CHORUS DEAMIDATED GLIADIN-G REF REF 86100/12 DIESSE Diagnostica Senese S.p.A. Via delle Rose, Monteriggioni (Siena) Italy

Transcript

1 /GK/ 1/14 CHORUS Fabriqué par/ Κατασκευάζεται από/ Manufactured by: DEAMIDATED GLIADIN-G REF REF 86100/12 DISE Diagnostica Senese S.p.A. Via delle Rose, Monteriggioni (Siena) Italy Modifications apportées à la révision courante Τροποποιήσεις που εισήχθησαν στην τρέχουσα διόρθωση Changes introduced in the current revision Chapitre Κεφάλαιο Section

2 2/14 INSTRUCTIONS POUR L UTILISATION CHORUS DEAMIDATED GLIADIN-G Pour la détermination semi-quantitative des anticorps IgG anti-gliadine désaminée Uniquement pour diagnostic in vitro 1. UTILISATION Méthode immuno-enzymatique pour la détermination semiquantitative des anticorps IgG anti-gliadine désaminée dans le sérum humain grâce à un dispositif à usage unique appliqué sur les instruments Chorus e Chorus TRIO. 2. INTRODUCTION L entéropathie sensible au gluten (GSE) ou maladie cœliaque est caractérisée par une atrophie des villosités intestinales avec aplatissement consécutif de la muqueuse. La cause de cette maladie est une intolérance pathologique envers la gliadine. La gliadine est la fraction soluble dans l alcool du gluten, un composant du froment, du seigle et de l orge. La maladie coeliaque est provoquée par l ingestion de gluten. Comme thérapie, il faut observer toute la vie un régime sans gluten, car les symptômes peuvent toujours réapparaître en cas de nouvelle absorption de gluten. La maladie cœliaque est associée au HLA et environ 95% des patients cœliaques es présente le DQ2 codifié par DQA1*0501 et DQB1*0201. La maladie peut se manifester à tout âge, plus fréquemment cependant dans la petite enfance, en partie déjà chez les nouveau-nés. En Europe, l incidence a une gamme comprise entre 1/4000-1/300. Le diagnostique définitif, avec détermination de la muqueuse plate typique, est réalisé à travers une biopsie de l intestin grêle accompagnée de marqueurs sérologiques. Les anticorps antigliadine et anti-transglutaminase tissulaire (ttg) sont dans ce cas particulièrement importants. La ttg a été identifiée comme l antigène cible des EMA. Les EMA sont des anticorps qui se lient à l endomysium, un composant extra-cellulaire des muscles lisses et leur détermination au travers du test par immunofluorescence indirecte (IFT) a été jusqu à présent un instrument important dans le diagnostique de la maladie cœliaque. Les anticorps anti-peptides désaminés de la gliadine (DGP) ont été découverts au cours de la deuxième moitié des années 2000 : ces anticorps réagissent avec les peptides dérivés de la digestion de la gliadine et sont successivement désaminés par la ttg. Les kits pour la détection des anticorps anti-dgp sont donc plus sensibles et plus spécifiques pour le diagnostic des GSE que les kits classiques pour les anticorps anti gliadine. La détermination d anticorps ce classe IgG est très importante surtout pour les patients présentant un déficit en IgA et chez lesquels, par conséquent, les anticorps anti-gliadine désaminée ne peut pas être détectés par le dosage des IgA. Chez les nouveau-nés, la détermination des anticorps antigliadine est très importante cliniquement, car à ce stade ne sont pas encore présents les auto-anticorps anti-ttg ou EMA. La gliadine représente donc en pédiatrie le premier paramètre sérologique pour le diagnostique de la maladie cœliaque. 3. PRINCIPE DE LA MÉTHODE Le dispositif Deamidated Gliadin-G est prêt à l emploi pour la détermination des anticorps IgG anti-gliadine désaminée, avec les instruments CHORUS. Le dosage est de type ELISA. L antigène, constitué de gliadine désaminée hautement purifiée, est lié à la phase solide. Les immunoglobulines spécifiques se lient à l antigène après incubation en présence de sérum humain dilué. Après élimination des protéines non réactives par lavage, le conjugué constitué d anticorps anti-immunoglobulines humaines conjuguées à la peroxydase de raifort est incubé. Le conjugué non lié est éliminé et le substrat de la peroxydase est ajouté. La coloration bleue qui se développe est proportionnelle à la concentration des anticorps spécifiques présents dans le sérum examiné. Les dispositifs à usage unique contiennent tous les réactifs nécessaires à l exécution du dosage lorsqu appliqués sur les instruments Chorus. 4. PRECAUTIONS UNIQUEMT POUR DIAGNOSTIC IN VRO. Ce coffret contient des matériaux d origine humaine qui ont été contrôlés et trouvés négatifs à la suite de l'exécution de tests approuvés par la FDA, tant pour le recherche de HbsAg que pour celles des anticorps anti- VIH-1/VIH-2 et anti-vhc. Étant donné qu'aucun test diagnostic ne peut offrir une garantie absolue quant à l'absence d'agents infectieux, tout matériel d'origine humaine doit être considéré comme étant potentiellement infecté. Tous les réactifs et échantillons doivent être maniés conformément aux normes de sécurité normalement adoptées par les laboratoires. Mise au rebut des résidus: les échantillons de sérum, les calibreurs et les bains utilisés doivent être traités comme étant des résidus infectés. Ils doivent donc être éliminés conformément aux réglementations légales en vigueur. Avertissements pour la sécurité personnelle 1. Ne pas pipeter avec la bouche. 2. Utiliser des gants à jeter et des lunettes de protection lors de la manipulation des échantillons et durant l essai. 3. Se laver soigneusement les mains une fois le test terminé. 4. Les réactifs suivants contiennent de faibles concentrations en substances nocives ou irritantes : a) Le conjugué et les contrôles contiennent du phénol b) Le substrat est acide. Si un réactif entre en contact avec la peau ou avec les yeux, les laver à grande eau.

