Γενετική απαλοιφή. G. Patrinos

Transcript

1 Γενετική απαλοιφή

2 Γιατί το ποντίκι είναι το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο είδος στη βιοτεχνολογία Χαμηλό κόστος Ευκολία χειρισμών Μικρός χρόνος αναπαραγωγής (19 ημέρες) Μεγάλος αριθμός ομόμικτων (inbred) γενετικών σειρών (σειρές στις οποίες το 99.99% των γενετικών τόπων είναι σε ομοζυγωτία) Μεγάλος αριθμός μεταβολικών οδών και φυσιολογικών διεργασιών είναι ΟΜΟΙΟΣ με τον άνθρωπο => Μοντέλα για ανθρώπινες ασθένειες

3 ιαγονιδιακή τεχνολογία στα ποντίκια Συμβατική διαγένεση Μεταφορά με μικροένεση ενός διαγονιδίου σε γονιμοποιημένα ωοκύτταρα. Το εξωγενές DNA ενσωματώνεται ΤΥΧΑΙΑ στο γονιδίωμα του ζώου. Τα ωοκύτταρα επανεισάγονται σε μητέρατροφό, ηοποίαγεννάτην1 η διαγονιδιακή σειρά. Τα ζώα που φέρουν το διαγονίδιο αναγνωρίζονται με συμβατική γονοτύπιση (στύπωση Southern ή PCR). Εφαρμογές: Εκτοπική ή ιστο-ειδική έκφραση in vivo; Επιπλέον λειτουργία.

4 Το ποντίκι εργαστηρίου: Προεμφυτευτικά αναπτυξιακά στάδια From: Manipulating the mouse embryo

5 Το ποντίκι εργαστηρίου: Προεμφυτευτικά αναπτυξιακά στάδια From: Manipulating the mouse embryo

6 Περιορισμοί συμβατικής διαγένεσης Τυχαία ενωμάτωση Πιθανή διαταραχή της δομής ενδογενών γονιδίων, με αποτέλεσμα καρκινογένεση ή θνησιμότητα σε εμβρυϊκό στάδιο Μεταβλητό πρότυπο γονιδιακής έκφρασης, συναφές με το σημείο ενσωμάτωσης του διαγονιδίου στο ενδογενές γονιδίωμα Πολλαπλά γονιδιακά αντίγραφα Μεταβλητή γονιδιακή έκφραση

7 ιαγονιδιακή τεχνολογία στα ποντίκια Γονιδιακή απαλοιφή με ομόλογο ανασυνδυασμό Εισαγωγή μιας συγκεκριμένης μεταλλαγής στο ενδογενές γονιδίωμα του ποντικού μέσω πολυδύναμων εμβυϊκών βλαστοκυττάρων (ES cells). Τα κύτταρα αυτά επανεισάγονται σε βλαστοκύστεις και οι τελευταίες σε μητέρες-τροφούς, οι οποίες θα γεννήσουν χιμαιρικές σειρές. Οι χίμαιρες διασταυρώνονται, κατόπιν, με ποντίκια άγριου τύπου για μετάδοση της γενετικά τροποποιημένων βλαστοκυττάρων. Εφαρμογές: Επιπλέον λειτουργία ή απώλεια λειτουργίας.

8 Γονιδιακή στόχευση με ομόλογο ανασυνδυασμό Βλαστοκύτταρα Στοχευμένο βλαστοκύτταρο 1α. Γενετική στόχευση 1β. Απομόνωση στοχευμένου κλώνου και πολλαπλασιασμός 1δ. Μεταμόσχευση βλαστοκύστης και γέννηση χιμαιρικής σειράς 1γ. Μικροένεση στοχευμένων βλαστοκυττάρων σε βλαστοκύστη Χίμαιρα ιαγονιδιακά (γκρί) και άγριου-τύπου (άσπρα) ποντίκια

