Παραγωγή φαρμακευτικών πρωτεϊνών με βιοτεχνολογικές μεθόδους Μεταφορά γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα (Γονιδιακή θεραπεία)

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "Παραγωγή φαρμακευτικών πρωτεϊνών με βιοτεχνολογικές μεθόδους Μεταφορά γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα (Γονιδιακή θεραπεία)"

Θήρων Ιωάννου
8 χρόνια πριν
Προβολές:

1 Παραγωγή φαρμακευτικών πρωτεϊνών με βιοτεχνολογικές μεθόδους Μεταφορά γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα (Γονιδιακή θεραπεία)

2 Παραγωγή ινσουλίνης από βακτήρια Παρελθόν: απομόνωση ινσουλίνης από πάνγκρεας χοίρου ή αγελάδας Μειονέκτημα: η αμινοξική αλληλουχία δεν είναι πανομοιότυπη με αυτή του ανθρώπου οπότε κάποιοι ασθενείς ανέπτυσσαν αντισώματα Ανασυνδυασμένη ινσουλίνη: πεπτίδιο Α+ Β Στάδια Κατασκευή 2 ξεχωριστών πλασμιδιακών φορέων που παράγουν την Α και την Β αλυσίδα της ινσουλίνης στο καρβοξυτελικό άκρο της β-γαλακτοσιδάσης Μετασχηματισμός βακτηρίων Καλλιέργεια βακτηρίων Απομόνωση β-γαλακτοσιδάσης-ινσουλίνης χιμαιρικής πρωτεΐνης Αποικοδόμηση της β-γαλακτοσιδάσης με πέψη κυανογόνου βρωμιδίου Καθαρισμός Α και Β αλυσίδων Συνένωση των Α και Β αλυσίδων σε ενεργή ινσουλίνη (δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών) ΠΡΟΣΟΧΗ Χρησιμοποιείται μόνο cdna και ποτέ γενωμικό DNA (τα βακτήρια δεν μπορούν να κάνουν μάτισμα) Οι πρωτεΐνες που παράγονται δεν έχουν μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις όπως συμβαίνει στα θηλαστικά π.χ. γλυκοζυλίωση

β-γαλακτοσιδάσης Μετασχηματισμός βακτηρίων Καλλιέργεια βακτηρίων Απομόνωση β-γαλακτοσιδάσης-ινσουλίνης χιμαιρικής πρωτεΐνης Αποικοδόμηση της β-γαλακτοσιδάσης με πέψη κυανογόνου βρωμιδίου Καθαρισμός Α

3 Παραγωγή φαρμακευτικών πρωτεϊνών από κτηνοτροφικά ζώα 1. Επιλογή υποκινητών γονιδίων που εκφράζονται σε κύτταρα του μαστικού αδένα π.χ. καζεΐνη, β-γαλακτοσφαιρίνη 2. Προετοιμασία διαγονιδιακής κατασκευής 3. Εισαγωγή διαγονιδίου στον προπυρήνα γονιμοποιημένου ωαρίου με μικροένεση 4. Εμφύτευση σε θετή μητέρα 5. Ταυτοποίηση διαγονιδιακών απογόνων με PCR 6. Συλλογή γάλακτος 7. Απομόνωση και καθαρισμός φαρμακευτικής πρωτεΐνης από το γάλα

Προετοιμασία διαγονιδιακής κατασκευής 3.

4 Υψηλή έκφραση γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα Eφαρμογές Μελέτη της λειτουργικότητας μιας πρωτεΐνης (φυσικού τύπου ή τροποποιημένης) Μελέτητηςυπερέκφρασηςμιαςπρωτεΐνης Παραγωγή φαρμακευτικών πρωτεϊνών (σωστή μετα-μεταφραστική τροποποίηση) Μελέτη της ενεργότητας και ιστοειδικότητας υποκινητών ή ενισχυτών όταν η πρωτεΐνη που παράγεται μπορεί εύκολα να ανιχνευθεί, είναι για παράδειγμα ένζυμο (β-γαλακτοσιδάση, λουσιφεράση) Μπορεί να επιτευχθεί παραγωγή πρωτεΐνης που να αντιστοιχεί στο 10% της πρωτεϊνικής παραγωγής του κυττάρου

και ιστοειδικότητας υποκινητών ή ενισχυτών όταν η πρωτεΐνη που παράγεται μπορεί εύκολα να ανιχνευθεί, είναι για παράδειγμα ένζυμο

