مراحل همانندسازي DNA همانندسازي DNA را ميتوان به سه مرحله تقسيم كرد : ۱. مرحله ا غاز phase) :(Initiation شامل شناسايي مبدا همانندسازي تشكيل كمپلكس شروع همانندسازي يا ريپليزوم و اضافه شدن چند نوكلي وتيد اوليه است. ۲. مرحله طويل شدن phase) :(Elongation فرا يند همانندسازي به صورت چرخهاي ادامه پيدا ميكند و نوكلي وتيدها در جهت 5 به 3 اضافه شده پليمريزاسيون رشته پلينوكلي وتيدي ادامه مييابد. ۳. مرحله پايان phase) :(Termination كمپلكس همانندسازي يا ريپليزوم جدا ميشود و سنتز رشتههاي جديد پايان مييابد. اولين قدم در مرحله شروع يا ا خر همانندسازي شناسايي عمل مبدا همانندسازي OriC در باكتري E.coli به وسيله پروتي ين dnaa و ايجاد سوپرهليكس منفي و فرم Z DNA است كه حالت ناپايداري ايجاد كرده و به ناحيه غني از A و T با دو پيوند هيدروژني ضعيف فشار وارد ميكند سپس توسط dnac dnab شناسايي شده و dnab با فعاليت هليكازي دو رشته DNA را كام لا از هم باز ميكند پس از ا ن پروتي ينهاي SSB به رشتههاي منفرد DNA متصل شده و اين رشتهها را از هم باز نگه ميدارند سپس پرايماز و پروتي ينهاي n n, و I به مجموعه اضافه ميشوند تا كمپلكس پرايموزوم در ناحيه چنگال همانندسازي تشكيل شود., n پرايماز RNA ا غازگر را در ابتداي رشته راهنما و ابتداي قطعات اوكازاكي ميسازد و انتهاي OH 3 مورد نياز DNA پليمراز III را فراهم ميكند. دو مولكول DNA پليمراز III و پروتي ين rep به مجموعه اضافه شده و ريپليزوم تشكيل ميشود و از ا نجايي كه همانندسازي دوسويه يا دوجهته است دو ريپليزوم با چهار DNA پليمراز وارد عمل ميشوند. در محل همانندسازي دو رشته DNA شبيه دو شاخه چنگال ميشوند و به همين
دليل به ا ن چنگال همانندسازي يا Replication fork ميگويند. يك DNA پليمراز رشته راهنما را به صورت پيوسته و مداوم و DNA پليمراز ديگر رشته تاخير را به صورت گسسته و با تشكيل قطعات اوكازاكي به طول ١٠٠٠ تا ٢٠٠٠ نوكلي وتيد سنتز ميكند. براي اينكه در هنگام همانندسازي رشته تاخير ا نزيم DNA پليمراز III در هر بار ١٠٠٠ تا ٢٠٠٠ نوكلي وتيد به عقب برنگردد و سرعت عمل ا ن كاهش نيابد رشته تاخير در محل چنگال همانندسازي تا ميخورد به طوري كه در اين محل هر دو رشته راهنما و تاخير در جهت 5 به 3 ) 3 5 ( همانندسازي ميشوند و دو ا نزيم DNA پليمراز III در كنار يكديگر قرار مييگرند و به طور همزمان كار خود را انجام ميدهند. وجود پروتي ين rep جهت هماهنگ كردن سرعت DNA پليمراز III با سرعت باز شدن مارپيچ دورشتهاي DNA ضروري است. همچنين وجود توپوايزومراز I و II براي تنظيم پيچهاي DNA لازم است زيرا پيچهاي DNA به تدريج در جلو فشرده ميشوند و اين فشرده شدن پيچشها مانع پيشرفت كمپلكس همانندسازي در طول مولكول DNA ميشود. DNAپليمراز III نوكلي وتيدها را طبق قانون بازهاي مكمل واتسون كريك (A با T و C با ( G مقابل رشته الگو يا قالب قرار داده و بين ا نها پيوند فسفودياستر برقرار ميكند. تشكيل پيوند فسفودياستر حاصل حمله هستهخواه گروه فسفات نوكلي وتيد وارد شده به عامل OH 3 رشته در حال ساخت ميباشد. در اين مرحله پيروفسفات ا زاد ميشود كه به وسيله ا