הנדסה מטבולית של פלבנואידים בסולידגו

ה'' הנדסה מטבולית של פלבנואידים בסולידגו עבודת גמר מוגשת לפקולטה לחקלאות, מזון וסביבה על שם רוברט ה. סמית האוניברסיטה העברית בירושלים לשם קבלת תואר "מוסמך למדעי החקלאות" מאת קטררו נדב תשע חשון, רחובות נובמבר 4102

עבודה זו נעשתה בהדרכתו של פרופסור אלכסנדר ויינשטיין המכון למדעי הצמח וגנטיקה בחקלאות הפקולטה למדעי החקלאות, מזון וסביבה על שם רוברט ה. סמית האוניברסיטה העברית בירושלים

ברצוני להודות לפרופ' סשה ויינשטיין על ההדרכה והלימוד. תודה ללנה, על העברת הזמן שעות רבות במנדף הביולוגי ועל ההדרכה והדאגה בכל שלבי המחקר )ולא רק( ועל כך שלימדת אותי את סודות השקשוקה. לאלון, קארין, אור, יסמין, מגלי, חבייארה, אורית ומאשה תודה על עזרתכם, כל אחד בתחומו. ותודה מיוחדת ברצוני לתת לאשתי האהובה העומדת לצידי, עדי. תודה על כל העצות, העזרה והתמיכה ושהייתה שם כעזר כנגדי בזמנים היותר קשים.

תקציר אחד מתחומי המחקר העיקריים של צמחי נוי מתמקד במסלולים הקשורים לצבע הפרח. צבע הפרח הינו בעל חשיבות עליונה באקולוגיה של צמחים בגלל תפקידו במשיכת מאביקים. בנוסף, צבע הפרח הוא אחד ממוקדי משיכתו של הצרכן ולכן מהווה גורם חשוב ביותר בטיפוח צמחי נוי ובהצלחתם המסחרית. ישנן שלוש קבוצות עיקריות של פיגמנטים האחראיות למגוון הצבעים בפרחים: בטאלאינים, קרוטנואידים ואנתוציאנינים. מבין שלושת הקבוצות, האנתוציאנינים הם הנפוצים ביותר והידע לגבי מסלולי הביוסינתזה ומנגנוני בקרתם הוא נרחב ביותר. צמח הסולידגו )Solidago( הוא צמח נוי פופולארי השייך למשפחת המורכבים (Asteraceae) ועיקר גידולו בארץ ובעולם משמש עבור פילר בסידורי פרחים. סולידגו הוא צמח רב שנתי המגיע בתנאי האקלים בארץ לשלושה גלי פריחה בשנה. בארץ ובעולם קיימים מס' זנים של סולידגו שהמובילים מביניהם הם: טרה )Tara( אייבורי גלורי Glory) (Ivory וגולדן גלורי Glory).(Golden זני הסולידגו הקיימים כיום הנם בעלי פריחה צהובה בלבד הנובעת מצבירת קרוטנואידים. על כן, מאגר הגנים הניתן למניפולציה בסולידגו בהשבחה הקלאסית מוגבל ואי יכולת זו מהווה גורם מגביל בשיווק הגידול. לעומת טיפוח בטכניקות של השבחה קלאסית, טיפוח זנים חדשים באמצעות טכניקות של הנדסה גנטית מאפשר את הרחבת הגנים אל מחוץ לעולם הצומח ומאפשר טיפוח יעיל לתכונה ממוקדת כמו למשל: הגברה של מסלול הפלבנואידים ובכך לענות על חלק מהבעיות הנובעות ממוגבלות המגוון הגנטי. הידע שנצבר לאורך השנים וזמינותם של גנים הקשורים במסלול הביוסינתזה של אנתוציאנינים אפשרו השבחה מולקולארית של צבע הפרחים במס' צמחי נוי. כמוהם, גם בצמח הסולידגו ייתכן כי יהיה ניתן לממש את מלוא הפוטנציאל המסחרי הטמון בו על ידי שימוש בכלים של השבחה מולקולארית. מטרת עבודתי היא לייצר מערכת רגנרציה וטראנספורמציה לסולידגו, על מנת ליצור צמחי סולידגו בעלי מופע צבע השונה מאלו הנמצאים כיום בענף גידול הסולידגו. שלב מקדים לפיתוח מערכת טרנספורמציה הוא פיתוח מערכת רגנרציה. לשם כך נבחנו השפעתם של שלושה סוגי ציטוקינינים: (Zea) Zeatin,(BA) benzylaminopurine ו- thiadiazuron (TDZ) בשילוב האוקסין (NAA) α-naphthaleneacetic acid על יעילות רגנרציה אדוונטיבית מאקספלנטים שמקורם מעלים צעירים של סולידגו מהזן.Ivory Glory הרגנרציה היעילה ביותר התקבלה מהאקספלטים בשילוב הציטוקינין Zea ו- NAA )93%(. באותם התנאים רגנרציה יעילה מעלים נצפתה גם בזני הסולידגו Golden Glory ו- Tara. תוצאה זו מהווה בסיס רחב וטוב לטרנספורמציה של סולידגו באמצעות אקספלנטים שמקורם מעלים צעירים. שלב מקדים נוסף לניסויי הטרנספורמציה ארוכי הטווח הוא בדיקת התאמת הפרומוטורים לרקמה שתעבור את הטראנספורמציה. לצורך כך בוצעו ניסויי ביטוי חולף )קצרי זמן( על סולידגו מהזן Ivory CaMV 35S בקרת הפרומוטור תחת ו- DsRED GUS באמצעות שימוש בשני גנים מדווחים: Glory

ובאמצעות שתי שיטות הדבקה שבוצעו כל אחת בנפרד: האחת באמצעות אגרובקטריום והשנייה באמצעות ירי חלקיקים על עלים צעירים ופרחים בהתאמה. תוצאות ביטוי חולף של הגנים המדווחים התקבלו בשני הגנים ובשתי הרקמות ששמשו לניסוי. כמו כן, ניסויים אלו הראו שאקספלנטים שמקורם בעלים צעירים הינם רגישים לאגרובקטריום דבר המהווה בסיס ליצירת צמחים טראנסגנים כאשר עלים הם האקספלנטים. שיטת הטראנספורמציה ליצירת הצמחים הטראנסגנים המבטאים באופן קבוע גנים זרים התבססה על מערכת הרגנרציה שפותחה מעלים צעירים. אנליזת יעילות הטראנספורמציה על שלושת זני הסולידגו Golden Glory,Ivory Glory ו- Tara הראו שהזן המוביל היה Golden Glory עם יעילות טראנספורמציה גבוהה פי 4 ופי 8 מהזנים Ivory Glory ו- Tara בהתאמה. על מנת לנסות ולשנות את הצבע בפרחי סולידגו מהזנים Ivory Glory ו- Glory Golden נבחרו מס' גנים רגולטורים. אחד מהם הוא הגן )PAP1( Production of Anthocyanin Pigment 1 שמקורו מארבידופסיס thaliana( )Arabidopsis ומקודד לפקטור שעתוק מסוג,MYB הידוע כמבקר חיובית את מסלול האנתוציאנינים במגוון רב של פרחים. גן זה שובט תחת הבקרה של שני פרומוטורים שונים: הפרומוטור של הגן AP3 הספציפי לרקמת הפרח, והפרומוטור 35S. הקווים השונים שהתקבלו עקב ההתמרה עם הקונסטראקט AP3:PAP1 לא הראו הצטברות של פיגמנטים אנתוציאנינים ברקמת הפרח בצמחים בוגרים בחממה, וזאת למרות ביטוי הגן PAP1 בפרחים של הצמחים המותמרים כפי שהוכח באנליזת.RT-PCR לעומת זאת, קווי הסולידגו שהתקבלו עקב ההתמרה עם הקונסטראקט 35S:PAP1 הראו הצטברות של פיגמנטים אנתוציאנינים )בהשוואה לצמחי הביקורת שהותמרו עם הקונסטראקט.)35S:GUS בארבעה קווי סולידגו מהזן Golden Glory שהראו את הפנוטיפ החזק ביותר: 42, 01, 01 ו- B נערכה אנליזת פיגמנטים אנתוציאנינים וקרוטנואידים בפרחים ונמצא כי הפרחים של הקווים המותמרים צברו בתוכם פי 01 ופי 01 יותר אנתוציאנינים מאשר פרחי הביקורת. בנוסף אף נראה שהייתה ירידה ברמות הקרוטנואידים בקווים 42 01, ו- 01. באנליזת חומרי ריח נדיפים,)Headspace( שנערכה ע"י מכשיר,GC-MS על הקווים בהם נצפו רמות האנתוציאנינים הגבוהים ביותר, נמצאה ירידה של בערך פי 4.0 בחומרי ריח נדיפים ממסלול הטרפנואידים ביחס לביקורת. מלבד הגן, PAP1 נבדקו שני גנים רגולטורים נוספים, (Del) Delila ו-( Ros1 ),Rosea1 שמקורם מפרחי "לוע הארי" majus( )Antirrhinum ומקודדים לשני פקטורי שעתוק מסוג Basic helix loop (bhlh) helix ו- MYB בהתאמה. צמחי סולידגו מהזנים Golden Glory ו- Tara עברו התמרה עם קונסטראקטים המכילים את הגנים Del שהיה תחת הפרומוטור 35S ואת הגן Ros1 תחת בקרה של פרומוטורים שונים: הפרומוטור של הגן,AP3 הפרומוטור של הגן E8 שהינו גן המתבטא ספציפית בפרי העגבנייה ומופעל בתחילת תהליך ההבשלה של הפרי ואף מגיב לטיפול באתילן חיצוני, והפרומוטור 35S(. חלק מהקווים שהותמרו עם הקונסטרקטים הנ"ל צברו בשלבי התרבית פיגמנטים, אך לאחר

העברתם לחממה פנוטיפ זה חלף. יש לציין כי ברוב הקווים של Golden Glory ו- Tara הוכח ביטויים של הטרנסגניים באמצעות אנליזת.RT-PCR בעבודה זו הצגתי לראשונה הצטברות של פלבנואידים בפרחי סולידגו ע"י שימוש בהנדסה גנטית. כמו כן, מלבד שינוי הפנוטיפ של צבע הפרח מחקר זה חיזק את הממצאים לגבי הקשר בין מסלולים ביוסינתטים שונים כגון: מסלול הפנילפרופנואידים ומסלול הטרפנואידים והקרוטנואידים. על כן השימוש בהנדסה גנטית לצורך שינוי הצבע בפרחים, כפי שהודגם בעבודה זו, פותח את האפשרות לפיתוח זנים חדשים של סולידגו בעלי פרחים עם מופעי צבע חדשים.

תוכן עניינים 0 4 2 2 3 3 09 09 01 02 41 42 40 99 92 92 29 רשימת קיצורים מבוא צמח הסולידגו קבוצת הקרוטנואידים קבוצת האנתוציאנינים השבחה מולקולארית של צבע וריח בפרחים ובפירות שיטות וחומרים חומר צמחי טראנספורמציה של צמחי סולידגו אנליזות של הפיגמנטים בעלי הכותרת בפרחי סולידגו אנליזות מולקולאריות בדיקת חומרי ריח נדיפים תוצאות פיתוח מערכת רגנרציה לסולידגו פיתוח מערכת טראנספורמציה לזני סולידגו בניית מחדרים בעלי פרומוטורים שונים טראנספורמציה של זני סולידגו שונים עם גני המטרה אפיון פיגמנטים בפרחי סולידגו מותמרים בדיקת חומרים נדיפים בתפרחות סולידגו טראנסגנים דיון רשימת ספרות

רשימת קיצורים 35S AP3 BA bhlh Cb Del GA GC-MS GUS Kan MS NAA nptii PAP1 Ros1 RT TDZ W.T. Zea cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S APETALA3 Benzylaminopurine basic helix loop helix Carbenicillin Delila 3-Gibberellic acid gas chromatography-mass spectrometry β-glucuronidases (uida) kanamycin Murashige and Skoog α-naphthaleneacetic acid neomycin phosphotransferase II Production of Anthocyanin Pigment 1 Rosea1 reverse transcriptase thiadiazuron wild type Zeatin

