Consensus AAAGAATAAT -GGACAACGA -TGAATTG ----C5--- איור 3: השוואה בין קטעים גנומים מהגנים ל- S10-RNase ול- S28-RNase מתפוח קטעי רצפים גנומיים של (MdS10) S10-RNase ושל (MdS28) S28-RNase הושוו לקטע מרצף DNA גנומי של,AF201748,AF239809.(MdS3) מתפוח S3-RNase חלקי של cdna ולרצף (PsS4) מאגס יפני S4-RNase AB014072 ו- U12200 הם מספרי הגנים הללו בבנק הגנים, בהתאמה. קווים מציינים בסיסים זהים לרצף הקונסנזוס, נקודות מציינות רווחים ורצף שאינו ידוע מסומן ב- ~. האזורים השמורים (C2 RC4,,C3 ו- C5 ) והאזור בעל השונות הגבוהה (HV) מסומנים בהתאם למתואר ב-. al (1998b). Ushijima et גבולות האינטרון של -S4.(1998a) Ushijima et al. מסומנים ב- * על-פי RNase 31

.3.2 האבקת Topred באמצעות דבורי-דבש mellifera) (Apis 3.2.1. מבנה פרחי הזנים, Topred Smoothee ו- Jonathan מבנה הפרח נלמד כדי להבין כיצד הוא משפיע על התנהגות דבורי הדבש ויעילות ההאבקה. מבנה פרחי Topred נקבע בהשוואה לפרחים מהזנים: Smoothee ו- Jonathan, כאשר הבדיקות נערכו בפרחים משלב 2 (סעיף 2.2.2.), כיוון שהם המועדפים לביקורי הדבורים. קוטר הפרח, גובה הצלקות, גובה המאבקים וקוטר פיזור האבקנים נמדדו בעזרת קליבר דיגיטלי ±0.1,mm המרווח בין בסיסי האבקנים נמדד בעזרת תמונות ממקרוסקופ אלקטרוני. התקבלו מספר הבדלים במבנה הפרח בין הזנים השונים: קוטר פרחי Topred גדול בהשוואה לפרחי, Jonathan אך קטן בהשוואה לפרחי Smoothee (תמונה 3A, טבלה 11). בזנים Topred ו- Jonathan הצלקות נמוכות מהמאבקים, ובזן Smoothee הצלקות ממוקמות בגובה המאבקים או מעט מעליהם (תמונה 3B, טבלה 11). קוטר פיזור האבקנים בפרחי Topred דומה לזה הקיים בפרחי, Jonathan אך קטן בהשוואה לפרחי Smoothee (תמונות 3B ו- 3C, טבלה 11). המרווח בין בסיסי האבקנים בפרחי Topred ו- Smoothee רחב ובפרחי הזן Jonathan צר (טבלה 12, תמונה 4). 32

A Topred Smoothee Jonathan B C תמונה 3: פרחי הזנים, Topred Smoothee ו- Jonathan פרחים משלב 2 עם עלי הכותרת (A) או בלעדיהם (B ו- C ). 33

Cultivar Topred Smoothee Jonathan טבלה 11: מבנה פרחי הזנים, Topred Smoothee ו- Jonathan שנת 2000 א. Flower diameter (mm) Style height (mm) Stamen height (mm) Stamen filaments spread (mm) 38.8 B 7.1 B 10.3 A 8.3 B n=10 S.E.=0.8 n=10 S.E.=0.2 n=10 S.E.=0.3 n=10 S.E.=0.6 46.3 A 8.6 A 9.3 B 12.5 A n=10 S.E.=0.8 n=10 S.E.=0.2 n=10 S.E.=0.3 n=10 S.E.=0.4 31.9 C 6.3 C 8.9 B 9.3 B n=10 S.E.=1.1 n=10 S.E.=0.2 n=10 S.E.=0.2 n=10 S.E.=0.4 Cultivar Flower Style height Stamen height שנת 2001 Stamen diameter (mm) (mm) (mm) filaments spread (mm) Topred 39.8 A 8.8 B 9.3 A 8.3 B n=10 S.E.=1.0 n=10 S.E.=0.2 n=10 S.E.=0.2 n=10 S.E.=0.4 Smoothee 42.6 A 10.2 A 9.1 AB 11.4 A n=11 S.E.=1.2 n=11 S.E.=0.2 n=11 S.E.=0.2 n=11 S.E.=0.4 Jonathan 34.5 B n=12 S.E.=0.7 7.4 C n=12 S.E.=0.3 8.6 B n=12 S.E.=0.2 10.9 A n=12 S.E=0.4 ב. n מציין את מספר הפרחים שנמדדו. ערכים באותה עמודה, המלווים באותיות שונות, נבדלים זה מזה באופן מובהק (0.05=P). טבלה 12: מרווח בין בסיסי האבקנים בפרחי, Topred Smoothee ו- Jonathan Cultivar Topred Smoothee Jonathan Basal gaps between the stamen filaments at 20µm from the base of the anthers 60 A n=5 S.E.=7 80 A n=5 S.E.=11 18 B n=6 S.E.=7 (µm) (0.05=P). מציין את מספר המרווחים שנמדדו. ערכים המלווים באותיות שונות נבדלים זה מזה באופן מובהק n 34