نزيم پيروفسفاتاز هيدروليز و به دو مولكول فسفات و انرژي تبديل ميشود. انرژي حاصله تامينكننده انرژي مورد نياز براي همانندسازي ميباشد. در اين مرحله يون لازم. دقت عمل ا نزيم DNA پلي استمراز III بسيار بالا است ولي گاهي اشتباهي هم رخ ميدهد 2 Mg + كه اين اشتباه اصلاح ميشود و به ا ن ε به عهده زيرواحد DNA ميگويند. وظيفه اصلي اصلاح Proof reading ا نزيم DNA پليمراز III با خاصيت اگزونوكلي ازي 5 3 است كه باز اشتباه را خارج ميكند و باز صحيح در 3 جاي ا ن قرار ميدهد. عمل اصلاح DNA نيز گاهي دچار اشتباه ميشود كه ميزان اين اشتباه 10 تعيين شده است و چون عمل همانندسازي نيز به ميزان 10 دچار اشتباه ميشود در مجموع برا يند اين دو 4
6 5 10 4 3 خواهد بود و چون ژنوم باكتري E.coli برابر با 10 اشتباه = 10 7 10 است پس در هر بار همانندسازي تقريب ا فقط يك نوكلي وتيد از ژنوم E.coli تغيير ميكند و اين نشاندهنده دقت بسيار بالاي همانندسازي است. همچنين در هنگام همانندسازي RNA ا غازگر قطعات اوكازاكي رشته تاخير توسط DNA ase I پليمراز DNA خارج ميشوند و سپس ا نزيم RN پليمراز I يا H فواصل خالي ايجاد شده را پر ميكند و NAD در پروكاريوتها يا ATP در يوكاريوتها قطعات را به هم متصل + DNA ليگاز با استفاده از كمك گهرمايه ميكند. پس از تكميل همانندسازي مرحله پايان يا خاتمه است. پايان همانندسازي باكتري E.coli در منطقه Termination وسيع ٣٥٠ kb كه شامل هفت جايگاه پاليندرومي ٢٣ جفتبازي موسوم به جايگاههاي پايان ) (Sites انجام ميگيرد. جايگاه پايان در نقطه مقابل جايگاه شروع ) Oric ( قرار دارد. دو چنگال همانندسازي كه از مبدا شروع ميشود و در دو جهت مخالف همديگر حركت ميكنند. چنگال همانندسازي كه در جهت خلاف عقربههاي ساعت حركت ميكند از جايگاههاي پايان B F G و C عبور ميكند و در جايگاههاي پايان D A يا E متوقف ميگردد. از طرفي چنگال همانندسازي كه در جهت عقربههاي ساعت حركت ميكند از جايگاههاي E D و A عبور كرده و در F B C يا G متوقف ميگردد. جايگاههاي پايان همانندسازي قطبي Polar) ( هستند در پايان همانندسازي پروتي يني به نام Tus شركت ميكند كه مونومر با ٣٠٩ اسيد ا مينه است كه به جايگاه پايان متصل ميشود از باز شدن دو رشته DNA توسط هليكاز dnab جلوگيري ميكند. پروتي ين Tus تنها ميتواند چنگال همانندسازي را در يك جهت متوقف كند. در پايان همانندسازي دو كروموزوم حلقوي ايجاد ميشود كه در قسمتي به هم متصل هستند كه به ا ن كاتنان (Catenane) گفته ميشود. سپس به وسيله فعاليت دكاتناسيون Decatenation) ( نوعي ا نزيم توپوايزومراز II به نام توپوايزومراز IV از يكديگر جدا ميشوند. - همانندسازي به روش دايره غلتان: نوع ديگري از همانندسازي در پروكاريوتها ميباشد كه در تكثير بعضي از فاژها و پلاسميدها فاكتور جنسي F باكتريها تزايد ژني ديده ميشود. ابتدا در ناحيه خاص يكي از رشتههاي DNA