מבוא צבעם של הפירות והפרחים מהווה מרכיב בעל חשיבות עליונה באקולוגיה של צמחים וביכולת שלהם למשוך מאביקים ומפיצי זרעים )1983 Kevan,.)Baker and בנוסף, צבע הפרח הוא אחד ממוקדי משיכתו של הצרכן ולפיכך מהווה גורם מכריע בהצלחתם המסחרית של צמחי נוי בשוק ועל כן גורם חשוב ביותר בטיפוח צמחי נוי. שלושת הקבוצות העיקריות של הפיגמנטים בצמחים הם: בטאלאינים, קרוטנואידים ואנתוציאנינים 2008( al.,.)grotewold, 2006; Tanaka et מבין הפיגמנטים השונים המעורבים בצביעת עלי הכותרת של הפרחים, האנתוציאנינים הם הנפוצים ביותר והידע לגבי מסלולי הביוסינתזה ומנגנוני בקרתם הוא הנרחב ביותר. כתוצאה מטיפוח קלאסי באמצעות הכלאות, נוצרו במהלך השנים מאגרים של זנים בעלי מגוון צבעי פרחים. עם זאת ישנם עדיין ענפי גידול בהם קשת צבעי הפרחים מוגבלת, ולעתים אף מונוכרומטית, כמו לדוגמא בצמח הסולידגו שהוא בעל תפרחת צהובה בלבד. צמח הסולידגו סולידגו (Solidago) הוא צמח רב שנתי ממשפחת המורכבים (Asteraceae) המגיע בתנאי האקלים בארץ לשלושה גלי פריחה בשנה. עיקר גידולו בארץ ובעולם משמש עבור פילר בסידורי פרחים. ישראל הנה אחת מספקי הסולידגו העיקריים לבורסת הפרחים ההולנדית, לצד הולנד ומדינות אפריקה. בשנת 4113 נראתה ירידה ברורה בהיקף ייצוא פרחי הקטיף למכרזות הפרחים בהולנד והיקף ייצוא הסולדגו היה כ- 49 מליון פרחים לעומת כ- 99 מליון בשנת 4112 )וייל מ., 4101(. בנוסף לכך היקף שטחי גידול הסולידגו על פי מחלקת השיווק של "דנציגר - משק פרחים דן" כיום מוערכים בין 901-211 דונם ובהם מס' זנים עיקריים: טרה,(Tara) אייבורי גלורי Glory) (Ivory וגולדן גלורי Glory).(Golden זני הסולידגו הקיימים כיום הנם פרחים מונוכרומטים, בעלי פריחה צהובה בלבד הנובעת מהצטברות קרוטנואידים )2010 al.,.)horváth et על כן, מאגר הגנים הניתן למניפולציה בהשבחה הקלאסית בסולידגו מוגבל. עוד נראה כי גבעולי סולידגו "מטופל בצבע" פודים מחירים גבוהים משמעותית בהשוואה לכלל זני הסולידגו הנסחרים )וייל מ., 4112( ודרישת השוק לפרחים בעלי תכונות משופרות )כגון: צבעים חדשים, צורות פרח וצימוח חדשות, פרחים בעלי ריח( הינה הגורם המניע ליצירת זני פרחים חדשים ואטרקטיביים יותר מדי שנה. טיפוח זנים חדשים באמצעות טכניקות של הנדסה גנטית עשוי לענות על חלק מהבעיות המתעוררות בהשבחה קלאסית, שבסיסה הטכני-מדעי הוא סדרת הכלאות בין מינים או זנים קרובים. השימוש בכלים מולקולאריים המאפיין את ההנדסה הגנטית מאפשר את הרחבת מאגר הגנים אל מחוץ לעולם הצומח וטיפוח יעיל לתכונה ממוקדת. בכך הדבר מהווה יתרון בטיפוח צמחים בו המטפחים אינם כבולים על ידי מגבלות המגוון הביולוגי שקיים בזן או מין מסוים. 1

א) קבוצת הקרוטנואידים קרוטנואידים הינם קבוצה גדולה של מולקולות אורגניות רב-פחמימניות )בד"כ )C 40 המיוצרות על ידי אורגניזמים רבים בניהם חיידקים, פטריות, אצות וצמחים. הקרוטנואידים השייכים למשפחת האיזופרנים אלו פיגמנטים הידרופוביים שלאחר יצירתם נאגרים ומצטברים בפלסטידות כגון: כרומו-פלסטידות, כלורופלסט ואשר להם תפקיד חשוב בחיי הצמח. תפקידם החשוב ביותר הוא ברקמות ירוקות מטמיעות בהן הקרוטנואידים נמצאים בכלורופלסטים ומשמשים כמרכיבים במערכת ה- light harvesting )LHC( complex כאמצעי להתמודדות עם נזקי חימצון )1995 Scolnik,.)Bartley and בנוסף הם מעניקים הגנה מפני נזקי UV בזמן הפוטוסינטזה ומהווים פרקורסור בביוסינטזה של ABA C( 5 ( מסלול הביוסינטזה של הקרוטנואידים שמור מאוד ומתחיל מהאיזופרן.)Grotewold, )2006 IPP שזוהי היחידה הבסיסית ביותר. משלב זה, ארבע יחידות של )IPP( isopentenyl pyrophosphate נדחסות יחד על מנת ליצור חומר C 20 הנקרא )GGPP( geranylgeranylpyrophosphate ולאחריו שתי מולקולות של GGPP נדחסות יחד על ידי האנזים (PSY) phytoene synthase על מנת ליצור את הקרוטנואיד הראשון הנקרא )Tanaka et al., 2008( phytoene יור 0(. לאחר שלב זה, מתרחשות ארבע ריאקציות של דה-סטורציה, ששתיים מהן מתקיימות ע"י האנזים )PDS( phytoene desaturase ושתיים נוספות ע"י האנזים )ZDS( ζ-carotene desaturase היוצרות את הליקופן הוורוד ולאחריו ע"י האנזים )CRISTO( carotenoid isomerase ישנה איזומריזציה לקבלת ליקופן )איור 0(. אחת מנקודות הפיצול במסלול זה, זהו שלב יצירת הטבעות בו עלולים להתקבל חומרים שונים בהתאם למיקום הקשר הכפול בטבעת. מצד אחד האנזים,lycopene β-cyclase שלו קיימות שתי צורות בעגבנייה, האחת ספציפית לרקמות ירוקות )LYC-B( והשנייה ספציפית לכרומו-פלסטידות,)CYC-B( בשני המקרים נוצר γ-carotene בעל טבעת ציקלית אחת המומרת לאחר מכן ל- β-carotene. מצד שני ישנו האנזים )LCY-E( lycopene ε-cyclase היוצר את δ-carotene המומר לאחר מכן ע"י האנזים Hirschberg, 2001; ( lutein הפרקורסור לפיגמנט שזהו ל- α-carotene lycopene β-cyclase )Grotewold, 2006 )איור.)0 תפקיד הקרוטנואידים בפירות ופרחים צבעוניים הוא לשמש כצבענים. הם מקנים לפרחים ולפירות מגוון צבעים בין צהוב לאדום, המשמשים למשיכת מאביקים ומפיצי זרעים. למשל בעלי הכותרת של ציפורן החתול (Calendula) וחרצית,)Chrysanthemum( ששניהם ממשפחת המורכבים, כ- 31% מהפיגמנט הוא lutein וכך גם בעלי הכותרת של סולידגו שם הוא הפיגמנט העיקרי ומהווה יותר מ- 01% מכלל חומרי הצבע 2010( al.,.)tanaka et al., 2008; Horváth et בצמחים יש לפיגמנטים אלו מגוון תפקידים הבאים לידי ביטוי ברקמות שונות ובזמנים שונים לאורך חיי הצמח ( ;2001 Hirschberg,.)Grotewold, 2006 למרות שכל סוג פלסטידה מסוגלת להפוך לכרומו-פלסטידה בד"כ המקרה הנפוץ הוא שהתהליך מקורו מהכלורופלסט )1999 al.,.)vishnevetsky et מהלך הצטברות הצבע בהבשלת 2

פירות ובתהליך יצירת הפרח מלווה בהתמיינות הכלורופלסטים לכרומו-פלסטידות כמות רבה של קרוטנואידים )1999 al.,.)vishnevetsky et אשר בהם מצטברת איור - 1 הצגה סכמתית של מסלול ביוסינתזת הפיגמנטים הקרוטנואידים השכיחים ביותר בצמחים )2006.)Grotewold, קיצור שמותיהם של האנזימים העיקריים בביוסינטזה של הקרוטנואידים הם: PDS, PSY, phytoene synthase; phytoene desaturase; ZDS, ζ-carotene desaturase; CRTISO, carotenoid isomerase; CYC-B, chromoplastic form of lycopene β-cyclase; LCY-E, lycopene ε-cyclase; HYD-B, carotenoid β-ring.hydroxylases; HYD-E, carotenoid ε-ring hydroxylase 3

קבוצת האנתוציאנינים האנתוציאנינים הינם מטבוליטיים שניוניים השייכים לקבוצת הפיגמנטים הפלבנואידים, פיגמנטים אלו מסיסים במים ומצטברים בווקואולה של תאים אפידרמלים ותת-אפידרמלים בפרחים, פירות ועלווה )1991.)Forkmann, מבין קבוצות הפיגמנטים בצמחים, קבוצת הפלבנואידים היא אחת הקבוצות המאופיינות ביותר, במובנים של כימיה, גנטיקה וביולוגיה מולקולרית ( Grotewold, Stafford, ;1990 2006(. בנוסף להיותם מוקד עניין לעין האנושית, הפיגמנטים האנתוציאנינים מעורבים למעשה בעוד מגוון רחב של תהליכים כגון: משיכת מאביקים, הגנה מפני קרינת UV והגנה מפני מזיקים ( and Holton.)Cornish, 1995; Weisshaar and Jenkins, 1998; Koes et al., 2005; Vogt, 2010 האנתוציאנינים למעשה נגזרים ממסלול הפנילפרופנואידים בו נוצרים מטבוליטים שניוניים רבים הספציפיים לצמחים עיליים כגון: ליגנין, פיטולקסינים ועוד, ומקורם בחומצה האמינית פנילאלנין. עד כה זוהו כ- 9111 סוגי פיגמנטים שונים ממשפחת הפלבנואידים אשר אופיינו מבחינה כימית ומבנית הודות לפריצות דרך בפיתוח של שיטות כרומוטוגרפיות. כמו כן, מסלול הביוסינתזה נחקר לעומקו ונסקר שוב ושוב מנקודות מבט שונות )2003 al., )Winkel-Shirley,,2001b ;a Springob et כולל שינוי צבע הפרח על ידי מודיפיקציות גנטיות 2008( al.,.)tanaka et al., 1998; Tanaka et המבנה הבסיסי של הפלבנואידים הוא שתי טבעות ארומטיות המחוברות בטבעת הטרוציקלית ובעלי מבנה בסיסי של C6-C3-C6 ונפוצים מאוד בצמחי יבשה )איור 4(. על בסיס שלד זה של 00 פחמנים, ישנן התמרות ותגובות שונות המובילות ליצירת חומרים נוספים כמו הצ'לקונים, פלבונים, הפלבנונים והאנתוציאנינים. עד כה ידועים כ- 03 סוגים של אנתוציאנידינים, אגליקונים או כרומופורים של אנתוציאנינים, אך ישנם שישה עיקריים: פלרגונידין,(pelargonidin) ציאנידין (cyanidin( ונגזרתו פאונידין,(peonidin( דלפינידין (delphinidin( ונגזרותיו, petunidin ו- malvidin. פיגמנטים אלו אחראים לצבעים כתום, אדום, אדום, ורוד, סגול וכחול בהתאמה )איור 9(. צבעם תלוי במידה רבה במספר קבוצות ההידרוקסיל על טבעת ה- B, ככל שמספרן גדול יותר כך הצבע יהיה כחול יותר, בעוד שמתילציה של חמצן הינה בעלת אפקט מועט של אדמומיות ( and Tanaka et al., ;1998 Tanaka.)Ohmiya, 2008 הפיגמנטים flavonols,aurones,chalcones ו- flavones אחראים לצבע הצהוב בפרחים. ה- chalcones מקנים צבע צהוב בהיר לפרחים רבים, לדוגמא פרחי ציפורן ( Dianthus 2,4,4,6 -tetrahydroxy הצוברים את הפיגמנט )Cyclamen persicum( ורקפת )caryophyllus )THC( chalcone ואת הפיגמנט.(isosalipurposide) 2 -glucoside קבוצת ה- aurones הם קבוצה נדירה של פיגמנטים פלבנואידים המקנים לפרחים צבע צהוב בהיר מאשר ה- chalcones וניתן למצוא אותם במספר מוגבל של מיני צמחים, לדוגמא בפרחי לוע ארי majus(,)antirrhinum קוסמוס bipinnatus( )Cosmos ולימוניום.)Limonium( flavonols ו- flavones אחראים ליצירת צבע צהוב חיוור מאוד שלעיתים אינו נראה לעין האדם. ברוב המחקרים על פרחים נמצא כי flavones או יותר( מצויים בכמויות הרבה יותר גדולות מהאנתוציאנינים. תפקיד ה- flavonols )השכיחים flavonols 4

