ΓΕΩΡΓΙΑ Ε. ΧΡΙΣΤΟΠΟΥΛΟΥ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ESSEX ΚΑΤΟΧΟΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ (MSc): ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ESSEX ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΙ ΚΑΙ ΙΣΤΟΠΑΘΟΛΟΓΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΕΚΤΙΜΗΣΗΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΥΓΧΡΟΝΩΝ ΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΕΩΝ ΟΣΤΕΟΠΟΡΩΣΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ» ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: Καθηγητής Ι. ΒΑΡΑΚΗΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΑΤΡΑ 2007
ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Η. Παναγιωτόπουλος: Επιβλέπων Καθηγητής, Καθηγητής Ορθοπαιδικής Πανεπιστημίου Πατρών Ι. Βαράκης: Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής, Καθηγητής Ανατομικής Πανεπιστημίου Πατρών Μ. Ασημακοπούλου: Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής, Επίκουρη Καθηγήτρια Ανατομικής Πανεπιστημίου Πατρών ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Η. Παναγιωτόπουλος: Επιβλέπων Καθηγητής, Καθηγητής Ορθοπαιδικής Πανεπιστημίου Πατρών Ι. Βαράκης: Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής, Καθηγητής Ανατομικής Πανεπιστημίου Πατρών Μ. Ασημακοπούλου: Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής, Επίκουρη Καθηγήτρια Ανατομικής Πανεπιστημίου Πατρών Η. Λαμπίρης: Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής, Καθηγητής Ορθοπαιδικής Πανεπιστημίου Πατρών Ν. Καραμάνος: Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής, Καθηγητής Τμήματος Χημείας Πανεπιστημίου Πατρών Ε. Παπαδάκη-Πέτρου: Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ανατομικής Πανεπιστημίου Πατρών Σ. Παντελιού: Μέλος Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήματος Μηχανολόγων-Μηχανικών και Αεροναυπηγών Πανεπιστημίου Πατρών
... για τη Χριστίνα, τον άγγελό μου.
Σημείωμα Συγγραφέα... τούτη η σελίδα, ίσως να ναι η πιο σημαντική αυτής της διατριβής, διότι καταθέτω την ψυχή μου ως ένα ευχαριστώ για όλους τους σημαντικούς ανθρώπους που είχα την τύχη να γνωρίσω στο πέρασμα των τελευταίων τεσσάρων ετών. Και πρώτα απ όλους, τον καθηγητή μου κ ο Ηλία Παναγιωτόπουλο, του οποίου η ψυχική ευγένεια και γαλήνη με έκανε καλύτερο άνθρωπο. Μου δίδαξε πως μόνο με υπομονή και ηρεμία μπορεί κανείς να προοδεύσει στην έρευνα, αλλά και στη ζωή!!! Τον καθηγητή μου κ ο Ιωάννη Βαράκη, του οποίου η παρουσία ήταν μόνιμα αισθητή δίπλα μου, να με καθοδηγεί και να φωτίζει το δρόμο μου στα εύκολα και στα δύσκολα. Την επίκουρη καθηγήτρια κ α Μάρθα Ασημακοπούλου, η οποία με αγκάλιασε με φιλική διάθεση μέσα στο εργαστήριο Ανατομικής, καθώς και την αναπληρώτρια καθηγήτρια κ α Ελένη Παπαδάκη που με υπομονή κι επιμονή στάθηκε κοντά μου σε όποια δυσκολία προέκυπτε στο χώρο του εργαστηρίου. Τη συνάδελφό μου, βιολόγο, Νατάσα Σταυροπούλου, με την οποία μοιράστηκα αμέτρητες ώρες εργαστηριακής δουλειάς, αντιξοότητες και προβλήματα, που όμως, χάρη στο χιούμορ και το ανεξάντλητο χαμόγελό της, πέρασαν ανώδυνα και διασκεδαστικά. Τον συνάδελφό μου και, πλέον, αγαπημένο μου φίλο, μηχανολόγο μηχανικό Γιώργο Αναστασόπουλο, για την πολύτιμη βοήθεια και υποστήριξή του σε όλες τις φάσεις αυτής της έρευνητικής μελέτης αλλά, κυρίως, για τη γνήσια αγάπη και φιλία που μου χάρισε. Πολλά ευχαριστώ στον καθηγητή κ ο Νίκο Καραμάνο, για την προθυμία του να με βοηθήσει όποτε και όπου τον χρειαζόμουν. Ασυγχώρητη παράληψή μου θα ήταν αν δεν αναφερόμουν στην αναπληρώτρια καθηγήτρια και υπεύθυνη του ερευνητικού αυτού προγράμματος κ α Σοφία Παντελιού. Εδώ οι λέξεις περιττεύουν... Ένας άνθρωπος, μια γυναίκα, μια επιστήμονας που με δίδαξε πως, ό,τι κι αν επιβάλλει ο νόμος του Murphy, εμείς έχουμε υποχρέωση απέναντι στον εαυτό μας και τα θέλω μας να συνεχίζουμε τον αγώνα μας, πάντα με το κεφάλι ψηλά.
Για το τέλος άφησα τη μητέρα μου. Ένα ανθρώπινο αμορτισέρ που λειτουργούσε πάντα αποσυμπιεστικά και κατευναστικά απέναντι στα πάθη μου και μου θύμιζε πως τα αγαθά κόποις κτώνται. Ήταν τύχη και συνάμα τιμή για μένα να γνωρίσω σε τόσο μικρό χρονικό διάστημα τόσους πολλούς και σημαντικούς ανθρώπους. Σας ευχαριστώ... Τζίνα Ε. Χριστοπούλου Η διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στα πλαίσια του ερευνητικού προγράμματος ΠΕΝΕΔ 2001 ΕΔ 377, με επιδότηση της Γενικής Γραμματείας Έρευνας και Τεχνολογίας, Υπουργείο Ανάπτυξης, Πρόγραμμα ΕΠΑΝ.
