PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο

Transcript

1 PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο Εκδοση 2 Το σύστημα PAXgene Blood RNA συνίσταται από σωληνάρια λήψης αίματος (PAXgene Blood RNA Tube) και κιτ απομόνωσης νουκλεїνικού οξέος (PAXgene Blood RNA Kit). Το σύστημα χρησιμοποιείται για τη λήψη, αποθήκευση και τη μεταφορά δειγμάτων αίματος, τη σταθεροποίηση ενδοκυτταρικού RNA σε κλειστά σωληνάρια καθώς και για την ακολουθούμενη απομόνωση και καθαρισμό ενδοκυτταρικού RNA από ολικό αίμα σε μοριακά διαγνωστικά τεστ που βασίζονται στη RT-PCR. Τα αναφερόμενα στο εγχειρίδιο αυτό χαρακτηριστικά της μεθόδου του συστήματος PAXgene Blood RNA ισχύουν για FOS και IL1B μεταγραφήματα γονιδίων. Ο χρήστης είναι υπεύθυνος για τη δυνατότητα χρησιμοποίησης του συστήματος PAXgene Blood RNA και την παραγωγή αντίστοιχων χαρακτηριστικών της μεθόδου για άλλα μεταγραφήματα-στόχος. Για διαγνωστικές εφαρμογές in vitro EL PreAnalytiX GmbH, Feldbachstrasse, CH-8634 Hombrechtikon Κατσκευάζεται από τη QIAGEN GmbH για την PreAnalytiX R EL Απρίλιος 2008

2

3 Εμπορικό σήμα/εμπορική ονομασία PAXgene, PreAnalytiX (PreAnalytiX GmbH); QIAGEN, QIAcube (QIAGEN Group); BD Vacutainer, BD Hemogard, Safety-Lok (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA); Eppendorf (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH). Τα PAXgene Blood RNA Kit δεν είναι διαθέσιμα σε όλες τις χώρες, παρακαλούμε πληροφορηθείτε σχετικά. Συμφωνία περιορισμένης αδείας Η χρήση του προїόντος αυτού σημαίνει ότι κάθε αγοραστής ή χρήστης του PAXgene Blood RNA Kit συμφωνεί με τους ακόλουθους όρους: 1 Το PAXgene Blood RNA Kit μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο σύμφωνα με το εγχειρίδιο PAXgene Blood RNA Kit και μόνο με τα αντιδραστήρια που περιέχονται στο κιτ. Η PreAnalytiX δεν παραχωρεί καμμία άδεια υπό την πνευματική της ιδιοκτησία για τη χρήση ή συσσωμάτωση των περιεχομένων στο κιτ αυτό αντιδραστηρίων με αντιδραστήρια που δεν συμπεριλαμβάνονται εντός του ίδιου κιτ εκτός εάν αναφέρεται στο εγχειρίδιο του PAXgene Blood RNA Kit και στα περιλαμβανόμενα πρωτόκολλα διαθέσιμα στην ιστοσελίδα 2 Διαφορετικά από τις κατηγορηματικές κρατικές άδειες, η, PreAnalytiX δεν παρέχει καμμία εγγύηση ότι αυτό το κιτ και/ή η χρήση του δεν παραβιάζει τα δικαιώματα τρίτων προσώπων. 3 Το κιτ αυτό και τα αντιδραστήριά του διατίθενται για μία χρήση και δεν μπορούν να επαναχρησιμοποιηθούν, ανακαινισθούν ή μεταπωληθούν. 4 Ειδικότερα η PreAnalytiX αποποιεί οποιαδήποτε άλλες άδειες, που διατυπώνουν ή υπονοούν οτιδήποτε άλλο από τις σαφείς αυτές συνθήκες. 5 Ο αγοραστής και ο χρήστης του κιτ συμφωνεί να μην επιτρέπει σε κανένα άλλο να λαμβάνει οποιαδήποτε μέτρα που θα μπορούσαν να οδηγήσουν ή να διευκολύνουν πράξεις που απαγορεύονται παραπάνω. Η PreAnalytiX μπορεί να επιβάλλει τις απαγορεύσεις αυτής της συμφωνίας περιορισμένης αδείας σε οποιοδήποτε δικαστήριο και να ανακτήσει όλα της τα ποανακριτικά και του δικαστηρίου έξοδα συμπεριλαμβανομένων και των δικηγορικών αμοιβών, σε κάθε πράξη που επιβάλλει αυτή η συμφωνία περιορισμένης αδείας ή οτιδήποτε από τα δικαιώματα της πνευματικής της ιδιοκτησίας που έχουν σχέση με το κιτ και/ή τα αντιδραστήριά του. Για νεότερη ενημέρωση που αφορούν τους όρους αδείας, μπορείτε να δείτε στην ιστοσελίδα PreAnalytiX GmbH, όλα τα δικαιώματα είναι κατωχυρωμένα. PreAnalytiX PreAnalytiX GmbH Feldbachstrasse CH 8634 Hombrechtikon Ελβετία Αντιπρόσωποι PreAnalytiX Τα προϊόντα PreAnalytiX κατασκευάζονται από τη QIAGEN ή BD για την PreAnalytiX και διατίθενται από τη QIAGEN ή BD για την PreAnalytiX. Τα προϊόντα δεν μπορούν να παραγγελθούν από την PreAnalytiX GmbH. Τις διευθύνσεις των αντιπροσώπων PreAnalytiX της περιοχής σας μπορείτε να τις βρείτε στην τελευταία σελίδα.

4

5 Περιεχόμενα Ερμηνεία των συμβόλων 4 Περιεχόμενο του κιτ 5 Συνθήκες αποθήκευσης 6 Προβλεπόμενη χρήση 6 Περιορισμοί χρήσης 7 Ελεγχος ποιότητας 7 Τεχνική εξυπηρέτηση 7 Πληροφορίες ασφάλειας 7 Εισαγωγή 10 Αρχή και εφαρμογή 10 Παραλαβή δειγμάτων και σταθεροποίηση 10 Χειροκίνητη απομόνωση RNA 19 Αυτοματοποιημένη απομόνωση του RNA 27 Παρεχόμενος εξοπλισμός και αντιδραστήρια 31 Σημαντικές σημειώσεις 32 Χειρισμός του QIAcube 32 Εκκίνηση του QIAcube 32 Εγκατάσταση πρωτοκόλλων στο QIAcube 32 Πλήρωση του QIAcube 34 Πρωτόκολλο: Χειροκίνητη απομόνωση του συνολικού RNA από ολικό αίμα ανθρώπου συλλεγμένου σε PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) 43 Πρωτόκολλο: Αυτοματοποιημένη απομόνωση του συνολικού RNA από ολικό αίμα ανθρώπου συλλεγμένου σε PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) 49 Οδηγός αντιμετώπισης προβλημάτων 54 Παράρτημα A: Γενικές υποδείξεις για το χειρισμό του RNA 56 Παράρτημα B: Ποσοτικοποίηση και προσδιορισμός της ποιότητας του συνολικού RNA 57 Παράρτημα C: Χειρισμός των PAXgene Blood RNA Tubes 59 Πληροφορίες παραγγελιών 60 PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008 3

6 Ερμηνεία των συμβόλων i <N> Το περιεχόμενο επαρκεί για <N> τεστ Λάβετε υπόψη τις οδηγές χρήσης Ημερομηνία λήξης Απαγορεύεται η χρήση Διαγνωστικό ιατρικό προϊόν in-vitro Αριθμός καταλόγου Αριθμός παρτίδας Αριθμός υλικού Συστατικά Αριθμός Αποστείρωση με ακτινοβολία UV Μονάδες Kunitz Περιορισμοί θερμοκρασίας Ανώτατο όριο θερμοκρασίας Κατασκευαστής Σημαντικές οδηγίες? EtOH Μετά την προσθήκη αιθανόλης στη φιάλη σημειώστε την τρέχουσα ημερομηνία Προθεσμία παράδοσης Προσθήκη Περιέχει Επανασύσταση Δεσοξυριβονουκλεάση Ι Αιθανόλη Ισοθειοκυανική γουανιδίνη Σετ DNάσης ελεύθερο RNάσης Οδηγίες στο 4 PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008

7 Περιεχόμενο του κιτ PAXgene Blood RNA Kit (50) Αρ. καταλόγου Αριθμός προπαρασκευασμάτων 50 BR 1 Ρυθμιστικό διάλυμα επανασύστασης 20 ml BR 2 BR 3 Δεσμευτικό ρυθμιστικό διάλυμα * Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης 1* 18 ml 45 ml BR 4 BR5 RNFW PK PRC Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης 2 (συμπυκνωμένο) Ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλησης Νερό ελεύθερο RNάσης (σε φιάλη) Πρωτεϊνάση K (πράσινο κάλλυμα) Στήλες διαχωρισμού PAXgene RNA (κόκκινη) 2 x 125 ml 2 x 1,4 ml 11 ml 6 ml 5 x 10 PT Σωληνάρια ανάλυσης (2 ml) Hemogard Δευτερεύων κλείστρο BD Hemogard MCT Σωληνάρια μικροφυγοκέντρησης (1,5 ml) 6 x x 50 1 x 10 RNFD DNάση l, ελεύθερη RΝάσης (λυοφιλοποιημένη) 1500 ΜονάδεςKunitz Συνέχεια του πίνακα στην επόμενη σελίδα * Να μην έρχεται σε επαφή με μέσα απολύμανσης που περιέχουν λευκαντικό χλωρίου. Περιέχει ένα άλας γουανιδίνης. Βλέπε τις πληροφορίες ασφάλειας στη σελίδα 8. Το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης 2 (BR4) παραδίδεται μαζί με το κιτ σε συμπυκνωμένη μορφή. Πριν από την πρώτη χρήση, προσθέστε στη φιάλη τον τετραπλάσιο όγκο αιθανόλης ( %, βαθμός καθαρότητας ανά ανάλ.), όπως αναφέρεται στην ετικέττα, για τη παρασκευή του διαλύματος εργασίας. Η μονάδα Kunitz είναι μία κοινή μονάδα μέτρησης της DNase I; τον ορισμό θα το βρείτε στη σελίδα 42 ή 48. PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008 5