5 ΤΡΟΠΟΙ ΕΙΣΑΓΩΓΗΣ DNA ΣΕ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ 1. Μικροένεση DNA στον προπυρήνα 2. Ηλεκτροπαλμός (electroporation), δημιουργία παροδικών πόρων λόγω ηλεκτρικού παλμού 3. Χρήση πολυκατιόντων για την εξουδετέρωση των φορτίων σε DNA και κυτταρική μεμβράνη, που παρεμποδίζουν την πρόσληψη του DNA 4. Πακετάρισμα του DNA σε λιποσώματα και εισαγωγή του στο κύτταρο με κυτταρική σύντηξη 5. Με ιικούς φορείς 6. Μεταφορά μέσω σπέρματος, πιθανόν σε συνδυασμό με ενδοκυτταροπλασματική ένεση σπέρματος (ICSI), ή με ηλεκτροπαλμό. Ενσωμάτωση του DNA στο γονιδίωμα γίνεται σε τυχαία θέση, συνήθως σε πολλαπλά αντίγραφα της ίδιας φοράς Όταν μετασχηματίζονται σωματικά ή εμβρυικά βλαστικά κύτταρα, τότε απαιτείται ένας δείκτης θετικής επιλογής

Πακετάρισμα του DNA σε λιποσώματα και εισαγωγή του στο κύτταρο με κυτταρική σύντηξη 5. Με ιικούς φορείς 6.

6 Παροδική ή σταθερή έκφραση πρωτεϊνών σε ευκαρυωτικά κύτταρα 48hrs Συλλογή κυττάρων Παροδική έκφραση (όχι ενσωμάτωση DNA) Παρουσία αντιβιοτικού 2 εβδομάδες Σταθερή έκφραση (ενσωμάτωση DNA)

7 Μετασχηματισμός κυττάρων με Ηλεκτροπαλμό Επιθυμητό Γονίδιο + γονίδιο ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικό Παρουσία αντιβιοτικού Σταθερή έκφραση (>2 εβδομάδες) Παροδική έκφραση=48hrs

8 Μετασχηματισμός κυττάρων με Λιποσώματα Συνθετική λιπιδική διπλοστιβάδα

9 ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ 1990: πρώτη φορά γονιδιακή θεραπεία σε ασθενή με ADA SCID Εισαγωγή ενός φυσιολογικού γονιδίου στα κύτταρα του ιστού που πάσχει με σκοπό τη διόρθωση της γονιδιακής λειτουργίας Τυχαία ενσωμάτωση (ιικοί φορείς) Αντικατάσταση γονιδίου Αναστολή της έκφρασης ενός γονιδίου σε περιπτώσεις παθολογικής υπερέκφρασης ή κακοήθειες λόγω υπερέκφρασης ογκογονιδίων(gene knockdown) Γονιδιακή στόχευση και αδρανοποίηση γονιδίων (CCR5, ασθενείς με AIDS) με μεταφορά αντι νοηματικών (anti sense) ολιγονουκλεοτιδίων, sirna (small interfering RNAs)

ενός γονιδίου σε περιπτώσεις παθολογικής υπερέκφρασης ή κακοήθειες λόγω υπερέκφρασης ογκογονιδίων(gene knockdown) Γονιδιακή στόχευση και

10 lung cancer, colorectal carcinoma, pancreatic carcinoma, malignant glioma and malignant melanoma), diabetes, Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Duchenne muscular dystrophy

13 ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ Ακόμα σε πειραματικό στάδιο Ασθένειες στόχοι: κυστική ίνωση, αιμορροφιλία, υπερχοληστερολαιμία, μυική δυστροφία, έλλειψη της διαμινάσης της αδενοσίνης (ADA) Απαραίτητες προϋποθέσεις: Κλωνοποίηση του υπεύθυνου γονιδίου Προσδιορισμός των κυττάρων που εμφανίζουν την βλάβη Το γονίδιο πρέπει να ενσωματωθεί στο γονιδίωμα κυττάρων που παραμένουν στον οργανισμό για μεγάλο χρονικό διάστημα

προϋποθέσεις: Κλωνοποίηση του υπεύθυνου γονιδίου Προσδιορισμός των κυττάρων που εμφανίζουν την βλάβη

14 Χ-SCID cytokine receptor common gamma chain 2005: 5 παιδιά εμφάνισαν λευχαιμία