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 1.i Οστίτης Ιστός Κυτταρική Δομή 2 1.ii Κυτταρική Βιολογία Οστεοβλαστών και Οστεοκλαστών 3 1.ii 1 Προέλευση και Κύκλος Ζωής Οστεοβλαστών 3 1.ii 2 Λειτουργίες Οστεοβλαστών 5 1.ii 3 Προέλευση και Κύκλος Ζωής Οστεοκλαστών 8 1.ii 4 Λειτουργίες Οστεοκλαστών 9 1.iii Ανακατασκευή του Οστού (Bone Remodeling) 11 1.iv Οστεοπόρωση 13 1.iv 1 Γενικά 13 1.iv 2 Μετεμμηνοπαυσιακή Οστεοπόρωση 14 1.v Διαγνωστικά Μέσα Οστεοπόρωσης 15 1.v 1 Γενικά 15 1.v 2 Peripheral Quantitative Computerized Tomography (pqct) 17 1.v 3 Modal Damping Factor (MDF) 18 1.vi Βιοχημικοί Δείκτες Μεταβολισμού του Οστού 19 1.vi 1 Βιοχημικοί Δείκτες Παραγωγής Οστού 21 1.vi 2 Βιοχημικοί Δείκτες Απορρόφησης Οστού 23 1.vii Θεραπευτικές Προσεγγίσεις Οστεοπόρωσης 24 1.vii 1 Γενικά 24 1.vii 2 Διφωσφονικά Αλενδρονάτη 26 1.viii Στατίνες και Οστεοπόρωση 27 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 31 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 33 2.Α ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΠΛΑΝΟ 34 2.Β ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 36 2.Βi Μέτρηση Βιοχημικών Δεικτών με Ανοσοενζυμική Μέθοδο ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 36 2.Bi 1 Μέτρηση Επιπέδων NTx 38 2.Bi 2 Μέτρηση Επιπέδων Οσετοκαλσίνης 41 2.Βii Οστική Πυκνομετρία με τη Μέθοδο pqct 44 2.Biii Μέτρηση Συντελεστή Εσωτερικής Απόσβεσης (MDF) 47 2.Biv Παρασκευή Τομών Κνήμης σε Παραφίνη 48
2.Βv Ιστολογική Mελέτη Tομών Παραφίνης με Χρώση Αιματοξυλίνης Ηωσίνης 50 2.Βvi Παρασκευή Τομών Κνήμης σε Πλαστικό (μεθυλ-μεθακρυλικό) 52 2.Βvii Ιστομορφομετρική Ανάλυση Τομών Κνήμης σε Πλαστικό 54 2.Bviii Ανοσοϊστοχημική Μελέτη Τομών Κνήμης ως προς την Έκφραση της BMP-2 και του Αποπτωτικού Παράγοντα Fas 56 2.Bviii 1 Ανοσοϊστοχημική Εντόπιση της Bone Morphogenetic Protein 2 59 2.Bviii 2 Ανοσοϊστοχημική Εντόπιση του Αποπτωτικού Παράγοντα Fas 61 2.Bix Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήγματα πολυακρυλαμιδίου παρουσία SDS (SDS PAGE) 63 2.Bix 1 Προετοιμασία δειγμάτων 63 2.Bix 2 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών (SDS PAGE) 63 2.Bix 3 Βαφή πηγμάτων με χρωστική Coomassie Blue R-250 68 2.Bix 4 Ανοσοαποτύπωση πρωτεϊνών κατά Western (Western Blotting) 69 2.Βx Στατιστική Επεξεργασία Αποτελεσμάτων 72 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 73 3.i Μέτρηση Επιπέδων Βιοχημικών Δεικτών NTx και Οστεοκαλσίνης 74 3.ii Οστική Πυκνομετρία με το μέθοδο pqct 80 3.iii Mετρήσεις Συντελεστή Εσωτερικής Απόσβεσης (MDF) 86 3.iv Ιστολογικά Ευρήματα Τομών Κνήμης σε Παραφίνη 92 3.v Ιστομορφομετρία σε τομές μεθυλ-μεθακρυλικού 95 3.vi Aνοσοϊστοχημικά Ευρήματα ως προς την Έκφραση της Οστεομορφογενετικής Πρωτεΐνης BMP-2 και του Αποπτωτικού Παράγοντα Fas 98 3.vii Ανοσοαποτύπωση κατά Western Πρωτεϊνών BMP-2 και Fas 106 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΣΥΖΗΤΗΣΗ 109 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 131 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 134 SUMMARY 138 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 142 ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΣΕ ΣΥΝΕΔΡΙΑ 158 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 162
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 1 - ΕΙΣΑΓΩΓΗ
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 2-1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.i Οστίτης Ιστός Κυτταρική Δομή Ο οστίτης ιστός είναι ένας εξειδικευμένος συνδετικός ιστός, που αποτελείται από ασβεστοποιημένη μεσοκυττάρια ουσία, την οστική μητρική ή θεμέλια ουσία, και πέντε διαφορετικά είδη κυττάρων, τα οστεοπρογονικά, τους οστεοβλάστες, τα οστεοκύτταρα, τους οστεοκλάστες και τα επενδυτικά οστικά κύτταρα (lining cells) ή οστεοβλάστες εν ηρεμία ή οστεοβλάστες επιφανείας. Τα οστεοπρογονικά κύτταρα αποτελούν πολυδύναμα μεσεγχυματικά κύτταρα (stem cells) κι εντοπίζονται στις οστικές επιφάνειες. Οι οστεοβλάστες, οι οποίοι επίσης εντοπίζονται στις οστικές επιφάνειες, είναι τα αρμόδια κύτταρα για τη σύνθεση των πρωτεϊνών της μητρικής ουσίας και την ασβεστοποίησή της (Junqueira et al, 1991). Τα οστεοκύτταρα, τα πιο πολυάριθμα κύτταρα του οστίτη ιστού (700-900/mm 3 ) βρίσκονται σε κοιλότητες (lacunae) μέσα στην ασβεστοποιημένη μητρική ουσία, ενώ επικοινωνούν μεταξύ τους μέσω οστικών σωληναρίων, χασματοσυνδέσεων, καθώς και με τις αποφυάδες που διαθέτουν (Junqueira et al, 1991). Οι οστεοκλάστες προέρχονται από προγονικά κύτταρα του αιμοποιητικού ιστού, ενώ διαφοροποιούνται και ωριμάζουν σε πολυπύρηνα γιγαντοκύτταρα, εντοπισμένα στα βοθρία οστικής απορρόφησης (βοθρία του Howship) με λειτουργικό ρόλο την απορρόφηση του οστού (Junqueira et al, 1991).