8 PAXgene Blood RNA Kit (50) Αρ. καταλόγου Αριθμός προπαρασκευασμάτων 50 RDD DRB PSC Ρυθμιστικό διάλυμα κατάτμησης DNA (άσπρο κάλυμμα) Ρυθμιστικό διάλυμα επανασύστασης Dnάσης (σωληνάριο,μωβ κάλλυμα) Στήλες διαχωρισμού ομογενοποίησης PAXgene (μωβ) Εγχειρίδιο PAXgene Blood RNA Kit ( Εκδοση 2) 2 x 2 ml 2 ml 5 x 10 1 Συνθήκες αποθήκευσης Οι στήλες διαχωρισμού PAXgene RNA (PRC) και οι στήλες διαχωρισμού ομογενοποίησης PAXgene (PSC) καθώς η πρωτεϊνάση K (PK) και όλα τα ρυθμιστικά διαλύματα (BR1, BR2, BR3, BR4 και BR5) μπορούν να αποθηκευθούν υπό συνθήκες ξηρασίας στη θερμοκρασία που αναγράφεται στην ετικέττα. Το σετ DNάσης ελεύθερο RNάσης, το οποίο περιέχει DNάση I (RNFD), ρυθμιστικό διάλυμα κατάτμησης DNA (RDD) και ρυθμιστικό διάλυμα επανασύστασης DΝάσης (DRB), αποστέλλεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Αμέσως μετά την παραλαβή αποθηκεύστε όλα τα περιεχόμενα του σετ DNάσης ελεύθερο RNάσης στη θερμοκρασία που αναφέρεται στην ετικέττα. Προβλεπόμενη χρήση Το PAXgene Blood RNA Kit χρησιμεύει στον καθαρισμό του κυτταρικού RNA από ολικό αίμα που συλλέγεται με PAXgene Blood RNA Tubes (BRT). Μαζί με το σύστημα, το οποίο συνίσταται από το κιτ και τα PAXgene Blood RNA Tubes, παραλαμβάνετε και καθαρό ενδοκυτταρικό RNA από δείγματα ολικού αίματος, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μοριακά διαγνωστικά τεστ που έχουν σχέση με τη RT-PCR. Υποδείξεις για τη χρήση των PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) μπορείτε να βρείτε στην περιγραφή του προϊόντος PAXgene Blood RNA Tubes. Τα αναφερόμενα στο εγχειρίδιο αυτό χαρακτηριστικά της μεθόδου του συστήματος PAXgene Blood RNA ισχύουν για FOS και IL1B μεταγραφήματα γονιδίων. Ο χρήστης είναι υπεύθυνος για τη δυνατότητα χρησιμοποίησης του συστήματος PAXgene Blood RNA και την παραγωγή αντίστοιχων χαρακτηριστικών της μεθόδου για άλλα μεταγραφήματα-στόχος. 6 PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008

9 Περιορισμοί χρήσης Το PAXgene Blood RNA Kit χρησιμοποιείται ως μέσο για τον καθαρισμό ενδοκυτταρικού RNA από ολικό αίμα ανθρώπου (4,8 x ,1 x 10 7 λευκοκύτταρα/ml), για τη διαγνωστική χρήση in vitro. Δεν ενδείκνυται για τον καθαρισμό γονιδιωματικού DNA ή νουκλεϊνικών οξέων ιών από ολικό αίμα. Επειδή οι συνθήκες σταθεροποίησης που περιέχονται στο εγχειρίδιο αυτό ισχύουν μόνο για ένα περιορισμένο αριθμό μεταγραφημάτων RNA (FOS και IL1B μεταγραφήματα), δεν μπορεί να καθορισθεί μία χαρακτηριστική μέθοδος για όλα τα μεταγραφήματα. Ο χρήστης του κιτ θεωρείται υπεύθυνος για τον έλεγχο των δικών του δεδομένων και αυτών του παρασκευαστή, για να αποφασίσει εάν είναι απαραίτητη μία εγκυρότητα και για άλλα μεταγραφήματα εκτός αυτών που αναφέρονται σε αυτό το εγχειρίδιο. Ελεγχος ποιότητας Σύμφωνα με το σύστημα πιστοποιητικού ποιοτικής διαχείρησης ISO της QIAGEN, ελέγχεται κάθε παρτίδα του PAXgene Blood RNA Kit υπό καθορισμένα κριτήρια ελέγχου, για την εξασφάλιση μιας ομοιόμορφης ποιότητας του προϊόντος. Τεχνική εξυπηρέτηση Στη QIAGEN είμαστε υπερήφανοι για την ποιότητα και την διαθεσιμότητα της τεχνικής μας εξυπηρέτησης. Το τμήμα της τεχνικής μας εξυπηρέτησης είναι πλαισιωμένο με έμπειρους επιστήμονες με ευρεία πρακτική και θεωριτική γνώση στη μοριακή βιολογία και στη χρήση των προϊόντων της AnalytiX. Εάν έχετε ερωτήσεις που αφορούν το PAXgene Blood RNA Kit, μην καθυστερείτε να έρθετε σε επαφή μαζί μας. Για τεχνική εξυπηρέτηση και περισσότερες πληροφορίες παρακαλούμε τηλεφωνήστε την τεχνική υπηρεσία της QIAGEN (βλέπε σελιδα 17). Πληροφορίες ασφάλειας Κατά την επαφή σας με χημικές ουσίες, φορέστε πάντα ποδιά εργαστηρίου, γάντια και γυαλιά ασφάλειας. Για να αποφύγετε τον κίνδυνο μιας μόλυνσης (π. χ.με τους ιούς HIV ή ηπατίτιδας B) ή τραυματισμού κατά την επαφή σας με βιολογικά και χημικά υλικά, φοράτε πάντα ποδιά εργαστηρίου, γάντια μιας χρήσης και γυαλιά ασφάλειας. Περαιτέρω πληροφορίες μπορείτε να βρείτε στα φυλλάδια δεδομένων ασφάλειας (material safety data sheets, MSDSs). Στην επιγραμμική συλλογή μας των φυλλαδίων δεδομένων ασφάλειας, στην ιστοσελίδα μπορείτε να βρείτε για κάθε κιτ και κάθε περιεχόμενο του κιτ το εκάστοτε MSDS ως PDF αρχείο, το οποίο μπορείτε να διαβάζετε και να εκτυπώνετε. Το δεσμευτικό ρυθμιστικό διάλυμα (BR2) και ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης 1 (BR3) περιέχουν ισοθειοκυανική γουανιδίνη, η οποία κατά την επαφή του με λευκαντικό χλωρίου αντιδρά έντονα. Εάν χυθεί ένα υγρό που περιέχει δεσμευτικό ρυθμιστικό διάλυμα (BR2) ή ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης 1 (BR3), καθαρείστε την επιφάνεια με PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008 7

10 ένα κατάλληλο απολυμαντικό εργαστηρίου και με νερό. Εά το υγρό που χύθηκε περιέχει δυνητικά μολυσματικούς παράγοντες, καθαρείστε την επιφάνεια αρχικά με απολυμαντικό και νερό και στη συνέχεια με 1 % (v/v) υποχλωρικό νάτριο. ΠΡΟΣΟΧΗ: ΜΗΝ ΠΡΟΣΘΕΤΕΤΕ λευκαντικά χλωρίου ή όξινα διαλύματα κατευθείαν στα υγρά απορίμματα της προπαρασκευής. Το μίγμα του σταθεροποιητικού διαλύματος RNA και του αίματος από τα PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) μπορούν να απολυμανθούν χρησιμοποιώντας 1 όγκο διαλύματος λευκαντικού χλωρίου (5 % υποχλωρικό νάτριο) ανά 9 όγκους μίγματος σταθεροποιητικού διαλύματος RNA και αίματος. Τα απορίμματα που προκύπτουν κατά την προπαρασκευή του RNA, π.χ. τα υπερκείμενα υγρά μετά από τα στάδια φυγοκέντρησης, πρέπει να θεωρούνται πάντα δυνητικά μολυσματικά. Για την καταστροφή των μολυσματικών υλικών, πρέπει τα απορίμματα, πριν από την τελική τους απομάκρυνση, να αποστειρωθούν ή να καούν. Σε κάθε περίπτωση λάβετε υπόψη τις ισχύουσες υποδείξεις και κανονισμούς που αφορούν την απομάκρυνση υλικών. Οι ακόλουθες φράσεις κινδύνου και ασφάλειας ισχύουν για τα αντιδραστήρια του PAXgene Blood RNA Kit. Υποδείξεις ασφάλειας για την χρησιμοποίηση των PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) μπορείτε να βρείτε στην περιγραφή του προϊόντος PAXgene Blood RNA Tube. Δεσμευτικό ρυθμιστικό διάλυμα (BR2) Xn Περιέχει ισοθειοκυανική γουανιδίνη: ανθυγιεινό (Xn). Φράσεις κινδύνου και ασφάλειας:* R20/21/22-32, S Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης 1 (BR3) Περιέχει αιθανόλη: εύφλεκτη. Φράση κινδύνου:* R10 * R10: Εύφλεκτο. R20/21/22: Ανθυγιεινό κατά την αναπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα. R32: Κατά την επαφή με οξέα παράγονται πολύ τοξικά αέρια. R36/37/38: Ερεθίζει τα μάτια, αναπνευστικά όργανα και το δέρμα. R42/43: Πιθανή ευαισθητοποίηση μέσω εισπνοής και επαφής με το δέρμα. S13: Να φυλάσσεται μακρυά από τρόφιμα, ποτά και ζωοτροφές. S22: Να μην εισπνέεται η σκόνη. S23: Να μην εισπνέεται αέριο/καπνός/ατμός/αερόλυμα. S24: Αποφυγή επαφής με το δέρμα. S26: Σε περίπτωση επαφής με τα μάτια ξεπλύνετέ τα πολύ καλά με νερό και συμβουλευτείτε τον ιατρό. S36: Κατά τη διάρκεια της εργασίας να φοράτε ειδικά προσταστευτικά ρούχα. S36/37: Κατά τη διάρκεια της εργασίας να φοράτε ειδικά προστατευτικά γάντια και ρούχα. S46: Σε περίπτωση κατάποσης συμβουλευτείτε αμέσως τον ιατρό και δείξτε τη συσκευασία και την ετικέττα. 8 PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008