Topred Smoothee Jonathan תמונה 4: מרווח בין בסיסי האבקנים בפרחי, Topred Smoothee ו- Jonathan צולם באמצעות מקרוסקופ אלקטרוני סורק. 3.2.2. תכונות הצוף בפרחי, Topred Smoothee ו- Jonathan צוף הינו הגמול העיקרי של דבורי הדבש מפרחי התפוח (1985 al.,,(mayer et ולתכונותיו עשויה להיות השפעה על תדירות ביקוריהן של הדבורים בפרחים (1993.(Free, תכונות הצוף נבדקו בפרחים מכויסים משלב 2, כיוון שהם המועדפים לביקורי הדבורים. מהבדיקות עולה כי בעונות הפריחה בשנת 2000 ובשנת 2001 נפח הצוף בפרחי, Topred Smoothee ו- Jonathan היה נמוך בהשוואה לשנת 1999. יחד עם זאת, נפח הצוף בפרחי Topred היה דומה לזנים Smoothee או Jonathan בהשוואה לאותה עונת פריחה (טבלה 13). באנליזת HPLC שנערכה לצוף משלושת הזנים,, Topred Smoothee ו- Jonathan, נמצאו הסוכרים fructose,sucrose ו- glucose בלבד. בשנים 2000 ו- 2001 התקבל אותו הרכב סוכרים עבור כל אחד מהזנים, כאשר צוף מפרחי Topred הכיל sucrose בשיעור מעט נמוך, בהשוואה לשני הזנים האחרים (טבלה 14). התוצאות השונות, שהתקבלו בשנת 1999, נובעות ככל הנראה מהבדלים באופן שמירת הצוף (בשנה זו הצוף נשמר ב- 70% אתנול ב- 4ºC וביתר השנים הוא נשמר ב- ddh 2 O ב- 20ºC - ). ריכוז הסוכרים הכללי בצוף נמדד בשנת 1999 ישירות מהפרח בעזרת רפרקטומטר, ובשנים 2000 ו- 2001 הוא חושב מסכום ריכוזי הסוכרים, שהתקבלו באנליזת,HPLC ונמצא דומה בשלושת הזנים (טבלה 15). 35

Cultivar Topred Smoothee Jonathan טבלה 13: נפח הצוף בפרחי, Topred Smoothee ו- Jonathan Volume of nectar per flower (µl) 1999 2000 2001 1.7 AB n=7 S.E.=0.1 2.5 A n=8 S.E.=0.3 1.9 B n=6 S.E.=0.2 0.4 A n=7 S.E.=0.05 0.5 A n=8 S.E.=0.05 0.5 A n=5 S.E.=0.02 0.5 A n=10 S.E.=0.03 0.54 A n=9 S.E.=0.04 0.6 A n=10 S.E.=0.06 n מציין את מספר הפרחים שנבדקו. ערכים באותה עמודה, המלווים באותיות שונות, נבדלים זה מזה באופן מובהק.(P=0.05) %) Smoothee, Topred טבלה 14: הסוכרים בצוף) הרכב הסוכרים בצוף פרחי ו- Jonathan מכלל Cultivar Topred Smoothee Sucrose Fructose Glucose 1999 2000 2001 1999 2000 2001 1999 2000 2001 52 B 29 B 32 A 28 A 36 A 36 A 20 A 36 A 32 A n=3 n=9 n=6 n=3 n=9 n=6 n=3 n=9 n=6 S.E.=1 S.E.=5 S.E.=2 S.E.=1 S.E.=3 S.E.=1 S.E.=2 S.E.=2 S.E.=1 60 A n=3 S.E.=2 44 A n=10 S.E.=2 Jonathan / 35 AB n=10 S.E.=3 43 A n=6 S.E.=1 40 A n=6 S.E.=2 23 B n=3 S.E.=1 27 B n=10 S.E.=1 / 32 AB n=10 S.E.=2 29 B n=6 S.E.=1 31 B n=6 S.E.=1 17 A n=3 S.E.=2 29 B n=10 S.E.=1 / 33 AB n=10 S.E.=1 מציין את מספר החזרות בניסוי. ערכים באותה עמודה, המלווים באותיות שונות, נבדלים זה מזה באופן מובהק 27 B n=6 S.E.=0 29 B n=6 S.E.=1 n.(p=0.05) 36

