ΤΟ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ Εισαγωγή Το μικροσκόπιο είναιτο σημαντικότερο όργανο των μικροβιολογικών εργαστηρίων. Χρησιμοποιείταιγια την οπτικήπαρατήρησημικροοργανισμώνκαι κυτάρων που λόγω του μεγέθουςτουςδεν είναιδιακριτά μεγυμνό μάτι. Το ανθρώπινομάτιμπορείναπαρατηρήσειαντικείμεναμέχριτουμεγέθους50-200μm (διακριτικόόριοματιού). Aυτόισχύειότανηαπόστασηματιού αντικειμένουείναι περίπου25 cm (απόστασηευκρινούςόρασης). Ηιστορίατουμικροσκοπίουείναιπολύπαλιάκαιείναισυνυφασμένημετην ιστορία της ίδιας της μικροβιολογίας καιγενικότερα της βιολογίας. Τα πρώτα μικροσκόπια κατασκευάστηκαν το 1650 από τους Van Leeuwenhook, Hooke, Malpighi. Τα πιο συνηθισμένα μικροσκόπια που χρησιμοποιούνταιστα ιατρικά εργαστήρια χρησιμοποιούν, για την παρατήρηση των μικροοργανισμών και κυτάρων, δέσμηορατούφωτός. Ταμικροσκόπιααυτάονομάζονταιφωτονικάή οπτικά μικροσκόπια επειδή χρησιμοποιούν για την παρατήρηση των μικροοργανισμώνφωτόνιαορατούφωτός. Μεταμικροσκόπιααυτά μπορούμενα παρατηρήσουμεαντικείμεναμέχριτουμεγέθουςτων0,2μm. Κατάτονδέκατοένατοαιώναοιανάγκεςτηςβιολογίαςκαιτηςιατρικήςγια την οπτική παρατήρηση όλων καιμικρότερων αντικειμένων (μικροοργανίδια κυτάρων, ιών, μακρομορίων) οδήγησαν στην κατασκευή του λεγόμενου ηλεκτρονικού μικροσκοπίου. Σε αντίθεση με το οπτικό μικροσκόπιο, στο ηλεκτρονικόμικροσκόπιοηπαρατήρησητωνμικροαντικειμένωνγίνεταιμετηνχρήση
ηλεκτρονίων. Μετοηλεκτρονικόμικροσκόπιομπορούμεναπαρατηρήσουμεμόρια μέχριτουμεγέθουςτων2 Αngstrem. Περιγραφήφωτονικούμικροσκοπίου 1. Σύστημαπροσοφθάλμιωνφακών. Είναιτοσύστηματωνφακώνστοοποίο τοποθετούμετα μάτια μαςπροκειμένου να μικροσκοπήσουμε. Υπάρχουν μικροσκόπια με ένα προσοφθάλμιο φακό (μονοφθάλμια) ή με δύο (διοφθάλμια). Τασύγχροναοπτικάμικροσκόπιαείναιδιοφθάλμια. Σεαυτή τηνπερίπτωσητοσύστημα τωνδύοπροσοφθάλμιωνφακώνδιαθέτειειδικό κοχλία για την ρύθμιση της απόστασης των φακών ανάλογα με την απόσταση των δύο οφθαλμών του παρατηρητή (διακορική απόσταση). Επιπλέονκάθεφακόςμπορείναρυθμίσειτηνεστίασήτουδιορθώνονταςέτσι την όποια βλάβη οράσεως του παρατηρητή. Η μεγέθυνση των προσοφθάλμιωνφακώνείναιμεγέθους10χ 2. Σύστημα αντικειμενικών φακών. Είναιτο σύστημα των φακών που βρίσκεται πάνω από το προς παρατήρηση αντικείμενο δηλ. το παρασκεύασμα.. Οιαντικειμενικοίφακοίείναιτέσσεριςκαιβρίσκονταιπάνω σεένακυκλικόσύστημαπουμπορείνα εκτελείκυκλικήκίνησηώστενα τοποθετείταιο επιθυμητός φακός πάνω από το παρασκεύασμα. Οι μεγενθύσειςτωντεσσάρωνφακώνείναισυνήθως: 6X, 10X, 45X, 100X. Οι τρείς πρώτοιφακοίονομάζονταιξηροίενώ ο τέταρτος των 100X (καταδυτικός) Οιξηροίφακοίμικροσκοπούναπ ευθείαςτοπαρασκεύασμα ενώ ο καταδυτικός φακός απαιτεί να μεσολαβήσει μεταξύ φακούπαρασκευάσματοςμίασταγόνακεδρελαίου. 