3 3/14 5. Les acides neutralisés et les déchets liquides doivent être décontaminés avec un volume suffisant de solution d hypochlorite de sodium pour que la concentration finale soit de 1% minimum. Un contact de 30 minutes avec cette solution est nécessaire pour garantir une décontamination efficace. 6. En cas de renversement accidentel de matériaux potentiellement infectés, essuyer immédiatement avec du papier absorbant ; la zone contaminée devra être décontaminée avec, par exemple, de l hypochlorite de sodium (1%), avant de continuer le travail. En présence d un acide, veiller à bien essuyer le plan de travail avant d utiliser de l hypochlorite de sodium. Tout matériel (notamment les gants) utilisé pour décontaminer les zones salies par d éventuels renversements accidentels, doit être considéré comme potentiellement infecté et éliminé. Ne pas mettre en autoclave de matériaux contenant de l hypochlorite de sodium. Précautions analytiques Avant usage, laisser les dispositifs à utiliser à température ambiante ( C) et utiliser dans les 60 minutes. 1. Eliminer les dispositifs avec le substrat (puits 4) coloré de bleu. 2. S assurer que l échantillon soit parfaitement distribué sur le fond lorsqu il est déposé dans le puit. 3. Contrôler la présence effective des réactifs dans le dispositif et l intégrité du dispositif. Ne pas utiliser les dispositifs qui, au contrôle visuel, manquent d un quelconque réactif. 4. Les dispositifs doivent être utilisés avec l instrument Chorus, en suivant attentivement les instructions pour l usage et le Manuel de l instrument. 5. S'assurer que l instrument Chorus soit réglé comme il se doit (voir le Manuel d utilisation Chorus). 6. Ne pas modifier le code à barres situé sur la poignée du dispositif à fin que l'instrument puisse le lire correctement. 7. Éviter l utilisation de congélateurs auto-dégivrants pour conserver les échantillons. 8. Les codes à barres défectueux peuvent être insérés manuellement dans l instrument. 9. Ne pas exposer les dispositifs à une forte illumination ni aux vapeurs d hypochlorite pendant la conservation et l usage. 10. Les échantillons fortement hémolysés, ou les échantillons présentant une contamination microbienne peuvent causer des résultats erronés. 11. Avant d insérer le dispositif dans l instrument Chorus, contrôler que le puits de réaction ne contient pas de corps étrangers. 12. Pipeter le sérum examiné (50 µl) dans le puits 1 du dispositif (voir la figure). 13. Ne pas utiliser le dispositif après la date de péremption. 14. Controller si l instrument a la connexion avec la Washing Buffer Autoimmunity REF COMPOSION DU COFET ET PREPARATION D REACTIFS Le coffret suffit pour réaliser 36 déterminations (REF 86100). Le coffret suffit pour réaliser 12 déterminations (REF 86100/12). DD DISPOSIFS 6 emballages contenant 6 dispositifs chacun (REF 86100). 2 emballages contenant 6 dispositifs chacun (REF 86100/12). Description: Position 8 : Emplacement de l étiquette pour le code à barres Position 7 : Vide Position 6 : PU DE LA MICROPLAQUE Recouverte de gliadine désaminée. Position 5 : PU DE LA MICROPLAQUE Non recouvert. Position 4 : SUBSTRAT TMB Contenu : Tétraméthylbenzydine 0.26 mg/ml et H2O2 0.01% stabilisée en tampon citrate 0.05 mmol/l (ph 3.8) Position 3 : DILUANT POUR ÉCHANTILLON Contenu : Solution protéique contenant Tween % et Proclin 0.1%. Position 2 : CONJUGUÉ Contenu : anticorps monoclonaux anti-igg humaines marqués à la peroxydase en tampon phosphate contenant phénol 0.05% et Bronidox 0.02%. Position 1 : PU VIDE L utilisateur doit y mettre le sérum non dilué. Usage : équilibrer un sachet à température ambiante, ouvrir le sachet, sortir les dispositifs nécessaires, et placer les autres non utilisés dans le