ו- flavones הוא להשפיע על צבעם של האנתוציאנינים בתהליך הקו-פיגמנטציה ולעיתים הם הבסיס ליצירת סימוני UV המכוונים חרקים מאביקים לצוף הפרח, ותורמים דפוסי צבע לפרחים המושכים חרקים 2008( al.,.)grotewold, 2006; Tanaka et המסלול שמוביל ליצירה של האנתוציאנין הראשון בעל הצבע, 3-O-glucosides,anthocyanidin הינו שמור בצמחים. אנטוציאנין זה יכול לעבור בהמשך התמרות שונות עם סוכרים, חומצות אליפטיות, חומצות ארומטיות וקבוצות מתיל. צבע הפרח הנראה לעין הוא כתוצאה משילובם של כמה גורמים הכוללים את סוג האנתוציאנין שנצבר, ההתמרות למולקולת האנטוציאנידין, קו-פיגמנטציה )צבירה של פיגמנטים נוספים( וה- ph של הוואקואולה. כל אחד מהגורמים הנ"ל מבוקר על ידי מספר גנים, אשר רבים מהם בודדו ואופיינו )1998 al.,.)tanaka et האנזימים המבניים במסלול הביוסינתזה שייכים למגוון של משפחות, כמו,)OGD( 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases ציטוכרום P450 )P450( ו- glucosyltransferases,)vogt, )2010 דבר שמרמז על כך שהצמחים "גייסו" אנזימים אלו ממסלולים מטאבוליים שהיו קיימים קודם לכן.,(CHS) chalcone synthase הינו אנזים מפתח בביוסינתזת הפלבנואידים, מכיוון שהוא יוצר את המבנה הבסיסי של הפלבנואידים על ידי דחיסה של מולקולת 4-coumaroyl CoA עם שלוש מולקולות של malonyl CoA ליצירת.(THC) 2,4,4,6 - tetrahydroxy האנזים Chalcone isomerase.)flavanone( naringenin ליצירת כסובסטרט מקטלז תגובת איזומרציה ומשתמש ב- THC,(CHI) הצטברותם של ה chalcones בצמחים היא מועטה וזאת עקב שה- chalcone יכול לעבור איזומריזציה ליצירת naringenin באופן ספונטני גם ללא CHI פעיל וכאשר CHI פעיל תגובה זו מהירה אפילו יותר. האנזים,FHT) flavanone 3-hydroxylase נקרא גם )F3H מקטלז את ההידרוקסילציה של.flavanones ברוב המקרים naringenin משמש כסובסטרט של אנזים זה ליצירת flavonoid 3`,5`-- ו- (F3 H) flavonoid 3`-hydroxylase האנזימים.dihydrokaempferol )F3 5 H( hydroxylase, הם אנזימים מסוג P450, המבצעים הידרוקסילציה של naringenin ושל dihydrokaempferol בעמדות 3 ו- 3,5 של טבעת B בהתאמה. תוצרי ריאקציה זו משמשים כפרקורסורים ישירים של האנתוציאנינים, כך שסוג האנטוציאנין הספציפי, ומכאן צבע הפרח, נקבע כבר בשלב זה. אם ישנה הידרוקסילציה בטבעת B בעמדות 5, 3 נוצר,dihydromyricetin המהווה פרקורסור ישיר ליצירת הדלפינידינים בצבעם הכחול-סגול. כאשר ההידרוקסילציה מתרחשת בטבעת B בעמדה 3 נוצר,dihydroquercetin המהווה פרקורסור ישיר ליצירת הציאנידינים בצבעם האדום-ורוד. כאשר אף אחד משני האנזימים האלה אינו פעיל, כלומר אין הידרוקסילציה בעמדות 5, 3 או בעמדה 3 בטבעת B, נצבר dihydrokaempferol המהווה פרקורסור לפלרגונידינים בצבעם הכתום. (DFR) dihydroflavonol 4-reductase מקטלז את החיזור של dihydroflavonols ליצירת.leucoanthocyanidins בפטוניה ובמספר צמחים נוספים, לאנזים זה ספציפיות גבוהה מאוד והוא אינו מחזר את,dihydrokaempferol אלא רק את dihydroquercetin ואת Tanaka ( dihydromyricetin 5

anthocyanidin synthase ו- cyanidin. delphinidin וכתוצאה מכך מצטברים רק )et al., 2008 )ANS( נקרא גם,leucoanthocyanidin dioxygenase שייך למשפחת האנזימים OGD ומקטלז את הפיכת leucoanthocyanidins ל- anthocyanidins, השלב הראשון ביצירת פיגמנטים בעלי צבע. המודיפיקציות של anthocyanidins מגוונות מאוד ומשתנות בין מינים ומשפחות צמחים. האחראים למגוון המודיפיקציות הם UDP-glycose-dependent glycosyltransferases השייכים ל- BAHD השייכים בעיקר למשפחת )ATs( acyltransferases.glycosyltransferase family 1 2006( )D Auria, ו- methyltransferases.s-adenosylmethionine dependent באופן כללי, אנזימים אלו ספציפיים לעמדה של המודיפיקציה באנטוציאנין והסובסטרט התורם, אך פחות ספציפיים למבנה האנטוציאנין, כלומר האנזימים המקטלזים מודיפיקציות בטבעות A ו- C עושים זאת באנתוציאנינים ללא התחשבות בהידרוקסילציה בטבעת B. המודיפיקציה הראשונית של UDP-glucose:flavonoid (or anthocyanidin) 3GT נעשת על ידי האנזים anthocyanidins המקטלז את הגליקוזילציה בעמדה 9. בורדים שצוברים,anthocyanidin 3,5-diglucoside גליקוזילציה בעמדה 0 קודמת לגליקוזילציה בעמדה 9 ושתי ריאקציות הגליקוזילציה מקוטלזות על ידי אותו אנזים,.)Ogata et al., 2005( UDP-glucose: anthocyanidin 5,3GT האנזימים flavone (FNSI, FNSII) synthase I or II והאנזים (FLS) flavonol synthase הופכים flavanones ו- dihydroflavonols ל- flavones ו- flavonols בהתאמה. FLS ו- FNSI הינם אנזימים דיאוקסיגנאז המבצעים אוקסידציה תלויה ב- (2OGD) 2-oxoglutarate,בעוד ש- FNSII הוא אנזים ציטוכרום P450 )מונואוקסיגנאז( הקשור לממברנה. כיום, מחקרים רבים הוכיחו כי מסלול האנתוציאנינים מבוקר על ידי שילוב של חלבוני basic,myb )bhlh( helix loop helix ו- WD40 (WD-repeat( המסוגלים לאקטב את גני המטרה שלהם כקומפלקס חלבוני 2004( al., )Goff et al., 1992; Zhang et al., 2003; Zimmermann et הדומה במגוון רחב של מינים, דבר המצביע על כך שמנגנון זה שמור מאוד ( Koes Winkel-Shirley, ;2001b.)et al., 2005 A C B איור - 2 המבנה הבסיסי של הפלבנואידים. 6

איור 3 הצגה סכמתית של מסלול ביוסינתזת הפיגמנטים האנטוציאנידינים השכיחים ביותר )2006.)Grotewold, קיצור שמותיהם של האנזימים העיקריים בביוסינטזה של האנתוציאנינים הם קיצור שמותיהם של האנזימים בתיבות השחורות הם: 3-hydroxylase; CHS, chalcone synthase; CHI, chalcone isomerase; F3H, flavanone F3 H, flavanone 3 -hydroxylase; F3 5 H, flavanone 3,5 -hydroxylase; DFR, dihydroflavonol 4-.reductase; LDOX/ANS, leucoanthocyanidin dioxygenase/anthocyanidin synthase טבעות ה- B,A ו-.flavanone עם מספרי הפחמנים תואמים לאלו המצוינים במבנה שלnaringenin C השבחה מולקולרית של צבע וריח בפרחים ובפירות לאורך השנים היו פרסומים רבים על הצלחות בתחום ההשבחה המולקולארית של צבע הפרחים. מספר עבודות אחרונות בתחום הראו כי החדרה של הגן המקודד לאנזים F3'5'H לפרחי חרצית Ramat),(Chrysanthemum X morifolium וורדים hybrida) (Rosa וציפורן החסרים באופן טבעי את הגן F3'5'H ועל כן אינם צוברים את הפיגמנט דלפינידין, הובילה לייצור פרחים בעלי מופע צבע כחול הצוברים את הפיגמנט דלפינידן ונגזרותיו 2013( al.,.)katsumoto et al., 2007; Brugliera et ההצלחה הראשונה למסחורם של פרחי הנוי המהונדסים היה פרח ציפורן טראנסגני ה-" "Moon שעבר 7

ש] החדרה של הגן המקודד לאנזים F3'5'H מפרחי פטוניה/אמנון-ותמר )2005 al.,.)tanaka et למרות הצלחות אלו עדיין לא מורגשות השפעות ההנדסה הגנטית בתעשיית צמחי הנוי מלבד מס' מצומצם של יוצאים מן הכלל בעיקר בגלל עלויות אישורי גופי הבקרה. אחד מהגנים הרגולטורים המעורבים בבקרת מסלול הפלבנואידים הוא הגן, (PAP1) Production of Anthocyanin Pigment 1 שאופיין מארבידופסיס thaliana(.)arabidopsis גן זה מקודד לפקטור שעתוק מסוג MYB המבקר חיובית את מסלול הפנילפרופנואידים ובעיקר את הגנים המבניים במסלול זה, המהווים גורמי מפתח במסלול האנתוציאנינים 2008( al.,.)borevitz et al., 2000; Mathews et al., 2003; Zvi et בעבודה שנעשתה על וורדים, הראו שהחדרה של הגן PAP1 הצליחה לא רק להעלות את רמות האנתוציאנינים, אלא גם באופן מפתיע הצליחה להעלות את רמות חומרי הריח הנפלטים מהפרח בהשוואה לצמחי הביקורת הן ממסלול הפנילפרופנואידים והן ממסלול הטרפנואידים )2012 al.,.)zvi et בעבודה אחרת הראו שכאשר עשו לצמחי פטוניה התמרה עם הגן PAP1 הדבר הוביל להגברה של שני הענפים במסלול הפנילפרופנואידים, האחראים לייצור חומרי הריח והצבע בפרחים )2008 al.,.)zvi et מעבר לתרומתם האסתטית של האנתוציאנינים לצמחי הנוי, הפלבנואידים/אנתוציאנינים הינם בעלי חשיבות תזונתית רבה מאוד לבריאות האדם ותורמים רבות למניעת מחלות כגון סרטן, מחלות כלי דם ועוד, ועל כן ישנה חשיבות רבה להעשרתם של חומרים אלו בגידולים המשמשים למאכל. בעבודה שנעשתה לפני מס' שנים )2008 al., )Butelli et הצליחו לגרום לצבירה של פיגמנטים אנתוציאנינים בפרי העגבנייה, שבאופן טבעי צובר קרוטנואידים. במחקר הנ"ל נעשה שימוש בשני הגנים הרגולטורים, (Del) Delila ו-( Ros1 ),Rosea1 שמקורם מפרחי "לוע הארי" majus( )Antirrhinum ומקודדים לשני פקטורי שעתוק מסוג (bhlh) basic helix loop helix ו- MYB בהתאמה. כאשר גרמו לביטוי שני הגנים יחד תחת בקרת הפרומוטור של הגן E8 הינו גן המתבטא ספציפית בפרי העגבנייה ומופעל בתחילת תהליך ההבשלה של הפרי ואף מגיב לטיפול באתילן חיצוני )1998 al.,,])deikman et הדבר הוביל למופע צבע חדש של פירות עגבנייה סגולים וזאת עקב הצטברות הפיגמנטים האנתוציאנינים בפרי. מטרת עבודתי היא לייצר מערכת רגנרציה וטראנספורמציה לסולידגו, על מנת ליצור צמחי סולידגו בעלי מופע צבע חדש ואשר שונים מאלו הנמצאים כיום בענף גידול הסולידגו. אופן הביצוע יעשה באמצעות התמרה של גנים רגולטורים שונים ממסלול הפנילפרופנואידים כגון: PAP1, Delila, Rosea1 ואשר נמצאים תחת בקרה של פרומוטורים שונים כגון: AP3 שהינו פרומוטור של הגן APETALA3 הספציפי לרקמת עלי הכותרת 2013( al., 35S,)Kramer et al., 1998; Zhang et ו- E8. 8