3. Οπτικόςσωλήνας. Είναιοσωλήναςπουσυνδέειταδύοσυστήματαφακών καιείναιεξοπλισμένοςμεπρίσματακαικάτοπτρα, για να μεταφέρειτην εικόνα του αντικειμένου από τον αντικειμενικό φακό στους προσοφθάλμιους. 4. Βραχίονας. Αποτελείτονσκελετότουμικροσκοπίου. Χρησιμεύειεπιπλέον γιατηνμεταφοράτουοργάνου. 5. Αντικειμενοφόρος τράπεζα. Βρίσκεταικάτω από τους αντικειμενικούς φακούς καιείναιο μηχανισμός που δέχεταιτο παρασκεύασμα για μικροσκόπηση. Διαθέτειένασύστημαστηρίξεωςτουπαρασκευάσματοςμε τοοποίομπορούμεναμετακινήσουμετοπαρασκεύασμα, ώστενααλλάζειη θέση του οπτικού πεδίου. Με την βοήθεια του μικρομετρικού και μακρομετρικού κοχλία η αντικειμενοφόρος τράπεζα πλησιάζει ή απομακρύνεταιαπότοναντικειμενικόφακόέτσιώστεναεπιτυγχάνουμεήόχι τηνεστίασητουπαρασκευάσματος. 6. Πυκνωτής. Είναιομηχανισμόςπουδέχεταιτοφωςαπότηνφωτεινήπηγή καιτομεταφέρειστοπαρασκεύασμα. Είναικινητόςώστεναπλησιάζεικαινα απομακρύνεται από την τράπεζα του μικροσκοπίου. Ο πυκνωτής χρησιμεύειστηνρύθμισητουεύρουςτηςφωτεινήςδέσμηςμετηνίριδά του. 7. Μικρομετρικός κοχλίας. Μετηνρύθμιση του επιτυγχάνουμεμεμικρές κινήσεις την κίνηση της αντικειμενοφόρου τράπεζας. Μαζί με τον μακρομετρικόκοχλίαχρησιμεύουνγια εύρεσητουοπτικούπεδίου.
8. Μακρομετρικόςκοχλίας. Μετηνρύθμιση τουεπιτυγχάνουμεμεαδρές κινήσειςτηνκίνησητηςαντικειμενοφόρουτράπεζας. Μαζίμετονμικρομετρικό κοχλίαχρησιμεύουνγια εύρεσητουοπτικούπεδίου. 9. Φωτεινήπηγή. Στασύγχροναοπτικάμικροσκόπια τοφωςπαράγεταιμετο ηλεκτρικόρεύμα. Υπολογισμόςμεγέθυνσηςφωτονικούμικροσκοπίου ΗμεγέθυνσητωνκοινώνφωτονικώνμικροσκοπίωνμετριέταισεμονάδεςΧ. ΓιαναυπολογιστείτοσύνολοτωνμονάδωνΧ πολλαπλασιάζουμετηνμεγέθυνση τωνπροσοφθάλμιωνφακών10χμετηνμεγέθυνσητωναντικειμενικώνφακών6χ, 10Χ, 45Χ και100χ. Κατάσυνέπεια η μεγαλύτερη μεγέθυνση του φωτονικού μικροσκοπίουείναι10χ* 100Χ= 1000Χ. Απαραίτητααναλώσιμαυλικάγιατηνμικροσκόπηση 1. Το κεδρέλαιο. Τοκεδρέλαιοείναιένα ειδικό λάδιπουχρησιμοποιείταιστην μικροσκόπηση όταν χρησιμοποιούμε τον καταδυτικό φακό 100Χ. Το όνομα άλλωστετουφακούοφείλεταιστοότιοφακόςθαπρέπεινα καταδυθεί μέσασε μίασταγόνακεδρέλαιου(λέγονταιεπίσηςκαιελαιοκαταδυτικοί). Τοκεδρέλαιοέχει τονίδιοδείκτηδιάθλασηςμετουλικότωνφακώνκαιηπαρεμβολήτουείναι απαραίτητη έτσιώστε όλες οιακτίνες του φωτός που διέρχονταιαπό το παρασκεύασμαναέρχονταιμέσαστονκαταδυτικόφακόχωρίςτηνδιάθλασήτους λόγω τωνμορίωναέρα. Στους ξηρούςφακούςλόγω τηςμεγάληςαπόστασης απότοπαρασκεύασμαηχρήσητουκεδρέλαιουείναιπεριτή. 