sachet en plastique avec le gel de silice; chasser l air et fermer le sachet par pression sur la fermeture. Conserver à 2-8 C. CALIBRATOR CALIBRATEUR 1 x ml Contenu : Sérum humain dilué, à une concentration connue d anticorps, contenant du Proclin et de la Gentamycine, liquide prêt à l usage. CONTROL + CONTRÔLE POSIF 1 x ml Contenu : Sérum humain dilué, à une concentration connue d anticorps, contenant du Proclin et de la Gentamycine. Liquide, prêt à l usage. AUTRE MATÉRIEL NÉCSAIRE MAIS NON FOURNI WASHING BUFFER AUTOIMMUNY REF CLEANING SOLUTION 2000 REF SANIZING SOLUTION REF CHORUS NEGATIVE CONTROL/SAMPLE DILUT REF Eau distillée ou déionisée

4 4/14 Instruments de laboratoire en verre normaux : cylindres, éprouvettes, etc. Micropipettes capables de prélever de façon précise des volumes de µl Gants à jeter Solution à 5 % d hypochlorite de sodium Récipients pour les matériaux potentiellement infectés 6 MODALÉS DE CONSERVATION ET STABILÉ D RÉACTIFS Les réactifs doivent être conservés à +2-8 C. En cas de température de conservation incorrecte, il faut refaire le calibrage et contrôler l'exactitude du résultat en recourant au sérum de contrôle (voir section 9 : validation du test). La date de péremption est imprimée sur chaque composant et sur l étiquette apposée sur la confection. Les réactifs ont une stabilité limitée après ouverture et/ou préparation: DISPOSIFS CALIBRATEUR CONTROLE POSIF 8 semaines à 2/8 C 8 semaines à 2/8 C 8 semaines à 2/8 C 7. TYPE D ÉCHANTILLONS ET CONSERVATION Les échantillons sont des sérums préparés à partir de prélèvements sanguins obtenus par ponction veineuse et préparés selon les procédures standards de laboratoire. Le sérum frais peut être maintenu pendant 4 jours à 2/8 C ; pour une plus longue période de conservation, il doit être congelé à - 20 C. L échantillon peut subir au plus 3 cycles de congélation/décongélation. Après décongélation, agiter soigneusement l échantillon avant le dosage. La qualité de l échantillon peut être fortement compromise par la présence de contamination microbienne qui peut induire de faux résultats. Les échantillons fortement lipémiques, ictériques ou contaminés ne doivent pas être utilisés. Ce dosage ne peut pas être utilisé sur du plasma humain. 8. PROCÉDURE 1. Ouvrir le sachet (du côté contenant la fermeture à pression), et sortir le nombre de dispositifs nécessaires et conserver les autres dans le sachet après avoir chassé l air. 2. Contrôler visuellement l état du dispositif selon les indications reportées au paragraphe 4 : «Précautions analytiques». 3. Dispenser 50 µl de sérum non dilué dans le puits no. 1 de chaque dispositif à analyser; utiliser un dispositif pour le calibrateur à chaque changement de lot. 4. Introduire les dispositifs dans l instrument Chorus. Effectuer le calibrage (si nécessaire) et le test selon les indications du Manuel d'instruction de l instrument. 9. VALIDATION DU DOSAGE Utiliser le sérum «contrôle positif» pour vérifier l exactitude du résultat obtenu, le dosant comme indiqué dans le manuel d utilisation de l instrument. Si l instrument indique que le sérum de contrôle a une valeur en dehors de la limite de tolérance, il est nécessaire d'effectuer à nouveau la calibration. Les résultats précédents seront automatiquement corrigés. Si le résultat du sérum de contrôle n est toujours pas compris dans la plage d'acceptabilité, contacter le Scientific Support. Tél. : Fax : scientificsupport@diesse.it 10. INTERPRÉTATION DU DOSAGE L instrument Chorus fournit un résultat en unité arbitraire (AU/mL), calculé sur la base d un graphique lot-dépendant mémorisé dans l instrument. Le dosage du sérum examiné peut être interprété comme suit : POSIF lorsque le résultat est >18.0 AU/mL NÉGATIF lorsque le résultat est <12.0 AU/mL DOUTEUX/ÉQUIVOQUE lorsque le résultat est compris entre 12.0 et 18.0 AU/mL. En cas de résultat douteux, répéter le dosage. Si le résultat reste douteux, répéter le prélèvement. 