שיטות וחומרים חומר צמחי התקבלו שלושה זנים מסחריים של סולידגו מ"דנציגר משק פרחים דן", ממושב משמר השבעה: MS הגיעו כבר בתרבית רקמה על מצע גידול הזנים ו- Tara. Ivory Glory, Golden Glory )1962 Skoog,.)Murashige and לצורך יצירת מטע אם בשביל ניסויי הרגנרציה והטרנספורמציה נלקחו גבעולים בעלי ניצנים חיקיים מהזנים השונים והונחו על גבי מצע MS המכיל את הציטוקינין )BA( benzylaminopurine בריכוז 1.0 מ"ג/ליטר. כל ניסויי הרגנרציה והטראנספורמציה בוצעו כמתואר בפרק תוצאות. כל הצמחים גודלו בחדר בו קיימת טמפרטורה קבועה של 25±1 C תחת 01 שעות תאורת פלורוסנט ( 1- s )60μmolm 2- למשך 91 יום..1 טרנספורמציה של צמחי סולידגו 2.1. חיידק האגרובקטריום הניסויים בוצעו באמצעות שני זני אגרובקטריום tumefaciens( AGLO )Agrobacterium ו- EHA105. חיידקי האגרובקטריום והווקטורים הבינארים בהם נעשה שימוש במחקר זה: 0. ניסויי ביטוי חולף של הגן המדווח uida( β-glucuronidases ונקרא גם )GUS המכיל את הפלסמיד הבינארי EHA105 נעשו באמצעות שימוש בחיידק GUS תחת בקרת.pKIWI105 הפלסמיד מכיל את הגן uida המקודד לחלבון הפרומוטור (Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) 35S) 35S שמקורו מהווירוס CaMV ובנוסף מכיל את הטרמינטור של הגן.)OCS( Octopine syntase כמו כן, Neomycin הפלסמיד מכיל את הגן לעמידות לאנטיביוטיקה קנאמיצין, nopaline תחת בקרת הפרומוטור של הגן )nptii( phosphotransferase II.)NOS( syntase ניסויי ביטוי קבוע של הגן GUS ויצירת הצמחים הטראנסגנים נעשה באמצעות שימוש 4. בחיידקי האגרובקטריום מהזן AGLO המכיל את הפלסמיד הבינארי.pCGN7001 הפלסמיד, גם הוא, מכיל את הגן לעמידות לאנטיביוטיקה קנאמיצין, אך בניגוד ל- uida והגן CaMV 35S הגן לעמידות מבוקר באמצעות הפרומוטור pkiwi105 מבוקר באמצעות הפרומוטור של הגן.)MAS( Mannopine synthase לצורך יצירת צמחים טראנסגנים בהם מבוטא ביתר הגן PAP1 נעשה שימוש בחיידקי 9. PAP1 הגן.pCGN1559 המכילים את הפלסמיד AGLO אגרובקטריום מהזן AF325123( )GENEBANK accession no. הינו גן המקודד לפקטור שעתוק.2 9

ממשפחת חלבוני ה- MYB ובודד מצמחי אראבידופסיס thaliana) )Arabidopsis מהזן "Columbia" באמצעות שימוש בפריימרים: )Forward( -'5 ATCTGCAGACTTATACCTTTTACAATTTGTTTA-3' ו-) Reverse (.5'-TCAAACTGCAGAAACTAAGCCCA-3' המקטע שהוגבר הוכנס pcd shuttle vector בין הפרומוטור 35S לטרמינטור של OCS ולאחר מכן כל הקונסטראקט הוכנס לווקטור הבינארי pcgn1559 המכיל את הגן לעמידות לאנטיביוטיקה של קנאמיצין 2008) al.,.(ben Zvi et לצורך יצירת צמחים טראנסגנים בהם מבוטאים הגנים (Ros1) Rosea1 ו-( Del ) Delila תחת הבקרה של פרומוטורים שונים, נעשה שימוש בחיידקי אגרובקטריום מהזן AGLO המכילים את הפלסמיד הבינארי pjam1890 )באדיבותה של פרופ' קייטי מרטין מ- Centre.)John Innes הגנים Ros1 ו- Del M84913.1( )GENEBANK accession no. DQ275529.1, מקודדים לשני פקטורי שעתוק ממשפחות R2R3 MYB ו- bhlh בהתאמה ובודדו מצמחי לוע הארי majus(.)antirrhinum הגן Ros1 הגיע בקסטת (Invitrogen) Gateway וללא פרומוטור. לעומתו, הגן Del היה תחת בקרת הפרומוטור 35S. על מנת שהגן Ros1 יהיה תחת בקרה של כל אחד מהפרומוטורים:,35S E8 ו- AP3 תוכננו פריימרים ספציפיים לשם הגברתם: א. הפרומוטור 35S הוגבר מהפלסמיד )Tzfira et al., 2005( psat ע"י שימוש בפריימרים:,5'-CACCGTCAACATGTGGAGCACGAC-3' )Forward( וגם )Reverse(.5'-TGGCTATCGTTCGTAAATGG-3' ב. הפרומוטור של הגן (AP3) Kramer et al., 1998; Zhang et ( Apetala3 )al., 2013 הוגבר מהפלסמיד pcd ע"י שימוש בפריימרים: )Forward(,5'-CACCGCAAACCAAGTTTTTAGCTTT-3' וגם 5'-TATTCTTCTCTCTTTGTTTAATC-3' )Reverse( ג. הפרומוטור של הגן )Deikman et al., )1998 E8 הוגבר מהפלסמיד pcd ע"י שימוש בפריימרים:,5'-CACCCTAGAAGGAATTTCACGAAATC-3' )Forward( וגם )Reverse(.5'-CTTCTTTTGCACTGTGAAT-3' כל אחד מהמקטעים שהוגברו הוכנסו, לפלסמיד הביניים pentr D-TOPO TM (Invitrogen) ולאחר מכן הועברו לפלסמיד הבינארי pjam1890 המכיל את הגן לעמידות לאנטיביוטיקה קנאמיצין )nptii( בקונסטראקט. בדרך זו נוצרו שלושה.2 11

פלסמידים המכילים את הגן Ros1 הגן Del תחת הבקרה של 35S. תחת בקרה של שלושה פרומוטורים נפרדים ואת 2.2. מצעים ותנאי גידול פירוט כל סוגי המצעים ששימשו אותי מפורטים בטבלה 0. מצע גידול חיידקי האגרובקטריום )לפני הטרנספורמציה של הצמחים( היה מצע LB נוזלי, בתוספת Acetosyringone 50mM )A.S.( ואנטיביוטיקה בהתאם לווקטור הבינארי שהחיידקים מכילים. החיידקים גודלו בטמפ' של 28 C בטלטול של 180rpm למשך 42 שעות. לאחר מכן החיידקים עברו סרכוז למשך 4 דק' בצנטריפוגה במהירות של.10,000rpm המשקע הורחף במצע MS נוזלי )5.8 )ph + גלוקוז g/g( 3%( עד לריכוז של = 0.2 ) 600.O.D. A) מצע מוצק לקו-קולטיבציה ורגנרציה הוקשה ע"י הוספת אגר בריכוז.)Oxoid( 0.7% g/g להתארכות והשרשה נעשה שימוש במצע )121 C, כל המצעים עברו עיקור באוטוקלאב.)Oxoid( 0.8% g/g המכיל אגר בריכוז MS למשך 41 דק'( לפני הוספת הורמונים ואנטיביוטיקה. לאורך כל הניסוי המצעים המתוארים הוחלפו במצע טרי כל 02 יום. תרביות הרקמה נשמרו בחדר גידול בטמפ' קבועה של 25±1 C תחת 01 שעות תאורת פלורוסנט ( -1 s.)60μmolm -2 אנטיביוטיקה )mg/l( סוג המדיום סוגי ההורמונים )mg/l( הערות 50mM A.S., 3% (g/g) glucose מצע אינוקולציה )מצע MS נוזלי( ללא אנטיביוטיקה ללא הורמונים 50 mm A.S. 0.15 Zea מצע קו-קולטיבציה )מצע MS עם אגר( ללא אנטיביוטיקה - 1.5 Zea, 0.1 NAA מצע רגנרציה 70 Kan, 200 Cb וסלקציה ראשונה 0.5 Zea, 0.1 NAA מצע רגנרציה 60 Kan, 200 Cb וסלקציה שנייה - 0.1 Zea, 0.1 NAA 50 Kan, 200 Cb אלונגציה - 0.1 NAA, 0.5 GA 3 50 Kan, 200 Cb השרשה טבלה 1: סוגי המצעים ששימשו לטרנספורמציה ורגנרציה של צמחי סולידגו. קיצורים: NAA - α-naphthaleneacetic acid, Zea - Zeatin, GA - 3-Gibberellic acid, Cb - Carbomycilin, Kan- Kanamycin. 11

2.3. טרנספורמציה האקספלנטים הורחפו בתמיסת האילוח למשך 01 דקות, יובשו בנייר סינון סטרילי והועברו לצלחות פטרי עם מצע קו-קולטיבציה )ראה טבלה 0(. האקספלנטים הונחו על גבי המצע כך שכל שטח הפנים התחתון של העלה בא במגע עם המצע. הצלחות הונחו למשך שלושה ימים בחושך בחדר גידול בו שררה טמפרטורה קבועה של.25 1 C 2.2. רגנרציה וקבלת צמחונים לאחר 9 ימי אינקובציה עם החיידק הועברו האקספלנטים למצע רגנרציה וסלקציה ראשונה )טבלה 0( למשך שבועיים, כאשר בחלוף השבוע הראשון נוקו האקספלנטים מנצרונים שמקורם במריסטמות חיקיות והועברו למצע טרי. לאחר קבלת נצרונים אדוונטיבים, הנצרונים נחתכו מהאקספלנט והועברו למצע רגנרציה שנייה )טבלה 0( למשך שלושה חודשים ולאחר מכן למצע אלונגציה למשך עוד חודשיים עד לקבלת צימחון ממוין. בסיומם הצמחונים הועברו למצע השרשה למשך חודש וחצי בחדר גידול בטמפ' קבועה של 25±1 C תחת 01 שעות תאורת פלורוסנט ( 1- s.)60μmolm 2- לאחר קבלת צמחונים עם שורשים מפותחים, הצמחונים הועברו לחדר הקשחה בו שררה טמפרטורה קבועה של 23ºc ואור רציף בעוצמה של - s 80 µe* m 2- * 1 ממנורות פלואורסנט white(.)tadiran Israel, cool הצמחונים כוסו בניילון לשמירת הלחות ולאחר מספר ימים הוסר הכיסוי בהדרגה והצמחים הועברו לגידול בחממה בעציצים. 2.2. בדיקה היסטוכימית של GUS רקמת הצמחים נבדקה לפעילות האנזים GUS על פי (1987) Jefferson ובשימוש בבופר שהכיל 10mM EDTA, 100mM sodium phosphate ph 7.5 ו- X- 0.1% Triton 100. תמיסת ה- X-Gluc הוכנה על ידי המסה ב- (DMF) )911 dimethylformamide מיקרוליטר DMF ל- 01 מ"ג אבקת 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic 21.1 mg/l potassium ( Irocyanide ל- 0 מ"ל בופר הוספו 01 מיקרוליטר תמיסת.)acid ferricyanide ו- ferrocyanide 16.5 mg/l potassium מומסים במים( ו- 40 מיקרוליטר תמיסת.) 20 mg/l( X-Gluc הרקמה שהתה (Over Night) O.N בתמיסה ב- 37ºC והועברה לאתנול 21%. למחרת נבדקה הכחלת הרקמה באמצעות בניקולר. 2.2. שימוש ברובה חלקיקים ירי החלקיקים התבצע על פרחים מהזן Ivory Glory באמצעות רובה החלקיקים מהדגם PDS-.)Bio-Rad, Richmond, CA, USA( 1000/He הפרחים סודרו במרכז צלחת המכילה מצע 1/2MS עם 0% אגר Agar) (Difco, Bacto ו- 9% סוכרוז והתבצע במרחק של כ- 1 ס"מ ממוקד הירי. 12