9 Ομόλογος ανασυνδυασμός στα βλαστοκύτταρα Βλαστοκύτταρα: Πολυδύναμα εμβρυϊκά κύτταρα το οποία μπορούν να δώσουν γένεση εν δυνάμει σε όλους τους ιστούς και προέρχονται από τη βλαστοκύστη σε προεμφυτευτικό στάδιο. Τα βλαστοκύτταρα καλλιεργούνται σε θρεπτικό υλικό τροφικής στοιβάδας με ανενεργούς ινοβλάστες ποντικού (inactivated mouse embryonic fibroblasts, MEFs) παρουσία LIF (leukemia inhibiting factor). Το όχημα στόχευσης (targeting vector) μεταφέρεται στα βλαστοκύτταρα με φυσικό (ηλεκτρισμό, electroporation) ή χημικό(λιποσώματα, lipofection) τρόπο. Για την επίτευξη υψηλών αποδόσεων στον ανασυνδυασμό, τα ανασυνδυασμένα μόρια DNA που ενίονται πρέπει να προέρχονται από την ίδια ομόμικτη σειρά του ποντικού που έχουν προέλθει και τα βλαστοκύτταρα (ισογενή), συνήθως 129 Ola ή SV. Το μήκος της εκατέρωθεν ομόλογης περιοχής στο ανασυνδυασμένο DNA που ενίεται είναι ανάλογο με την συχνότητα/απόδοση του ομόλογου ανασυνδυασμού.

10 Βλαστοκύτταρα Τροφική στοιβάδα: Ανενεργοί ινοβλάστες (MEF s)

11 Γονιδιακή στόχευση με ομόλογο ανασυνδυασμό: Οχήματα προσθήκης (insertion vectors) SacI XbaI BamHI KpnI ATG KpnI SacI BamHI Ανιχνευτης A Εκκινητής 1 exon 1 exon 2 exon 3 Ανιχνευτής Β χημα προσθήκης neo tk Εκκινητής 2 Ομόλογος ανασυνδυασμός SacI BamHI ATG SacI BamHI neo Ανιχνευτής Α exon 2 exon 3 Ανιχνευτής Β

12 SacI Γονιδιακή στόχευση με ομόλογο ανασυνδυασμό: Οχήματα απαλοιφής (deletion vectors) XbaI BamHI KpnI ATG KpnI SacI BamHI Ανιχνευτής Α Εκκινητής 1 exon 1 exon 2 exon 3 Ανιχνευτής Β BamHI KpnI KpnI SacI neo Εκκινητής 2 exon 3 tk Όχημα απαλοιφής Ομόλογος ανασυνδυασμός SacI BamHI KpnI KpnI SacI BamHI neo Ανιχνευτής Α exon 3 Ανιχνευτής Β

13 Γονιδιακή απαλοιφή: Επιλογή κλώνων Φορέας στόχευσης neo tk Μεταφορά βλαστοκυττάρων Επιλογή βλαστοκυττάρων: G418 + GANC Τυχαία ενσωμάτωση: neo + /tk +, ΑΡΑ Ανθεκτικά σε G418 και Ευαίσθητα σε GANC Ομόλογος ανασυνδυασμός: neo + /tk -, ΑΡΑ Ανθεκτικά σε G418 και GANC

14 Μικροένεση βλαστοκυττάρων σε βλαστοκύστεις

15 Γενετική της γονιδιακής απαλοιφής Τα κύτταρα ES προέρχονται από ζώα 129 Ola (ή SV) Οι βλαστοκύστεις προέρχονται από ζώα C57BL6 Οι χίμαιρες αποτελούν μωσαϊκό από ζώα σωματικά και γεννητικά κύτταρα ζώων C57BL6 (μαύρα) και 129 Χίμαιρα

16 Γενετική γονιδιακής απαλοιφής: Παραγωγή χίμαιρας Μη χιμαιρικά ζώα Μητέρες-τροφοί Χιμαιρικά ζώα Τομές εμφύτευσης

17 Γονιδιακή στόχευση και θνησιμότητα στο έμβρυο Χίμαιρα C57BL6 άγριου τύπου ιαστάυρωση αδελφών ζώων (ετερόζυγων για την εν λόγω γονιδιακή στόχευση)? Η παρουσία ή απουσία ομόζυγων ζώων μεταξύ των απογόνων είναι ενδεικτική του αν μια στοχευμένη μεταλλαγή είναι θανατηφόρος ή όχι στο εμβρυϊκό στάδιο, αντίστοιχα