11. LIM DU DOSAGE Le seul dosage ne suffit pas pour un diagnostic clinique. Un résultat négatif n exclut pas la présence éventuelle de maladie. Le résultat du dosage doit être évalué avec les données provenant de l anamnèse du patient et/ou les autres analyses de diagnostic. 12. PLAGE D ÉTALONNAGE Plage d Etalonnage 3.0 à 300 AU/mL Pour les échantillons >300 AU/mL, répéter le dosage en prédiluant l échantillon dans Negative Control Sample Diluent (PF non fourni avec le kit). 13. INTERVALL DE RÉFÉRCE Les valeurs attendues dans la population normale, déterminées après examen de 120 sérums provenant de donateurs sains, sont comprises entre 3.0 et 10.8 AU/mL. 14. SPÉCIFICÉ ANALYTIQUE 5 échantillons ont été dosés (2 négatifs, 1 à la limite et 2 positifs) auxquels ont été ajoutés les substances interférentes suivantes: Facteur rhumatoïde ( IU/mL) Bilirubine (4,5 mg/dl 45 mg/dl) Triglycérides (10 mg/ml 250 mg/ml) Hémoglobine (5 mg/ml 30 mg/ml) Dans la présence dans le sérum examiné de substance interférente comme reportées ci-dessus, n'altère pas les résultats du dosage à l'exception du facteur rhumatoïde qui peut influencer le résultat du dosage.

5 5/ RÉACTIVÉ CROISÉE 3 échantillons, positifs à Scl-70, SS-B, et Cenp-B ont été testés. Aucune réaction croisée significative n a été observée. 16. SSIBILÉ ET SPÉCIFICÉ DIAGNOSTIQUE Lors d une étude, 117 échantillons ont été analysés avec le kit Diesse et avec un autre kit commercial. Les résultats de l étude sont résumés ci-dessous : Fabriqué par DISE Diagnostica Senese S.p.A. Via delle Rose Monteriggioni (Siena) Italy Diesse Référence + - Total Total Percent Positive Agreement (~Sensibilité Diagnostique) : 89.3%, IC95 % Percent Negative Agreement : (~Spécificité Diagnostique) : 97.8%, IC95 % PRÉCISION Au sein du dosage Entre les dosages Échantillon Moyenne Moyenne CV % (AU/mL) (AU/mL) CV % Entre lots Entre instruments Échantillon Moyenne Moyenne CV % (AU/mL) (AU/mL) CV % BIBLIOAPHIE 1. Dietrich W et al : 81997) Nat, Med, 3: , 2. Holtmeier W and Caspary WF (1998) Z, Gastroenterol, 36: , 3. Caspary WF, Holtmeier W (1999) Deutches Arzteblatt 96 (36): A , 4. Catassi C, et al (1994) Lancet 343: , 5. Volta U. et al (2008) Dig Dis Sci 53(6):

6 GK 6/14 ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ CHORUS DEAMIDATED GLIADIN-G Για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό των αντισωμάτων IgG έναντι απαμιδιωμένης γλιαδίνης Μόνο για διαγνωστική χρήση in vitro 1. ΧΡΗΣΗ Ανοσοενζυμική μέθοδος για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό των αντισωμάτων IgG έναντι απαμιδιωμένης γλιαδίνης στον ανθρώπινο ορό με συσκευή μίας χρήσης που χρησιμοποιείται μαζί με τους αναλυτές Chorus και Chorus TRIO. 2. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ευαίσθητη στη γλουτένη (GSE) εντεροπάθεια ή κοιλιοκάκη, χαρακτηρίζεται από ατροφία των λάχνων του εντέρου ακολουθούμενη από λείανση του βλεννογόνου. Αιτία αυτής της πάθησης είναι η παθολογική δυσανεξία προς την γλιαδίνη. Η γλιαδίνη είναι το διαλυτό στο οινόπνευμα μέρος της γλουτένης, ένα συστατικό των σιτηρών, της σίκαλης και της κρίθης. Η κοιλιοκάκη προκαλείται από τη λήψη της γλουτένης. Ως θεραπευτική αγωγή πρέπει να ακολουθηθεί εφ όρου ζωής, ένα διαιτολόγιο χωρίς γλουτένη, επειδή τα συμπτώματα μπορεί πάντοτε να επανεμφανιστούν σε περίπτωση νέας λήψης γλουτένης. Η κοιλιοκάκη είναι μία συζευγμένη HLA και το 95% των ασθενών που πάσχουν από κοιλιοκάκη, παρουσιάζει το αντιγόνο DQ2 αποτελούμενο από DQA1*0501 και DQB1*0201. Η ασθένεια μπορεί να εκδηλωθεί σε όλες τις