אנליזות של הפיגמנטים בפרחי סולידגו 3.1. מיצוי וקביעה כמותית של כלל האנתוציאנינים אנתוציאנינים מוצו מפרחי סולידגו המפורקים מעלי הגביע, לאחר שקילת הרקמה )011 מ"ג( היא הוכנסה לאפנדורף 4 safe lock מ"ל עם 4 בידים של זכוכית והוקפאה בחנקן נוזלי. כתישת הרקמה נעשתה במכשיר Tissue Lyser )תוצרת ) Retsch, Qiagen, למשך 0 דקה ב- 25 הרץ. המיצוי נעשה ב- 0 מ"ל מתנול חומצי HCl) 1%), בטלטול, בטמפרטורה של 4 C ולמשך 9 שעות. לאחר סירכוז בצנטריפוגה במשך 0 דקות rpm( 12000( הועברה הפאזה העליונה לאפנדורף חדש ובעזרת ספקטרופוטומטר ( Scanning Microplate )Spectrophotometer, Power Wave 200, Bio-Tek Instruments נבדקה הקריאה באורכי גל 091 ו- 102 ננומטר של מיהולים שונים עם מתנול חומצי. החישובים נעשו על ידי שימוש בנוסחה,Absorbance = A 530 A*0.25-657 המפחיתה את בליעת האור על ידי הכלורופיל שבתמיסת המיצוי 1975( al.,.)mancinelli et 3.2. מיצוי וקביעה כמותית של כלל ההקרוטנואידים פרחי סולידגו המפורקים מעלי הגביע הוקפאו ב- 80 C -, נכתשו וטולטלו בתמיסת אצטון 81% עד למיצוי הצבע לתמיסה בתוספת פטרוליום אתר PE(.)Petroleum ether, קביעת רמת הקרוטנואידים ברקמה נעשתה בספקטרופוטומטר באורך הגל של 221 ננומטר..3 אנליזות מולקולאריות.2.1 אנליזת RNA בדיקת הצמחים נעשתה לאחר שהצמחונים התפתחו והועברו לחממה מבוקרת..2.0.0 הפקת RNA Tri-reagent כללי הופק מעלים ומפרחים של צמחי סולידגו בעזרת קיט RNA OH( 80mg :)Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, רקמת עלים ופרחים הוקפאה בחנקן נוזלי, נטחנה לאבקה דקה בעזרת מכתש ועלי והועברה למבחנות המכילות 1ml תמיסת.TRI REAGENT המבחנות עורבבו היטב והושארו בטמפרטורת החדר למשך 0 דקות. למבחנות הוספו 0.2ml כלורופורם ולאחר ערבוב בוורטקס המבחנות הושארו בטמפרטורת החדר למשך 01 דקות. לאחר מכן המבחנות סורכזו במשך 00 דקות בצנטריפוגה )13,500g( והפאזה העליונה הועברה למבחנות חדשות המכילות 0.5ml איזופרופנול. המבחנות עורבבו בוורטקס, הושארו בטמפרטורת החדר למשך 01 דקות ולאחר מכן סורכזו במשך 01 דקות בצנטריפוגה )15,800g(. התרחיף סולק ולמשקע הוסף 1ml אתנול 81%. לאחר ערבוב קצר סורכזו המבחנות במשך 0 דקות בצנטריפוגה )15,800g(. לאחר סילוק הנוזל, הפלט שמכיל את ה- RNA יובש, ואז.2 13

ועבר חימום בטמפרטורה של 60ºC וערבוב בוורטקס הורחף ב- DDW 35µl DEPC לסירוגין למשך כ- 01 דקות. קביעת ריכוז RNA 2.0.4. באמצעות מכשיר 1µl RNA נבדק בדוגמאות, RNA לצורך קביעת ריכוז ה-.)Wilmington, DE., USA( NanoDrop Technologies של חברת NanoDrop הבסיס לחישוב הכמותי הוא:.260nm נבדקה בליעת האור באורך גל של.1O.D. (A 260 ) = 40µg RNA/1ml פירוק DNA.2.0.9 )Gdansk, Poland( EUR X לדוגמאות הוסף Ribonuclease Inhibitor של חברת לפני פירוק.DNA מרכיבי הריאקציה כללו: 10X,10µg RNA בופר ריאקציה הכולל 1U,MgCl 2 אנזים (Fermentas) Deoxyribonuclease I והשלמה ל- 10µl על ידי 2µl ולאחר מכן הוספו התמיסה עברה אינקובציה למשך 20 דקות ב- 37ºC,.DDW והתמיסה חוממה שוב למשך 01 דקות ב- 65ºC. 25mM EDTA ריאקצית (RT) Reverse Transcriptase.2.0.2 של חברת ImProm-II Reverse Transcriptase הריאקציה לפי פרוטוקול,DNA לאחר פירוק 1µg RNA - מרכיבי הריאקציה :)Madison, USA( Promega חוממו למשך 0 דקות ב- 70ºC - DDW על ידי והשלמה ל- 5µl 0.5µg oligo(dt) וקוררו בקרח משך 0 דקות. לריאקציה הוספו Reverse Transcriptase Mix 15µl 1X ImProm-II Reaction Buffer, 3mM MgCl 2, 0.5mM dntp שכלל: mix, 1µl/reaction ImProm-II Reverse Transcriptase והשלמה ל- 15µl על ידי.DDW התמיסה הסופית הושארה בטמפרטורת החדר למשך 0 דקות, חוממה ב- 42ºC למשך 11 דקות ולאחר מכן חוממה ל- 70ºC למשך 00 דקות..2.2 ריאקצית RT-PCR דוגמאות cdna נבדקו ב- PCR לקביעת רמות ביטוי הגנים: Pap1, Ros1, Del בצמחים הטרנסגנים. את תכניות ה- PCR השונות ששימשו לבדיקה ניתן לראות בטבלה 4. הפריימרים ששימשו לריאקצית ה- RT-PCR : 2.4.0. פריימרים ספציפיים לגן :)AF325123( AtPAP1 א.,5' ACGCCCATTCCTACAACAC 3' :F3870 5' TCTCTCCATCGAAAAGACTCC 3' :R4224 גודלו המצופה של המקטע הוא 354. bp פריימרים ספציפיים לגן :)DQ275529.1( AmRos1 ב.,5' TGTGAGAAGCAAACGC 3' :F514 5' TTAATTTCCAATTTGTTGGG 3' :R663 14

גודלו המצופה של המקטע הוא 149. bp ג. פריימרים ספציפיים לגן )M84913.1(: AmDel,5' TGGTCCAATTCAGTTGCACAA 3' :F124 5' CGGCTCCAATCTTGTCCGT 3' :R1678 גודלו המצופה של המקטע הוא 1554. bp ד. פריימרים ספציפיים לגן :)AA660796( MtActin,5' GGTTTTGCTGGGGATGATGC 3' :F139.5' CATTGAATGTCTCAAACATGATTTGAGTC 3' :R467 גודלו המצופה של המקטע הוא 328. bp 2.4.4. הרכב ריאקציות ה- RT-PCR : cdna 1µl שהתקבלו בהפקה שתוארה בסעיף 2.0.2..0.2µl Taq polymerase )0.5U( )SRP-801, Fermentas( )X10(. בופר האנזים 2µl.)1.25 mm( תערובת נוקליאוטידים 1.6µl 10pmol מכל פריימר. נפח הריאקציה הושלם ל- 20µl עם.DDW 2.4.9. תנאי ריאקציות ה- PCR Mastercycler gradient, Eppendof, ריאקציות ה- PCR בוצעו במכשיר 91 כל תכניות ה- PCR ששימשו עבור כל זוגות הפריימרים כללו סבבים,.Germany כאשר הטמפרטורה בשלב היקשרות הפריימרים )Annealing( זוג לכל בהתאם הייתה פריימרים )ראה טבלה 4(. Gene PAP1 Rosea1 Delila Actin PCR steps Time Temp Time Temp Time Temp Time Temp Denaturation 3 min 49ºC 3 min 49ºC 3 min 49ºC 3 min 49ºC Annealing 2 min 60ºC 2 min 52ºC 2 min 55ºC 2 min 55ºC Elongation 2 min 22ºC 2 min 22ºC 2 min 22ºC 2 min 22ºC 03 Cycles 03 Cycles 03 Cycles 03 Cycles Denaturation 00 sec 49ºC 00 sec 49ºC 20 sec 49ºC 30 sec 49ºC Annealing 00 sec 60ºC 00 sec 52ºC 00 sec 55ºC 00 sec 55ºC Elongation 20 sec 22ºC 20 sec 22ºC 40 sec 22ºC 20 sec 22ºC Long Elongation 00 min 22ºC 00 min 22ºC 00 min 22ºC 00 min 22ºC טבלה 2: תנאי ריאקציות ה- PCR. 15

2.4.2. הפרדת תוצרי ריאקציות ה- PCR תוצרי ריאקצית ה- PCR הורצו )בנוכחות 2.5 mm EDTA ו- 4.0% גליצרול( על ג'ל,)0.1M EDTA, 2M Tris ph 7.6, 1M Na-acetate( TAE 0.0% אגרוז שהכיל 1.10% אתידיום ברומיד 10mg/ml(.)EtBr הדוגמאות הורצו במקביל לסמן מולקולארי Mix(.)Fermentas GeneRuler DNA Ladder ההפרדה נעשתה במכשיר אלקטרופורזה מאוזן בנוכחות בופר.TAE ההרצה התבצעה במתח קבוע של 100V. חזית ההרצה סומנה באמצעות.Bromophenol blue בדיקת חומרי ריח נדיפים.2.1 מערכת Headspace תפרחות סולידגו קטופות במשקל של 6±0.6 גר' )בערך 01 פרחים( הונחו בתוך כוס זכוכית המכילה 20ml מים שהוכנסה לצנצנת זכוכית )1L( המחוברת דרך קולונה למשאבת אוויר. המערכת הופעלה ל- 42 שעות, החומרים הנדיפים שנפלטו מהפרחים נאספו בתוך קולונה מזכוכית )0.7X10cm( שבתוכה 0.1gr של USA).Porapak Q 80/100 (Waters, קולונה נוספת, שבתוכה 0.2gr של,Porapak Q 80/100 שימשה לסינון האוויר הנכנס לכלי. החומרים הנדיפים נאספו בקולונה על ידי שאיבת האוויר )זרם- min /,)200cm 3 שסביב הדוגמא. החומרים הנדיפים מוצו מקולונת ה- Q Porapak עם 1.5ml של Bio ( hexane.)lab למיצוי הוסף 0.2ml של )2µg/ml( isobutyl benzene המשמש כסטנדרט. המיצוי רוכז בעזרת חנקן לנפח של 150µl ממנו נלקח 1µl אשר הוזרק למכשיר ה- GC-MS..2.2 אנליזת (GC-MS) Gas Chromatography-Mass Spectrometry התרכובות הנדיפות עברו אנליזה במערכת GC-MS המורכבת מ- sampler Ophir ( Pal auto analytic Tel Aviv, Israel, representive of CTC analytic, Zwingen, TRACE DSQ ו- TRACE GC 2000 gas chromatograph,)switzerland Bargal Analytics, Tel Aviv, Israel, ( quadruple mass spectrometer.)representative of Thermo Finnigan, Hemel, UK מכשיר ה- GC מצויד בקולונה קפילרית מסוג )30m, 0.25I.D, 0.25um( Zebron ZB-WAXplus טמפרטורת ה- 235ºC הייתה Ion טמפרטורת ה- source,)splitless injector( 230ºC הייתה injector וטמפרטורת ה- line Transfer הייתה.230ºC טמפרטורת התנור הוחזקה ב- 45ºC למשך 4 דקות ולאחר מכן עלתה מ- 45ºC ל- 235ºC בקצב של 10ºC/min והמתנה של 1 דקות ב-.235ºC הליום )1ml/min( שימש כגז נשא. טווח המסות היה 40-450. m/z זיהוי החומרים נעשה על ידי השוואה עם retention time וספקטרום המסות שהתקבל מסטנדרטים מקוריים שהוזרקו למכשיר ועל ידי אנליזת ספקטרום המסות בשימוש בספריה ממוחשבת 2.0.V.NIST לצורך אנליזה כמותית )2µg/ml( Isobutylbenzene שימש כסטנדרט פנימי..2 16

תוצאות פיתוח מערכת רגנרציה לסולידגו בניסוי זה נבחנו השפעתם של שילובי הורמונים על רגנרציה אדוונטיבית מאקספלנטים שמקורם מעלים צעירים של סולידגו מהזן.Ivory Glory האקספלנטים הונחו על מצעי האינדוקציה השונים המבוסס על מצע MS כאשר צידם התחתון על גבי המצע. ניצרונים אדוונטיבים נראו בעין לאחר 00 ימים או יותר. על מנת לבחון את השפעת הרכב הציטוקינינים במצע הגידול על יכולת הרגנרציה האדוונטיבית של עלי הסולידגו נלקחו החומרים: (BA) Benzylaminopurine בריכוז 0.0 מ"ג/ליטר, )Zea( Zeatin בריכוז 0.0 מ"ג/ליטר או (TDZ) Thidiazuron בריכוז 0.0 מ"ג/ליטר. כל מצעי הגידול הכילו )NAA( α-naphthaleneacetic acid בריכוז של 1.0 מ"ג/ליטר. לאחר 44 יום נבחנו אחוז האקספלנטים הרגנרטיבים ומספר אזורי רגנרציות לאקספלנט רגנרטיבי )טבלה 9(. על מנת לבחון את יעילות הרגנרציה של כל הורמון ביצירת ניצרונים אדוונטיביים נעשה חישוב של ממוצע אחוז האקספלנטים הרגנרטיבים כפול מספר רגנרציות לאקספלנט רגנרטיבי. ניתן היה לראות הבדל של בערך פי 0.0 ביעילות הרגנרציה על גבי מצע המכיל )93%( Zea בהשוואה למצעים המכילים את ההורמונים )42%( BA ו- TDZ )42%( )גרף 0(. בשביל לראות את ההשפעה של ההורמון Zea בריכוז 0.0 מ"ג/ליטר ו- NAA בריכוז 1.0 מ"ג/ליטר על יכולת הרגנרציה האדוונטיבית בזני סולידגו נוספים, "דנציגר-משק פרחים דן" הביא למעבדתינו שני זני סולידגו נוספים: Golden Glory ו- Tara. הזנים הונחו כאמור לעיל ונבחנה יעילות הרגנרציה של שלושת הזנים לאחר כ- 44 יום. נמצא שיעילות הרגנרציה האדוונטיבית של הזן Tara )82%( היא הגבוהה ביותר, לאחריו יעלות הרגנרציה של הזן )12%( Golden Glory ולאחריו הזן Ivory Glory בו נראתה יעילות הרגנרציה הנמוכה ביותר )21%(, )טבלה 2(. יש לציין כי לאחר 44 ימים בתנאי תרבית רקמה על המצע המתואר לעיל האקספלנטים שמקורם בעלים של הזנים השונים הראו דפוסי רגנרציה שונים. בעוד שבזן Tara הניצרונים האדוונטיבים מתפתחים לאורך כל האקספלנט, הניצרונים האדוונטיבים בזן Ivory Glory מתפתחים בעיקר בקצוות האקספלנט )בקצה הטרף ובקצה הפטוטרת( )איור 2(. בנוסף, בזן Golden Glory מרבית הניצרונים התפתחו בקצוות האקספלנט אך יחד עם זאת נצפתה יצירה של רקמה לא ממוינת )קאלוס( גם באזורים אחרים שבהמשך חלקה המשיך להתפתח לנצרונים )איור 2(..1 17

