«ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ ΣΤΗΝ ΑΛΛΕΡΓΙΚΗ ΕΥΑΙΣΘΗΤΟΠΟΙΗΣΗ (ΑΝΑΦΟΡΑ)»

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "«ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ ΣΤΗΝ ΑΛΛΕΡΓΙΚΗ ΕΥΑΙΣΘΗΤΟΠΟΙΗΣΗ (ΑΝΑΦΟΡΑ)»"

Ὑπατια Ακρίδας
7 χρόνια πριν
Προβολές:

Ακαδημίας Αθηνών- Ωρίμανση της μη ειδικής ανοσίας: επιρροή των λοιμώξεων και ρόλος τους στην ανάπτυξη ατοπίας και άσθματος» (MIS 377047) του

1 ΠΑΡΑΔΟΤΕΟ: Π.5.2 «ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ ΣΤΗΝ ΑΛΛΕΡΓΙΚΗ ΕΥΑΙΣΘΗΤΟΠΟΙΗΣΗ (ΑΝΑΦΟΡΑ)» για το ΥΠΟΕΡΓΟ 1 της Πράξης: «ΘΑΛΗΣ- Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών Ακαδημίας Αθηνών- Ωρίμανση της μη ειδικής ανοσίας: επιρροή των λοιμώξεων και ρόλος τους στην ανάπτυξη ατοπίας και άσθματος» (MIS ) του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» Επιστημονικός Υπεύθυνος Πράξης και Υπεύθυνος Υποέργου 1: Ανδρεάκος Ευάγγελος Επιμέλεια σύνταξης εγγράφου: ΑΝΔΡΕΑΚΟΣ ΕΥΑΓΓΕΛΟΣ ΚΟΛΤΣΙΔΑ ΟΥΡΑΝΙΑ ΓΑΛΑΝΗ ΙΩΑΝΝΑ ΜΟΥΡΑΤΗΣ ΜΑΡΙΟΣ- ΑΓΓΕΛΟΣ ΕΛΕΜΗΝΙΑΔΟΥ ΕΥΡΥΔΙΚΗ ΤΡΙΑΝΤΑΦΥΛΛΙΑ ΒΑΣΙΛΙΚΗ- ΓΕΩΡΓΙΑ

2 Η προαναφερθείσα συγχρηματοδοτούμενη πράξη ΕΚΤ-ΕΣΠΑ έχει ως σκοπό να εξετάσει την υπόθεση ότι η ελαττωματική ωρίμανση της φυσικής ανοσίας νωρίς στη ζωή, επηρεαζόμενη από λοιμώξεις, συμβάλλει στην ανάπτυξη αλλεργικών παθήσεων του αναπνευστικού συστήματος. Στόχοι της πράξης είναι να περιγραφεί η ωρίμανση της φυσικής ανοσίας σε υγιείς και ασθματικούς δότες, να διευκρινιστεί η επιρροή των λοιμώξεων στην ωρίμανση της φυσικής ανοσίας και την ανάπτυξη/επιμονή αλλεργικών αντιδράσεων στους αεραγωγούς, να προσδιοριστεί η συσχέτιση ιϊκών λοιμώξεων με τη μικροβιακή αποικιοποίηση του ανώτερου αναπνευστικού και να αποσαφηνιστεί ο ρόλος του αναπνευστικού επιθηλίου και την αναδόμησης των αεραγωγών στην ανάπτυξη αλλεργίας και άσθματος. Σκοπός του προγράμματος είναι να αποκαλύψει σημαντικές βιολογικές διαδικασίες που ενεργοποιούνται στα πρώτα στάδια της ζωής και συμβάλλουν στην ανάπτυξη αλλεργικών παθήσεων του αναπνευστικού συστήματος με σημαντική διαγνωστική και θεραπευτική σημασία. Στο πλαίσιο της πράξης, υλοποιείται το Υποέργο 1 με τίτλο «Ωρίμανση της μη-ειδικής ανοσίας: επιρροή των λοιμώξεων και ρόλος τους στην ανάπτυξη ατοπίας και άσθματος» και θα εκτελεστούν οκτώ (8) Δράσεις. Το παρόν παραδοτέο 5.2 αποτελεί μέρος της Δράσης 5: «Επιρροή της ηλικιακής ωρίμανσης ανοσιακών αποκρίσεων στην ανάπτυξη αλλεργικής ευαισθητοποίησης και άσθματος σε πειραματικά μοντέλα μυών» και περιλαμβάνει την πορεία ωρίμανσης της μη ειδικής ανοσίας του ανοσοποιητικού συστήματος των μυών από τη γέννηση μέχρι την ενηλικίωσή τους. Συγκεκριμένα: Αναπτύχθηκε πρωτόκολλο για τη μελέτη της επιρροής ρινοιϊκής λοίμωξης στην αλλεργική ευαισθητοποίηση σε πειραματικό μοντέλο μυός και χαρακτηρίστηκαν οι ανοσιακές αποκρίσεις έπειτα από επανέκθεση στο αλλεργιογόνο. Δράση 5: «Επιρροή της ηλικιακής ωρίμανσης ανοσιακών αποκρίσεων στην ανάπτυξη αλλεργικής ευαισθητοποίησης και άσθματος σε πειραματικά μοντέλα μυών» 2 Παραδοτέο Π.5.2 του Υποέργου 1 της πράξης MIS377047