2. Αντικειμενοφόρος πλάκα. Είναιμία γυάλινη ορθογώνια πλάκα (συνήθως διαστάσεων 7,6 * 2,6 cm). Πάνω σε αυτή τοποθετούμε μία σταγόνα παρασκευάσματος. Η αντικειμενοφόρος πλάκα κατά την μικροσκόπηση τοποθετείταιπάνω στηναντικειμενοφόροτράπεζα. 3. Καλυπτρίδα. Είναιμίαμικρήτετράγωνηγυάλινηπλάκα(συνήθωςδιαστάσεων (1,8 * 1,8 cm). Σήμερα κυκλοφορούν καλυπτρίδες διαφόρων διαστάσεων. Χρησιμεύειγιατηνκάλυψητουπαρασκευάσματοςπάνω στηναντικειμενοφόρο πλάκα. Τοπαρασκεύασμασεαυτήτηνπερίπτωσηείναισευγρήμορφή(π.χ. σταγόναούρωνήεναιώρημαμικροβίων) καιηκαλυπτρίδαχρησιμεύειγιατην συγκράτησητουπαρασκευάσματοςκαιτηνομοιογενοποιησήτου. 4. ΠλάκαNeubauer. Είναιμίαειδικήαντικειμενοφόροςπλάκαπουχρησιμεύειγια την μέτρηση κυτάρων (κυρίως λευκών καιερυθρών). Διαφέρειαπό τις συνηθισμένες«λείες» αντικειμενοφόρεςπλάκεςαπότογεγονόςότιφέρειτην επιφάνεια του ειδικές μικροσκοπικές τετράγωνες χαραγές συγκεκριμένης διαμέτρους μέσασταοποίαμετρώνταιτακύταρα. 5. Σιφώνια Pasteur. Σταγονόμετρα. Διάφορα σκεύη χρησιμεύουν για την τοποθέτησητουπαρασκευάσματοςπάνω στηναντικειμενοφόροπλάκα.
Συντήρησημικροσκοπίου Τομικροσκόπιοείναιεξαιρετικάευαίσθητοόργανογι αυτόκαιαπαιτείιδιαίτερη συντήρηση. Πρέπεινα προφυλάσσεταιαπό τηνσκόνη η οποία είναιιδιαίτερη επιβλαβήςγια το σύστημα των οπτικών του (προσοφθάλμιοικαιαντικειμενικοί φακοί). Ότανδενχρησιμοποιούνταιπρέπεινακαλύπτονταιαπόέναπλαστικό κάλυμμα. Ιδιαίτερα μάλιστα κατά την αποθήκευσή τους θα πρέπει να τοποθετούνταισταειδικά ξύλινακουτιάτους. Ιδιαίτερησυντήρησηθέλειοκαταδυτικόςφακόςοοποίοςκατάτηνχρήσητου λερώνεταιαπότοκεδρέλαιο. Τόσοοκαταδυτικόςφακόςόσοκαιοιυπόλοιποι φακοίκαθαρίζονταιμεξυλόληκαισκουπίζονταιμεειδικάχαρτιά (π.χ. χαρτιά Whatman). Ο καθαρισμόςτωνφακώνπρέπειναγίνεταιτόσοπρινόσοκαιμετάτην μικροσκόπηση. Προσοχή: Στην περίπτωση που μικροσκοπούμε μολυσματικά παρασκευάσματαθαπρέπεινααπολυμαίνουμετοόργανομετάαπότηνχρήσητου. Σεαυτήτηνπερίπτωσηθα πρέπεικαθ όλητηνδιάρκειατηςμικροσκόπησηςνα φοράμεπροστατευτικά γάντια. Επιπλέονθαπρέπειναπροσέξουμεταακόλουθα:.