Regeneration efficiancy (%) הורמון BA 1.5mg/L ממוצע טבלה - 3 אחוז האקספלנטים הרגנרטיביים ומס' הניצרונים פר אקספלנט ממקטעי עלה צעירים של סולידגו מהזן Ivory Glory שגדלו במשך 44 יום על גבי מצעי גידול המכילים סוגים שונים של ציטוקינינים. בתוצאות מוצגים תוצאות של 9 חזרות וממוצע±שגיאת התקן. אחוז אקספלנטים רגנרטיבים 49 42 48 מס' ניצרונים לאקספלנט רגנרטיבי 1.11 0.12 0.1 1.05±0.02 0.00 1.33 1 41±0.4 92 91 98 Zeatin 1.5mg/L ממוצע 1.16±0.1 1.13 1.2 0.0 34±1.8 03 40 49 TDZ 1.5mg/L ממוצע 1.14±0.02 40±0 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 a b c BA Zeatin TDZ Cytocinin type גרף - 1 יעילות הרגנרציה )מספר ניצרונים ל- 011 אקספלנטים( של אקספלנטים ממקטעי עלה של הזן Ivory Glory שגדלו במשך 44 יום על גבי מצעי גידול המכילים סוגים שונים של ציטוקינין. כל עמודה מייצגת את הממוצע של 9 חזרות±שגיאת התקן. לשם בחינה האם קיים הבדל בין הטיפולים השונים בוצע מבחן.one way ANOVA אותיות מעל העמודות מציינות מובהקות סטטיסטית בין הטיפולים השונים ברמת ביטחון של 30% ומחושבות במבחן t-test שבוצע בתוכנת.Excel 18

זן Golden Glory ממוצע מס' מערכת 0 אחוז אקספלנטים רגנרטיבים 00 מס' ניצרונים לאקספלנט רגנרטיבי 0.4 יעילות רגנרציה באחוזים 12 22 04 64±7 20 20 90 0.0 0.9 1.2±0.04 0.0 0.0 0.0 18 20 54±8 91 20 90 4 9 0 4 9 Ivory Glory ממוצע 40±3 30 20 30 1.1±0.0 0.2 0.9 0.0 36±3 12 08 14 0 4 9 Tara ממוצע 87±6 1.4±0.07 61±2 טבלה - 2 אחוז אקספלנטים רגנרטיביים, מס' הרגנרציות לאקספלנט רגנרטיבי ויעילות הרגנרציה )מספר ניצרונים ל- 011 אקספלנטים( של שלושה זני סולידגו שונים, שגודלו במשך 44 יום בתרבית על גבי מצעי גידול המכילים את הציטוקינין Zea בריכוז 0.0 מ"ג לליטר והאוקסין NAA בריכוז 1.0 מ"ג לליטר. בתוצאות מוצגים תוצאות של 9 חזרות וממוצע±שגיאת התקן. איור 19-2 רגנרציה של ניצנים אדוונטיביים על גבי אקספלנטים שמקורם מעלים של שלושה זני סולידגו לאחר 44 יום בתרבית.

לאחר 20 יום הניצנים האדוונטיבים הועברו למצע התארכות )ראה פרק שיטות וחומרים(. ניתן להבחין שלאחר 11 יום הניצנים מתחילים להתארך, אך עדיין ווטריפיקנטים )איור 0(. לאחר מכן הועברו הצמחונים המאורכים למבחנות זכוכית המכילות מצע השרשה )ראה פרק שיטות וחומרים(, )איור 1( ולאחר מכן להקשחה בחממה להמשך גידול. A איור - 2 ניצנים אדוונטיבים במדיום התארכות )לאחר 11 יום מתחילת הרגנרציה( שהתפתחו על גבי אקספלנטים מעלים של הזנים )A(.Golden Glory,)C( ; Ivory Glory )B( ; Tara מצע הגידול בשלב זה מכיל 1.0 מ"ג/ליטר,GA 3 1.0 מ"ג/ליטר,Zea 1.0 מ"ג/ליטר.NAA איור - 2 צמחוני סולידגו מושרשים מהזנים )A( Tara )C( ;Golden Glory )B( ;Ivory Glory לאחר 001 יום מתחילת הרגנרציה. פיתוח מערכת טראנספורמציה לזני סולידגו על מנת לבדוק את התאמתו של הפרומוטור 35S לפרחי סולידגו נעשה ניסוי ע"י רובה חלקיקים לבחינת ביטוי חולף של הגן DsRED תחת הבקרה של פרומוטור זה. הירי התבצע עם חלקיקי זהב המצופים בפלסמיד psat המכיל את הקונסטראקט.35S:DsRED לאחר הירי הפרחים הונחו ב- 25±1 C תחת 01 שעות תאורת פלורוסנט ( 1- s )60μmolm 2- למשך 9 ימים שבמהלכם היה ניתן להבחין בביטוי חולף של הגן DsRED במספר מועט של אזורים על גבי עלה הכותרת, בעוד.2 21

שבביקורת שהופצצה בחלקיקי זהב המצופים בפלסמיד psat ללא גן מדווח לא נצפתה פלורוסנציה כלל )איור.)7A-F, 7B-G כמו כן, כאשר בוצע ירי על הפרחים עם חלקיקי זהב המצופים בפלסמיד המכיל את הקונסטראקט,35S:PAP1 היה ניתן להבחין )לאחר 28 שעות מזמן הירי( בהצטברות של פיגמנט אדום-סגול ברקמת הפרח )איור 7C( איור - 7 ביטוי חולף של הגן DsRED והגן PAP1 תחת הפרומוטור 90S בעלי כותרת של סולידגו. הטראנספורמציה התבצעה באמצעות רובה חלקיקים על פרחי סולידגו מהזן,A(,D )F.Ivory Glory פרחי ביקורת שהופצצו בחלקיקי זהב המצופים בפלסמיד ללא גן מדווח. )G,B(,E פרחים שהופצצו בחלקיקי זהב המצופים בפלסמיד psat- )C(.35S:DsRED פרחי Ivory Glory שהופצצו בחלקיקי זהב המצופים בפלסמיד.pCGN1559-35S:PAP1 תנאי הירי היו בלחץ של PSI 0011 ובמרחק 1 ס"מ ממוקד הירי. התמונות נלקחו 28 שעות לאחר הירי. חצים מסמנים את האזורים בהם נראה הביטוי של הגנים DsRED ו- PAP1. 2.1. ביטוי חולף של GUS בכדי לבדוק את רגישותם של האקספלנטים לחיידקי אגרובקטריום נעשה ניסוי לביטוי חולף של GUS באקספלנטים מעלים צעירים של.Ivory Glory בניסוי הודבקו עלי סולידגו עם חיידקי אגרובקטריום מזן EHA105 המכילים את הפלסמיד pkiwi105 הנושא את הגן המדווח.GUS לאחר האילוח, האקספלנטים עברו קו-קולטיבציה של 9 ימים עם החיידקים במצע ללא אנטיביוטיקות. לאחר 0 ימים נוספים על מצע לסלקציה המכיל את האנטיביוטיקה Kan נבחנה פעילות האנזים GUS בצביעה היסטוכימית. באיור 8D ניתן לראות כי הושג ביטוי חולף באזורים רבים על גבי האקספלנט. 21

איור - 8 ביטוי חולף של הגן GUS בעלים של סולידגו מהזן.Ivory Glory פאנל עליון לפני צביעה ופאנל תחתון לאחר צביעה. )A( עלה ביקורת שאולח בחיידק אגרובקטריום מהסוג EHA105 המכיל את הפלסמיד pkiwi105 ללא הגן המדווח (A( GUS לפני צביעה היסטוכימית, )B( ואחרי צביעה היסטוכימית. )C( עלה שעבר קו-קולטיבציה עם חיידקי אגרובקטריום מזן EHA105 המכילים את הפלסמיד pkiwi105-35s:gus למשך 9 ימים במצע ללא אנטיביוטיקות, ולאחר 0 ימי שהייה על גבי מצע המכיל את האנטיביוטיקה לסלקציה )D(.Kan העלים המודבקים לאחר חמישה ימים ולאחר צביעה היסטוכימית לבחינת פעילות.GUS 2.2. ביטוי קבוע של GUS האילוח על הזנים Golden Glory,Ivory Glory ו- Tara נעשה עם חיידקי אגרובקטריום מזן AGLO שהכילו את הפלסמיד pcgn7001-35s:gus )כמתואר בפרק שיטות וחומרים(. על מנת להשרות רגנרציה של צמחים טראנסגנים הועברו האקספלנטים, לאחר 9 ימי קו-קולטיבציה עם החיידק, למצע רגנרציה וסלקציה ראשונה המכיל את האנטיביוטיקה Kan למשך חודש וחצי. במהלך חודש וחצי זה התחילו להיווצר ניצרונים אדוונטיבים על גבי האספלנטים. אקספלנטים שלא נראה בהם התפתחות של ניצרונים על גבי מצע הסלקציה שהכיל 11 מ"ג/ליטר,Kan הצהיבו ולבסוף מתו עם הזמן. הניצרונים שהתפתחו הופרדו והועברו למצע רגנרציה וסלקציה שני שהכיל ריכוז נמוך יותר )50 מ"ג/ליטר( של האנטיביוטיקה Kan ושל הציטוקינין )1.0 מ"ג/ליטר( Zea בהשוואה למצע הרגנרציה והסלקציה הראשון. שלב זה לקח כ- 0-1 חודשים וזאת מכיוון שגידולם של הניצרונים היה וויטריפיקנטי. לאחר גידול הניצרונים והתייבשותם, הצימחונים הועברו למצע התארכות למשך 0-0.0 חודשים ולאחר מכן למצע השרשה. לאחר 3 חודשים מההדבקה התקבלו צמחונים מושרשים. בכדי להוכיח שהצמחונים אכן טראנסגנים ולאשר את ביטויו של הגן,GUS הופק RNA מעלים מהצמחונים הנ"ל ונעשה.Actin ולגן GUS באמצעות פריימרים ספציפים לגן cdna על RT-PCR באנליזת RT-PCR על רקמת עלים מהזנים Golden Glory ו- Glory,Ivory שהתפתחו על מצעי הסלקציה המכילים את האנטיביוטיקה,Kan התקבלו תוצרי PCR בעוד שבביקורת )צמחי )W.T. לא נראו תוצרים אלו באיור 9A. כמו כן, על מנת להוכיח את פעילותו של האנזים GUS בצמחונים הנ"ל נעשתה צביעה היסטוכימית )איור.)9B,C 22

הפרוטוקול שפותח יושם עבור טראנספורמציה על זני הסולידגו ועל מנת לבחון את יעילות הטראנספורמציה בזנים השונים, האקספלנטים ובהמשך הניצרונים, טופלו על פי המתואר לעיל ונבחנו פרמטרים שונים של יעילות טראנספורמציה. ניתן לראות בטבלה 9 כי מס' הניצרונים פר אקספלנט רגנרטיבי בשלושת הזנים היה בין 0-0.1, לעומת זאת יעילות הטראנספורמציה בין שלושת הזנים הייתה 2-92% בתחילת הסלקציה )לאחר כחודש ממועד ההדבקה(, כאשר הגבוה מבין השלושה היה )92%(, Golden Glory אחריו )02%( Ivory Glory ובסוף )2%(. Tara לאחר 3 חודשים ממועד ההדבקה ניתן לראות כי מגמה זו נשמרה )טבלה 0(. איור - 9 צמחונים טראנסגנים מהזנים Ivory Glory ו- Glory Golden המבטאים את הגן GUS שהודבקו עם חיידקי אגרובקטריום מזן AGLO המכיל את הפלסמיד )A(.pCGN7001 תוצרי אנליזת RT-PCR שבוצעה עם פריימרים ספציפיים לגן GUS ולגן Actin על cdna שנוצר מ- RNA מרקמת עלים שנלקחו מהצמחים הטראנסגנים. )B( צמחונים של Golden Glory )פאנל עליון( ו- Glory Ivory )פאנל תחתון(. )C( צביעה היסטוכימית לבדיקת פעילותו של האנזים.GUS 23