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 3 - Τέλος, τα επενδυτικά οστικά κύτταρα (lining cells) προέρχονται από οστεοβλάστες που έπαψαν να είναι ενεργοί και που, όμως, δεν εγκλωβίστηκαν σε οστεοειδές (νεοσχηματισμένη θεμέλια ουσία που δεν έχει ασβεστοποιηθεί) για να μετατραπούν σε οστεοκύτταρα. Τα επενδυτικά οστικά κύτταρα είναι αποπλατυσμένα στη μορφολογία τους, ενώ διαθέτουν μειωμένο αριθμό κυτταροπλασματικών οργανιδίων. Καλύπτουν μεγάλη έκταση των οστικών επιφανειών, προστατεύοντας τις, έτσι, από την αποικοδομητική δράση των οστεοκλαστών (Junqueira et al, 1991). 1.ii Κυτταρική Βιολογία Οστεοβλαστών και Οστεοκλαστών Τα πιο ενεργά κύτταρα του οστίτη ιστού είναι οι οστεοβλάστες και οι οστεοκλάστες, υπεύθυνοι για την παραγωγή και την απορρόφηση του οστού, αντίστοιχα. 1. ii 1 Προέλευση και Κύκλος Ζωής Οστεοβλαστών Ο απώτερος πρόγονος του οστεοβλάστη είναι το πολυδύναμο, αρχέγονο μεσεγχυματικό κύτταρο (stem cell), που εκτός από τη μεγάλη αναγεννητική του ικανότητα, μπορεί εν δυνάμει να διαφοροποιηθεί προς την κατεύθυνση άλλων κυτταρικών σειρών. Το πρώτο στάδιο στη διαφοροποίηση του stem cell προς τη σειρά των οστεοπαραγωγών κυττάρων είναι το επαγώγιμο οστεοπρογονικό κύτταρο (osteoprogenitor), δηλαδή το κύτταρο που δεν έχει ακόμα τελεσίδικα προκαθορισθεί ότι θα ακολουθήσει την κατεύθυνση διαφοροποίησης προς οστεοβλάστη, αλλά που σε κατάλληλο περιβάλλον,όπως επαφή με μη τιτανωμένο οστό, ακολουθεί αυτή την οδό διαφοροποίησης.
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 4 - Η ύπαρξη τέτοιων επαγώγιμων οστεοπρογονικών κυττάρων πιστεύεται ότι εξηγεί την έκτοπη παραγωγή οστίτη ιστού σε εξωσκελετικούς ιστούς (Ducy et al, 2000). Το επόμενο στάδιο διαφοροποίησης είναι ο προ-οστεοβλάστης, ο οποίος είναι προκαθορισμένος να εξελιχθεί σε οστεοβλάστη. Οι προοστεοβλάστες έχουν ικανότητα κυτταρικής διαίρεσης, η οποία όμως μειώνεται καθώς τα κύτταρα διαφοροποιούνται περαιτέρω. Οι οστεοβλάστες δεν έχουν δυνατότητα διαίρεσης. Μικρό ποσοστό οστεοβλαστών εγκλωβίζεται σε τιτανωμένη μητρική ουσία και μετατρέπεται σε οστεοκύτταρα. Θεωρείται πως πολλοί οστεοβλάστες παραμένουν ανενεργοί στις οστικές επιφάνειες ως επενδυτικά κύτταρα. Ο κύκλος ζωής των οστεοβλαστών συνοψίζεται στην Εικόνα 1.1 (Goltzman, 2002). Εικόνα 1.1. Ο κύκλος ζωής του οστεοβλάστη (Goltzman, 2002)
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 5 - Σε γενετικό επίπεδο, η διαφοροποίηση των οστεοβλαστών είναι μια διαδικασία που γίνεται βαθμιαία (Ducy & Karsenty, 1998). Κατά τον κύκλο της ζωής του ο οστεοβλάστης εκφράζει όλα τα γονίδια που είναι απαραίτητα για την παραγωγή οστίτη ιστού, αλλά όχι συγχρόνως. Αρχικά, εκφράζονται γονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, καθώς και γονίδια που αφορούν στη σύνθεση πρωτεϊνών της μητρικής ουσίας (κολλαγόνο και μη κολλαγόνες πρωτείνες). Ακολουθεί η έκφραση γονιδίων που σχετίζεται με την ωρίμανση του οστεοειδούς και, τέλος, εκφράζονται γονίδια υπεύθυνα για την τιτάνωση (π.χ. οστεοκαλσίνη). 1. ii 2 Λειτουργίες Οστεοβλαστών Οι λειτουργίες των οστεοβλαστών χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: α) την παραγωγή δομικών συστατικών του οστίτη ιστού και β) την παραγωγή ρυθμιστικών παραγόντων κι ενζύμων που επηρεάζουν την παραγωγή και απορρόφηση του οστού (Aubin, 1998). Στην πρώτη κατηγορία εντοπίζεται η παραγωγή δομικών πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας, με κυριότερη το κολλαγόνο τύπου Ι που αποτελεί το κύριο συστατικό του οστεοειδούς. Επιπλέον, οι οστεοβλάστες συμμετέχουν στην ασβεστοποίηση της εξωκυττάριας ουσίας, μέσω κυρίως της παραγωγής και δράσης της αλκαλικής φωσφατάσης. Το ένζυμο αυτό εντοπίζεται στην κυτταροπλασματική μεμβράνη των οστεοβλαστών και σχετίζεται με τον σχηματισμό νέου οστίτη ιστού, αν και ο ακριβής μηχανισμός δράσης δεν έχει αποσαφηνισθεί πλήρως.