15 ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ Ιικοί Φορείς Μη ιικές μέθοδοι Ενέσεις γυμνού DNA Ολιγονουκλεοτίδια Ηλεκτροπαλμός Υπέρηχοι Λιποσώματα Πολυκατιόντα

16 Εισαγωγή DNA σε κύτταρα καλλιέργειας ή σε σωματικά κύτταρα πειραματικών ζώων με ιούς (Μεταγωγή, transduction) Ex vivo: Απομόνωση κυττάρων από τον οργανισμό Γενετική τροποποίηση τους εκτός σώματος Μεταφορά τους και πάλι στον οργανισμό In vivo: Απευθείας χορήγηση φορέων/γονιδίων στον οργανισμό

τον οργανισμό Γενετική τροποποίηση τους εκτός σώματος Μεταφορά τους και

17 In vivo Ex vivo Απλή, γρήγορη, οικονομική Δεν είναι κατάλληλοι όλοι οι φορείς Απευθείας μεταφορά φορέων εγείρει ανησυχία για την ασφάλεια Δεν απαιτεί απομόνωση ιστών Απαιτεί ειδικές εγκαταστάσεις, ακριβή Μεγαλύτερη ποικιλία φορέων Τα γενετικώς τροποποιημένα κύτταραμπορείναελεγχθούν πριν την εισαγωγή τους στον οργανισμό Απαιτεί απομόνωση ιστών

ιστών Απαιτεί ειδικές εγκαταστάσεις, ακριβή Μεγαλύτερη ποικιλία φορέων Τα γενετικώς

18 Ιοί που ενσωματώνονται Ρετροιοί Ογκορετροιοί : (MMLV) Λεντι-ιοί: (HIV) Αδενο-σχετιζόμενοι ιοί: Μολύνουν κύτταρα σε φάση διπλασιασμού, ευρέως διαδεδομένοι σε κλινικές δοκιμές Μολύνει μη διπλασιαζόμενα κύτταρα, δεν χρησιμοποιούνται ακόμα σε κλινικές δοκιμές Μολύνει μη διπλασιαζόμενα κύτταρα Ιοί που δεν ενσωματώνονται Αδενοιοί: Μολύνει μη διπλασιαζόμενα κύτταρα, υψηλή αντιγονικότητα ευρέως διαδεδομένοι σε κλινικές δοκιμές Ερπητοιοί: Μολύνει μη διπλασιαζόμενα κύτταρα, προκαλούν φλεγμονή, αρχικές γενιές ιών ήταν κυτταροτοξικές

δοκιμές Μολύνει μη διπλασιαζόμενα κύτταρα Ιοί που δεν ενσωματώνονται Αδενοιοί: Μολύνει μη διπλασιαζόμενα κύτταρα, υψηλή

19 ΡΕΤΡΟΙΟΙ Αποτελείται από: Ένα εξωτερικό φάκελο που προέρχεται από την κυτταρική μεμβράνη του κυττάρου ξενιστή Αρκετά αντίγραφα μιας πρωτεΐνης φακέλου που βρίσκεται στην λιπιδική διπλοστιβάδα του φακέλου Ένα καψίδιο; Ένα πρωτεινικό κέλυφος που περιβάλει: δύο μόρια RNA και το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση (reverse transcriptase) Το γονιδίωμα των ρετροιών περιβάλλεται από επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες ("R") που επιτρέπουν ενσωμάτωση στο γονιδίωμα του ξενιστή λειτουργούν ως ενισχυτής

κέλυφος που περιβάλει: δύο μόρια RNA και το ένζυμο αντίστροφη μεταγραφάση (reverse transcriptase) Το γονιδίωμα των

20 Όταν ένας ρετροιός μολύνει ένα κύτταρο : Τα μόρια της αντίστροφης μεταγραφάσης μεταφέρονται στο κύτταρο συνδεδεμένα με τα μόρια του RNA. Η αντίστροφη μεταγραφάση συνθέτει DNA αντίγραφα του RNA. Αυτά εισέρχονται στο πυρήνα και ενσωματώνονται στο γονιδίωμα του κυττάρου. Το DNA που ενσωματώθηκε μεταγράφεται από τα ένζυμα του ξενιστή σε νέα μόρια RNA που εξέρχονται στο κυτταρόπλασμα όπου Κάποια μεταφράζονται από τα ριβοσώματα του ξενιστή Το γονίδιο gag μεταφράζεται σε μόρια της πρωτεϊνικής θήκης (καψιδίου) Το γονίδιο pol μεταφράζεται σε μόρια αντίστροφης μεταγραφάσης Το γονίδιο env μεταφράζεται στις πρωτεΐνες του φακέλου άλλα μόρια RNA χρησιμοποιούνται για την δημιουργία νέων ιών