יעילות טראנספורמציה של הזן Ivory Glory אחוז אקספלנטים רגנרטיבים מס' ניצרונים לאקספלנט רגנרטיבי יעילות טראנספורמציה לאחר חודש יעילות טראנספורמציה לאחר 9 חודשים 3% 17% 1.3 13% יעילות טראנספורמציה של הזן Golden Glory אחוז אקספלנטים רגנרטיבים מס' ניצרונים לאקספלנט רגנרטיבי יעילות טראנספורמציה לאחר חודש יעילות טראנספורמציה לאחר 9 חודשים 5% 34% 1.6 22% יעילות טראנספורמציה של הזן Tara אחוז אקספלנטים רגנרטיבים מס' ניצרונים לאקספלנט רגנרטיבי יעילות טראנספורמציה לאחר חודש יעילות טראנספורמציה לאחר 9 חודשים 0.6% 4% 1 4% טבלה - 2 סיכום תוצאות ניסוי הטראנספורמציה של זני סולידגו שעברו התמרה עם חיידקי אגרובקטריום מזן AGLO שהכילו את הפלסמיד.pCGN7001-35S:GUS הערכים הינם מחזרה אחת מכל זן. בניית מחדרים בעלי פרומוטורים שונים בשביל לגרום לפרחי הסולידגו לייצר פיגמנטים אנתוציאנינים נעשה שימוש במס' גנים רגולטורים המבקרים חיובית את מסלול האנתוציאנינים. אחד מאותם גנים רגולטורים הוא הגן PAP1 (2000 al., (Borevitz et שבודד מצמח הארבידופסיס ומקודד לפקטור שעתוק מסוג MYB המבקר חיובית את מסלול הפנילפרופנואידים ובעיקר את הגנים המבניים במסלול זה, המהווים גורמי מפתח במסלול האנתוציאנינים. עם גן זה עשיתי שימוש כאשר הוא נמצא תחת שני פרומוטורים שונים. מלבד הקונסטראקט של 35S:PAP1 ששובט בעבר ונעשה בו שימוש במעבדתנו ( al., Zvi et 2008( הגן PAP1 שובט תחת בקרת הפרומוטור של הגן,AP3 שהינו גן המתבטא באופן ספציפי בפרחים 2013) al.,.)kramer et al., 1998; Zhang et מבדיקת פעילות הפרומוטור של הגן AP3 במעבדתנו, נמצא שהוא אכן פעיל בפרחי טבק, ולכן השימוש בו מגביר את הסיכוי לקבלת פרחים המבטאים את הגן ברקמת הפרח. מלבד השימוש בגן הרגולטורי,PAP1 תחת הבקרה של הפרומוטורים 35S ו- AP3 יצרתי שלושה קונסטראקטים נוספים המכילים את הגנים הרגולטורים Ros1 ו- Del שבודדו לראשונה מפרחי "לוע הארי" majus( )Antirrhinum ומקודדים לשני.3 24

פקטורי שעתוק מסוג MYB ו- bhlh בהתאמה, וכמו כן מבקרים חיובית את מסלול האנתוציאנינים בכך שמבקרים חיובית מס' גנים מבניים במסלול זה. הגנים הנ"ל נמצאים בווקטור pjam1890 והתקבלו באדיבותה של פרופ' קייטי מרטין Centre),(John Innes כאשר הגן Del נמצא תחת הבקרה של הפרומוטור הקונסטיטוטיבי 35S ואילו הגן Ros1 נמצא ללא פרומוטור. הגן Ros1 שובט תחת בקרת פרומוטורים שונים כגון,35S AP3 ובנוסף הפרומוטור של הגן Deikman et al., ( E8 1998(. גן זה מתבטא ספציפית בפרי העגבנייה ומופעל בתחילת תהליך ההבשלה של הפרי ואף מגיב לטיפול באתילן חיצוני. כמו כן, נמצא שכאשר איחו את הפרומוטור של גן זה ל- GUS (E8:GUS) במעבדתנו נמצא שהיה ביטוי של GUS בפרחים )מידע לא פורסם( ולא ברקמות הווגטטיביות. השתמשתי במגוון זה של פרומוטורים על מנת לקבל גמישות באופן ביטוי של הגנים הזרים הללו בסולידגו )איור 10A(. בכדי לבחון את תקינות הווקטורים, נעשתה טראנספורמציה לצמחי טבק עם חיידקי אגרובקטריום מזן AGLO המכיל את אחד הווקטורים )הגנים Ros1/Del תחת בקרת הפרומוטור 35S(. ניתן לראות את ביטוי הגנים ברמת ה- RNA בצמחי הטבק הטראנסגנים שהתקבלו והצטברות אנתוציאנינים הן בחלקי הצמח הווגטטיבים והן הרפרודוקטיבים בהשוואה לצמחי הביקורת )איור.)10B,C איור - 11 צמחי טבק טראנסגנים המבטאים באופן קבוע את הגנים (Ros1) Rosea1 ו-( Del ) Delila תחת בקרת הפרומוטור )A( 35S. איור סכמטי של איזור ה- T-DNA שהוחדר לצמחי הטבק. )B( צמחי טבק טראנסגנים )משמאל( המראים הצטברות של פיגמנטים אנתוציאנינים ברקמות הווגטטיביות והרפרודקטיביות ומכילים את הקונסטראקט pjam-2*35s:ros1-2*35s:del לעומת צמחי טבק W.T. כביקורת )מימין(. )C( אנליזת RT-PCR לרקמת עלים של טבק המכיל את הקונסטראקט pjam-2*35s:ros1-2*35s:del וצמחי W.T. כביקורת. 25

טראנספורמציה של זני סולידגו שונים עם גני המטרה 2.1. טראנספורמציה עם הגן PAP1 על מנת ליצור צמחי סולידגו מזן Golden Glory ו- Glory Ivory המבטאים את הגן PAP1 נעשה שימוש בחיידקי אגרובקטריום מזן AGLO המכילים את pcgn1559-35s:pap1 ו- pcgn1559-ap3:pap1 ובנוסף שימש כביקורת הפלסמיד pcgn7001 )כמתואר בפרק שיטות וחומרים(. לאחר הטראנספורמציה התפתחו מספר צמחונים על מצע הסלקציה שהכיל Kan וכבר בשלבים הראשונים של הסלקציה ניתן היה לזהות בתרבית רקמה כי צמחונים שהותמרו עם 35S:PAP1 צוברים פיגמנטים בעלים ולא כן בצמחי הביקורת, וזאת ככל הנראה כתוצאה מביטוי ביתר של הגן PAP1 )איור.)11I,J התפתחותם של הצמחונים שהכילו את 35S:PAP1 בתרבית הרקמה הייתה איטית מאוד. בנוסף כל הצמחונים )הביקורת, אלו שהכילו את AP3:PAP1 ו- 35S:PAP1 ( נראו וויטריפיקנטים. לאחר כ- 01 חודשים הצמחונים המכילים את הקונסטראקטים 35S:PAP1 ו- AP3:PAP1 הועברו לתנאים מעודדי התארכות והשרשה וגודלו עד לפריחה בחממה )כמתואר בפרק שיטות וחומרים(..2 איור - 11 צמחונים צעירים בשלבי רגנרציה לאחר 2 חודשים )פאנל עליון( ולאחר 04 חודשים )פאנל תחתון( של סולידגו (A-D) Ivory Glory ו- Glory )E-J( Golden שעברו טראנספורמציה עם חיידקי אגרובקטריום מזן AGLO המכילים את הקונסטראקט,)G-H, C-D( AP3:PAP1,)I, J( 35S:PAP1 וכביקורת מוצגים צמחי סולידגו שעברו טראנספורמציה עם חיידק אגרובקטריום המכיל את הקונסטראקט.(E-F, A-B) 35S:GUS על מנת לבחון את יעילות הטראנספורמציה של הזנים שעברו התמרה עם הקונסטראקט AP3:PAP1 נבחנו פרמטרים שונים של יעילות טראנספורמציה. ניתן לראות בטבלה 2 את סיכום הניסוי. על פי התוצאות הן לאחר חודש ממועד ההדבקה )כאשר תהליך הסלקציה עדיין לא הושלם( והן לאחר כ- 3 חודשים )כאשר ישנם צמחים בוגרים בחממה( יעילות הטראנספורמציה הייתה גבוהה יותר בזן Golden Glory לעומת הזן.Ivory Glory 26

זן Ivory Glory Golden Glory אחוז אקספלנטים רגנרטיבים 9±3 מס' ניצרונים לאקספלנט רגנרטיבי 1.1±0.15 יעילות טראנספורמציה לאחר חודש )ב-%( 11±5 יעילות טראנספורמציה לאחר 9 חודשים )ב-%( 3±1 8±2 28±6 1.3±0.19 20±6 טבלה - 2 סיכום ניסוי תוצאות הטראנספורמציה של זני הסולידגו Golden Glory ו- Glory Ivory שעברו התמרה עם חיידקי אגרובקטריום מזן AGLO עם הקונסטראקט AP3:PAP1 לאחר חודש ולאחר כ- 3 חודשים. הערכים הינם ממוצע של שתי חזרות מכל זן. מוצגות התוצאות ±שגיאת התקן. בשני זני הסולידגו שהותמרו עם הקונסטראקט )1 AP3:PAP1 קווים של הזן Ivory Glory ו- 8 קווים מהזן )Golden Glory לא נראתה הצטברות אנתוציאנינים ברקמת הפרח, והפרחים נראו זהים לפרחי הביקורת אשר הותמרו עם הגן המדווח GUS )איור 12 פאנל תחתון(. בכדי לאשר את ביטויו של הגן PAP1 בקווים השונים של Ivory Glory ו- Glory,Golden הופק RNA מהפרחים ונעשה RT-PCR על cdna באמצעות פריימרים ספציפים לגן PAP1 ולגן.Actin ניתן לראות הגברה ספציפית של הגן PAP1 ברוב הקווים השונים של הזנים שהותמרו עם AP3:PAP1 לעומת צמחי הביקורת שהותמרו עם הקונסטראקט 35S:GUS ששימשו כביקורת )איור 12 פאנל עליון(. איור - 12 צמחי סולידגו מהזנים (A) Golden Glory )B(,Ivory Glory המבטאים את AP3:PAP1 בפרחים בוגרים. בפאנל העליון מוצגים תוצרי RT-PCR שנעשה על RNA שהופק מפרחים )ללא עלי גביע( של קווי סולידגו מהזנים Golden Glory ו- glory Ivory שהותמרו ב- AP3:PAP1 או 35S:GUS כביקורת. הפריימרים בריאקציה תוכננו לאזורים ספציפיים של הגן PAP1 או של הגן.Actin 27

בזני הסולידגו Golden Glory ו- Glory Ivory שהותמרו עם הקונסטראקט 35S:PAP1 נצפתה צבירה של פיגמנט בעלים ובפרחים לעומת צמחי הביקורת )איור.)13A,14A על מנת לוודא את ביטויו של הגן PAP1 בצמחים אלו, הופק RNA ממס' קווים מפרחים ונעשה RT-PCR על cdna באמצעות פריימרים ספציפים לגן PAP1 ולגן.Actin ניתן לראות את תוצרי ההגברה הספציפית של הגן PAP1 בקווים שהותמרו עם 35S:PAP1 בעוד שבצמחי הביקורת שהותמרו עם הקונסטראקט.)13B,14B לא ראו את תוצרי הגברה זו )איור 35S:GUS B איור - 13 סולידגו מהזן Golden Glory הצובר אנתוציאנינים בשלבים שונים של גידול.) A ( פאנל עליון מוצגים פרחי Golden Glory שהותמר עם 35S:PAP1 בשלבים שונים של גידול )2 חודשים ו- 02 חודשים(. פאנל תחתון מוצגים פרחים מצמחים שהותמרו עם 35S:GUS כביקורת בשלבים שונים של גידול )2 חודשים ו- 02 חודשים(. )B( תוצרי RT-PCR מ- RNA שהופק מרקמת פרחים של קווים שונים. הפריימרים בריאקציה תוכננו לאזורים ספציפיים של הגן.Actin או של הגן PAP1 28