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 6 - Η οστεοκαλσίνη, εξ άλλου, είναι μια ακόμα μη κολλαγόνα πρωτεΐνη, η οποία παράγεται από τους οστεοβλάστες κατά τη διάρκεια της φάσης ασβεστοποίησης του οστού. Στη δεύτερη κατηγορία λειτουργιών του οστεοβλάστη εμπεριέχεται η παραγωγή αυξητικών παραγόντων, κυττοκινών και ενζύμων, απαραίτητων για το σχηματισμό και την απορρόφηση του οστού. Οι οστεοβλάστες παράγουν αυξητικούς παράγοντες οι οποίοι εναποτίθενται και παραμένουν δεσμευμένοι στη θεμέλια ουσία του οστίτη ιστού. Σε μεταγενέστερο χρόνο, κι αφού με τη δράση των οστεοκλαστών γίνει απορρόφηση οστού, οι δεσμευμένοι αυξητικοί παράγοντες απελευθερώνονται, προάγοντας τον πολλαπλασιασμό οστεοπρογονικών κυττάρων κι επάγοντας τη διαφοροποίησή τους σε οστεοβλάστες. Μερικοί από αυτούς τους αυξητικούς παράγοντες είναι οι παρακάτω: Insulin-like Growth Factor (IGF), Transforming Growth Factor (TGF), Fibroblast Growth Factor (FGF) και Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) (Aubin, 2001). Εξ άλλου, οι οστεοβλάστες συμμετέχουν με έμμεσο τρόπο στην απορρόφηση του οστού. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της παραγωγής κυττοκινών από τους οστεοβλάστες, οι οποίες επενεργούν πάνω στους οστεοκλάστες, προκαλώντας την ενεργοποίησή τους και, τελικά, την απορρόφηση οστού. Η αλληλένδετη σχέση οστεοβλαστών οστεοκλαστών περιγράφεται στην Εικόνα 1.2 (Goltzman, 2002).
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 7 - Εικόνα 1.2. Διαδραστική σχέση οστεοβλαστών οστεοκλαστών. Κύκλος ζωής οστεοκλαστών (Goltzman, 2002)
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 8-1. ii 3 Προέλευση και Κύκλος Ζωής Οστεοκλαστών Τα κύτταρα προέλευσης των οστεοκλαστών είναι τα αρχέγονα, πολυδύναμα κύτταρα του μυελού των οστών (stem cells) (Parfitt, 1998). Τα κύτταρα αυτά, υπό την επίδραση κυττοκινών κι άλλων μοριακών παραγόντων, πολλαπλασιάζονται, διαφοροποιούνται και συγχωνεύονται, σχηματίζοντας πολυπύρηνα κύτταρα (οστεοκλάστες) που προσφύονται στην επιφάνεια του οστού, απορροφούν οστέινη ουσία και, τελικά, αποπίπτουν (Εικόνα 1.2). Πιο αναλυτικά, τα stem cells, υπό την επίδραση του Osteoclast Differentiation Factor (ODF) και του Monocyte Colony Stimulating Factor (MCSF), πολλαπλασιάζονται και δεσμεύονται (commited cells) στην κατεύθυνση διαφοροποίησης προς οστεοκλάστη, παράγοντας, έτσι, μονοπύρηνα κύτταρα, προγόνους οστεοκλαστών. Ακολούθως, τα μονοπύρηνα αυτά κύτταρα συγχωνεύονται υπό την επίδραση της παραθορμόνης (PTH) και της 1,25 δι-υδρόξυ Βιταμίνης D (1,25 D 3 ), καθώς και από την επίδραση κυττοκινών, όπως η ιντερλευκίνη 1 (IL-1), δίνοντας ανώριμους οστεοκλάστες (Roodman, 1999). Εφ όσον οι ανώριμοι οστεοκλάστες βρεθούν σε οστική επιφάνεια, γυμνή απο επενδυτικά κύτταρα (lining cells), υφίστανται περετέρω διαφοροποίηση, σχηματίζουν πτυχωτή παρυφή και προσφύονται στο οστό για να πραγματοποιηθεί η απορρόφησή του. Όπως αναφέρθηκε και νωρίτερα, χημικά ερεθίσματα για την ενεργοποίησή τους λαμβάνουν και από τους οστεοβλάστες.
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 9-1. ii 4 Λειτουργίες Οστεοκλαστών Από τη στιγμή που τα επενδυτικά κύτταρα (υπό την επίδραση παραγόντων που προάγουν την οστική απορρόφηση) συνέλκονται, ο οστεοκλάστης προσφύεται μέσω της πτυχωτής του παρυφής στην οστική επιφάνεια. Η προσκόλληση του οστεοκλάστη στην οστική επιφάνεια επιτυγχάνεται μέσω της πρόσδεσης ειδικών ιντεγκρινών, που εκφράζονται στην κυτταρική μεμβράνη της πτυχωτής παρυφής, με μη κολλαγόνες γλυκοπρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας (π.χ. οστεοποντίνη). Το επόμενο στάδιο είναι η παραγωγή κι έκλυση υδρογονοκατιόντων Η + και λυσοσωμιακών ενζύμων μέσα στο βοθρίο που σχηματίζεται ανάμεσα στον οστεοκλάστη και την οστική επιφάνεια (βοθρίο οστικής απορρόφησης ή βοθρίο του Howship). Η παραγωγή Η + καταλύεται από τη δράση του ενζύμου καρβονική ανυδράση, ενώ η απελευθέρωσή τους στο βοθρίο πραγματοποιείται μέσω αντλίας πρωτονίων που εντοπίζεται στην πλασματική μεμβράνη της πτυχωτής παρυφής. Το όξινο ph διαλύει τους κρυστάλλους υδροξυαπατίτη, ενώ καθεψίνες και μεταλλοπρωτεϊνάσες αποδομούν τα οργανικά στοιχεία της οστικής ουσίας κι ενεργοποιούν κολλαγενάσες που βρίσκονται σε λανθάνουσα κατάσταση στη θεμέλια ουσία. Τελικό αποτέλεσμα είναι η διάσπαση του κολλαγόνου από τις κολλαγενάσες και η αποικοδόμηση του οστού (Teitelbaum, 2000). Η Εικόνα 1.3 (Goltzman, 2002) αποτελεί σχηματική περιγραφή των παραπάνω διαδικασιών.