Το DNA που ενσωματώθηκε μεταγράφεται από τα ένζυμα του ξενιστή σε νέα μόρια RNA που εξέρχονται στο κυτταρόπλασμα όπου Κάποια μεταφράζονται από τα ριβοσώματα του ξενιστή

21 Εισαγωγή DNA σε κύτταρα καλλιέργειας ή σε σωματικά κύτταρα πειραματικών ζώων μέσω ρετροιών Κύτταρα πακεταρίσματος Γονιδιακή κατασκευή

22 Μεταφορά γονιδίων σε κύτταρα με ρετροιούς Το φυσιολογικό γονίδιο ενσωματώνεται σ ένα ιικό φορέα Μολύνει κύτταρα πακεταρίσματος Παράγονται ιοί που περιέχουν το RNA του γονιδίου Οι τροποποιημένοι ιοί μολύνουν σωματικά κύτταρα π.χ. λεμφοκύτταρα που έχουν ήδη απομονωθεί και καλλιεργηθεί ex vivo To RNA θα μετατραπεί σε DNA που θα ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του ξενιστή

23 Γονιδιακή κατασκευή 8 kb R P Γονίδιο R R (LTRs, long terminal repeats):αλληλουχίες απαραίτητες για την ενσωμάτωση του DNA στο γονιδίωμα του ξενιστή, λειτουργούν επίσης ως ενισχυτές επιτρέποντας έντονη μεταγραφή του «ξένου γονιδίου» P: αλληλουχίες απαραίτητες για το πακετάρισμα του RNA σε ιικά σωματίδια Πλεονέκτημα: Ενδείκνυται για μακρόχρονη έκφραση του γονιδίου Mειονέκτημα: η ενσωμάτωση δεν είναι ειδική οπότε μπορεί να καταστρέψει ενδογενή γονίδια Εφαρμογές Εισαγωγή DNA σε κύτταρα καλλιέργειας ή σε σωματικά κύτταρα πειραματικών ζώων μέσω ρετροιών Τροποποίηση της γαμετικής σειράς σε ψάρια, μαλάκια, πτηνά, ποντίκια, αγελάδες

24 Αδενοϊοί Διπλής έλικας DNA που κωδικοποιεί 30 πρωτεΐνες Οι φυσικού τύπου ιοί μολύνουν το ανώτερο αναπνευστικό σύστημα του ανθρώπου Το DNA δεν ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του ξενιστή οπότε χάνεται σε κύτταρα που διπλασιάζονται Ενδείκνυται ως φορέας σε κύτταρα που δεν πολλαπλασιάζονται Μειονέκτημα: Υψηλή αντιγονικότητα

25 Προβλήματα στην γονιδιακή θεραπεία Ενεργοποίηση ανοσοποιητικού συστήματος λόγω της υψηλής αντιγονικότητας των ιικών φορέων Γονιδιακή θεραπεία με χαμηλή απόδοση Επαναχορήγηση σε τακτά χρονικά διαστήματα Προβλήματα που σχετίζονται με τους ιικούς φορείς: τοξικότητα, ανοσοποιητικές και φλεγμονώδεις αντιδράσεις, παθογένεια Οι πολυγονιδιακές ασθένειες (διαβήτης, αρθρίτιδα) δεν θεραπεύονται με μονογονιδιακή θεραπεία Πιθανότητα εμφάνισης καρκίνου λόγω της μη ελεγχόμενης θέσης ενσωμάτωσης.

26 Επαγόμενα πλειοδύναμα βλαστικά κύτταρα Induced Pluripotent Stem cells ips Αποδιαφοροποίηση σωματικών κυττάρων και επαναπρογραμματισμός σε πλειοδύναμα κύτταρα

Σχετικά έγγραφα

ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΙΚΗ

ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΗ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΙΚΗ ΑΝΑΣΤΡΟΦΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ (γονίδιο φαινότυπος) Πρόσθεση εξωγενών γονιδίων (διαγονιδιακά) Τροποποίηση ενδογενών γονιδίων Αφαίρεση γονιδίων (knockout) ΥΠΟΘΕΣΗ Στοχευμένη μεταλλαξογένεση