Ναμηνακουμπάμεποτέτουςφακούςτουμικροσκοπίουμεταδάκτυλα μας(οιφακοίλιπαίνονταιαπότοδέρματωνδακτύλωνμας). Δενπρέπεινατους σκουπίζουμεμεοποιαδήποτεχαρτιά(τραυματίζεταιανεπανόρθωταηεπιφάνεια τωνφακών) παράμόνομε ειδικόδιηθητικόχαρτίγια φακούς. Κατά την μικροσκόπηση προσέχουμε να μην τραυματίζουμε τους αντικειμενικούςφακούςκατάτηνκίνησητηςαντικειμενοφόρουπλάκαςπροςτα πάνω. Μετά το τέλος της μικροσκόπησης στρέφουμε το σύστημα των αντικειμενικώνφακώνώστεοιφακοίνααπομακρυνθούναπότηναντικειμενοφόρο τράπεζα. Επίσηςστρέφουμετοσύστηματωνπροσοφθάλμιωνφακώνπροςτην αντίθετηπλευρά. Κατάτηνμετακίνησήτουςταμικροσκόπιαθαπρέπειναπιάνονταιαπό τονπλαϊνόβραχίονακαιτηνβάσητουςχρησιμοποιώνταςκαιταδύοχέρια. Σεκαμία περίπτωσηδενπρέπεινατασηκώνουμεκρατώνταςτααπόταοπτικάτουςμέρη. Χρήσηφωτονικούμικροσκοπίου 1. Τοποθετούμετομικροσκόπιοσεένασταθερότραπέζι. Ρυθμίζουμετούψος τουκαθίσματόςμαςέτσιώστεταμάτιαμαςναφτάνουνμεάνεσηστούψοςτων φακών. 2. Ρυθμίζουμε την εστίαση των προσοφθάλμιων φακών έτσιώστε να προσαρμοστούν στην όραση μας. Ρυθμίζουμε την απόσταση των δύο
προσοφθάλμιωνφακώνώστενασυμφωνείμετηναπόστασητωνδύοματιών μας. Σταδιοφθάλμιαμικροσκόπιαμικροσκοπούμεπάντοτεμεταδύομάτια. 3. Τοποθετούμετο παρασκεύασμα στηναντικειμενοφόρο πλάκα. Ανείναι υγρό το καλύπτουμε με μία καλυπτρίδα. Τα παρασκευάσματα που χρησιμοποιούνταιστηνμικροσκόπησησυνήθωςείναιχρωματισμέναμεειδικές κυταρικέςχρωστικέςέτσιώστεναείναιευδιάκριτα τόσοτοπερίγραμμαόσοκαι ταοργανίδιατους. 4. Διαλέγουμεκαιτοποθετούμεέναμικρόαντικειμενικόφακό6Χή10Χ. 5. Κατεβάζουμετηναντικειμενοφόροτράπεζαχαμηλάχρησιμοποιώνταςτον μακρομετρικόκοχλία. 6. Αρχίζουμενα μικροσκοπούμε. Κατά τηνμικροσκόπηση προσπαθούμενα βρούμε οπτικόπεδίο. Οπτικόπεδίοονομάζουμετηνευδιάκριτηεικόνατων μικροοργανισμώνκαιτωνκυττάρωντουπαρασκευάσματοςμας. Αποτελεί τηνβασική επιδίωξη τηςμικροσκόπησης. Για να βρούμετο οπτικό πεδίο γυρνάμετονμακρομετρικόκοχλίασηκώνονταςσιγά-σιγάτηναντικειμενοφόρο τράπεζαπροςτούψοςτωναντικειμενοφόρωνφακών. 7. Μόλις δούμε την πρώτη έστω και θολή εικόνα του παρασκευάσματος σταματάμετηνχρήσητουμακρομετρικούκοχλία. Απότοσημείοαυτόαρχίζουμε ναστρέφουμετονμικρομετρικόκοχλίαέτσιώστεναβρούμε οπτικόπεδίο δηλ. ευδιάκριτηεικόνα. 8. Μόλιςβρούμεοπτικόπεδίοαλλάζουμεαντικειμενικόφακόκαιβάζουμετον αμέσωςμεγαλύτερο45χ. Γυρίζουμετονμικρομετρικόκοχλίαγιαναβρούμε πάλιοπτικόπεδίο. 9. Ανδενμαςικανοποιείαυτήημεγέθυνση(10Χ * 45Χ= 450Χ) τοποθετούμε τονκαταδυτικόφακό(100χ). Σεαυτήτηνπερίπτωσηπρινμικροσκοπίσουμε, τοποθετούμεπάνω στοπαρασκεύασμαμαςμίασταγόνακεδρέλαιου. 10. Βυθίζουμε τον καταδυτικό φακό μέσα στο κεδρέλαιο του παρασκευάσματος καιμικροσκοπούμε. Βρίσκουμε πάλιοπτικό πεδίο γυρνώνταςτονμικρομετρικόκοχλία. Γυρνάμετονμικρομετρικόκοχλίαπολύσιγά προσέχοντας να μην τραυματίσουμε τον καταδυτικό φακό με την αντικειμενοφόροπλάκα.