ηλικίες, πιο συχνά όμως κατά την πρώιμη παιδική ηλικία και μερικώς δε και στα νεογνά. Στην Ευρώπη η συχνότητα των περιπτώσεων κυμαίνεται από 1/4000 μέχρι 1/300. Η τελική διάγνωση, με την εξακρίβωση της χαρακτηριστικής λείανσης του βλεννογόνου, γίνεται μέσω βιοψίας του λεπτού εντέρου συνοδευόμενη από ορολογικούς δείκτες (marker). Τα αντισώματα αντι-γλιαδίνη και ιστική αντι-τρανσγλουταμινάση (ttg) σε αυτή την περίπτωση αποδεικνύονται ιδιαίτερα σημαντικά. Η ttg ταυτοποιήθηκε ως το αντιγόνο target των EMA. Τα EMA είναι αντισώματα που συνδέονται με το ενδομύσιο, ένα εξωκυτταρικό συστατικό μέρος των λείων μυών, και ο προσδιορισμός τους μέσω άμεσης δοκιμασίας ανοσοφθορισμού (IFT) αποτελούσε μέχρι σήμερα ένα σημαντικό υποβοηθητικό μέσο στη διάγνωση της κοιλιοκάκης. Στο δεύτερο μισό της δεκαετίας του 2000 ανακαλύφθηκαν τα αντισώματα έναντι των απαμιδιωμένων πεπτιδίων της γλιαδίνης (DGP): αυτά τα αντισώματα αντιδρούν με τα πεπτίδια που απελευθερώνονται κατά την πέψη της γλιαδίνης και τα οποία στη συνέχεια απαμιδιώνονται από την τρανσγλουταμινάση (ttg). Κατά συνέπεια, τα κιτ ελέγχου αντισωμάτων έναντι DGP έχουν υψηλότερη ευαισθησία και ειδικότητα στη διάγνωση εντεροπάθειας λόγω δυσανεξίας στη γλουτένη (GSE) σε σχέση με τα συμβατικά κιτ ελέγχου αντισωμάτων έναντι γλιαδίνης. Ο προσδιορισμός των αντισωμάτων τάξης IgG έχει ιδιαίτερη σημασία κυρίως για ασθενείς με ανεπάρκεια αντισωμάτων IgA, στους οποίους τα αντισώματα έναντι της απαμιδιωμένης γλιαδίνης δεν μπορούν να ανιχνευθούν με προσδιορισμό των αντισωμάτων IgA. Στα νεογνά ο προσδιορισμός των αντισωμάτων αντι-γλιαδίνης έχει μεγάλη κλινική σημασία, επειδή σε αυτό το στάδιο δεν υπάρχουν ακόμα τα αυτοαντισώματα αντι-ttg ή EMA. Η γλιαδίνη αποτελεί λοιπόν στην παιδιατρική την πρώτη ορολογική παράμετρο για τη διάγνωση της κοιλιοκάκης. 3. ΒΑΣΙΚΗ ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Η συσκευή Deamidated Gliadin-G είναι έτοιμη για χρήση με σκοπό τον προσδιορισμό των αντισωμάτων IgG έναντι απαμιδιωμένης γλιαδίνης στους αναλυτές CHORUS. Η δοκιμασία βασίζεται στη μέθοδο ELISA. Το αντιγόνο, που αποτελείται από απαμιδιωμένη γλιαδίνη υψηλής καθαρότητας, δεσμεύεται στη στερεά φάση. Οι ειδικές ανοσοσφαιρίνες συνδέονται με το αντιγόνο μετά από επώαση με αραιωμένο ανθρώπινο ορό. Αφού πραγματοποιηθούν εκπλύσεις για να απομακρυνθούν οι πρωτεΐνες που δεν αντέδρασαν, γίνεται επώαση με το σύμπλοκο που αποτελείται από αντισώματα έναντι ανθρώπινων ανοσοσφαιρινών συζευγμένων με υπεροξειδάση αγριοραφανίδων. Απομακρύνεται το σύμπλοκο που δεν αντέδρασε και προστίθεται το υπόστρωμα για την υπεροξειδάση. Το κυανό χρώμα που σχηματίζεται είναι ανάλογο με τη συγκέντρωση των ειδικών αντισωμάτων που υπάρχουν στο δείγμα του ορού. Οι συσκευές μίας χρήσης περιέχουν όλα τα αντιδραστήρια που απαιτούνται για να εκτελεστεί η δοκιμασία στους αναλυτές Chorus. 4. ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΜΟΝΟ ΓΙΑ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ IN VRO. Αυτό το κιτ περιέχει υλικά ανθρώπινης προέλευσης που έχουν ελεγχθεί και έχουν βρεθεί αρνητικά σε δοκιμασίες εγκεκριμένες από την FDA, τόσο όσον αφορά την ανίχνευση του HbsAg όσο και για τα αντισώματα αντι-hiv- 1, αντι-hiv-2 και αντι-hcv. Επειδή καμία διαγνωστική δοκιμασία δεν προσφέρει απόλυτη εγγύηση απουσίας μολυσματικών παραγόντων, κάθε υλικό ανθρώπινης προέλευσης πρέπει να θεωρείται δυνητικά μολυσματικό. Χρησιμοποιείτε όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα παίρνοντας όλες τις προφυλάξεις που προβλέπονται από τους κανονισμούς ασφαλείας του εργαστηρίου. Διάθεση αποβλήτων: τα δείγματα ορού, οι βαθμονομητές και οι ταινίες που χρησιμοποιούνται πρέπει να επεξεργάζονται ως μολυσματικά απόβλητα και στη συνέχεια να διατίθενται σύμφωνα με τις διατάξεις των ισχυόντων νόμων.