11 Πρωτεϊνάση K (PK) Xn Περιέχει πρωτεϊνάση K (από Tritirachium album): ευαισθητοποιητικό, ερεθιστικό. Φράσεις κινδύνου και ασφάλειας:* R36/37/38-42/43, S /37 DNάση I Xn Περιέχει δεσοξυριβονουκλεάση (από βοοειδή): ευαισθητοποιητικό. Φράσεις κινδύνου και ασφάλειας:* R42/43, S /37 Κλήση κινδύνου σε 24ωρη βάση Σε περίπτωση κινδύνου μπορείτε να πάρετε ιατρικές πληροφορίες όλο το 24ωρο στην αγγλική, γαλλική και γερμανική γλώσσα: Κέντρο πληροφοριών δηλητηριάσεων στο Mainz, Γερμανία τηλ: * R10: Εύφλεκτο. R20/21/22: Ανθυγιεινό κατά την αναπνοή, κατάποση και επαφή με το δέρμα. R32: Κατά την επαφή με οξέα παράγονται πολύ τοξικά αέρια. R36/37/38: Ερεθίζει τα μάτια, αναπνευστικά όργανα και το δέρμα. R42/43: Πιθανή ευαισθητοποίηση μέσω εισπνοής και επαφής με το δέρμα. S13: Να φυλάσσεται μακρυά από τρόφιμα, ποτά και ζωοτροφές. S22: Να μην εισπνέεται η σκόνη. S23: Να μην εισπνέεται αέριο/καπνός/ατμός/αερόλυμα. S24: Αποφυγή επαφής με το δέρμα. S26: Σε περίπτωση επαφής με τα μάτια ξεπλύνετέ τα πολύ καλά με νερό και συμβουλευτείτε τον ιατρό. S36: Κατά τη διάρκεια της εργασίας να φοράτε ειδικά προστστευτικά ρούχα. S36/37: Κατά τη διάρκεια της εργασίας να φοράτε ειδικά προστατευτικά γάντια και ρούχα. S46: Σε περίπτωση κατάποσης συμβουλευτείτε αμέσως τον ιατρό και δείξτε τη συσκευασία και την ετικέττα. PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008 9

12 Εισαγωγή Το πρώτο βήμα σε πολλές μοριοβιολογικές αναλύσεις κυτταρικού RNA είναι η λήψη δείγματος αίματος. Το κύριο πρόβλημα σε αυτές τις περιπτώσεις είναι η αστάθεια του προφίλ του κυτταρικού RNA in vitro. Ερευνες από την PreAnalytiX εδειξαν ότι ο αριθμός αντιγράφων, για μεμονωμένα είδη mrna στο ολικό αίμα, μπορεί να αλλάξει περισσότερο από το 1000πλάσιο κατά τη διάρκεια της μεταφοράς και της αποθήκευσης σε θερμοκρασία δωματίου.* Αυτό οφείλεται τόσο στην ταχεία αποδόμηση του RNA όσο και η προξενούμενη έκφραση ωρισμένων γονιδίων, μετά τη λήψη αίματος. Τέτοιου είδους αλλαγές του προφίλ του RNA εμποδίζουν την εξαγωγή αξιόπιστων αποτελεσμάτων από μελέτες έκφρασης γονιδίων. Για το λόγο αυτό, μία μέθοδος που διατηρεί το προφίλ έκφρασης RNA κατά τη διάρκεια και μετά τη λήψη αίματος, για ακριβείς αναλύσεις έκφρασης γονιδίων στο ολικό αίμα ανθρώπου, θεωρείται ουσιαστική. Αρχή και εφαρμογή Η PreAnalytiX ανέπτυξε ένα νέο σύστημα το οποίο καθιστά δυνατή τη λήψη, σταθεροποίηση, αποθήκευση και μεταφορά δειγμάτων ολικού αίματος ανθρώπου και την απομόνωση ενδοκυτταρικού RNA, σύφωνα με ένα γλήγορο και αποτελεσματικό πρωτόκολλο. Το σύστημα προϋποθέτει τη χρήση του PAXgene Blood RNA Tubes (BRT; US Πατέντες 6,602,718 και 6,617,170) για τη λήψη αίματος και σταθεροποίηση του RNA και του PAXgene Blood RNA Kit για τον επακόλουθο αυτοματοποιημένο και μη καθαρισμό του RNA. Καιτα δύο πρωτόκολλα χειροκίνητο και αυτοματοποιημένο παρέχουν ουσιαστικά ισάξια εκτέλεση σχετικά με την ποιότητα και απόδοση του RNA. Στο εγχειρίδιο αυτό περιέχονται τα δεδομένα της εκτέλεσης του χειροκίνητου (σελίδες 19 27) και του αυτοματοποιημένου πρωτοκόλλου (σελόδες 27 31). Παραλαβή δειγμάτων και σταθεροποίηση Τα PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) περιέχουν ένα αντιδραστήριο το οποίο βασίζεται σε μία κατοχυρωμένη μέθοδο σταθεροποίησης RNA. Το αντιδραστήριο αυτό προστατεύει το μοριακό RNA από την αποδόμηση μέσω της RNάσης και μειώνει στο ελάχιστο αλλαγές ex-vivo στην έκφραση γονιδίων. Τα PAXgene Blood RNA Tubes, για τη λήψη ολικού αίματος ανθρώπου, εγγυούνται τη σταθεροποίηση κυτταρικού RNA μέχρι 3 ημέρες στους C (εικ. 1 και 2, σελ. 13 και 14) ή μέχρι 5 ημέρες στους 2 8 C (εικ. 3 και 4, σελ. 15 και 16). Προς το παρόν, διατιθέμενα δεδομένα δείχνουν ότι το κυτταρικό RNA παραμένει σταθερό το λιγότερο για 24 μήνες στους 20 C ή -70 C. Περαιτέρω πληροφορίες σχετικά με τρέχουσες μελέτες για μεγαλύτερο χρόνο σταθεροποίησης, μπορείτε να λάβετε από την τεχνική εξυπηρέτηση της QIAGEN. * Rainen, L. et al. (2002) Stabilization of mrna expression in whole blood samples. Clin. Chem. 48, PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008

13 Η πραγματική διάρκεια της σταθεροποίησης του RNA μπορεί να μεταβάλλεται ανάλογα με το κάθε είδος κυτταρικού RNA και την χρησιμοποιούμενη εφαρμογή που ακολουθεί. Επειδή οι αναφερόμενες στο εγχειρίδιο αυτό συνθήκες σταθεροποίησης ισχύουν για ένα περιορισμένο αριθμό μεταγραφημάτων RNA (FOS και IL1B μεταγραφήματα γονιδίων), δεν μπορεί να καθορισθούν χαρακτηριστικά της μεθόδου για όλα τα μεταγραφήματα. Ο χρήστης θεωρείται υπεύθυνος στο να ελέγξει εάν είναι απαραίτητη μία εγκυρότητα και για άλλα μεταγραφήματα εκτός αυτών που αναφέρονται. PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/

14 Σταθερότητα RNA σε δείγματα αίματος στους C: FOS Αποθήκευση (ημέρες) Αποθήκευση (ημέρες) Εικόνα 1. Λήψη δειγμάτων αίματος από δέκα δότες, τα οποία αποθηκεύτηκαν στους C για τον αναγραφόμενο αριθμό ημερών, πριν από την απομόνωση του συνολικού RNA. Ολα τα δείγματα παρελήφθηκαν εις διπλούν. Παραλαβή αίματος και αποθήκευση σε PAXgene Blood RNA Tubes (BRT), απομόνωση του συνολικού RNA με το PAXgene Blood RNA Kit. Λήψη αίματος και αποθήκευση σε πρότυπα σωληνάρια παραλαβής αίματος με EDTA ως αντιπηκτικό, απομόνωση του συνολικού RNA με μία πρότυπη μέθοδο εκχύλισης με οργανικά μέσα διάλυσης και καθαρισμός του RNA βασιζόμενος σε μία μεβράνη χαλαζία. Οι σχετικές συγκεντρώσεις των FOS μεταγραφημάτων καθορίσθηκαν,μέσω της real-time duplex RT-PCR, χρησιμοποιώντας το 18S rrna ως εσωτερικό πρότυπο. Οι τιμές όλων των δειγμάτων που αναλύθηκαν σημειώθηκαν με μέσο όρο και τυπική απόκλιση. Οι διακεκομμένες γραμμές αποδίδουν την ± 3πλάσια συνολική ακρίβεια της μεθόδου (2,34 C T ). 12 PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008

15 Σταθερότητα RNA σε δείγματα αίματος στους C: IL1B Αποθήκευση (ημέρες) Αποθήκευση (ημέρες) Εικόνα 2. Η λήψη αίματος και η απομόνωση του συνολικού RNA, μετά από αποθήκευση στους C, έγιναν όπως περιγράφεται στην εικόνα 1. Οι σχετικές συγκεντρώσεις των IL1B μεταγραφημάτων καθορίσθηκαν, μέσω της real-time duplex RT-PCR, χρησιμοποιώντας το 18S rrna ως εσωτερικό πρότυπο. Οι τιμές όλων των δειγμάτων που αναλύθηκαν σημειώθηκαν με μέσο όρο και τυπική απόκλιση. Οι διακεκομμένες γραμμές αποδίδουν την ± 3πλάσια συνολική ακρίβεια της μεθόδου (1.93 C T ). PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/