טבלה 15: ריכוז הסוכרים הכללי בצוף פרחי, Topred Smoothee ו- Jonathan Cultivar Topred Smoothee Total sugar concentration (%w/v) 1999 2000 2001 50 A 51 A 56 A n=7 S.E.=3 n=8 S.E.=5 n=6 S.E.=3 50 A 53 A 60 A n=8 S.E.=2 n=9 S.E.=5 n=6 S.E.=4 Jonathan 42 A n=6 S.E.=3 55 A n=9 S.E.=3 53 A n=6 S.E.=3 n מציין את מספר החזרות בניסוי. ערכים באותה עמודה, המלווים באותיות שונות, נבדלים זה מזה באופן מובהק.(P=0.05) 3.2.3. תדירות ביקורי הדבורים בזנים, Topred Smoothee ו- Jonathan לתדירות ביקורי דבורי הדבש בעצי התפוח חשיבות רבה, כיוון שהן משמשות כוקטור העיקרי להעברת אבקה במטע (1985 al.,.(mayer et תדירות ביקורי הדבורים נבחנה בעצי Topred פורחים, ולשם השוואה גם בזנים Smoothee ו- Jonathan הנחשבים פוריים. תדירות הביקורים נצפתה במועדים שונים במהלך הפריחה, ונקבעה על-פי מספר הדבורים שביקרו בעץ בדקה. כדי להשוות בין הזנים, נצפו עצים אחידים מבחינת גיל, גודל, שלב הפריחה ועוצמתה. התצפיות נערכו ברצף לכל הזנים, כאשר בכל אחד מהזנים נצפו 10 עצים בכל מועד. בשנת 1999 נצפו עצים אקראיים בכל מועד, בשנים 2000 ו- 2001 נבדקו אותם העצים בכל המועדים. תדירות הביקורים בעצי Topred נמצאה דומה לזו שנצפתה בעצי, Smoothee וגבוהה מזו שנצפתה בעצי Jonathan (טבלה 16). בשנים 1999 ו- 2000 נערכו מעט תצפיות בזנים Topred ו- Jonathan, בהשוואה לשנת 2001, ויתכן שהתוצאות בשנים אלה אינן מדויקות בשל כך. 37

Topred Cultivar Smoothee טבלה 16: תדירות ביקורי דבורי הדבש בזן Topred לעומת הזן Smoothee א. Number of honeybees/tree/min. 1999 2000 2001 12.4 A 4.2 A 12.5 A n=8 S.E.=0.6 n=3 S.E.=0.4 n=6 S.E.=0.5 9.0 A 4.4 A 13.0 A n=8 S.E.=0.5 n=3 S.E.=0.5 n=6 S.E.=0.5 Cultivar ב. בזן Topred לעומת הזן Jonathan Number of honeybees/tree/min. n 1999 2000 2001 Topred 10.6 A 4.2 A 8.3 A n=2 S.E.=0.7 n=3 S.E.=0.4 n=8 S.E.=0.4 Jonathan 5.8 A 3.6 A 4.6 B n=2 S.E.=0.6 n=3 S.E.=0.4 n=8 S.E.=0.2 מציין את מספר המועדים בהם נבדק כל זן. ערכים באותה עמודה, המלווים באותיות שונות, נבדלים זה מזה באופן מובהק (0.05=p). 3.2.4. אופן איסוף הגמול מפרחי, Topred Smoothee ו- Jonathan הגמול של דבורי הדבש מהפרח הינו צוף ואבקה. איסוף הצוף מפרחי התפוח יכול להתבצע הן על- ידי החדרת החדק מהחלק העליון של הפרח ( Topworking ) והן מצידו.( Sideworking ) לעומת זאת איסוף אבקה הינו רק על-ידי Topworking ישירות מהמאבקים ) al., Mayer et Free, 1993 ;1985). אופן איסוף הגמול מהפרח נבדק בזן, Topred ולשם השוואה גם בזנים הנחשבים פוריים, Smoothee ו- Jonathan, כיוון שהאבקה מתבצעת רק על ידי, Topworkers הנוגעות בצלקות ובמאבקים 1993) Free,.(Robinson and Fell, 1981; שיעור ה- Topworkers נקבע מכלל דבורי הדבש שפעלו בפרחים, הן כ- Topworkers והן כ-. Sideworkers שיעור הדבורים אוספות האבקה נקבע מכלל דבורי הדבש, שנצפו אוספות צוף ו/או אבקה מהפרחים. הבדיקות נערכו במהלך הפריחה, כאשר בכל בדיקה נצפו בכל אחד מהזנים 50 דבורים אקראיות, שביקרו בפרחים בשלב 2. מהתצפיות עולה כי רק 10-40% מכלל הדבורים, שביקרו בפרחי Topred ו- Smoothee, פעלו כ- Topworkers, לעומת כ- 90% בפרחי Jonathan (טבלה 17 א.). שיעור אוספות האבקה מכלל הדבורים שביקרו בפרחים היה נמוך. בפרחי Topred ו- Smoothee הוא לא עלה על 38