3 5.2 Ανάλυση της φυσικής ανοσίας στην αλλεργική ευαισθητοποίηση Επιδημιολογικές μελέτες καταδεικνύουν τον πολύ σημαντικό ρόλο της πορείας ωρίμανσης του ανοσοποιητικού συστήματος στη μετέπειτα ανάπτυξη αλλεργικών παθήσεων. Ανεπαρκής δημιουργία Th1 και Treg ρυθμιστικών αποκρίσεων καθώς και μηχανισμών ανοσιακής ανοχής κατά τη νεογνική και προσχολική ηλικία έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη επαγωγή Th2 αποκρίσεων σε περιβαλλοντικά αντιγόνα και τελικά την ανάπτυξη αλλεργικών αποκρίσεων. Αν και οι ακριβείς μηχανισμοί ωρίμανσης του ανοσοποιητικού συστήματος είναι ασαφείς, είναι φανερό ότι διάφορες ιογενείς και βακτηριακές λοιμώξεις είναι καθοριστικές τόσο για το σχηματισμό ειδικής ανοσίας εναντίον αλλεργιογόνων όσο και για την εμφάνιση αλλεργίας. Στόχος είναι να μελετηθεί λεπτομερώς η επιρροή ιογενών λοιμώξεων στην αλλεργική ευαισθητοποίηση σε διαφορετικές ηλικιακές περιόδους και να συσχετιστεί με τη διαφοροποίηση της ωρίμανσης του ανοσοποιητικού συστήματος και την ανάπτυξη αλλεργικού άσθματος. Για το σκοπό αυτό, αναπτύχθηκε μοντέλο ρινοιϊκής λοίμωξης (human rhinovirus 1b, RV) σε νεογέννητους και ενήλικους μύες συνοδευόμενη από έκθεση στο αλλεργιογόνο ακάρεα σκόνης (house dust mite, HDM) (Εικόνα 1). Στη συνέχεια, χαρακτηρίστηκαν οι ανοσολογικές αποκρίσεις στον σπλήνα και στους μεσοθωρακικούς λεμφαδένες έπειτα από επαναδιέγερση με HDM. Εικόνα 1: Σχηματική αναπάρασταση του πειραματικού πρωτοκόλλου. Μύες ηλικίας πέντε έως επτά ημερών ή ενήλικοι μύες (δύο μηνών) εκτέθηκαν την πρώτη μέρα σε ρινοιό (RV) και ακάρεα σκόνης (HDM). Ακολούθησαν τρεις επανεκθέσεις σε HDM και έντεκα μέρες μετά πραγματοποιήθηκε η ανάλυση. Παρατηρήθηκε πως οι ειδικές Τh2 ανοσιακές αποκρίσεις έναντι του αλλεργιογόνου HDM στο σπλήνα και στους μεσοθωρακικούς λεμφαδένες ήταν παρόμοιες μεταξύ των νεογνικών και ενήλικων μυών (Εικόνες 2Α-Β, 3Α-Β). Επιπλέον, δε σημειώθηκε σημαντική διαφορά στα επίπεδα της αντι- 3 Παραδοτέο Π.5.2 του Υποέργου 1 της πράξης MIS377047