16 Σταθερότητα RNA σε δείγματα αίματος στους 2 8 C: FOS Αποθήκευση (ημέρες) Αποθήκευση (ημέρες) Εικόνα 3. Λήψη δειγμάτων αίματος από δέκα δότες, τα οποία αποθηκεύτηκαν στους 2 8 C για τον αναγραφόμενο αριθμό ημερών, πριν από την απομόνωση του συνολικού RNA. Ολα τα δείγματα παρελήφθηκαν εις διπλούν. Παραλαβή αίματος και αποθήκευση σε PAXgene Blood RNA Tubes (BRT), απομόνωση του συνολικού RNA με το PAXgene Blood RNA Kit. Λήψη αίματος και αποθήκευση σε πρότυπα σωληνάρια λήψης αίματος με EDTA ως αντιπηκτικό, απομόνωση του συνολικού RNA με μία πρότυπη μέθοδο εκχύλισης (με οργανικά μέσα διάλυσης) και καθαρισμός του RNA βασιζόμενος σε μία μεβράνη χαλαζία. Οι σχετικές συγκεντρώσεις των FOS μεταγραφημάτων καθορίσθηκαν,μέσω της real-time duplexrt-pcr, χρησιμοποιώντας το 18S rrna ως εσωτερικό πρότυπο. Οι τιμές όλων των δειγμάτων που αναλύθηκαν σημειώθηκαν με μέσο όρο και τυπική απόκλιση. Οι διακεκομμένες γραμμές αποδίδουν την ± 3πλάσια συνολική ακρίβεια της μεθόδου (2,34 C T ). 14 PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008

17 Σταθερότητα RNA σε δείγματα αίματος στους 2 8 C: IL1B Αποθήκευση (ημέρες) Αποθήκευση (ημέρες) Εικόνα 4. Η λήψη αίματος και η απομόνωση του συνολικού RNA, μετά από αποθήκευση στους 2 8 C, έγιναν όπως περιγράφεται στην εικόνα 3. Οι σχετικές συγκεντρώσεις των IL1B μεταγραφημάτων καθορίσθηκαν,μέσω της real-time duplexrt-pcr, χρησιμοποιώντας το 18S rrna ως εσωτερικό πρότυπο. Οι τιμές όλων των δειγμάτων που αναλύθηκαν σημειώθηκαν με μέσο όρο και τυπική απόκλιση. Οι διακεκομμένες γραμμές αποδίδουν την ± 3πλάσια συνολική ακρίβεια της μεθόδου (1,93 C T ). PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/

18 Συγκέντρωση και απομόνωση RNA Το PAXgene Blood RNA Kit προβλέπεται για την απομόνωση του συνολικού RNA από 2,5 ml ολικού αίματος ανθρώπου που συλλέγεται σε ένα PAXgene Blood RNA Tube (BRT). Η διαδικασία είναι απλή και μπορεί να εκτελεσθεί χρησιμοποιώντας αυτοματοποιημένες ή μη διαδικασίες (βλέπε διάγραμμα διαδικασίας). Η απομόνωση του RNA αρχίζει με ένα στάδιο φυγοκέντρησης, για την ιζηματοποίηση των νουκλεϊνικών οξέων στο PAXgene Blood RNA Tube (BRT). Και στα δύο πρωτόκολλα, η απομόνωση του RNA αρχίζει με ένα στάδιο φυγοκέντρησης, για την ιζηματοποίηση των νουκλεϊνικών οξέων στο PAXgene Blood RNA Tube (BRT). Το ίζημα πλένεται και επανασυσταίνεται και ακολουθεί η χειροκίνητη ή αυτοματοποιημένη απομόνωση του RNA. Ουσιαστικά και τα δύο πρωτόκολλα ακολουθούν τα ίδια στάδια με τα ίδια αντιδραστήρια. 16 PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008

19 Η χειροκίνητη διαδικασία του PAXgene Blood RNA Αίμα Προσθήκη πρωτεϊνάσης K (PK) και δευσμευτικού ρυθμιστικού διαλύματος (BR2) Επώαση Μεταφορά σε στήλη διαχωρισμού ομογενοποίησης PAXgene Ανάμιξη Μεταφορά του υπερκείμενου υγρού της διαρροής σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης Προσθήκη αιθανόλης Επίθεση σε στήλη διαχωρισμού PAXgene RNA (PRC) Πλύση ιζήματος Δεύσμευση συνολικού RNA Πλύση Επανασύσταση Κατάτμηση DNA Μεταφορά σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης (MCT) Πλύση Εκχύληση Θέρμανση στους 65 C RNA έτοιμο προς χρήση PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/

20 Η αυτοματοποιημένη διαδικασία του PAXgene Blood RNA Αίμα Ανάμιξη Προσθήκη πρωτεϊνάσης K (PK) και δευσμευτικού ρυθμιστικού διαλύματος (BR2) Επώαση Μεταφορά σε στήλη διαχωρισμού ομογενοποίησης PAXgene (PSC) Προσθήκη αιθανόλης στο υγρό ροής Πλύση ιζίματος Μεταφορά σε σωληνάριο ανάλυσης (PT) και επίθεση εντός του αναμικτήρα QIAcube Επανασύσταση Επίθεση σε στήλη διαχωρισμού PAXgene (PRC) Δεύσμευση συνολικού RNA Πλύση Κατάτμηση DNA Πλήρης αυτοματοποίηση στο QIAcube Πλύση Μεταφορά στήλης διαχωρισμού PAXgene (PRC) Εκχύλιση RNA έτοιμο προς χρήση Κλείσιμο καλλύματος σωληναρίων μικροφυγοκέντρησης (MCT) και μεταφορά στον αναμικτήρα QIAcube Θέρμανση στους 95 C 18 PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008

21 Χειροκίνητη απομόνωση RNA Λεπτομερώς, το επανασυστάμενο ίζημα επωάζεται σε κατάλληλα ρυθμιστικά διαλύματα με πρωτεϊνάση K (PK), για τη κατάτμηση των πρωτεϊνών. Μία δεύτερη φυγοκέντρηση, μέσω στήλης διαχωρισμού ομογενοποίησης PAXgene (shredder spin column, PSC), αποσκοπεί στην ομογενοποίηση του κυτταρικού διαλύματος, για την απομάκρυνση των υπολλειμάτων των κατακερματισμένων κυττάρων. Το υπερκείμενο υγρό της ποσότητας διαρροής μεταφέρεται σε ένα νέο σωληνάριο ανάλυσης 1,5ml. Με την αιθανόλη που προστίθεται στη συνέχεια, ρυθμίζονται κατάλληλες συνθήκες δέσμευσης και το παράγωγο λύσης επιτίθεται σε στήλη διαχωρισμού PAXgene RNA (PRC). Με την ακόλουθη σύντομη φυγοκέντρηση δεσμεύεται εκλεκτικά RNA στη μεμβράνη ζελ χαλαζία PAXgene, ενώ επιμικτικά στοιχεία διέρχονται μέσω αυτής. Υπόλοιπα επιμικτικών στοιχείων απομακρύνονται με πολλά αποτελεσματικά βήματα πλύσης. Μεταξύ πρώτης και δεύτερης πλύσης επωάζεται η μεμβράνη με DNάση I (RNFD), για την απομάκρυνση τυχόν δεσμευμένων υπολοίπων του DNA. Μετά τα βήματα πλύσης το RNA εκχυλίζεται σε ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλισης (BR5) και μετουσιώνεται μέσω θέρμανσης. Το συνολικό RNA που απομονώνεται με το σύστημα PAXgene Blood RNA είναι υψηλής καθαρότητας. Χρησιμοποιώντας το χειροκίνητο πρωτόκολλο, οι τιμές A 260 /A 280 είναι μεταξύ 1,8 και 2,2 και 1% (w/w) του γονιδιωματικού DNA είναι παρών σε 95% όλων των δειγμάτων, όπως κατά την ποσοτική μέτρηση, στην real-time PCR σε ακολουθία του γονιδίου β-ακτίνης. Τουλάχιστον 95% των δειγμάτων δεν έδειξαν αναστολή στην RT-PCR, χρησιμοποιώντας μέχρι 30% του εκχυλίσματος. Χρησιμοποιώντας το χειροκίνητο πρωτόκολλο, ο μέσος όρος του χρόνου επεξεργασίας των δειγμάτων (με βάση τα δεδομένα 12 προπαρασκευασμένων δειγμάτων) είναι περίπου 90 λεπτά, ενώ ο καθαρός χρόνος χειρισμού είναι 40 λεπτά. Σε πάνω από 95 % των δειγμάτων που επεξεργάζονται, επιτυγχάνεται μία απόδοση RNA ύψους 3 µg από 2,5 ml ολικού αίματος υγιών δοτών. Αφότου οι αποδόσεις εξαρτώνται απόλυτα από τους εξεταζόμενους δότες, μπορεί οι μεμονωμένες αποδόσεις του RNA να ποικίλλουν. Κατά την εξέταση μεμονωμένων ατόμων το σύστημα PAXgene Blood RNA παρέχει σε υψηλό βαθμό αναπαραγώμενες και επαναλαμβανόμενες αποδόσεις (βλέπε εικόνες 5 και 6 στις σελίδες 21 και 22) καθώς και αναπαραγώμενα και επαναλαμβανόμενα αποτελέσματα της RT-PCR (βλέπε εικόνες 7 και 8 στις σελίδες 25 και 26), έτσι ώστε αυτό να θεωρείται άκρως ανθεκτικό για κλινικές διαγνωστικέs εξετάσεις. Η εικόνα 5 δείχνει την αναπαραγωγιμότητα και επαναληψημότητα του συστήματος PAXgene Blood RNA. Σε περαιτέρω σειρές πειραματισμών εξετάσθηκαν αφ ενός διάφορες παρτίδες του PAXgene Blood RNA Kit και αφ ετέρου η επιρροή του προσωπικού του εργαστηρίου που εκτελεί τα τεστ, στην αναπαραγωγιμότητα της απόδοσης του RNA και στα αποτελέσματα της real-time RT-PCR. Επειδή για τις εξετάσεις αυτές χρησιμοποιούνται δείγματα από δεξαμενή αίματος και όχι αίμα που παραλαμβάνεται αποκλειστικά με PAXgene Blood RNA Tubes (BRT), τα αποτελέσματα των πειραματισμών αυτών δεν αντανακλούν την ακρίβεια της επανάληψης του συνολικού συστήματος, η οποία επίσης λαμβάνει υπόψη τις διαφορές κατά τη λήψη αίματος, αλλά απλώς και μόνο την ακρίβεια της επανάληψης της πρετοιμασίας του RNA (βλέπε εικόνα 6). PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/