10% בשלושת עונות הפריחה, ואילו ב- Jonathan הוא היה גבוה מכך, 16-28%, בשנת 2000 הנתונים הראו הבדל מובהק בין הזנים (טבלה 17 ב.). אם כי רק טבלה 17: אופן איסוף הגמול מפרחי, Topred Smoothee ו- Jonathan דבורים שפעלו מחלקו העליון של הפרח ( Topworkers ) א. Cultivar Topworkers /total number of honeybees (%) 1999 2000 2001 Topred 10.0 B 11.3 B 17.7 C n=6 S.E.=2.0 n=3 S.E.=2.8 n=8 S.E.=1.5 Smoothee 31.6 A 7.4 B 39.7 B n=6 S.E.=6.3 n=3 S.E.=4.4 n=8 S.E.=2.1 Jonathan 91.7 n=1 89.8 A n=3 S.E.=3.2 91.0 A n=8 S.E.=2.1 Cultivar Topred Smoothee Jonathan ב. דבורים אוספות אבקה Pollen gatherers/total number of honeybees (%) 1999 2.6 A n=6 S.E.=1.4 3.2 A n=6 S.E.=2.8 16.7 n=1 2000 6.5 B n=3 S.E.=2.8 6.7 B n=3 S.E.=4.5 28.0 A n=3 S.E.=2.8 2001 10.0 A n=8 S.E.=1.7 8.8 A n=8 S.E.=1.6 16.1 A n=8 S.E.=3.0 תוצאות הניסוי נותחו סטטיסטית בניתוח דו גורמי ללא אינטרקציה. באותה עמודה, המלווים באותיות שונות, נבדלים זה מזה באופן מובהק (0.05=P). n מציין את מספר התצפיות בניסוי. ערכים 39

3.3. רמת ההתאם העצמי ב- Topred לעומת Smoothee 3.3.1. זיהוי אללי S בזנים המצויים במטע Topred בתגובת PCR ככלי לבדיקת הרכב אללי S בצאצאים, במטרה לעקוב אחר ההאבקה וההפריה במטע, עובדה שיטה לזיהוי ספציפי של אללי S בתגובת.PCR על בסיס רצפי ה- DNA של אללי S שפוענחו במסגרת עבודה זו ועבודותיהם של אחרים Broothaerts et al., 1995; Janssens et al., 1995; Sakurai et al., 1997; Goldway et al., ) 1999) סונטזו תחלים ספציפיים לכל אחד מאללי S (סעיף 2.3.3.6.). כך זוהו באופן ספציפי האללים: S10 S9, S7, S5, S3, S2, ו- S28. בתמונה 5 מוצגת האנליזה של כל זני התפוח ההוריים המצויים במטע:, Topred Granny Smith, Jonathan, Smoothee ו- Gala. Royal כל זוג תחלים הגביר קטע מאלל S ספציפי, ולא הגביר קטעים מאללי S אחרים. Topred Smoothee Jonathan Granny Smith Royal Gala S9 S28 S2 S3 S7 S9 S3 S10 S2 S5 603 bp - 310 bp - 72 bp - תמונה 5: תוצרי תגובת PCR לזיהוי ספציפי של אללי S מהזנים במטע. Topred 3.3.2. קביעת רמת אי ההתאם העצמי ב- Topred על-ידי זיהוי אללי S בצאצאים כפי שהוזכר הזן Topred נחשב בעל אי-התאם עצמי מלא (1979,(Dennis, יחד עם זאת מניסוי האבקה ידנית של פרחי Topred עם עודף אבקה עצמית התקבלו פירות אחדים (טבלה 9). הועלתה האפשרות כי, למרות המקובל בספרות, יתכן ול- Topred יכולת הפריה עצמית מסוימת בתנאי הארץ. במטרה לבחון זאת ברמה המולקולרית הונבטו זרעי הפירות הללו ותכולת אללי S בהם נקבעה בתגובת PCR לזיהוי אללי S (סעיף 3.3.1.), שנערכה על מיצוי DNA גנומי מהעלים. 40