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 10 - Εικόνα 1.3. Οστική απορρόφηση από οστεοκλάστη (Goltzman, 2002)
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 11-1.iii Ανακατασκευή του Οστού (Bone Remodeling) Μετά τη βρεφική ηλικία, ο πρωτογενής οστίτης ιστός που έχει ήδη διαπλασθεί, αντικαθίσταται από δευτερογενή οστίτη ιστό. Αυτή η διαδικασία της αντικατάστασης προϋπάρχοντος οστού από νεοσχηματισμένο οστίτη ιστό ονομάζεται ανακατασκευή (ανάπλαση) και επιτελείται με τη διαδοχική ενεργοποίηση των μηχανισμών απορρόφησης και παραγωγής οστίτη ιστού, δηλαδή, με την αρμονική και ισορροπημένη δράση οστεοκλαστών και οστεοβλαστών. Ως ζεύξη (coupling) ορίζεται η διαδικασία διαφοροποίησης των προ-οστεοβλαστών σε ώριμους οστεοβλάστες, ως αποτέλεσμα ενεργοποίησής τους από αυξητικούς παράγοντες και κυττοκίνες που ελευθερώνονται κατά την οστεοκλαστική οστική απορρόφηση (Parfitt, 2000). Η ανακατασκευή του οστού (bone remodeling) συνεχίζει καθ όλη τη διάρκεια της ζωής για τη διατήρηση και την υγιή κατάσταση του οστού (Εικόνα 1.4). Η διαδοχή των κυτταρικών δραστηριοτήτων κατά τη διαδικασία της ανάπλασης είναι συγκεκριμένη και περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια: α) ενεργοποίηση τοπικών και μεταφερόμενων με το αίμα προγονικών κυττάρων των οστεοκλαστών β) απορρόφηση οστού γ) ενεργοποίηση νεοπαραχθέντων οστεοβλαστών δ) παραγωγή νέου οστού Η διαδοχή αυτή είναι αυστηρώς ελεγχόμενη από τοπικά παραγόμενους (αυτοκρινείς ή παρακρινείς) ή μεταφερόμενους παράγοντες (Filvaroff & Derynck, 1998).
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 12 - Σε παθολογικές καταστάσεις, όπου διαταράσσεται το ισοζύγιο οστεοβλαστικής οστεοκλαστικής λειτουργίας και η οστική απορρόφηση δεν ακολουθείται από αντίστοιχη οστική παραγωγή, επέρχεται ως άμεση συνέπεια η σημαντική ελάττωση της οστικής πυκνότητας. Παράδειγμα μιας τέτοιας παθολογικής κατάστασης αποτελεί η μετεμμηνοπαυσιακή οστεοπόρωση. Εικόνα 1.4. Σχηματική αναπαράσταση του κύκλου απορρόφησης και παραγωγής του οστού υπό φυσιολογικές συνθήκες. Bone Remodeling. (Gunta, 2002)
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 13-1.iv Οστεοπόρωση 1. iv 1 Γενικά Η οστεοπόρωση αποτελεί μια μεταβολική νόσο των οστών, η οποία χαρακτηρίζεται από ελάττωση της μάζας του οστού και συνακόλουθη αλλαγή της μικροαρχιτεκτονικής του (Tannirandorn & Epstein, 2000). Επιδημιολογικά, η οστεοπόρωση φαίνεται να είναι η πιο συχνή πάθηση των οστών. Δέκα εκατομμύρια άνθρωποι στις Ηνωμένες Πολιτείες πάσχουν από οστεοπόρωση ισχίου, ενώ περίπου 18 εκατομμύρια εμφανίζουν οστεοπενία στο ισχίο (Inzerillo & Zaidi, 2002). Τα κατάγματα που προκαλούνται από οστεοπόρωση ξεπερνούν το 1,5 εκατομμύριο ανά έτος, ενώ υπολογίζεται πως μία στις δύο γυναίκες και ένας στους οχτώ άνδρες άνω των 50 ετών υφίστανται οστεοποροτικό κάταγμα. Χαρακτηριστικό είναι το γεγονός ότι χαμηλή οστική μάζα παρατηρείται συχνότερα στους Καυκάσειους πληθυσμούς, παρά στους πληθυσμούς αφρικανικών φυλών. Υπάρχουν δύο κύριες κατηγορίες οστεοπόρωσης, η πρωτογενής και η δευτερογενής οστεοπόρωση. Στην πρωτογενή οστεοπόρωση συμπεριλαμβάνεται η μετεμμηνοπαυσιακή οστεοπόρωση (high-turnover osteoporosis), καθώς και η γηραντική οστεοπόρωση (low-turnover osteoporosis). Ως δευτερογενής οστεοπόρωση ορίζονται οι καταστάσεις εκείνες που σχετίζονται με οστεοπόρωση επαγόμενη από φαρμακευτικούς παράγοντες ή είναι απόρροια άλλων παθήσεων. Παρά ταύτα, καθώς η οστική πυκνότητα αποτελεί τον πιο καθοριστικό παράγοντα για μελλοντικό κάταγμα, είτε αυξηθεί η οστική απορρόφηση, είτε μειωθεί η οστική παραγωγή, το
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 14 - αποτέλεσμα είναι η μείωση της οστικής μάζας και, συνεπώς, η αύξηση των πιθανοτήτων μελλοντικών καταγμάτων (Sewell, 1995). 1. iv 2 Μετεμμηνοπαυσιακή Οστεοπόρωση Ως έχει προαναφερθεί, απώλεια οστικής μάζας προκαλείται όταν οι διαδικασίες οστικής απορρόφησης και οστικής παραγωγής απορυθμιστούν, και η οστική ανακατασκευή πραγματοποιείται με μια δυσανάλογη αύξηση στην απορρόφηση οστού. Μια τέτοια εικόνα, ιδιαίτερα αυξημένης οστεοκλαστικής δράσης, εμφανίζεται στη μετεμμηνοπαυσιακή οστεοπόρωση. Ο ακριβής μηχανισμός, με τον οποίο η απώλεια οιστρογόνων προκαλεί οστεοπόρωση δεν είναι πλήρως διευκρινισμένος. Φαίνεται, όμως, πως ορισμένοι οστεοκλαστογενετικοί παράγοντες, όπως η ιντερλευκίνη 6 (IL-6) και ο Macrophage Colony Stimulating Factor (M-CSF) υπερεκφράζονται, οδηγώντας σε αυξημένη οστεοκλαστική γέννηση και λειτουργία (Inzerillo & Zaidi, 2002). Σε κυτταρικό επίπεδο, τα οιστρογόνα δεσμεύονται σε πυρηνικούς υποδοχείς παρόντες τόσο σε οστεοβλάστες όσο και σε οστεοκλάστες (Rickard et al, 1999, Oursler et al, 1991, Gray et al, 1987, Eriksen et al, 1988,). Τα οιστρογόνα δρουν στους οστεοβλάστες προκαλώντας ένα φάσμα πολλών διαφορετικών αποτελεσμάτων, συμπεριλαμβανομένης της αυξημένης παραγωγής προ-κολλαγόνου και της αυξημένης έκφρασης αλκαλικής φωσφατάσης (Komm et al, 1988, Ernst et al, 1989, Lin et al, 1991).