22 Αναπαραγώμενη και επαναλαμβανόμενη απομόνωση του RNA Δότης Μέσος όρος απόδοσης RNA (µg/2,5 ml αίματος) Απόδοση RNA (µg/2,5 ml αίαίματος) Δότης Εικόνα 5 Εκτέλαση τετραπλασίου χειροκίνητου προσδιορισμού δειγμάτων αίματος από 14 δότες, από τρεις διάφορους παρασκευαστές (A, B, C). Συγχρόνως χρησιμοποιήθηκαν τρείς διάφορες σειρές οργάνων εργαστηρίου και άλλων βοηθητικών μέσων, καθώς έκαστος των παρασκευαστών χρησιμοποίησε για την επεξεργασία των δειγμάτων την ίδια σειρά οργάνων. Απεικόνιση των μέσων όρων της απόδοσης του RNA (με τυπικές αποκλίσεις) των προσδιορισμών των δειγμάτων των ίδιων δοτών που εκτελέσθηκαν από τους διάφορους παρασκευαστές. Εκτέλεση δώδεκα επαναλήψεων της απομόνωσης του RNA από τα δείγματα αίματος των 14 δοτών, από τους 3 παρασκευαστές. Απεικόνιση των μέσων όρων της απόδοσης του RNA (με τυπικές αποκλίσεις) των προσδιορισμών των δειγμάτων των ίδιων δοτών που εκτελέσθηκαν και από τους τρείς παρασκευαστές. Σε όλα τα δείγματα RNA οι συνθήκες απορρόφησης A 260 /A 280 κυμαίνονταν από 1,8 μέχρι 2,2. 20 PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008

23 Επαναληψημότητα και αναπαραγωγιμότητα της απόδοσης του RNA από διάφορους παρασκευαστές και διάφορες παρτίδες PAXgene Blood RNA Kit χρησιμοποιώντας δεξαμενή αίματος Δεξαμενή δοτών CV της απόδοσης RNA (%) Απόδοση RNA (µg/2.5 ml αίματος) Δότης Εικόνα 6. Από 30 δότες συλέχθηκαν δείγματα αίματος σε PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) (12 σωληνάρια ανά δότη, συνολικά 360 σωληνάρια). Το περιεχόμενο των σωληναρίων από 3 δότες δεξαμενοποιήθηκε και τελικά διαμοιράστηκε πάλι σε 36 δείγματα. Τα 36 αυτά δείγματα ανά 3 δότες δεξαμενής εξετάσθηκαν με το χέρι από τρείς διάφορους παρασκευαστές. Κάθε παρασκευαστής χρησιμοποίησε για την εκχύλιση τρείς διάφορες παρτίδες του PAXgene Blood RNA Kit και εξέτασε δείγματα εις τερταπλούν από κάθε μία από τις 10 δεξαμενές δοτών. Απόδοση RNA και τυπική απόκλιση για κάθε συνδυασμό παρασκευαστή-παρτίδας. Δείγματα αίματος από 10 δεξαμενές δοτών εξετάσθηκαν επανειλημμένα εις τετραπλούν από τρείς διάφορους παρασκευαστές (A, B, C) με κάθε μία από τις τρείς παρτίδες κιτ (1, 2, 3). Παρουσίαση των μέσων όρων απόδοσης (στήλες) και τυπικών αποκλίσεων (εσφαλμένοι δοκοί) ανά τετραπλό προσδιορισμό από την ίδια δεξαμενή δοτών από διάφορους παρασκευαστές και παρτίδες κιτ. Υπολογισμός του συντελεστή μεταβλητότητας (CV) της απόδοσης RNA ανά δεξαμενή δοτών για όλους τους συνδυασμούς παρασκευαστή-παρτίδας (A, B, C; 1, 2, 3)από τους μέσους όρους και τις τυπικές αποκλίσεις της απόδοσης που εμφανίζονται στην εικόνα 6A. PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/

24 Πίνακας 1A. Αναπαραγωγιμότητα εντός κάθε παρτίδας κιτ και για κάθε χρήστη Δεξαμενή δοτών 1 5,1 x 10 6 κύτταρα/ml Δεξαμενή δοτών 6 6,5 x 10 6 κύτταρα/ml Δεξαμενή δοτών 9 8,4 x 10 6 κύτταρα/ml Συνδιασμός δεδομένων Παρτίδα 1, χρήστης Α Μ. όρoς απόδοσης (µg) 8,03 SD (µg) 0,42 CV (%) 5 Μ. όρος απόδοσης (µg) 9,55 SD (µg) 0,99 CV (%) 10 Μ. όρος απόδοσης (µg) 7,52 SD (µg) 0,41 CV (% ) 6 Παρτίδα 1, χρήστης B 7,98 1, ,38 1, ,82 1,72 19 Παρτίδα 1, χρήστης C 7,87 0, ,71 0, ,14 1,46 14 Παρτίδα 2, χρήστης Α 7,32 0, ,78 1, ,92 0,27 4 Παρτίδα 2, χρήστης B 6,09 1, ,82 2, ,20 0,71 10 Παρτίδα 2, χρήστης C 6,87 0, ,37 0,74 7 9,14 1,52 17 Παρτίδα 3, χρήστης A 7,04 0, ,96 0,68 8 8,18 0,76 9 Παρτίδα 3, χρήστης B 6,98 1, ,73 0, ,41 0,88 14 Παρτίδα 3, χρήστης C 8,78 0, ,59 1, ,78 0,56 5 Πίνακας 1B. Αναπαραγωγιμότητα μεταξύ όλων των παρτίδων κιτ για κάθε χρήστη Συνδιασμός δεδομένων Χρήστης A, όλες οι παρτ. Δεξαμενή δοτών 1 5,1 x 10 6 κύτταρα/ml Μ. όρος απόδοσης (µg) 7.46 SD (µg) 0,85 CV (%) 11 Δεξαμενή δοτών 6 6,5 x 10 6 κύτταρα/ml Μ. όρος απόδοσης (µg) 9,43 SD (µg) 1,22 CV (%) 13 Δεξαμενή δοτών 9 8,4 x 10 6 κύτταρα/ml Μ. όρος απόδοσης (µg) 7,54 SD (μg) 0,72 CV (%) 10 Χρήστης B, όλες οι παρτ. 7,02 1, ,98 2, ,48 1,50 20 Χρήστης C, όλες οι παρτ. 7,84 0, ,56 1, ,02 1,34 13 Δεξαμενή δοτών 10 10,2 x 10 6 κύτταρα/ml Μ. όρος απόδοσης (µg) 7,96 SD (µg) 0,49 CV (%) 6 8,90 0, ,22 1, ,63 1, ,00 0, ,56 1, ,85 0, ,88 2, ,88 0,37 3 Δεξαμενή δοτών 10 10,2 x 10 6 κύτταρα/ml Μ. όρος απόδοσης (µg) 7,81 SD (μg) 0,82 CV (%) 11 8,26 1, ,89 1, PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008

25 Πίνακας 1C. Αναπαραγωγιμότητα εντός κάθε παρτίδας κιτ και μεταξύ όλων των χρηστών Συνδιασμός δεδομένων Παρτίδα 1, όλοι οι χρήστες Δεξαμενή δοτών 1 5,1 x 10 6 κύτταρα/ml Μ. όρος απόδοσης (µg) 7,96 SD (µg) 0,69 CV (%) 9 Δεξαμενή δοτών 6 6,5 x 10 6 κύτταρα/ml Μ. όρος απόδοσης (µg) 9,88 SD (µg) 1,34 CV (%) 14 Δεξαμενή δοτών 9 8,4 x 10 6 κύτταρα/ml Μ. όρος απόδοσης (µg) 8,83 SD (µg) 1,63 CV (%) 19 Δεξαμενή δοτών 10 10,2 x 10 6 κύτταρα/ml Μ. όρος απόδοσης (µg) 9,02 SD (µg) 1,27 CV (%) 14 Παρτίδα 2, όλοι οι χρήστες 6,76 0, ,99 1, ,75 1, ,73 2,31 26 Παρτίδα 3, όλοι οι χρήστες 7,60 1, ,09 1, ,46 1, ,20 1,80 20 Πίνακας 1D. Αναπαραγωγιμότητα μεταξύ όλων των παρτίδων κιτ και μεαξύ όλων των χρηστών Συνδιασμός δεδομένων Ολες οι παρτίδες και όλοι οι χρήστες Δεξαμενή δοτών 1 5,1 x 10 6 κύτταρα/ml Μ. όρος απόδοσης (µg) 7,44 SD (µg) 1,09 CV (%) 15 Δεξαμενή δοτών 6 6,5 x 10 6 κύτταρα/ml Μ. όρος απόδοσης (µg) 9,66 SD (µg) 1,65 CV (%) 17 Δεξαμενή δοτών 9 8,4 x 10 6 κύτταρα/ml Μ. όρος απόδοσης (µg) 8,35 SD (µg) 1,70 CV (%) 20 Δεξαμενή δοτών 10 10,2 x 10 6 κύτταρα/ml Μ. όρος απόδοσης (µg) 8,99 SD (µg) 1,80 CV (%) 20 Λεπτομεριακή ανάλυση από 4 δεξαμενές δοτών. Οι δεξαμενές διαλέχθηκαν βάσει του αριθμού των λευκοκυττάρων τους και προσδίδουν την ανώτατη, μέση και κατώτερη τιμή των κανονικών ορίων των λευκοκυττάρων (4,8 x ,1 x 10 7 λευκοκύτταρα/ml). Ο αριθμός των λευκοκυττάρων υπολογίστηκε βάσει του μέσου όρου των λευκοκυττάρων των τριών δοτών κάθε μιας δεξαμενής. PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/