תכולת אללי S בזרעים הצביעה על כך שהם אינם תוצרי הפריה עצמית. כל אחד מהזרעים הכיל אלל S שמקורו בזן האימהי, Topred (S9 או S28), ואלל S שני שמקורו באבקה זרה מאחד הזנים המאביקים המצויים במטע (טבלה 18). טבלה 18: תכולת אללי S בצאצאי Topred (S9-S28) ידנית עם עודף אבקה עצמית שהתקבלו לאחר האבקה S-alleles 9-2 No. of seedlings 6 Total: 9-3 9-5 9-7 2 1 1 9-10 28-2 28-3 28-5 28-10 5 2 1 2 1 21 3.3.3. החנטה בפרחי Smoothee לאחר האבקה עצמית בניגוד ל- Topred, הזן Smoothee נחשב כבעל יכולת הפריה עצמית (1979.(Dennis, מטרת הניסוי הייתה לברר את מידת החנטה לאחר האבקה עצמית ב- Smoothee ולבחון האם ניתן להסביר את ההבדל בפוריות שבין הזנים Smoothee ו- Topred על-ידי הבדל בתכונה זו. החנטה העצמית ב- Smoothee נבדקה לאחר שפרחים מכויסים הואבקו בעודף אבקה עצמית, ולאחר האבקה ספונטנית של פרחים מכויסים, שלא הואבקו כלל. כביקורת הואבקו פרחי Royal ו- Granny Smith מכויסים בעודף אבקה מזנים בעלי התאם גנטי חלקי, Smoothee,Gala הנושאים כל אחד אלל (S3 S ו- S2 בהתאמה) המצוי גם בזן Smoothee ובעודף אבקה מזנים בעלי התאם גנטי מלא, Topred ו- Jonathan (שאינם נושאים אללי S המצויים ב-.( Smoothee הניסוי נערך בבלוקים באקראי בכ- 10 עצים, שכל אחד מהם מהווה בלוק. בכל עץ שימש ענף אחד לכל טיפול. בכל אחד מהענפים הואבקו 40 פרחים בשלבים שונים. אחוזי החנטה נקבעו חמישה שבועות לאחר ההאבקה. שיעורי החנטה של פרחי, Smoothee שהואבקו בעודף אבקה עצמית, או לאחר האבקה ספונטנית, היו נמוכים בהשוואה לשאר טיפולי ההאבקה (8-17% לעומת 19-37%, בהתאמה) (טבלה 19), למרות שלאחר שהזרעים מהחנטים הללו נבחנו נמצא כי רובם (88%) התקבלו כתוצאה מהפריה זרה עם אבקה שחדרה לפרחים המכויסים שבניסוי (טבלה 21). עוד עולה מטבלה 19 כי לרמת ההתאם הגנטי בין ה- Smoothee לזן המאביק לא הייתה השפעה על שיעורי החנטה בניסוי זה. 41