4 φλεγμονώδους IL-10 μεταξύ νεογνικών και ενήλικων μυών, τόσο στο σπλήνα όσο και στους λεμφαδένες (Εικόνες 2Ε, 3Ε). Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκε επαγωγή της IL-17 στο σπλήνα και στους λεμφαδένες των νεογνικών μυών σε αντίθεση με τους ενήλικες (Εικόνες 2Δ, 3Δ). Η ευαισθητοποίηση στο αλλεργιογόνο HDM, όταν συνδυαστεί με ρινοιϊκή λοίμωξη φαίνεται πως οδηγεί σε εντονότερη ανοσιακή απόκριση. Πιο συγκεκριμένα, η λοίμωξη από τον ρινοιό τείνει να αυξάνει τα επίπεδα των κυτοκινών IL-5, IL-13 και IL-10 σε σχέση με το HDM στο σπλήνα και στους λεμφαδένες των νεογνικών μυών, ενώ τα αυξάνει σημαντικά στους ενήλικους μύες (Εικόνες 2Α-Β, 2Δ, 3Α-Β, 3Δ). Α Β Γ Δ Ε Εικόνα 2: Χαρακτηρισμός των ειδικών ανοσιακών απαντήσεων έναντι του αλλεργιογόνου HDM και του ρινοιού στον σπλήνα. Εναιώρημα κυττάρων σπληνός καλλιεργήθηκε παρουσία 30ug/ml HDM για τέσσερις ημέρες. Στα υπερκείμενα των καλλιεργειών ελέγχθηκε η παρουσία των Th2 (Α, Β), Th1 (Γ) και Th17 (Δ) κυτοκινών IL-5, IL-13, IFNγ και ΙL-17 αντίστοιχα και της αντι-φλεγμονώδης ΙL-10 (Ε) με τη μέθοδο της ELISA. Ν= 5-9 μύες ανά ομάδα. * p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001 Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η έλλειψη παραγωγής IFNγ στο σπλήνα και στους λεμφαδένες των νεογνικών μυών. Αντίθετα, στους ενήλικες μύες παρατηρήθηκε περιορισμένη παραγωγή IFNγ έπειτα 4 Παραδοτέο Π.5.2 του Υποέργου 1 της πράξης MIS377047

5 από έκθεση στο HDM στο σπλήνα και στους λεμφαδένες, η οποία αυξήθηκε σημαντικά μετά από τη συνδυαστική λοίμωξη με τον ρινοιό (Εικόνες 2Γ, 3Γ). Εικόνα 3: Χαρακτηρισμός των ειδικών ανοσιακών απαντήσεων έναντι του αλλεργιογόνου HDMκαι του ρινοιού στους λεμφαδένες. Εναιώρημα κυττάρων από τους μεσοθωρακικούς λεμφαδένες καλλιεργήθηκε παρουσία 30ug/ml HDM για τέσσερις ημέρες. Στα υπερκείμενα των καλλιεργειών ελέγχθηκε η παρουσία των Th2, Th1 και Th17 κυτοκινών IL-5, IL-13, IFNγ και ΙL-17 αντίστοιχα και της αντι-φλεγμονώδης ΙL-10 με τη μέθοδο της ELISA. Ν= 5-9 μύες ανά ομάδα. * p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001 Συνολικά, η έκθεση στο αλλεργιογόνο HDM επάγει παρόμοιες Τh2 ανοσολογικές αποκρίσεις στον σπλήνα και τους λεμφαδένες των νεογνικών και ενήλικων μυών και οι αποκρίσεις αυτές ενισχύονται σημαντικά παρουσία ρινοιϊκής λοίμωξης. Η βασική διαφορά των δύο ηλικιακών ομάδων έγκειται στην αδυναμία επαγωγής Th1 αποκρίσεων στους νεογνικούς μύες, οδηγώντας τελικά σε αυξημένη Τh2 ανοσολογική απάντηση. Ιούλιος 2015, Αθήνα ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ-ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ 1. Πειραματόζωα 5 Παραδοτέο Π.5.2 του Υποέργου 1 της πράξης MIS377047