26 Αναπαραγωγιμότητα της RT-PCR μεταξύ χρηστών Χρήστης Χρήστης Εικόνα 7 Το απομονωμένο RNA του πειραματισμού που περιγράφεται στην εικ. 6 χρησιμοποιήθηκε για την realtime RT-PCR. Οι σχετικές συγκεντρώσεις των FOS και IL1B ορίσθηκαν ως εσωτερικά πρότυπα, μέσω της real-time duplex RT-PCR, με τη χρησιμοποίηση του 18S-rRNA. Παρουσιάζονται οι τιμές όλων των δειγμάτων και μάλιστα σχετικά προς τις τιμές για το χρήστη 1 (10 δεξαμενές δοτών x 3 παρτίδες κιτ x 4 επαναλήψεις = 120 σειρές δεδομένων για κάθε γονίδιο) με μέσους όρους (κόκκινες γραμμές) και τυπικές αποκλίσεις (μαύροι δοκοί). Οι διακεκομμένες γραμμές αποδίδουν ± 3πλάσια συνολική ακρίβεια των μεθόδων (FOS: 2,34 C T ; IL1B, 1,93 C T ). 24 PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008

27 Αναπαραγωγιμότητα της RT-PCR μεταξύ των παρτίδων κιτ Παρτίδα Παρτίδα Εικόνα 8 Το απομονωμένο RNA των δειγμάτων του πειραματισμού της εικ. 6 χρησιμοποιήθηκε στους πειραματισμούς της real-time RT-PCR. Οι σχετικές συγκεντρώσεις των FOS A και IL1B μεταγραφημάτων B ορίσθηκαν ως εσωτερικά πρότυπα, μέσω της real-time duplex RT-PCR, με τη χρησιμοποίηση του 18S-rRNA. Παρουσιάζονται οι τιμές όλων των δειγμάτων και μάλιστα σχετικά προς τις τιμές για το χρήστη 1 (10 δεξαμενές δοτών x 3 χρήστες x 4 επαναλήψεις = 120 σειρές δεδομένων για κάθε γονίδιο) με μέσους όρους (κόκκινες γραμμές) και τυπικές αποκλίσεις (μαύροι δοκοί). Οι διακεκομμένες γραμμές αποδίδουν ± 3πλάσια συνολική ακρίβεια των μεθόδων (FOS: 2,34 C T ; IL1B, 1,93 C T ). PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/

28 Πίνακας 2. Σύνοψη των αποτελεσμάτων της RT-PCR από τις εικ. 7 και 8 Τεστ συστήματος Σύγριση δεδομένων Μέθοδος FOS/ 18S rrna Μέσος όρος ( C T ) ±SD ( C T ) Μέθοδος IL1B/ 18S rrna Μέσος όρος ( C T ) ±SD ( C T ) Αναπαραγωγιμότητα μεταξύ όλων των παρτίδων κιτ για κάθε χρήστη Ολοι οι χρήστες, παρτίδα 1 παρτίδα 1 Ολοι οι χρήστες, παρτίδα 2 παρτίδα 2 Ολοι οι χρήστες, παρτίδα 3 παρτίδα 3 0,00 0,00 0,00 0,00 0,03 0,48 0,07 0,66 0,21 0,52 0,11 0,71 Αναπαραγωγιμότητα μεταξύ όλων των χρηστών για κάθε παρτίδα Ολες οι παρτίδες, χρήστης A χρήστης A Ολες οι παρτίδες, χρήστης A χρήστης B Ολες οι παρτίδες, χρήστης A χρήστηςc 0,00 0,00 0,00 0,00 0,46 0,44 0,06 0,69 0,31 0,60 0,15 0,71 Χρήστης: Τεχνικό προσωπικό που εκτέλεσε τα πειράματα. Παρτίδα: Αριθμός παρτίδας του κιτ που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη αυτή. SD: Τυπική απόκλιση. Οι μέσοι όροι των τιμών DDC T (N = 120) και οι τυπικές αποκλίσεις των δεδομένων εκθέτονται στις εικόνες 7 και PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008

29 Αυτοματοποιημένη απομόνωση του RNA Η προπαρασκευή του δείγματος, χρησιμοποιώντας το QIAcube, ακολουθεί τα ίδια στάδια όπως η χειροκίνητη διαδικασία, επιτρέποντας τη συνέχιση χρησιμοποιώντας το PAXgene Blood RNA Kit για την απομόνωση υψηλής ποιότητας RNA. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με το QIAcube, βλέπε το QIAcube User Manual και την ιστοσελίδα Το αυτοματοποιημένο πρωτόκολλο απομόνωσης RNA συνίσταται από δύο μέρη (ή πρωτόκολλα), PAXgene Blood RNA μέρος A και PAXgene Blood RNA μέρος B, με σύντομη μη αυτοματοποιημένη παρέμβαση μεταξύ των 2 μερών. Το ίζημα νουκλεϊνικού οξέος που έχει ήδη φυγοκεντρηθεί, πληθεί και επανασυσταθεί (βλέπε Συγκέντρωση και απομόνωση του RNA, σελίδα 58) μεταφέρεται από το PAXgene Blood RNA Tube (BRT) στα σωληνάρια ανάλυσης (PT), τα οποία τοποθετούνται εντός της θερμομικτικής μονάδας στον πάγκο εργασίας QIAcube. Ο παρασκευαστής διαλέγει και εκκινεί το PAXgene Blood RNA Part A πρωτόκολλο από τον κατάλογο επιλογών. Το QIAcube εκτελεί τα στάδια του πρωτοκόλλου μέχρι την εκχύλιση του RNA στο ρυθμιστικό διάλυμα εκχύλησης (BR5). Ο παρασκευαστής μεταφέρει τα σωληνάρια μικροφυγοκέντρησης (MCT), που περιέχουν το καθαρό RNA, εντός της θερμομικτικής μονάδας του QIAcube. Ο παρασκευαστής διαλέγει και εκκινεί το PAXgene Blood RNA Part B πρωτόκολλο από τον κατάλογο επιλογών και η μετουσίωση μέσω θέρμανσης εκτελείται από το QIAcube. Ο μέσος όρος του χρόνου επεξεργασίας των δειγμάτων (με βάση τα δεδομένα 12 προπαρασκευασμένων δειγμάτων) είναι 125 λεπτά, ενώ ο καθαρός χρόνος χειρισμού είναι μόνο 40 λεπτά περίπου. Σε πάνω από 95 % των δειγμάτων που επεξεργάζονται, επιτυγχάνεται μία απόδοση RNA ύψους 3 µg από 2,5 ml ολικού αίματος υγιών δοτών. Η εικόνα 9 δείχνει την απόδοση του RNA από ένα σύνολο 288 δειγμάτων που προπαρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας το αυτοματοποιημένο πρωτόκολλο με 3 παρτίδες κιτ από 3 παρασκευαστές. Επειδή για τις εξετάσεις αυτές χρησιμοποιούνται δείγματα από δεξαμενή αίματος και όχι αίμα που παραλαμβάνεται αποκλειστικά με PAXgene Blood RNA Tubes (BRT), τα αποτελέσματα των πειραματισμών αυτών δεν αντανακλούν την ακρίβεια της επανάληψης του συνολικού συστήματος, η οποία επίσης λαμβάνει υπόψη τις διαφορές κατά τη λήψη αίματος. Αφότου οι αποδόσεις εξαρτώνται απόλυτα από τους εξεταζόμενους δότες, μπορεί οι μεμονωμένες αποδόσεις του RNA να ποικίλλουν (Εικόνα 9). PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/

30 Απόδοση RNA Αυτοματοποιημένη διαδικασία Απόδοση RNA (µg/2.5 ml αίματος) Εικόνα 9 Δείγματα αίματος από 48 διάφορους δότες συλέχθηκαν σε PAXgene Blood RNA Tubes (BRT; 6 σωληνάρια ανά δότη, συνολικά 288 σωληνάρια). Το περιεχόμενο των σωληναρίων από 6 δότες δεξαμενοποιήθηκε και τελικά διαμοιράστηκε πάλι σε 36 δείγματα. Τα 36 αυτά δείγματα ανά 6 δότες δεξαμενής εξετάσθηκαν από 3 διάφορους παρασκευαστές (A, B, C). Κάθε παρασκευαστής χρησιμοποίησε για την αυτοματοποιημένη εκχύλιση 3 διάφορες παρτίδες (1, 2, 3) του PAXgene Blood RNA Kit και εξέτασε δείγματα εις τερταπλούν από κάθε μία από τις 8 δεξαμενές δοτών. Οι αποδόσεις RNA όλων των ατομικών δειγμάτων εμφανίζονται για κάθε συνδυασμό παρτίδας - παρασκευαστή. Τουλάχιστον 95% των δειγμάτων δεν έδειξαν αναστολή στην RT-PCR, χρησιμοποιώντας μέχρι 30% του εκχυλίσματος. Χρησιμοποιώντας το αυτοματοποιημένο πρωτόκολλο, δεν εντοπίζεται διασταυρωμένη μόλυνση μεταξύ των δειγμάτων, όπως κατά την ποσοτική μέτρηση, στην real-time RT-PCR σε ακολουθίες της βήτα γλοβίνης και μεταγραφημάτων FOS τα αρνητικά δείγματα RNA (νερό) ζευγαρώνονται με τα θετικά δείγματα RNA (ολικό ανθρώπινο αίμα) στην ίδια εκτέλεση. Το RNA που απομονώνεται με το σύστημα PAXgene Blood RNA και το αυτοματοποιημένο πρωτόκολλο είναι υψηλής καθαρότητας, όπως φαίνεται από την έλλειψη αναστολής της RT-PCR (βλέπε πάνω) και τιμές A 260 /A 280 μεταξύ 1,8 και 2,2. 1% (w/w) του γονιδιωματικού DNA είναι παρών σε 95% όλων των δειγμάτων, όπως κατά την ποσοτική μέτρηση, στην real-time PCR σε ακολουθία του γονιδίου β- ακτίνης. Οι εικόνες 10 και 11 δείχνουν τις τιμές A 260 /A 280 και σχετικού γονιδιωματικού DNA επί του συνόλου 288 δειγμάτων που προετοιμάσθηκαν χρησιμοποιώντας το αυτοματοποιημένο πρωτόκολλο με 3 παρτίδες κιτ από 3 παρασκευαστές. 28 PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008

