2014-2015 Τεύχος 2 Μαθητές του Ομίλου με αλφαβητική σειρά: ΠΡΟΤΥΠΟ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΛΥΚΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΠΑΤΡΩΝ ΟΜΙΛΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Αγγελική Γιαννακοπούλου Ανδρέας Λικμέτα Ανδριάνα Κατσιγιάννη Ασπασία Κουκουβέλα Δήμητρα Δημακοπούλου Δημήτρης Σπανός Ευαγγελία Παπαϊωάννου Ιωάννα Δημητροπούλου Μάιρα Σπυροπούλου Μαρία Μπαντούνου Ναταλία Ροδοπούλου [ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΣΤΟΜΑΤΩΝ ΦΥΛΛΩΝ ΦΥΤΟΥ] Η εργασία αυτή πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Φυσικών Επιστημών του Πρότυπου Πειραματικού Λυκείου του Πανεπιστημίου Πατρών σε διάστημα 4 διδακτικών ωρών από τους μαθητές που συμμετείχαν στον Όμιλο Βιολογικών και Φυσικών Επιστημών. Οι μαθητές χωρίστηκαν σε 2 ομάδες και η κάθε ομάδα ανέλαβε να διερευνήσει ένα από τα 2 ερωτήματα που θέσαμε στην πορεία αυτής της εργασίας.
2 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα φυτά ανταλλάσουν με το περιβάλλον τους ύλη σε μορφή αερίων και για το σκοπό αυτό απαιτούνται δίοδοι επικοινωνίας, δηλαδή τα στόματα της επιδερμίδας των φύλλων. Η δημιουργία στομάτων στα φυτά θεωρείται κεφαλαιώδους σημασίας για την εξελικτική θεωρία. Η απόκτηση στομάτων από τα φυτά ήταν αυτή που επέτρεψε την ευρύτατη διάδοσή τους στις επιφάνειες της ξηράς περίπου πριν 400 εκατομμύρια χρόνια.. Όταν τα στόματα είναι ανοικτά εισέρχεται με διάχυση στο εσωτερικό του φύλλου διοξείδιο του άνθρακα (CO 2 ), απαραίτητο συστατικό για τη διαδικασία της φωτοσύνθεσης, ενώ οξυγόνο (O 2 ) αποβάλλεται στην ατμόσφαιρα ως προϊόν της φωτοσύνθεσης. Μέσω των στομάτων απομακρύνεται και νερό (H 2 O) στην μορφή των υδρατμών με τη διαδικασία της διαπνοής. (Βλέπε τεύχος 1). Εικόνα 1 Τα στόματα όπως φαίνεται στην εικόνα 1, είναι δομές που μπορούν να ανοίγουν (εικόνα α) και να κλείνουν (εικόνα β) με τη βοήθεια ειδικών κυττάρων, των καταφρακτικών κυττάρων, τα οποία όταν απομακρύνονται ανοίγει ο πόρος και όταν έρθουν κοντά κλείνει ο πόρος.
3 Στόματα υπάρχουν τόσο στα φύλλα όσο και νεαρούς πράσινους βλαστούς και στα άνθη αλλά είναι περισσότερα στα φύλλα και κυρίως στην κάτω επιφάνεια των φύλλων (εικόνα 2) στα χερσαία φυτά. Εικόνα 2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Για την παρατήρηση στομάτων σε φύλλα χερσαίων φυτών χρησιμοποιήσαμε φωτονικό μικροσκόπιο XSZ-106 Antimould. Η απεικόνιση των δειγμάτων έγινε με μολύβι στο χαρτί, λόγω έλλειψης ειδικής φωτογραφικής μηχανής προσαρμοσμένης στο μικροσκόπιο. Τα φύλλα που χρησιμοποιήσαμε προέρχονται από φυτά του γένους Pelargonium που αναπτύξαμε σε γλάστρες (εικόνα 3) στο χώρο του σχολείου. Ακολουθήσαμε δύο διαφορετικές μεθόδους για τη δημιουργία δειγμάτων επιδερμίδας φύλλων. Μέθοδος 1 η νωπή εφυμενίδα Σύμφωνα με την κλασσική μέθοδο, τα φύλλα κόβονται τραβώντας προς το μέρος μας ένα τμήμα όπως φαίνεται στις εικόνες 4, 5 και μικρό τεμάχιο της λεπτής επιδερμίδας
4 της κάτω επιφάνειας τοποθετείται σε αντικειμενοφόρο πλάκα εικόνα 6, μέσα σε σταγόνα νερό ή μέσα σε σταγόνα με Lugol για να βάψουμε τα κύτταρα για μικροσκόπηση. ΕΙΚΟΝΑ 4 ΕΙΚΟΝΑ 5 ΕΙΚΟΝΑ 6 Μέθοδος 2 η αποτύπωμα σε φιλμ από βερνίκι Τα φύλλα στα οποία θέλουμε να παρατηρήσουμε τα στόματα τα καλύπτουμε με ένα λεπτό στρώμα με βερνίκι νυχιών άχρωμο και αφού στεγνώσει μετά από 2-5 λεπτά αφαιρούμε το φιλμ αυτό από το φύλλο με προσοχή με μία λαβίδα. Έτσι φτιάχνουμε ένα αποτύπωμα του φύλλου με όλες τις δομές που μπορεί να φέρει όπως στόματα, τριχίδια. Το πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου είναι ότι μπορούμε να μεταβάλλουμε κάποιες παραμέτρους πριν την μικροσκοπική παρατήρηση όπως υγρασία φυτού και περιβάλλοντος χώρου ή φωτισμού σε μια σειρά φυτών και να φτιάξουμε αποτυπώματα τα οποία μπορούμε να παρατηρήσουμε στο μικροσκόπιο σε συντομότερο χρονικό διάστημα και με πιο ασφαλή τρόπο για την ποιότητα του παρασκευάσματος. Όλες οι απεικονίσεις των δειγμάτων έγιναν κάτω από την ίδια μεγέθυνση (x400) ενώ το μέτρημα των στομάτων σε μεγέθυνση (x100).