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 15 - Επιπλέον, τα οιστρογόνα επηρεάζουν τη σύνθεση συγκεκριμένων αυξητικών παραγόντων, καθώς επίσης και κυττοκινών. Η απώλεια οιστρογόνων έχει ως αποτέλεσμα τον αυξημένο σχηματισμό οστεοκλαστών. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της αυξημένης φωσφορυλίωσης της πυρηνικής πρωτεΐνης Egr-1, γεγονός που προκαλεί την υπερέκφραση του M- CSF, παράγοντα οστεοκλαστικής δημιουργίας (Cenci et al, 2000). Επιπλέον, η παρουσία οιστρογόνων στο βιολογικό σύστημα, αναστέλει τη μεταγραφή του γονιδίου, υπεύθυνου για τη σύνθεση του οστεοκλαστοπαραγωγικού μορίου Receptor Activator for NFκB-Ligand (RANKL) (Shevde et al, 2000). Συνεπώς, επιπρόσθετα στη ρύθμιση μορίων όπως ο M-CSF, η οστεοκαλσίνη, η οστεονεκτίνη και η οστεοποντίνη, τα οιστρογόνα μπορούν άμεσα να καταστείλουν την επαγόμενη από το RANKL οστεοκλαστική διαφοροποίηση, και συνεπώς την οστική απορρόφηση. 1.v Διαγνωστικά Μέσα Οστεοπόρωσης 1.v 1 Γενικά Η διάγνωση της οστεοπόρωσης μπορει να γίνει κλινικά, ραδιογραφικά, πυκνομετρικά, ενώ υπάρχει και μια πληθώρα βιοχημικών δεικτών του οστικού μεταβολισμού, που χρησιμοποιούνται συνεπικουρικά στις παραπάνω διαγνωστικές μεθόδους.
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 16 - Η συχνότερη διαγνωστική μέθοδος έιναι η Dual Energy X-Ray Absorptiometry (DEXA). Ο εξοπλισμός DEXA (Εικόνα 1.5A) επιτρέπει σάρωση της σπονδυλικής στήλης και του ισχίου (Εικόνες 1.5Β, 1.5C), που γενικά θεωρούνται ως τα μεγαλύτερης σπουδαιότητας σημεία μέτρησης, καθώς είναι περιοχές συχνής εμφάνισης καταγμάτων που έχουν σαν αποτέλεσμα μεγάλη θνησιμότητα (Marshall et al, 1996, Cummings et al, 1993). H μέθοδος αυτή βασίζεται στη διέλευση μιας ακτίνας φωτονίων από την υπό εξέταση περιοχή. Οι μετρήσεις αφορούν στο άθροισμα φλοιώδους και σπογγώδους οστού, με ποσοστό ακριβείας 1-3% (Kanis et al, 1994), ενώ τα επίπεδα ακτινοβολίας είναι πολύ χαμηλότερα από την κλασσική ακτινογραφία. Εικόνα 1.5. Μέτρηση DEXA και αποτελέσματα
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 17 - Εναλλακτική μέθοδο διάγνωσης της οστεοπόρωσης αποτελεί η Quantitative UltraSound (QUS), η οποία χρησιμοποιεί έναν ηχητικό παλμό που εξασθενεί μέσα στο οστό καθώς το σήμα διαδίδεται και απορροφάται από τα σπογγώδη τμήματα του οστού, ενώ, πιο εξελιγμένες μέθοδοι διάγνωσης της οστεοπόρωσης είναι η Lateral Vertebral Assessment (LVA), Magnetic Resonance Imaging (MRI) και micro-computerized Tomography (μct). Οι τεχνικές αυτές αναδεικνύουν την πραγματική μορφολογία του οστού, μέσω ψηφιακής εικόνας, ως ένα μέτρο εκτίμησης της ποιότητας του οστού. 1.v 2 Peripheral Quantitative Computerized Tomography (pqct) Εναλλακτική μέθοδος πυκνομετρίας αποτελεί η peripheral Quantitative Computerized Tomography (pqct). H τεχνική αυτή διαθέτει τη δυνατότητα διακριτής ποσοτικοποίησης του φλοιώδους και του σπογγώδους οστού, καθώς και εντοπισμού των σημείων της οστικής απώλειας που εμφανίζονται πρώτα στο σπογγώδες τμήμα του οστού. Παράλληλα, επιτρέπει την ογκομετρική μέτρηση της οστικής πυκνότητας. Η τεχνολογία μέτρησης QCT προσφέρει αρκετές δυνατότητες στην έρευνα της μηχανικής συμπεριφοράς των οστών, καθώς με αυτήν προσδιορίζονται δείκτες σχετικοί με την αντοχή του οστού, και πιο συγκεκριμένα, η μάζα, η μηχανική ποιότητα, και η κατανομή του υλικού του οστού στο χώρο (Ferretti et al, 1996). Η pqct αποτελεί μια υψηλής ανάλυσης προέκταση της μεθόδου με σκοπό τη μέτρηση περιφερειακών τμημάτων του σκελετού, με βελτίωση των εικόνων που λαμβάνονται.