7 GK 7/14 Οδηγίες για την προσωπική σας ασφάλεια 1. Μην κάνετε αναρρόφηση με το στόμα. 2. Χρησιμοποιείτε γάντια μίας χρήσης και προστατευτικά γυαλιά όταν χειρίζεστε τα δείγματα και κατά τη διάρκεια της ανάλυσης. 3. Πλένετε πολύ καλά τα χέρια σας μόλις τελειώσετε τη δοκιμασία. 4. Η περιεκτικότητα των παρακάτω αντιδραστηρίων σε βλαβερές ή ερεθιστικές ουσίες, είναι χαμηλή: a)το σύμπλοκο και τα αντιδραστήρια ελέγχου περιέχουν φαινόλη b)το υπόστρωμα είναι όξινο Αν ένα αντιδραστήριο έρθει σε επαφή με το δέρμα ή με τα μάτια, ξεπλύνατε με άφθονο νερό. 5. Εξουδετερωμένα οξέα και άλλα υγρά απόβλητα πρέπει να απολυμαίνονται προσθέτοντας υποχλωριώδες νάτριο, τόσο όσο χρειάζεται ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι τουλάχιστον 1%. Μια έκθεση σε υποχλωριώδες νάτριο στο 1% για 30 λεπτά, υπό κανονικές συνθήκες είναι αρκετή για να υπάρξει μία αποτελεσματική απολύμανση. 6. Χυμένα υγρά, δυνητικά μολυσματικά, πρέπει να καθαρίζονται αμέσως με απορροφητικό χαρτί και η ζώνη που έχει μολυνθεί θα πρέπει να απολυμαίνεται, για παράδειγμα με υποχλωριώδες νάτριο 1%, πριν να συνεχίσετε την εργασία. Παρουσία οξέος, το υποχλωριώδες νάτριο δεν πρέπει να χρησιμοποιείται πριν να στεγνώσει η ζώνη. Όλα τα υλικά, που χρησιμοποιήθηκαν για να καθαριστούν τυχόν χυμένα υγρά, πρέπει να απορρίπτονται ως δυνητικά μολυσματικά απόβλητα. Μην βάζετε στον κλίβανο υλικά που περιέχουν υποχλωριώδες νάτριο. Αναλυτικές οδηγίες Πριν από την χρήση φέρτε τα σετ σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (18-30 C) και χρησιμοποιήστε τα μέσα σε 60 λεπτά. 1. Απορρίψτε τις ταινίες όπου το υπόστρωμα (θέση 4) έχει γίνει μπλε. 2. Αφού ρίξετε το δείγμα στην κυψελίδα, ελέγξτε αν έχει κατανεμηθεί ομοιόμορφα στον πυθμένα. 3. Ελέγξτε αν υπάρχουν στο σετ όλα τα αντιδραστήρια και αν το σετ είναι άθικτο. Μην χρησιμοποιήστε εκείνα τα σετ που, μετά από έναν οπτικό έλεγχο, παρουσιάζουν έλλειψη κάποιου αντιδραστηρίου. 4. Τα σετ πρέπει να χρησιμοποιούνται αποκλειστικά με τον αναλυτή Chorus, ακολουθώντας σχολαστικά τις Οδηγίες Χρήσης και το Εγχειρίδιο του αναλυτή. 5. Ελέγξτε αν ο αναλυτής Chorus είναι ρυθμισμένος σωστά ( βλ. Εγχειρίδιο Χρήσης του Chorus). 6. Μην αλλοιώνετε με κανένα τρόπο το barcode στη λαβή του σετ, ώστε να μπορεί ο αναγνώστης barcode να το διαβάσει σωστά. 