טבלה 19: חנטה בפרחי Smoothee לאחר האבקה ידנית בעודף אבקה והאבקה ספונטנית Source of pollen Smoothee (Self pollination) Smoothee (Spontaneous pollination) Topred Jonathan Granny Smith Royal Gala 1999 8.2 C n=8 S.E.=0.5 9.1 C n=10 S.E.=4.0 36.6 A n=9 S.E.=4.4 27.0 AB n=8 S.E.=3.7 24.3 B n=9 S.E.=3.2 18.8 B n=7 S.E.=1.8 % Fruit-set 2000 16.9 A n=9 S.E.=1.8 10.8 B n=10 S.E.=2.7 25.2 A n=10 S.E.=4.1 22.5 A n=10 S.E.=3.3 26.3 A n=9 S.E.=3.6 24.2 A n=10 S.E.=3.1 הניסוי נערך בבלוקים באקראי (כל עץ מהווה בלוק), כאשר n מציין את מספר הבלוקים. ערכים באותה עמודה, המלווים באותיות שונות, נבדלים זה מזה באופן מובהק (0.05=p). 3.3.4. מספר הזרעים בפירות Smoothee לאחר האבקה עצמית בפרחי תפוח 5 מגורות, שכל אחת מהן מכילה שתי ביציות, לכן פרי תפוח יכול להכיל עד 10 זרעים (1993.(Free, יחד עם זאת, פירות מתפתחים גם עם מספר נמוך של זרעים. לכן מספר הזרעים בפירות, Smoothee שהתקבלו לאחר האבקה עצמית, יכול לשמש מדד, בנוסף לחנטה, למידת ההפריה שהתרחשה 1996) al.,.(voltz et מספר הזרעים נקבע בפירות, Smoothee שהתקבלו מניסוי האבקה שתואר בסעיף 3.3.3. נמצא כי מספר הזרעים בפירות, Smoothee שהתקבלו לאחר שהפרחים הואבקו בעודף אבקה עצמית או שלא הואבקו כלל (האבקה ספונטנית), היה נמוך באופן מובהק בהשוואה לשאר טיפולי ההאבקה (טבלה 20). זרעים אלו נבחנו בהמשך ונמצא שרובם (88%) הם תוצרי הפריה זרה עם אבקה שחדרה לפרחים המכויסים שבניסוי (טבלה 21). בתנאי ניסוי אלה להתאם הגנטי בין Smoothee לזן המאביק לא הייתה השפעה על מספר הזרעים בפרי. כאשר הזן המאביק היה Topred או, Jonathan להם התאם גנטי מלא עם Smoothee התקבל מספר זרעים ממוצע לפרי שאינו שונה באופן מובהק מהאבקה עם אבקת Smith Granny או Gala, Royal להם התאם גנטי חלקי עם. Smoothee 42

טבלה 20: מספר הזרעים בפירות Smoothee שהתקבלו לאחר האבקה ידנית בעודף אבקה Source of pollen Smoothee (Self pollination) Smoothee (Spontaneous pollination) Topred Jonathan Granny Smith Royal Gala 1999 2.9 B n=9 S.E.=0.5 3.0 B n=6 S.E.=0.5 7.8 A n=9 S.E.=0.3 7.0 A n=9 S.E.=0.4 7.2 A n=10 S.E.=0.3 7.0 A n=10 S.E.=0.6 No. of seeds/fruit 2000 2.7 C n=9 S.E.=0.4 1.8 C n=8 S.E.=0.3 7.6 A n=9 S.E.=0.4 6.1 B n=10 S.E.=0.7 8.2 A n=9 S.E.=0.5 5.7 B n=10 S.E.=0.4 הניסוי נערך בבלוקים באקראי (כל עץ מהווה בלוק), כאשר n מציין את מספר הבלוקים. ערכים באותה עמודה, המלווים באותיות שונות, נבדלים זה מזה באופן מובהק (0.05=p). 3.3.5. קביעת רמת ההתאם העצמי ב- Smoothee על-ידי זיהוי אללי S בצאצאים 3.3.5.1. זיהוי אללי S בצאצאי Smoothee שהתקבלו לאחר האבקה עצמית מטרת הניסוי הייתה לקבוע את רמת ההתאם העצמי ב- Smoothee ברמה המולקולרית, ולברר האם הבדלים בתכונה זו בין הזנים Topred ו- Smoothee יכולים להסביר את ההבדלים בפוריותם. בזן Smoothee התקבלו 8-17% חנטה לאחר האבקה ידנית בעודף אבקה עצמית ולאחר האבקה עצמית ספונטנית (טבלה 19). רמת ההפריה העצמית ב- Smoothee נקבעה על-ידי זיהוי תכולת אללי S בזרעים מ- 17 פירות שהתפתחו מחנטים אלה. הזרעים הונבטו ואללי S בהם זוהו בעזרת תגובת,PCR שנערכה על מיצוי DNA מהעלים שהתפתחו (סעיף 3.3.1.). נמצא שרק 12% מהזרעים הם תוצרי הפריה עצמית. יתר הזרעים הכילו אלל S שמקורו בזן האימהי Smoothee (S2 או S3) ואלל S שני שמקורו באבקה זרה מאחד הזנים המאביקים המצויים במטע. שלושה מהזרעים שנבדקו הכילו צרוף טריפלואידי של אללי S (טבלה 21). 43