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 18 - Οι διαθέσιμες μηχανές μέτρησης με τη μέθοδο pqct εκτελούν εγκάρσιες σαρώσεις σε ένα πλήθος από περιοχές ενδιαφέροντος, όπως ο ανθρώπινος λαιμός, το κεφάλι ή ο μηρός, ή ακόμα και μικροσκοπικά οστά από ποντίκια. Το μεγάλο μέγεθος των μηχανημάτων λειτουργεί δεσμευτικά ως προς τα σημεία και τα δείγματα που μπορεί να γίνει μέτρηση (Gasser J., 1997). 1.v 3 Modal Damping Factor (MDF) Ο υπολογισμός του Συντελεστή Εσωτερικής Απόσβεσης (Modal Damping Factor, MDF) αποτελεί μια νέα, αναλυτική, αριθμητική και πειραματική μέθοδο, η οποία εφαρμόστηκε στην παρούσα μελέτη ως μια επιπλέον μέθοδος αξιολόγησης της δομικής ακεραιότητας του οστού. Με τη μέθοδο αυτή μετράται η εσωτερική απόσβεση του οστού, κατόπιν ηχητικής διέγερσής του στην ακουστική συχνότητα. Η εσωτερική απόσβεση διαφοροποιείται ανάλογα με το ποσοστό πορώδους του οστού. Από την τιμή της εσωτερικής απόσβεσης, υπολογίζεται ο Συντελεστής Ποιότητας (Quality Factor, QF), ο οποίος πρακτικά είναι αντίστροφος του MDF και εκφράζει την ποιότητα του οστού (Panteliou et al, 1997, 1999, 2000, 2001, 2004, Stavropoulou et al, 2005, Christopoulou et al, 2006). Σημειώνεται ότι ο MDF λαμβάνει τιμές στο διάστημα 0 1, με μικρότερες τιμές MDF να αντιστοιχούν σε υγιέστερο οστό, ενώ μεγαλύτερες τιμές αντιστοιχούν σε οστεοπορωτικό οστό, μειωμένης αντοχής. Το αντίστροφο ισχύει για τις τιμές του QF.
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 19-1.vi Βιοχημικοί Δείκτες Μεταβολισμού του Οστού Όπως έχει ήδη αναφερθεί παραπάνω, εκτός από τις απεικονιστικές μεθόδους εκτίμησης της κατάστασης του οστού, υπάρχει, πλέον, μια πληθώρα βιοχημικών δεικτών που αντανακλούν τον οστικό μεταβολισμό. Ο ρόλος των βιοχημικών δεικτών δεν μπορεί να θεωρηθεί διαγνωστικός. Οι βιοχημικοί δείκτες μπορούν, εντούτοις, να χρησιμοποιηθούν ως μοριακά εργαλεία για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας εφαρμοσμένων θεραπευτικών αγωγών. Το γεγονός αυτό αποτελεί σημαντικό βοήθημα στην κλινική ιατρική, αφού ο θεράπων ιατρός, αφ ενός καλείται να επιλέξει ανάμεσα σε πολλά θεραπευτικά σκευάσματα, αφ ετέρου δε, ο κάθε ασθενής δεν ανταποκρίνεται το ίδιο ουσιαστικά στο κάθε θεραπευτικό σχήμα (Riggs, 2000). Οι βιοχημικοί δείκτες του οστικού μεταβολισμού διακρίνονται σε δύο κατηγορίες, δείκτες οστικής παραγωγής και δείκτες οστικής απορρόφησης (Looker et al, 2000), (Πίνακας 1.1). Οι δείκτες του οστικού μεταβολισμού μπορεί να είναι προϊόντα των οστεοβλαστών ή των οστεοκλαστών, ή προϊόντα αποικοδόμησης του κολλαγόνου. Οι δείκτες οστικής απορρόφησης θεωρούνται πιο ευαίσθητοι από τους δείκτες οστικής παραγωγής, αφού εντοπίζουν μεταβολές στον οστικό μεταβολισμό μόλις 3 με 6 μήνες μετά τη θεραπεία, ενώ οι δείκτες οστεοπαραγωγής απαιτούν διπλάσιο χρόνο αντίδρασης. Αξίζει να σημειωθεί πως η μέτρηση οστικής πυκνότητας μπορεί να δώσει αξιόπιστα αποτελέσματα μόνο αφού παρέλθουν 2 έτη από την έναρξη της θεραπευτικής αγωγής (Delmas et al, 2000).