7. Αποφύγετε τη χρήση καταψυκτών αυτόματης απόψυξης για την αποθήκευση των δειγμάτων. 8. Τα barcode που δεν διαβάζονται σωστά, μπορείτε να τα περάσετε με το χέρι. 9. Μην εκθέτετε τα σετ σε δυνατό φως ούτε σε υποχλωριώδεις ατμούς κατά τη χρήση ή την αποθήκευσή τους. 10. Τα δείγματα που παρουσιάζουν ισχυρή αιμόλυση, καθώς και εκείνα που παρουσιάζουν μικροβιακή μόλυνση, μπορεί να δώσουν λανθασμένα αποτελέσματα. 11. Πριν τοποθετήσετε το σετ στον αναλυτή Chorus, βεβαιωθείτε ότι η κυψελίδα αντίδρασης δεν περιέχει ξένα σώματα. 12. Εισάγετε τον ορό που θα αναλυθεί (50 ul) στην κυψελίδα 1 του σετ με σιφώνιο (βλ. εικόνα). 13. Μην χρησιμοποιείτε τα σετ μετά την ημερομηνία λήξης τους. 14. Βεβαιωθείτε ότι ο αναλυτής είναι συνδεδεμένος με τον Washing Buffer Autoimmunity ΚΩΔ ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ ΚΙΤ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ Το κιτ καλύπτει 36 προσδιορισμούς (REF 86100). Το κιτ καλύπτει 12 προσδιορισμούς (REF 86100/12). DD ΣΕΤ 6 πακέτα των 6 σετ το κάθε ένα (REF 86100). 2 πακέτα των 6 σετ το κάθε ένα (REF 86100/12). Περιγραφή: Θέση 8: Διαθέσιμος χώρος για ετικέτα barcode Θέση 7: Κενή Θέση 6: ΚΥΨΕΛΙΔΑ ΜΙΚΡΟΠΛΑΚΙΔΙΟΥ Επικαλυμμένη με απαμιδιωμένη γλιαδίνη. Θέση 5: ΚΥΨΕΛΙΔΑ ΜΙΚΡΟΠΛΑΚΙΔΙΟΥ Μη επικαλυμμένη. Θέση 4: ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ TMB Περιεχόμενο: τετραμεθυλβενζιδίνη 0.26 mg/ml και H2O2 0.01% σταθεροποιημένα σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικών 0.05 mol/l (ph 3.8) Θέση 3: ΑΡΑΙΩΤΙΚΟ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Περιεχόμενο: πρωτεϊνικό διάλυμα που περιέχει Tween % και Proclin 0.1%. Θέση 2: ΣΥΜΠΛΟΚΟ Περιεχόμενο: μονοκλωνικά αντισώματα έναντι ανθρώπινων IgG σημασμένα με υπεροξειδάση, σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών που περιέχει φαινόλη 0.05% και Bronidox 0.02%. Θέση 1: ΚΕΝΗ ΚΥΨΕΛΙΔΑ Στην οποία ο χειριστής πρέπει να τοποθετήσει μη αραιωμένο ορό. Χρήση: Αφήστε μία συσκευασία να ισορροπήσει σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, ανοίξτε τη συσκευασία, βγάλτε όσα σετ χρειάζεστε και βάλτε τα υπόλοιπα πίσω στη σακούλα που περιέχει γέλη πυριτίου, αφαιρέστε τον αέρα και σφραγίστε την πιέζοντας το ειδικό σύστημα κλεισίματος. Αποθηκεύστε στους 2/8 C.