A B איור - 12 סולידגו מהזן Ivory Glory שהותמר עם הקונסטראקט 35S:PAP1 הצובר אנתוציאנינים. )A( בפאנל הימני מוצגים פרחים מצמחים שהותמרו עם 35S:GUS כביקורת. פאנל שמאלי פרחי Ivory Glory שהותמר עם הקונסטראקט )B(.35S:PAP1 תוצרי RT-PCR מ- RNA שהופק מרקמת עלים של קווים שונים. הפריימרים בריאקציה תוכננו לאזורים ספציפיים של הגן PAP1 או של הגן.Actin 2.2. טראנספורמציה עם הגנים Del/Ros1 הזנים Tara ו- Glory Golden הותמרו עם חיידקי אגרובקטריום מזן AGLO המכילים את הגנים Del תחת הפרומוטור 35S ו- Ros1 תחת בקרה של פרומוטורים שונים (,E8,35S )AP3 ו- 35S:GUS כביקורת. לאחר חודש וחצי ממועד הטראנספורמציה התפתחו מספר ניצרונים על מצע הסלקציה שהכיל את האנטיביוטיקה Kan וניתן היה להבחין שבחלק מהקווים שהותמרו בקונסטראקטים השונים של הגנים Del/Ros1 ישנה צבירה מוגברת של פיגמנטים בעלים בהשוואה לצמחי הביקורת שהותמרו עם 35S:GUS )איור.)15A-F, 16A-F גידול הצמחונים בתרבית היה איטי בעיקר בגלל צימוח וויטריפיקנטי. בצמחים בוגרים בשני זני 29

הסולידגו לא נראתה הצטברות אנתוציאנינים הן ברקמת הפרח והן ברקמות הווגטטיביות, והפרחים נראו זהים לצמחי הביקורת אשר הותמרו עם הגן המדווח GUS )איור 02(. על מנת לוודא את ביטויים של הגנים Del/Ros1 בצמחים המותמרים, הופק RNA מפרחים של קווים מותמרים מהזנים Golden Glory ו- Tara ונעשה RT-PCR על cdna באמצעות פריימרים ספציפים לגנים Del/Ros1 ולגן.Actin באיור 08 ניתן לראות את תוצרי ההגברה הספציפית של הגנים Del ו- Ros1 עם שלושת הקונסטראקטים השונים בזן Golden Glory ו- Tara בעוד שבביקורת שהותמרה עם 35S:GUS לא היה ניתן לראות תוצרים אלו. איור - 12 ניצרונים אדוונטיבים לאחר חודשיים )פאנל עליון( וצימחונים לאחר 04 חודשים )פאנל תחתון( של המכילים את הגנים Del/Ros1 AGLO לאחר טראנספורמציה עם חיידקי אגרובקטריום מזן Golden Glory תחת הבקרה של פרומוטורים שונים.(A-F) כביקורת מוצגים צמחי Golden Glory שעברו טראנספורמציה עם חיידקי אגרובקטריום מהזן AGLO שהכילו את הקונסטראקט.(G-H) 35S:GUS 31

איור - 12 ניצרונים אדוונטיבים לאחר חודשיים )פאנל עליון( ולאחר 04 חודשים )פאנל תחתון( של Tara לאחר טראנספורמציה עם חיידקי אגרובקטריום מזן AGLO שהכילו את הגנים Del/Ros1 תחת הבקרה של פרומוטורים שונים.(A-F) כביקורת מוצגים צמחי Tara שעברו טראנספורמציה עם חיידקי אגרובקטריום מהזן.(G-H) 35S:GUS המכיל את הקונסטראקט AGLO איור - 17 תפרחות של קווי סולידגו שעברו התמרה עם הגנים Del ו- Ros1 מהזנים Tara Glory )פאנל תחתון(. 31 )פאנל עליון( ו- Golden על מנת לבחון את יעילות הטראנספורמציה של הזנים שעברו התמרה עם הגנים Del/Ros1 נבחנו פרמטרים שונים של יעילות טראנספורמציה. ניתן לראות בטבלה 2 את סיכום הניסוי. על פי התוצאות ניתן לראות שאף על פי שלא היה הבדל מובהק בין מס' הניצרונים לאקספלנט

רגנרטיבי בשני הזנים, כן נראה הבדל ביעילות הטראנספורמציה בין הזנים שעברו התמרה עם הגנים הנ"ל חודש וחצי )כאשר תהליך הסלקציה לא הושלם( והן לאחר 04 חודשים. בזן Golden Glory יעילות הטראנספורמציה נעה בין 9-8% לעומת 1.1-4% בזן Tara )טבלה 0(. זן קונסטראקט pjam-35s אחוז אקספלנטים רגנרטיבים 2±9 ממוצע מס' ניצרונים לאקספלנט רגנרטיבי 0.0±1.09 יעילות טרנספורמציה לאחר חודש וחצי )ב-%( 2±4 יעילות טרנספורמציה לאחר 12 חודשים )ב-%( 9±0 9±4 8±0 1.1 4 4 1±9 3±4 9±0 4±1.2 1±9 0.0±1.11 0±1 0.0±1.0 0.40±1.40 0.0±1.18 1±4 3±4 4±4 4±1.2 0±4 pjam-ap3 pjam-e8 pjam-35s pjam-ap3 pjam-e8 טבלה - 7 סיכום ניסוי תוצאות הטראנספורמציה של זני הסולידגו Tara ו- Glory Golden שעברו התמרה עם חיידקי אגרובקטריום מזן AGLO המכילים את הגנים Del ו- Ros1 לאחר חודש וחצי ולאחר שנה. הערכים הינם ממוצע של שתי חזרות מכל זן. מוצגים ממוצע התוצאות ±שגיאת התקן. Golden Glory Tara איור - 18 תוצרי RT-PCR מ- RNA שהופק מפרחים מקווים שונים של סולידגו מהזנים Golden Glory ו- Tara שעברו התמרה עם חיידקי אגרובקטריום מזן AGLO המכילים את הגנים Del תחת הבקרה של הפרומוטור 35S ו- Ros1 תחת הבקרה של הפרומוטורים 35S,AP3 או,Golden Glory )A(.E8 באריות 0-2 מייצגות: pjam-e8-0 קו ;88 4 - pjam-ap3-4 קו ;010 pjam-e8-0 באריות 0-2 מייצגות:,Tara )B( קו.62 pjam-35s - 9 ;K קו pjam-ap3 קו 999; 9 - pjam-35s קו 31. בארית מס' 2 בשני הזנים מייצגת RNA שהופק מפרחים של צמחי הביקורת המכילים את הגן.GUS הפריימרים בריאקציה תוכננו לאזורים ספציפיים של הגן Del )פאנל עליון(, Ros1 )פאנל אמצעי( או של הגן Actin )פאנל תחתון(. 32

איפיון פיגמנטים בפרחי סולידגו מותמרים 2.1. תכולת אנתוציאנינים בפרחי הסולידגו המותמרים מכיוון שנצפתה הצטברות פיגמנטים בגוון אדום-סגול בפרחים המותמרים עם הקונסטראקט,35S:PAP1 בוצע אפיון כמותי של תכולת כלל האנתוציאנינים בפרחים מהזן של סולידגו Golden Glory לעומת הביקורת שהותמרה עם.GUS הפרחים נאספו בשלב פתיחה מלאה הן של הפרחים החיצוניים והן של הפרחים הפנימיים, כאשר האבקנים ועמודי העלי בפתיחה מלאה. ניתן לראות שבקווים B ו- 01 של סולידגו Golden Glory המותמר עם 35S:PAP1 הייתה עלייה של פי 01 ברמות האנתוציאנינים ובקווים 01 ו- 42 עלייה של פי 01 ברמות האנתוציאנינים לעומת פרחי הביקורת )גרף 4(. 2.2. תכולת קרוטנואידים בפרחי הסולידגו המותמרים נאספו פרחים ממס' קווים של Golden Glory המותמרים עם הקונסטראקט,35S:PAP1 ללא עלי גביע ונמדדה רמת הקרוטנואידים בהשוואה לצמחי ביקורת שהותמרו עם.GUS הפרחים נאספו באותו שלב מסעיף 0.0. ניתן לראות שבקווים 01 42, ו- 01 הייתה ירידה מובהקת של 21%, 91% ו- 41% בהתאמה ברמות הקרוטנואידים בעוד שבקו B לא נראה שהייתה ירידה מובהקת ברמות הקרוטנואידים לעומת פרחי הביקורת )גרף 9(..2 גרף 2 תכולת אנתוציאנינים בפרחי סולידגו מהזן.Golden Glory בליעת האור )Absorbance( של מיצוי עלי הכותרת נמדדה באורכי גל של 091 ו- 102 ננומטר. הערכים מייצגים את בליעת האור עבור 100mg רקמה טרייה. העמודות מייצגות ממוצע של 9 חזרות±שגיאת התקן. כוכביות מעל העמודות מציינות מובהקות סטטיסטית ברמת ביטחון של 30% ומחושבת במבחן t-test שהתבצע בתכנת Excel לעומת הביקורת. 33

גרף 3 תכולת קרוטנואידים בפרחי סולידגו מהזן.Golden Glory בליעת האור )Absorbance( של מיצוי עלי הכותרת נמדדה באורכי גל של 221 ננומטר. הערכים מייצגים את בליעת האור עבור 100mg רקמה טרייה. העמודות מייצגות ממוצע של 9 חזרות בלתי±שגיאת התקן. כוכביות מעל העמודות מציינות מובהקות סטטיסטית ברמת ביטחון של 30% ומחושבת במבחן t-test שהתבצע בתכנת Excel לעומת הביקורת. בדיקת חומרים נדיפים בתפרחות סולידגו טראנסגנים בדיקת רמות החומרים הנדיפים מתפרחות סולידגו מהזן Golden Glory המבטאים ביתר את הגן PAP1 נעשתה על הקווים הטראנסגנים B, 01, 01 ו- 42, ובוצעה באנליזת Headspace בעזרת המכשיר.GC-MS בדיקה זו נעשתה משום שנראה שלפקטור השתוק PAP1 ישנה השפעה חיובית לא רק על מסלול הפנילפרופנואידים אלא גם באופן מפתיע הצליחה להעלות את רמות חומרי הריח הנפלטים מהפרח ממסלול הטרפנואידים )2012 al.,.)zvi et על כן, עשיתי אנליזה כמותית של חומרים נדיפים מקבוצת הבנזנואידים/פנילפרופנואידים על קווים שונים של Golden Glory המכילים את הקונסטראקט.35S:PAP1 בתוצאות שקיבלתי נראה שלא היה הבדל מובהק בחומרים אלו לעומת הביקורת. בחומר Benzaldehyde לא נראה שישנה ירידה או עלייה בחומרי הריח הנדיפים לעומת הביקורת )גרף 4A(, וכמו כן בחומר Methyl benzoate הייתה מגמת ירידה בקו 42 לעומת הביקורת, אך נראה שירידה זו אינה מובהקת )גרף 4B(..2 34

גרף - 2 בדיקת חומרים נדיפים מקבוצת הבנזנואידים שהשתחררו מתפרחות של קווים )27,B(,10,50 טראנסגנים מזן הסולידגו Golden Glory המבטאים ביתר את הגן PAP1 לאורך 24h לעומת צמחי הביקורת המכילים את.GUS החומרים עברו אנליזה כמותית באמצעות מכשיר.GC-MS כל עמודה מייצגת ממוצע של 4 חזרות±שגיאת התקן. כאשר נבדקו חומרים נדיפים מקבוצת הטרפנואידים, ניתן לראות שבקווים 01 ו- 42 הייתה ירידה של פי 4 ופי 4.0 בפליטת המונוטרפן β-ocimene והססקוויטרפן Germacrene D בהתאמה ביחס לביקורת )גרף 5A(. מלבד שני חומרים אלו נרשמה ירידה במס' מונוטרפנים נוספים כגון: -α pinene ירידה של פי 9 ופי 0.2, camphene ירידה של פי 9 ופי 4.4, sabinene ירידה של פי 9.2 ופי 4.0 ובנוסף β-pinene בו נרשמה ירידה של פי 4.8 ופי 4 בקווים 01 ו- 42 בהתאמה. לעומת זאת ניתן לראות כי נרשמה מגמת עלייה, אולם מגמה זו אינה מובהקת, של פי 9 ופי 4.0 בקווים 01 ו- 42 בהתאמה בנגזרות ח. שומן 2-Ethyl-1-hexanol ביחס לביקורת )גרף 5B(. 35

גרף - 2 בדיקת חומרים נדיפים מקבוצת הטרפנואידים שהשתחררו מתפרחות של קווים )27,B(,10,50 טראנסגנים מזן הסולידגו Golden Glory המבטאים ביתר את הגן PAP1 לאורך 24h לעומת צמחי הביקורת המכילים את.GUS החומרים עברו אנליזה כמותית באמצעות מכשיר.GC-MS כל עמודה מייצגת ממוצע של 4 חזרות±שגיאת התקן. כוכביות מעל העמודות מציינות מובהקות סטטיסטית ברמת ביטחון של 30% ומחושבת במבחן t-test שהתבצע בתכנת Excel לעומת הביקורת. 36