31 Καθαρότητα RNA (τιμές A 260 /A 280 ) Αυτοματοποιημένη διαδικασία Εικόνα 10 Το RNA απομονώθηκε από 3 διάφορους παρασκευαστές (A, B, C) χρησιμοποιώντας 3 διάφορες παρτίδες (1, 2, 3) του PAXgene Blood RNA Kit στο πειραματισμό που περιγράφεται στην εικόνα 9. Οι τιμές A 260 /A 280 όλων των ατομικών δειγμάτων εμφανίζονται για κάθε συνδυασμό παρασκευαστή - παρτίδας. Καθαρότητα RNA (% Επιμόλυνση γονιδιωματικού DNA) Αυτοματοποιημένη διαδικασία Γονιδιωματικό DNA (w/w) (%) Καθαρότητα RNA (A260/A280) Εικόνα 11 Το RNA απομονώθηκε από 3 διάφορους παρασκευαστές (A, B, C) χρησιμοποιώντας 3 διάφορες παρτίδες (1, 2, 3) του PAXgene Blood RNA Kit στο πειραματισμό που περιγράφεται στην εικόνα 9. Οι ποσότητες του γονιδιωματικού DNA (w/w) όλων των ατομικών δειγμάτων εμφανίζονται για κάθε συνδυασμό παρασκευαστή - παρτίδας. Το αυτοματοποιημένο πρωτόκολλο του καθαρισμού του RNA χρησιμοποιώντας το σύστημα PAXgene Blood RNA παρέχει σε υψηλό βαθμό αναπαραγώμενα και επαναλαμβανόμενα αποτελέσματα της RT-PCR, όπως φαίνονται στν εικόνα 12 έτσι ώστε αυτό να θεωρείται άκρως ανθεκτικό για κλινικές διαγνωστικέs. PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/

32 Αναπαραγωγιμότητα της RT-PCR μεταξύ αυτοματοποιημένου και χειροκίνητου πρωτοκόλλου Εικόνα 12 Το RNA απομονώθηκε από 3 διάφορους παρασκευαστές (A, B, C) χρησιμοποιώντας 3 διάφορες παρτίδες (1, 2, 3) του PAXgene Blood RNA Kit χρησιμοποιώντας το αυτοματοποιημένο πρωτόκολλο στο πειραματισμό που περιγράφεται στην εικόνα 9 A. Παράλληλα, το RNA απομονώθηκε από τα αντίστοιχα όμοια σωληνάρια χρησιμοποιώντας το χειροκίνητο πρωτόκολλο. Οι σχετικές συγκεντρώσεις των FOS και IL1B ορίσθηκαν ως εσωτερικά πρότυπα, μέσω της real-time duplex RT-PCR, με τη χρησιμοποίηση του 18S-rRNA. Πιθανές διαφορές συγκεντρώσεων μεταξύ RNA που παρασκευάσθηκε από ζεύγος δειγμάτων αίματος χρησιμοποιώντας και τα δύο πρωτόκολλα εκχύλισης (αυτοματοποιημένο και χειροκίνητο πρωτόκολλο) υπολογίσθηκαν με τη μέθοδο C T. Χωριστές C T τιμές για όλα τα ζεύγη δείγματος (4 επαναλήψεις x 8 δεξαμενές δοτών x 3 παρτίδες κιτ x 3 παρασκευαστές = 288 ζεύγη για κάθε γονίδιο) παρουσιάζονται ως απλά σημεία με μέσους όρους (μεγαλύτερα σημεία) και τυπικές αποκλίσεις (μαύροι δοκοί για όλα τα δείγματα. Οι διακεκομμένες γραμμές αποδίδουν ± 3πλάσια συνολική ακρίβεια των μεθόδων (FOS: 2,34 C T ; IL1B, 1,93 C T ). 30 PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008

33 Παρεχόμενος εξοπλισμός και αντιδραστήρια Κατά την επαφή σας με χημικές ουσίες, φορέστε πάντα ποδιά εργαστηρίου,γάντια και γυαλιά ασφάλειας. Για περαιτέρω πληροφορίες συμβουλευτείτε τα σχετικά δελτία ασφάλειας (MSDSs) που διατίθενται από τον εκάστοτε κατασκευαστή. Για όλα τα πρωτόκολλα PAXgene Blood RNA Tubes (BRT; Αρ.κατ ) Αιθανόλη ( %, βαθμός καθαρότητας ανά ανάλ.) Πιπέτες* (10 µl 4 ml) Στείρα ρύγχη πιπετών, με φραγμό αερολυμάτων, ελεύθερα RNάσης Ογκομετρικός κύλινδρος Φυγόκεντρος* με μεταβλητές ταχύτητες από x g και με κεφαλή ταλάντευσης και κατάλληλους υποδοχείς φυγοκέντρησης για τα PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) Αναδευτήρας Vortex* Τεμαχισμένος πάγος Μαρκαδόρος για την επιγραφή Για το χειροκίνητο πρωτόκολλο Μικροφυγόκεντρος μεταβαλλόμενης ταχύτητας* με δυνατότητα x g και εξοπλισμένη με ρότορα για σωληνάρια μικροφυγοκέντρησης 2 ml Επωαστής με αναδευτή* με δυνατότητα επώασης στους 55 C και 65 C και ανάδευσης στις 400 rpm, χωρίς να υπερβαίνει τις 1400 rpm (e.g., Eppendorf Thermomixer Compact, ή ισοδύναμος) Για το αυτοποιημένο πρωτόκολλο QIAcube* (QIAGEN, Αρ. κατ [110 V], Αρ. κατ [230 V]) Αναλώσιμα υλικά του QIAcube Ρύγχη πιπετών με φίλτρο, 1000 µl (1024) (QIAGEN, Αρ. κατ ) Φυάλες αντιδραστηρίων, 30 ml (6) (QIAGEN, Αρ. κατ ) Προσαρμοστές ρότορα (10 x 24) (QIAGEN, Αρ. κατ ) * Σιγουρευτείτε ότι τα όργανα ελέγχονται, συντηρούνται και βαθμονομούνται τακτικά σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή. Σιγουρευτείτε ότι είστε οικείοι με οδηγίες χειρισμού του RNA (Παράρτημα A, σελίδα 56). Για τηνπροσθήκη αιθανόλης στο συμπυκνωμένο ρυθμιστικό διάλυμα BR4. PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/

34 Εξαρτήματα του QIAcube Βάση στήριξης φυαλών αντιδραστηρίων (QIAGEN, Αρ. κατ ) Στήριγμα προσαρμοστή ρότορα (QIAGEN, Αρ. κατ ) Ψαλίδι Σημαντικές σημειώσεις Χειρισμός του QIAcube Σιγουρευτείτε ότι η λειτουργία του σας είναι γνωστή. Παρακαλούμε, πριν αρχίσετε με το αυτοποιημένο πρωτόκολλο PAXgene Blood RNA, διαβάστε το QIAcube User Manual και όλες τις πρόσθετες πληροφορίες που παρέχονται με το QIAcube, δίνοντας ιδιαίτερα προσοχή στις πληροφορίες ασφάλειας. Εκκίνηση του QIAcube Κλείστε την πόρτα του QIAcube και θέσετε σε λειτουργία το QIAcube με το διακόπτη λειτουργίας (βλέπε εικόνα 13). Ακούγεται ένας ήχος βομβητή και εμφανίζεται η αρχική οθόνη. Το όργανο εκτελεί αυτόματα τεστ ρύθμισης λειτουργίας. Εγκατάσταση πρωτοκόλλων στο QIAcube Απαιτείται μια αρχική εγκατάσταση πρωτοκόλλου πριν από την διεξαγωγή της πρώτης προετοιμασμένης εκτέλεσης του RNA στο QIAcube. Εγκαταστήστε και τα δύο πρωτόκολλα PAXgene Blood RNA Part A και PAXgene Blood RNA Part B. Πρωτόκολλα παρέχονται στην ιστοσελίδα και χρειάζεται μόνο να καταφορτωθούν στο κλειδί μνήμης USB που παρέχεται μαζί με το QIAcube και μεταφέρεται στο QIAcube μέσω της θύρας USB. Η θύρα USB, εγκαταστημένη πίσω από τον προστατευτικό πλαίσιο (βλέπε εικόνα 13), επιτρέπει τη σύνδεση του κλειδιού μνήμης USB με το QIAcube (παρέχεται με το QIAcube). Δεδομένα αρχείων όπως αναλογικά αρχεία ή στοιχεία αρχείων μπορούν επίσης να μεταφερθούν μέσω της θύρας USB από το QIAcube στο κλειδί μνήμης USB. Η θύρα USB είναι μόνο για τη χρήση με το κλειδί μνήμης USB που παρέχεται από την QIAGEN. Μην συνδέετε άλλες συσκευές με τη θύρα αυτή. Μην μετακινείτε το κλειδί μνήμης USB κατά τη διάρκεια της εγκατάστασης πρωτοκόλλων ή μεταφοράς δεδομένων αρχείων ή κατά την εκτέλεση πρωτοκόλλου. Συμπεριλαμβάνεται επίσης στην αρχική συσκευασία, QIAcube (QIAGEN, Αρ. κατ ). 32 PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008

35 Πρόσοψη του QIAcube Εικόνα 13 Οθόνη αφής Πόρτα Σειριακή θύρα RS232 πίσω από προστατευτικό πλαίσιο (μόνο για τη χρήση από τους ειδικούς τεχνικούς της QIAGEN) Θύρα USB πίσω από προστατευτικό πλαίσιο Διακόπτης λειτουργίας Συρτάρι αποβλήτων PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/