(S2-S3) טבלה 21: תכולת אללי S בצאצאי Smoothee עודף אבקה עצמית והאבקה עצמית ספונטנית שהתקבלו לאחר האבקה ידנית עם Self Cross fertilization fer. S-alleles 2-3 2-7 2-9 2-10 2-28 3-9 3-10 3-28 2-7-10 3-7-10 3-7-28 No. of seeds Self-hand pol. 1 3 1 4 3 12 Spontaneous 3 1 2 4 2 1 3 2 1 1 1 21 Total 4(12 %) 29(88%) 33 - לא נמצא 3.3.5.2. זיהוי אללי S בצאצאי Smoothee שהתקבלו לאחר האבקה עם אבקה מזנים בעלי התאם גנטי חלקי באללי S מטרת הניסוי הייתה לבחון האם הפריה עצמית בזן Smoothee מתרחשת בנוכחות גרגרי אבקה זרים. תכולת אללי S נקבעה בזרעי פירות, Smoothee שהתקבלו לאחר שהפרחים הואבקו ידנית בעודף אבקת (S3-S10), Granny Smith או בעודף אבקת (S2-S5) Royal Gala (טבלה.(19 לזנים אלו התאם גנטי חלקי עם (S2-S3), Smoothee כיוון שהם חולקים הפלוטיפ S משותף, S3 או S2 בהתאמה. הזרעים הונבטו ותכולת אללי S בהם נקבעה בעזרת תגובת PCR לזיהוי אללי S, שנערכה על מיצוי DNA מהעלים (סעיף 3.3.1.). בניסוי זה לא נמצאו זרעים שהינם תוצאה של הפריה עצמית (כלומר לא התרחשה הפריה עם גרגר אבקה נושא הפלוטיפ S2 או S3 המצויים גם ב- Smoothee ), וכל הזרעים שהתקבלו הכילו צירופי אללי S שהצביעו על הפריה זרה. 86% מהזרעים שהתקבלו לאחר האבקה עם אבקת או S5, נשאו הפלוטיפ S10, Royal Gala וכן לאחר האבקה עם אבקת Granny Smith בהתאמה. יתר הזרעים התקבלו מהפריה זרה עם אבקה מאחד הזנים המאביקים המצויים במטע (טבלה 22). 44

טבלה 22: תכולת אללי S בצאצאי Smoothee (S2-S3) שהתקבלו לאחר האבקה ידנית בעודף אבקה א. מפרחי Smith (S3-S10) Granny Fertilization with Gra. Smith pollen *Fertilization with other cultivars pollen S-alleles 2-10 3-10 2-5 3-9 3-5 No of seedlings 12 12 1 2 1 Total 24 (86%) 4 (14%) ב. מפרחי Gala (S2-S5) Royal Fertilization with Roy. Gala pollen **Fertilization with other cultivars pollen S-alleles 2-5 3-5 2-10 3-9 3-10 No of seedlings 13 11 1 2 1 Total 24 (86%) 4 (14%) * זנים מפרים אפשריים: (S7-S9) Royal Gala (S2-S5), Jonathan או (S9-S28). Topred ** זנים מפרים אפשריים: (S7-S9) Granny Smith (S3-S10), Jonathan או (S9-S28). Topred 3.3.6. האבקה והפריה של פרחי Smoothee במטע Solid block מכיוון שהזן Smoothee נחשב כבעל יכולת הפריה עצמית (1979,(Dennis, ניטעו בארץ ובעולם מטעי Smoothee ללא זנים מאביקים blocks).(solid הסתבר כי היבולים ממטעים כאלו בארץ נמוכים, בהשוואה למטעי Smoothee בהם ניטעו זנים מאביקים. מטרת הניסויים הייתה לבחון האם ניתן לקשור את רמת היבולים הנמוכה בהאבקה והפריה בלתי מספיקות. 3.3.6.1. מספר הזרעים בפירות Smoothee ממטע Solid block כאמור בפרי התפוח יכולים להתפתח עד 10 זרעים (1993,(Free, אך בהאבקה שאיננה אופטימלית יתפתחו פירות עם מספר נמוך של זרעים. לפיכך ניתן לעמוד על רמת ההאבקה וההפריה במטע על-ידי בחינת מספר הזרעים בפרי (1996 al.,.(voltz et מספר הזרעים בפירות Smoothee ממרכז מטע,Solid block המרוחקים כ- 20 שורות עצים (כ- 100 מטר) מהזן המאביק הקרוב ביותר, נקבע. כביקורת נבדק מספר הזרעים בפירות מעצי Smoothee ממטע סמוך, הסמוכים לזן מאביק. 45