حلقوي بريده ميشود سپس 5 انتهايي رشته بريده شده ا زاد باقي ميماند در حالي كه انتهاي OH 3 به عنوان محل اضافه شده نوكلي وتيدها در اختيار ا نزيم DNA پليمراز III قرار ميگيرد. اين ا نزيم شروع به عمل ميكند و به تدريج مكمل رشته داخلي را ميسازد. اين كار با حركت كردن ا نزيم DNA پليمراز III و پروتي ينهاي همراه ا ن ادامه مييابد و رشته راهنما در جهت 5 به 3 ساخته ميشود. - همانندسازي پلاسميد: پلاسميد قطعات DNA حلقوي هستند كه در داخل سيتوپلاسم باكتريها و جدا از كروموزوم ا نها قرار دارند و به طور مستقل تكثير پيدا ميكنند و خصوصيات بسيار مهمي در خنثي نمودن ا نتيبيوتيكها و كاربرد ا نها در مهندسي ژنتيكي دارند. عمل همانندسازي پلاسميد به صورت خاصي انجام ميگيرد. ا نزيم واسرشته كردن DNA را در درون خود انجام ميدهد. در ابتداي همانندسازي پلاسميد RNAاي به وجود ميا يد كه حالت چندحلقهاي يا مولتيلوپ DNA دارد كه به ( Multiloop) تكرشتهاي متصل شده مانند پروتي ين SSB در باكتري عمل ميكند و مانع از اتصال دو رشته DNA در هنگام همانندسازي ميشود. ا نزيم مسي ول پليمريزاسيون و همانندسازي پلاسميد DNA پليمراز I است كه در باكتري نقش ترميمكننده دارد. براي جلوگيري از همزماني نسخهبرداري و همانندسازي پروتي يني به نام ROP كه سركوبگر Repressor of ) RNA RNA نيز ناميده ميشود وجود دارد. اين پروتي ين تترامر با دو مارپيچ ا لفا ميل تركيبي شديدي به ( RNA RNA مولتيلوپ را كه باعث باز باقيماندن دو رشته DNA در هنگام همانندسازي ميشوند به دارد, RNA 2 1. RNA, RNA ايجاد ميگردد و دو رشته واسرشته شده DNA دوباره به يكديگر هم متصل ميكند و هيبريد 1 2 متصل ميشوند و همانندسازي انجام نميگيرد. - همانندسازي ويروسها: ويروسها به دو دسته ويروسهاي DNAدار و ويروسهاي RNAدار تقسيم ميشوند. ويروسهاي DNAدار در سه گروه كلي قرار ميگيرند: Replication ) ۱. ويروسهاي داراي DNA حلقوي تكرشتهاي مانند فاژ φx 174 كه فرم تكثيرشونده يا RF
(Form ايجاد ميكنند. ۲. ويروسهاي داراي DNA خطي دو رشتهاي مانند باكتريوفاژ λ نسخههاي متعددي از ژنوم به صورت متصل به هم ايجاد ميشوند كه به ا ن كنكاتمر (Concatmer) ميگويند سپس ا نزيم نوكلي از ا ن را جدا ميكند. PMS 2 در پسودوموناس. ويروسهاي RNAدار به. ۳ ويروسهاي داراي DNA حلقوي دورشتهاي مانند فاژ گروههاي مختلفي تقسيم ميشوند كه همانندسازي هر كدام خصوصيات خاص خود را دارند. RNA اين ويروسها به صورت RNA مثبت يا منفي ميباشد. RNA مثبت RNA اي است كه به طور مستقيم براي ساخت پروتي ين مورد استفاده قرار ميگيرد ولي RNA منفي نميتواند به عنوان الگوي پروتي ينسازي عمل كند و بايد ابتدا RNA مكمل ا ن ساخته شود. ژنوم اين ويروسها در داخل سلول ميزبان به دو حالت يافت ميشود: RF دورشتهاي متصل به هم كه مكرر از ا ن نسخهبرداري ميشود و به ا ن فرم تكثيرشونده يا RNA. ۱ Form) (Replication ميگويند. Replication. ۲ هنگامي كه از روي RF تكثير صورت ميگيرد به ا ن واسط تكثيرشونده يا ) RI ( Intermediate گفته ميشود. شكل RF نسبت به ا نزيم RNA H كام لا مقاوم است ولي فرم RI به طور ase نسبي مقاوم است. در داخل سلول ابتدا شكل RF ايجاد ميشود به اين صورت كه رشته مكمل رشته RNA مثبت ژنوم فاژ ساخته ميشود سپس اين رشته مكمل كه منفي است به عنوان واسط تكثيرشونده يا RI عمل كرده و شروع به ساختن RNA مثبت ميكند و به اين صورت فاژ تكثير ميشود.