36 Πλήρωση του QIAcube Για οικονομία χρόνου η πλήρωση μπορεί να διεξαχθεί κατά τη διάρκεια του ενός ή και των δύο 10λέπτων σταδίων (στάδια 3 και 5) στο Πρωτόκολλο: Αυτοματοποιημένη απομόνωση του συνολικού RNA από ολικό αίμα ανθρώπου συλλεγμένου σε PAXgene Blood RNA Tubes (BRT), σελίδα 50. Φυάλες αντιδραστηρίων Γεμίστε προσεκτικά 4 φυάλες αντιδραστηρίων QIAcube με τα αντιδραστήρια που αναφέρονται στον πίνακα 3 (γεμίστε τις φυάλες μέχρι το δείκτη στάθμης στις φυάλες αντιδραστηρίων). Επιγράψτε ευκρινώς τις φυάλες και τα καλύμματα με τα ονόματα των ρυθμιστικών διαλυμάτων και τοποθετήστε τις στις κατάλληλες θέσεις στη βάση στήριξης φυαλών αντιδραστηρίων (βλέπε εικόνα 14 και 15). Πριν από κάθε εκτέλεση στο QIAcube, σιγουρευτείτε ότι οι φυάλες αντιδραστηρίων είναι γεμάτες μέχρι το δείκτη στάθμης (ποσότητες που παραμένουν στις φυάλες ρυθμιστικών διαλυμάτων του πρωτότυπου κιτ χρησιμοποιούνται γαι το γέμισμα των φυαλών αντιδραστηρίων). Τοποθετήστε τη βάση στήριξης με τις ήδη γεμάτες φυάλες αντιδραστηρίων στο πάγκο εργασίας του QIAcube, όπως δείχνεται (εικόνες 14 και15). Σιγουρευτείτε ότι έχετε βγάλει το κάλυμμα από τις φυάλες πριν από την τοποθέτησή τους στον πάγκο εργασίας. Οι ποσότητες ρυθμιστικών διαλυμάτων που παρέχονται με το PAXgene Blood RNA Kit (50) επαρκούν κατά το μέγιστο για 7 προετοιμασμένες εκτελέσεις του RNA στο QIAcube. Πολλαπλές εκτελέσεις με λίγα δείγματα πρέπει να αποφεύγονται για να είναι δυνατή η επάρκεια των ποσοτήτων των ρυθμιστικών διαλυμάτων για την ολοκληρωτική διεργασία 50 δειγμάτων. Πίνακας 3. Θέσεις στη βάση στήριξης φυαλών αντιδραστηρίων Θέση Αντιδραστήριο 1 Δεσμευτικό ρυθμιστικό διάλυμα (BR2) 2 Αιθανόλη % 3 Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης 1 (BR3) 4 Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης 2 (BR4)* 5 (αφήνεται κενό) 6 (αφήνεται κενό) * Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης 2 (BR4) παραδίδεται σε συμπυκνωμένη μορφή. Πριν από την πρώτη χρήση προσθέστε στη φιάλη τον τετραπλάσιο όγκο αιθανόλης ( % βαθμός καθαρότητας ανά ανάλ.), όπως αναφέρεται στη φιάλη, για τη παρασκευή διαλύματος εργασίας. 34 PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008

37 Πλήρωση της βάσης στήριξης φυαλών αντιδραστηρίων Θέση 1 Δεσμευτικό ρυθμιστικό διάλυμα (BR2) Θέση 2 αιθανόλη % Λωρίδα επιγραφής Θέση 3 Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης 1 (BR3) Θέση 4 Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης 2 (BR4) Λωρίδα επιγραφής Θέση 5 Θέση 6 κενό κενό Εικόνα 14 Σχηματική παράσταση θέσεων και περιεχομένου των φυαλών στη βάση στήριξης των φυαλών αντιδραστηρίων. τοποθέτηση της βάσης στήριξης στο QIAcube. PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/

38 Εσωτερική όψη του QIAcube Εικόνα 15 Κάλλυμα φυγοκέντρου Φυγόκεντρος Αναδευτής Βάση στήριξης φυαλών αντιδραστηρίων Παροχέας ρύγχων πιπετών Υποδοχείς σωληναρίων μικροφυγοκέντρησης Βάσεις στήριξης ρύγχων πιπετών Υποδοχές απόρρηψης ρύγχων πιπετών και στηλών Αυτόματος βραχίονας 36 PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008

39 Στήλες διαχωρισμού (PRC, PSC), σωληνάρια μικροφυγοκέντρησης (MCT) και πλαστικά είδη QIAcube Τοποθετήστε 2 βάσεις στήριξης ρύγχων πιπετών γεμάτες με ρύγχη πιπετών με φίλτρο 1000 µl στο QIAcube (βλέπε εικόνα 15). Ξαναγεμίστε τις βάσεις με ρύγχη πιπετών όταν είναι απαραίτητο. Χρησιμοποιήστε ρύγχη πιπετών 1000 µl που παρέχονται μόνο για τη χρήση με το QIAcube. Επιγράψτε τους προσαρμοστές του ρότορα και τα σωληνάρια μικροφυγοκέντρησης (MCT) για κάθε δείγμα χρησιμοποιώντας μαρκαδόρο. Ανοίξτε τις στήλες διαχωρισμού ομογενοποίησης PAXgene (PSC) που πρόκειται ν;α χρησιμοποιηθούν και κόψτε τα καλύμματα τελείως χρησιμοποιώντας ψαλίδι (βλέπε εικόνα 16). Για τη σωστή λειτουργία της αυτόματης λαβίδας QIAcube, απομακρύνετε τελείως (κόψτε) τα καλύμματα και όλα τα πλαστικά μέρη που συνδέουν το κάλυμμα με τις στήλες διαχωρισμού ομογενοποίησης (PSC; βλέπε εικόνα 16). Διαφορετικά η αυτόματη λαβίδα δεν μπορεί να πιάσει τις στήλες (PSC, PRC) σωστά. Τοποθετήστε τις στήλες διαχωρισμού PAXgene RNA (PRC),τις στήλες διαχωρισμού ομογενοποίησης PAXgene (PSC, χωρίς κάλυμμα) και το επιγραμμένο σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης (MCT) στις σωστές θέσεις σε κάθε επιγραμμένο προσαρμοστή ρότορα όπως δείχνεται στον πίνακα 4 και στην εικόνα 17 (σελίδα 38). Σιγουρευτείτε ότι τα καλύμματα της στήλης διαχωρισμού (PRC) και του σωληναρίου μικροφυγοκέντρησης (MCT) ωθούνται στον πυθμένα των υποδοχών στο χείλος του προσαρμοστή του ρότορα, διαφορετικά κατά τη διάρκεια της φυγοκέντρησης τα καλύμματα θα σπάσουν. Τοποθέτηση στήλης διαχωρισμού ομογενοποίησης PAXgene (PSC) Κάλυμμα στήλης (PSC) που έχει απομακρυνθεί σωστά Κάλυμμα στήλης (PSC) που έχει απομακρυνθεί λανθασμένα; ένα μέρος του καλύμματος παραμένει Εικόνα 16 Η στήλη διαχωρισμού ομογενοποίησης PAXgene (PSC) τοποθετείται στη μεσαία θέση. Κόψτε το κάλυμμα πριν από τη τοποθέτηση της στήλης (PSC). PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/

40 Πίνακας 4. Εργαστηριακά είδη στον προσμαρμοστή του ρότορα Θέση Εργαστηριακά είδη Θέση καλύμματος 1 Στήλη διαχωρισμού PAXgene RNA (κόκκινη, PRC) 2 Στήλη διαχωρισμού ομογενοποίησης PAXgene (μωβ, PSC) (Κόψτε το κάλυμμα πριν από τη τοποθέτηση της στήλης) 3 Σωληνάριο μικροφυγοκέντρησης (MCT)* L3 L1 * Χρησιμοποιείτε σωληνάρια μικροφυγοκέντρησης (1.5 ml, MCT) που συμπεριλαμβάνονται στο PAXgene Blood RNA Kit. Εικόνα 17 Ο προσαρμοστής του ρότορα έχει τρεις θέσεις σωλήνων (1 3) και τρεις θέσεις καλυμμάτων (L1 L3). Πλήρωση της φυγοκέντρου Τοποθετήστε τους συναρμολογημένους προσαρμοστές του ρότορα εντός των θηκών της φυγοκέντρου όπως δείχνεται στήν εικόνα 18. Εάν επεξεργάζεστε λιγότερα από 12 δείγματα, συγουρευτείτε ότι γεμίζετε το ρότορα της φυγοκέντρου ακτινοειδώς ισορροπημένα (βλέπε εικόνα 19). Πριν από την εκκίνηση εκτέλεσης ενός πρωτοκόλλου πρέπει όλες οι θήκες της φυγοκέντρου να εγκατασταθούν ακόμα και όταν είναι να επεξεργασθούν λιγότερα από 12 δείγματα. Ενα δείγμα ή 11 δείγματα δεν μπορούν να επεξεργασθούν. 38 PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008

41 Πλήρωση της φυγοκέντρου Εικόνα 18 Τοποθέτηση το συναρμολογημένο προσαρμοστή του ρότορα εντός των θηκών της φυγοκέντρου. PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/

42 Πλήρωση της φυγοκέντρου και του αναδευτή 2 δείγματα 3 δείγματα 4 δείγματα 5 δείγματα 6 δείγματα 7 δείγματα 8 δείγματα 9 δείγματα 10 δείγματα Εικόνα 19 Δείχνονται οι θέσεις στη φυγόκεντρο και στον αναδευτή για την επεξεργασία από δύο (2 δείγματα) μέχρι δέκα (10 δείγματα) δείγματα. Ενα δείγμα ή 11 δείγματα δεν μπορούν να επεξεργασθούν. 40 PAXgene Blood RNA Kit Εγχειρίδιο 04/2008