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 20 - ΔΕΙΚΤΕΣ ΟΣΤΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΔΕΙΚΤΕΣ ΟΣΤΙΚΗΣ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗΣ Οστεοκαλσίνη ορού (OC) Ολική Αλκαλική Φωσφατάση ορού (ALP) Οστική Αλκαλική Φωσφατάση ορού (BSAP) Καρβοξυτελικό Προπεπτίδιο προκολλαγόνου Τύπου Ι (PICP) Αμινοτελικό Προπεπτίδιο προκολλαγόνου Τύπου Ι (PINP) Υδροξυπρολίνη ούρων (Hyp) Ολική Πυριδινολίνη ούρων (Pyr) Ολική δεοξυπυριδινολίνη ούρων (dpyr) Ελεύθερη Πυριδινολίνη ούρων (f-pyr) Ελεύθερη δεοξυπυριδινολίνη ούρων (f-dpyr) Αμινοτελικό Πεπτίδιο Κολλαγόνου Τύπου Ι (NTx) Καρβοξυτελικό Πεπτίδιο Κολλαγόνου Τύπου Ι (CTx) Πίνακας 1.1. Βιοχημικοί Δείκτες Οστικής Παραγωγής και Απορρόφησης (Looker et al, 2000)
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 21-1. vi 1 Βιοχημικοί Δείκτες Παραγωγής Οστού Οι οστεοβλάστες συνθέτουν και εκκρίνουν πολλές πρωτεΐνες, οι οποίες μπορούν να μετρηθούν στον ορό του αίματος και να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες οστικής σύνθεσης. Οι βιοχημικοί δείκτες παραγωγής οστού περιλαμβάνουν την οστική αλκαλική φωσφατάση (bone-specific alkaline phosphatase), την οστεοκαλσίνη (osteocalcin) και τα πεπτίδια προκολλαγόνου. Οι αλκαλικές φωσφατάσες είναι ένζυμα της κυτταροπλασματικής μεμβράνης. Υπάρχουν τέσσερις ισομορφές, οι οποίες διαφέρουν μεταξύ τους όσον αφορά στη γλυκοζηλίωσή τους. Η οστική αλκαλική φωσφατάση έχει χρόνο ημίσιας ζωής 1 2 ημέρες, ενώ η ευαισθησία της ως δείκτης μεταβολισμού των οστών είναι περιορισμένη, αφού η οστική ισομορφή συμμετέχει στην ολική δραστηριότητα του ενζύμου κατά 40%. Η μέτρηση της οστικής αλκαλικής φωσφατάσης συσχετίζεται με το ρυθμό τιτάνωσης του οστού (Swaminathan, 2001). Η οστεοκαλσίνη (bone Gla protein) είναι μια μικρή μη-κολλαγόνα πρωτεΐνη (M.W. 58 kda) και παράγεται αποκλειστικά από οστεοβλάστες και οδοντοβλάστες. Το μεγαλύτερο ποσοστό της παραγόμενης οστεοκαλσίνης συγχωνεύεται στην οστική θεμέλια ουσία, όπου δεσμεύεται στους κρυστάλλους υδροξυαπατίτη, ενώ μόλις ένα μικρό μέρος απελευθερώνεται στην κυκλοφορία του αίματος. Ο χρόνος ημίσιας ζωής της στην κυκλοφορία του αίματος είναι μόνο λίγα λεπτά.
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 22 - Η οστεοκαλσίνη ορού αποτελεί έναν ευαίσθητο δέικτη οστικής παραγωγής, ενώ αυξάνει τα επίπεδά της στο αίμα όταν υπάρχει επιτάχυνση του οστικού μεταβολισμού (Swaminathan, 2001). Το κολλαγόνο τύπου Ι αποτελεί το 90% του οργανικού μέρους της θεμέλιας ουσίας και συντίθεται ως προ-κολλαγόνο. Το μόριο του προκολλαγόνου διαθέτει άμινο- (PINP) και καρβόξυ-τελικά (PICP) πεπτίδια, η αφαίρεση των οποίων από ειδικές ενδοπρωτεάσες παράγει το κολλαγόνο. Τα πεπτίδια αυτά μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες παραγωγής κολλαγόνου και, άρα, ως δείκτες παραγωγής οστού. Ο λόγος του κολλαγόνου που παράγεται προς το PICP που απελευθερώνεται στην κυκλοφορία του αίματος είναι 1 : 1, ενώ το PICP είναι σταθερό για αρκετές ημέρες στον ορό του αίματος και μπορεί να μετρηθεί με ανοσολογικές μεθόδους. Η συγκέντρωση του PICP στον ορό συσχετίζεται με ιστομορφομετρικές ιδιότητες του οστού (Swaminathan, 2001).
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 23-1. vi 2 Βιοχημικοί Δείκτες Απορρόφησης Οστού Οι δείκτες οστικής απορρόφησης αφορούν κυρίως προϊόντα παραγόμενα από την καταστροφή του οστίτη ιστού. Η δράση, επίσης, οστεοκλαστικών ενζύμων, όπως η Tartrate-Resistant Acid Phosphatase (TRAP), χρησιμοποιείται για την ανίχνευση της απορρόφησης του οστού από τους οστεοκλάστες, αλλά η εγκυρότητα των μεθόδων μέτρησής της χρήζει περαιτέρω επιβεβαίωσης (Swaminathan, 2001). Η υδροξυπρολίνη (OHP), η οποία αντιστοιχεί στο 13 14% των αμινοξέων του κολλαγόνου, σχηματίζεται με μετα-μεταφραστική (posttranslational) υδροξυλίωση μέσα στην πεπτιδική αλυσίδα. Όταν το κολλαγόνο αποδομείται, η υδροξυπρολίνη δεν μπορεί να ξαναχρησιμοποιηθεί, κι έτσι απελευθερώνεται στην κυκλοφορία του αίματος και των ούρων. H OHP των ούρων συσχετίζεται πολύ ασθενώς με τον οστικό μεταβολισμό και, γι αυτό το λόγο, έχει αντικατασταθεί πλέον από πιο ευαίσθητους δείκτες (Swaminathan, 2001). Το κολλαγόνο σταθεροποιείται με τη δημιουργία μορίων διασύνδεσης (cross-link molecules), τα οποία σχηματίζουν ομοιοπολικές συνδέσεις μεταξύ του άκρου του ενός μορίου κολλαγόνου και του ελικοειδούς τμήματος του γειτονικού μορίου κολλαγόνου. Τα σημαντικότερα μόρια διασύνδεσης του κολλαγόνου είναι η πυριδινολίνη (PYD) και η δεοξυπυριδινολίνη (DPD). Η σύνδεση πραγματοποιείται εξωκυτταρικά, αφού το κολλαγόνο έχει εναποτεθεί στη μητρική οστέϊνη ουσία, ενώ τα μόρια διασύνδεσης αποδεσμεύονται στα ούρα και στο αίμα μόνο όταν το κολλαγόνο αποικοδομείται.