5 ΕΡΩΤΗΜΑΤΑ ΚΑΙ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Διερευνήσαμε τα εξής ερωτήματα: Ερώτημα 1 ο. Σε ποια επιφάνεια του φύλλου υπάρχουν περισσότερα στόματα στο Pelargonium; Ακολουθήσαμε την κλασσική μέθοδο δημιουργίας δειγμάτων για μικροσκοπική παρατήρηση μετά από χρώση των κυττάρων με Lugol. Από τις παρατηρήσεις μας προέκυψε ότι περισσότερα στόματα υπάρχουν ανά μονάδα επιφάνειας στην κάτω παρά στην επάνω επιφάνεια του φύλλου σε φυτό που είχε παραμείνει στο χώρο του σχολείου με φυσικό φωτισμό ημέρας- νύκτας. Παρόλο που επεξεργαστήκαμε αρκετά φύλλα από το φυτό, δεν είμαστε ικανοποιημένοι για την επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων μας. Σε αυτό ίσως φταίει η δυσκολία δημιουργίας πολύ λεπτής στρώσης κυττάρων οπότε και δεν ήταν πολύ καθαρά τα δείγματα. Ερώτημα 2 ο. Πόσα στόματα είναι ανοικτά και πόσα κλειστά σε ένα φυτό που αναπτύσσεται σε σταθερές συνθήκες θερμοκρασίας, υγρασίας καθώς και επίπεδα CO 2 αλλά κάτω από διαφορετικές συνθήκες φωτισμού; Διατηρήσαμε ένα φυτό για 24 ώρες στο σκοτάδι (μέσα σε ντουλάπι) το οποίο είχαμε προηγουμένως ποτίσει. Με βάση και τα αποτελέσματα του πρώτου ερωτήματος προτιμήσαμε να φτιάξουμε παρασκευάσματα από την κάτω επιφάνεια των φύλλων. Παρατηρήσαμε ότι τα περισσότερα στόματα από αυτά που μετρήσαμε ήταν κλειστά. Δεν βρήκαμε ποσοστό κλειστών / ανοικτών στομάτων αλλά μόνο μια εκτίμηση μπορέσαμε να εξάγουμε βασισμένοι σε μετρήσεις από τουλάχιστον 5 φύλλα. Στο φυτό που είχαμε αφήσει στο φυσικό φως καθ όλη τη διάρκεια μιας ημέρας ήταν περισσότερα τα ανοικτά στόματα από ότι τα κλειστά.
6 ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στα πειράματα με τη μικροσκοπική παρατήρηση των στομάτων μας εντυπωσίασε η μέθοδος αποτυπώματος της επιφάνειας του φύλλου αλλά δεν καταφέραμε να έχουμε δεδομένα ποσοτικά αξιόπιστα. Πιστεύουμε ότι θα πρέπει να είναι πιο ελεγχόμενες οι συνθήκες ανάπτυξης του φυτού και ενδεχομένως δεν ήταν το Pelargonium το καταλληλότερο φυτό για την παρατήρηση των στομάτων. Τα φύλλα του Pelargonium εμφανίζουν και πολλά τριχίδια που μας δυσκόλεψαν στην παρατήρηση των στομάτων. Παρόλο που ήταν γνωστή η εικόνα που αναμέναμε να δούμε για ένα στόμα της επιδερμίδας ενός φύλλου, ήταν αντικειμενικά πολύ πιο δύσκολο από ότι αρχικά πιστεύαμε να εντοπίσουμε μια τέτοια δομή. Πολύ περισσότερο μας δυσκόλεψε η διαφοροποίηση μεταξύ ανοικτού και κλειστού στόματος το οποίο τελικά το καταφέραμε «παίζοντας» με την αντίθεση και τον φωτισμό του μικροσκοπίου. Η καλύτερη παρατήρηση των στομάτων έγινε σε μεγέθυνση x 400 αλλά για τη μέτρηση του αριθμού τους ανά μονάδα επιφάνειας μας διευκόλυνε η μεγέθυνση x 100. Στα νωπά παρασκευάσματα και όχι σε αυτά με το φιλμ αποτυπώματος, η χρώση των κυττάρων με Lugol έδωσε πιο καλά αποτελέσματα από την άποψη ότι η εικόνα ήταν πιο ευδιάκριτη για κάθε μεγέθυνση. Αποκτήσαμε μεγάλη δεξιότητα στη χρήση του μικροσκοπίου καθώς και σε χειρισμούς δημιουργίας λεπτών τομών από νωπά δείγματα.