מטבלה 23 עולה כי מספר הזרעים הממוצע בפירות Smoothee ממטע Solid block נמוך באופן מובהק, בהשוואה למספר הזרעים בפירות, Smoothee שמקורם בעצים הסמוכים לזנים המאביקים Topred או Smith. Granny טבלה 23: מספר הזרעים בפירות Smoothee שהתקבלו לאחר האבקה חופשית במטע Pollenizer No Pollenizer (Solid block) Granny Smith Topred No. of seeds/fruit 1999 2000 1.7 B 2.8 B n=50 S.E.=0.2 n=25 S.E.=0.4 7.9 A 7.2 A n=50 S.E.=0.2 n=49 S.E.=0.2 8.1 A 6.7 A n=48 S.E.=0.3 n=49 S.E.=0.3 n מייצג את מספר הפירות שנבדקו. ערכים באותה עמודה, המלווים באותיות שונות, נבדלים זה מזה באופן מובהק.(P=0.05).3.3.6.2 זיהוי אללי S בצאצאי Smoothee ממטע Solid block תכולת אללי S בזרעי פירות Smoothee ממטע Solid block נקבעה, כדי לבחון האם יכולת הפריה עצמית נמוכה וחוסר באבקה זרה להפריה יעילה הם הגורמים לפוריות הנמוכה של מטעים אלה. 33 זרעי פירות Smoothee ממרכז מטע,Solid block מעצים המרוחקים כ- 20 שורות (כ- 100 מטר) מהזן המאביק הקרוב ביותר, הונבטו ותכולת אללי S בהם נקבעה בעזרת תגובת PCR לזיהוי אללי S, שנערכה על מיצוי DNA גנומי מהעלים (סעיף 3.3.1.). מטבלה 24 ניתן לראות כי למרות הריחוק הרב מהזן המאביק הקרוב ביותר, רק 21% מהזרעים התקבלו כתוצאה מהפריה עצמית. יתר הזרעים התקבלו מהפריה עם אבקה זרה. אבקה זו הגיעה כנראה באמצעות דבורים שנשאו אותה ממטעים מרוחקים. 46

טבלה 24: תכולת אללי S בצאצאי Smoothee ממטע Solid block Self- Cross fertilization fertilization S-alleles 2-3 2-2 3-3 2-7 2-9 2-10 3-9 3-10 3-28 3-9-10 No of seedlings 3 1 3 4 3 10 1 2 5 1 Total 7 (21%) 26 (79%) 3.3.7. פעילות S-RNase בעליים של פרחי Smoothee אחת הדרכים לשבירת מנגנון אי-התאם עצמי היא אובדן פעילות S-RNases בעמוד העלי ) Sassa al., 1997.(et פעילות S-RNase בעליים של פרחי Smoothee נבחנה, כדי לבדוק האם זו הסיבה להתאם העצמי החלקי של הזן. 30µg מיצוי חלבון נטיבי מעליים של הזנים Smoothee ו- Topred הורצו בג'ל לפי הנקודה האיזואלקטרית.(pI) לאחר הדגרה בתמיסת RNA וצביעה ב-,toludine blue O הג'ל נשטף. פסים בהירים הופיעו במקומות בהם התרחש פרוק מולקולות.RNA מיקום פסי הפעילות של S28-RNase פס הפעילות של.(1999) Boskovic and Tobutt נקבע לפי S9-RNase ו- S3-,S2- זוהה לפי האופי הבסיסי של חלבוני (Sassa et al., (1996 S-RNase (תמונה 6). רמות הפעילות של ה- S-RNases, שנקבעו ממכפלת העוצמה הממוצעת של פס הפעילות בשטח שלו, מפורטות בטבלה 25. מג'ל פעילות RNase עולה כי שני האללים הנישאים ב- Smoothee, S2 ו- S3, פעילים בעליים (תמונה 6). בהרצת כמויות חלבון זהות ממיצויי עליים מהזנים Smoothee ו- Topred נמצא כי פעילות S3-RNase בעליים של Smoothee גבוהה בהשוואה לפעילות -S9 ו- S28-RNase מהזן. Topred פעילות S2-RNase מהזן Smoothee דומה לפעילות,S28-RNase וגבוהה בהשוואה לפעילות S9-RNase מהזן. Topred 47

Topred Smoothee S3 - S28 - S2 - S9 - תמונה 6: פעילות S-RNase מעליים של פרחי Smoothee ו- Topred. טבלה 25: עוצמת פסי הפעילות של S-RNase מהג'ל שבתמונה 6: S-RNase Activity (OD*mm 2 ) S3 31.9 S28 16.5 S2 13.5 S9 7.1 48