6 Χρησιμοποιήθηκαν αρσενικοί μύες πέντε έως επτά ημερών (νεογνικοί μύες) και δύο μηνών (ενήλικοι μύες) της φυλής C57BL/6. 2. Παραγωγή ανθρώπινου ρινοιού Η παραγωγή καθώς και η τιτλοδότηση του ρινοϊού αναπτύχθηκε σε ανθρώπινα καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα HeLa H1 και HeLa Ohio αντίστοιχα (NW. Bartlett et al. Nature Medicine 14, (2008)). H απομόνωση του ρινοϊού πραγματοποιείται έπειτα από λύση των μολυσμένων επιθηλιακών κυττάρων και η συμπύκνωση του σε PBS έπειτα από διαδοχικές υπερφυγοκεντρίσεις στις 4000 rpm, 15min, 4 o C. 3. Μοντέλο ρινοιϊκής λοίμωξης και αλλεργικής ευαισθητοποίησης Η ενδορρινική χορήγηση του ρινοιού και του αλλεργιογόνου σε νεογνικούς μύες πραγματοποιήθηκε έπειτα από κρυοαναισθησία. Συνοπτικά, ένα φύλλο αλουμινίου τοποθετήθηκε σε θρυμματισμένο πάγο και διαμορφώθηκε για να σχηματίσει μία στενή αυλάκωση, αρκετά μεγάλη για να φιλοξενήσει ένα νεογέννητο μυ, μεγιστοποιώντας έτσι την έκθεσή του σε χαμηλή θερμοκρασία. Έπειτα από 10 λεπτά παραμονής στον πάγο, τα νεογνά βρίσκονται υπό αναισθησία, οπότε καθίσταται δυνατή η ενδορρινική χορήγηση. Αντίθετα, η ενδορρινική χορήγηση στους ενήλικους μύες πραγματοποιήθηκε έπειτα από αναισθητοποίηση με τη χρήση κεταμίνης/ξυλαζίνης. Στο μοντέλο ρινοιϊκής λοίμωξης και αλλεργικής ευαισθητοποίησης χορηγήθηκαν την πρώτη μέρα 2*10 7 TCID50/ml RV και 25μg HDM ανά ποντίκι (10μl στους νεογνικούς μύες και 40μl στους ενήλικους). Ακολούθησαν τρεις διαδοχικές επανεκθέσεις σε 12.5μg HDM ανά ποντίκι. Όσον αφορά την πειραματική οργάνωση, οι μύες (νεογνικοί και ενήλικες) χωρίστηκαν σε τρεις πειραματικές ομάδες: 1. Μύες που τους χορηγήθηκε ενδορρινικά PBS (PBS ομάδα) 2. Μύες που τους χορηγήθηκε ενδορρινικά HDM (HDM ομάδα) 3. Μύες που τους χορηγήθηκε ενδορρινικά την πρώτη μέρα RV με HDM (HDM+RV ομάδα) Η θυσία των μυών και η συλλογή ιστών πραγματοποιήθηκε έντεκα μέρες μετά την τελευταία έκθεση σε HDM. 4. Απομόνωση μεσοθωρακικών λεμφαδένων και σπληνός Κατόπιν θυσίας των μυών συλλέχθηκαν οι μεσοθωρακικοί λεμφαδένες και ο σπλήνας. 6 Παραδοτέο Π.5.2 του Υποέργου 1 της πράξης MIS377047

7 Συλλογή μεσοθωρακικών λεμφαδένων: 1. Μετατροπή των λεμφαδένων σε εναιώρημα μονών κυττάρων σε RPMI (RPMI+Glutamax Gibco, 10% FCS Gibco, 1% P/S, Gibco) έπειτα από διήθηση με 70μm cell strainer 2. Καλλιέργεια 5x10 6 κυττάρων/ml σε 96 well plate (U-bottom 96-well plate 92097, TRP) 3. Προσθήκη 30μg/ml HDM στην καλλιέργεια για 96 ώρες 4. Συλλογή υπερκείμενων των καλλιεργειών και μέτρηση των επιπέδων IL-13, IL-5, IL-10, IL-17 και IFNγ με ELISA. Συλλογή σπληνός: 1. Μετατροπή του σπλήνα σε εναιώρημα μονών κυττάρων σε RPMI (RPMI+Glutamax Gibco, 10% FCS Gibco, 1% P/S, Gibco) έπειτα από διήθηση με 70μm cell strainer 2. Καλλιέργεια 5x10 6 κυττάρων/ml σε 96 well plate (U-bottom 96-well plate 92097, TRP) 3. Προσθήκη 30μg/ml HDM στην καλλιέργεια για 96 ώρες 4. Συλλογή υπερκείμενων των καλλιεργειών και μέτρηση των επιπέδων IL-13, IL-5, IL-10, IL-17 και IFNγ με ELISA. 7 Παραδοτέο Π.5.2 του Υποέργου 1 της πράξης MIS377047

Σχετικά έγγραφα

«ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ ΣΤΗΝ ΑΛΛΕΡΓΙΚΗ ΦΛΕΓΜΟΝΗ (ΑΝΑΦΟΡΑ)»

ΠΑΡΑΔΟΤΕΟ: Π.5.3 «ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΑΝΟΣΙΑΣ ΣΤΗΝ ΑΛΛΕΡΓΙΚΗ ΦΛΕΓΜΟΝΗ (ΑΝΑΦΟΡΑ)» για το ΥΠΟΕΡΓΟ 1 της Πράξης: «ΘΑΛΗΣ- Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών Ακαδημίας Αθηνών- Ωρίμανση της μη ειδικής ανοσίας: επιρροή