18 Γονιδιακή στόχευση με τεχνολογία Cre-loxP Εκκινητής 1 exon 1 exon 2 exon 3 Εκκινητής 2 neo/tk lox P lox P Ομόλογος ανασυνδυασμός (Επιλογή με G418) neo/tk Εκκινητής 1 exon 1 exon 2 exon 3 εκκινητής 2 Επαγωγή CRE-recombinase (Επιλογή με GANC) Εκκινητής 1 Εκκινητής 2

19 Ιστο-ειδική γενετική στόχευση με τεχνολογία Cre-loxP Ερώτημα: Επίδραση της αδρανοποίησης ενός γονιδίου που είναι θνησιγόνο στο εμβρυϊκό στάδιο σε έναν ιστό (π.χ. ουρά!!) ενήλικου ζώου. Γονίδιο Cre Γονίδιο A Ιστοειδικός εκκινητής για την «ουρά» Σεόλατασωματικά κύτταρα εκτός «ουράς»: Γονίδιο Cre Στα κύτταρα της «ουράς»: Γονίδιο Cre NO CRE EXPRESSION CRE EXPRESSION Παρουσία γονιδίου A ιαγραφή γονιδίου A

20 Ανασυνδυασμός χρωμοσωμάτων Cre-loxP ύο κύκλοι στόχευσης με loxp Επαγωγή Cre Στοχευμένη χρωμοσωμική μετάθεση

21 Εναλλακτικός τρόπος διαγένεσης με ιούς τύπου lenti Αρχή ιαμόλυνση των βλαστοκυττάρων ή εμβρύων σε προεμφυτευτικό στάδιο με ιούς lenti, ως φορείς για γονιδιακή μεταφορά. Πλεονεκτήματα 1. Πολύ υψηλή απόδοση στη γονιδιακή μεταφορά (ως 100%) 2. Απουσία αποσιώπησης διαγονιδίων 3. Απουσία ομαδοποίησης διαγονιδίων (concatamerization) Μειονέκτημα Μικρή χωρητικότητα (μέγεθος διαγονιδίου ως 20kb)

22

23

24 Χίμαιρες από συγχώνευση: Ένας εναλλακτικός τρόπος γονιδιακής στόχευσης 5-8 cell stage 2.5 days p.c.

25 Αρχή Γονιδιακή στόχευση με χρήση τετραπλοϊδών ζώων Παραγωγή τετραπλοϊδών εμβρύων (4n), μεσκοπότηδημιουργία χιμαιρών από συγχώνευση με βλαστοκύτταρα F1 (129Sv x C57BL/6) Τα τετραπλοϊδή έμβρυο κανονικά έχουν πολύ πτωχή ανάπτυξη. Στις χίμαιρες. Όλα τα κύτταρα προέρχονται από τα F1 βλαστοκύτταρα-δότες ενώ τα τετραπλοϊδή κύτταρα παράγουν λίγους ιστούς και τροφοβλαστικά κύτταρα στη βλαστοκύστη και τον πλακούντα. Πλεονεκτήματα 1. Πολλαπλοί κύκλοι στόχευσης στα βλαστοκύτταρα F1 2. Παράκαμψη του χιμαιρικού ενδιάμεσου σταδίου => Ταχύτερα 3. Απαιτούνται λιγότερα ζώα

26 Γονιδιακή στόχευση με χρήση τετραπλοϊδών ζώων

27 Κλωνοποίηση ζώων με πυρηνική μεταφορά Μη-φυλετική αναπαραγωγή ενός οργανισμού, με τέτοιο τρόπο ώστε οι απόγονοι έχουν πανομοιότυπο πυρηνικό γονιδίωμα Οι πυρήνες προέρχονται από σωματικά κύτταρα ή βλαστοκύτταρα Έχει εφαρμοστεί κυρίως σε πρόβατα, κατσίκες, αγελάδες, κουνέλια, γάτες, ποντίκια, (άνθρωπο ;;;!!)

28 Πυρηνική μεταφορά ότης ωοκυττάρων Βλαστοκύτταρα Μεταφορά προ-πυρήνα Βλαστοκύστη Εισαγωγή πυρήνα Εμφύτευση

29 Οι κλώνοι δεν είναι ποτέ ίδιοι!!!