8 GK 8/14 CALIBRATOR ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΤΗΣ 1 x ml Περιεχόμενο: Αραιωμένος ανθρώπινος ορός γνωστού τίτλου σε αντισώματα με Proclin και Gentamycin, υγρός, έτοιμος για χρήση. CONTROL + ΘΕΤΙΚΟ ΠΡΟΤΥΠΟ ΕΛΕΓΧΟΥ 1 x ml Περιεχόμενο: Αραιωμένος ανθρώπινος ορός γνωστού τίτλου σε αντισώματα με Proclin και Gentamycin, υγρός, έτοιμος για χρήση. ΑΛΛΟ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΟ ΑΛΛΑ ΜΗ ΣΥΝΟΔΕΥΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ. WASHING BUFFER AUTOIMMUNY REF CLEANING SOLUTION 2000 REF SANIZING SOLUTION REF CHORUS NEGATIVE CONTROL/SAMPLE DILUT REF Αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό Στάνταρντ υάλινος εξοπλισμός εργαστηρίου: κύλινδροι, δοκιμαστικοί σωλήνες, κ.λ.π. Μικροπιπέτες που αναρροφούν με ακρίβεια όγκους μl Γάντια μίας χρήσης Διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 5% Δοχεία για την απόρριψη των δυνητικά μολυσματικών υλικών. 6. ΤΡΟΠΟΣ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗΣ ΚΑΙ ΣΤΑΘΕΡΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ Τα αντιδραστήρια πρέπει να αποθηκεύονται στους 2/8 C. Σε περίπτωση που αποθηκεύτηκαν σε λανθασμένη θερμοκρασία, πρέπει να επαναληφθεί η βαθμονόμηση και να ελεγχθεί το αποτέλεσμα με τον ορό ελέγχου (βλ. κεφ. 9: Επικύρωση της δοκιμασίας). Η ημερομηνία λήξης είναι τυπωμένη σε κάθε επιμέρους στοιχείο και πάνω στην εξωτερική ετικέτα της συσκευασίας. Τα αντιδραστήρια έχουν περιορισμένη διάρκεια ζωής μετά το άνοιγμα και/ή την προετοιμασία ΣΕΤ ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΤΗΣ ΘΕΤΙΚΟΣ ΟΡΟΣ ΕΛΕΓΧΟΥ 8 εβδομάδες σε 2/8 C 8 εβδομάδες σε 2/8 C 8 εβδομάδες σε 2/8 C 7. ΕΙΔΟΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΦΥΛΑΞΗ Τα δείγματα αποτελούνται από ορό ο οποίος προέρχεται από αίμα που έχει συλλεχθεί με τυπική φλεβοπαρακέντηση και έχει υποβληθεί σε επεξεργασία σύμφωνα με τυπικές εργαστηριακές διαδικασίες. Ο νωπός ορός διατηρείται 4 ημέρες στους 2/8 C. Εάν απαιτείται μεγαλύτερο χρονικό διάστημα φύλαξης, καταψύξτε τα δείγματα στους 20 C. Το δείγμα μπορεί να αποψυχθεί έως 3 φορές το μέγιστο. Μετά την απόψυξη, ανακινήστε καλά το δείγμα πριν το τοποθετήσετε στις κυψελίδες. Τυχόν μικροβιακή μόλυνση μπορεί να επηρεάσει σημαντικά την ποιότητα του δείγματος και να δώσει λανθασμένα αποτελέσματα. Υψηλά λιπαιμικά και ικτερικά δείγματα, καθώς και μολυσμένα δείγματα δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν. Η δοκιμασία δεν μπορεί να εφαρμοστεί σε ανθρώπινο πλάσμα. 8. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Ανοίξτε την συσκευασία (από την πλευρά του κλείστρου με πίεση), πάρτε όσα σετ χρειάζεστε για την ανάλυση και φυλάξτε τα υπόλοιπα κλείνοντας την σακούλα, αφού πρώτα αφαιρέσετε τον αέρα. 2. Ελέγξτε προσεκτικά την κατάσταση του σετ ακολουθώντας τις υποδείξεις που αναφέρονται στο κεφ. 4 Αναλυτικές Οδηγίες, 3. Ρίξτε στην κυψελίδα 1 καθενός σετ, 50 μl μη αραιωμένο ορό για ανάλυση. Σε κάθε αλλαγή παρτίδας, χρησιμοποιήστε ένα σετ για τον βαθμονομητή. 4. Τοποθετήστε τα σετ στον αναλυτή Chorus. Κάνετε την βαθμονόμηση (αν είναι αναγκαίο) και τις δοκιμασίες, ακολουθώντας τις οδηγίες του Εγχειριδίου Χρήσης του αναλυτή. 9. ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ Χρησιμοποιήστε το θετικό ορό ελέγχου για να επαληθεύσετε την ακρίβεια του ληφθέντος αποτελέσματος, ακολουθώντας τις οδηγίες του εγχειριδίου χρήσης του αναλυτή. Αν ο αναλυτής δείξει ότι η τιμή του ορού ελέγχου βρίσκεται έξω από το αποδεκτό όριο, πρέπει να επαναλάβετε τη βαθμονόμηση. Τα προηγούμενα αποτελέσματα θα διορθωθούν αυτόματα. Αν το αποτέλεσμα του ορού ελέγχου εξακολουθεί να βρίσκεται εκτός των αποδεκτών ορίων, επικοινωνήστε με το Τμήμα Επιστημονικής Υποστήριξης. Τηλ.: Φαξ: scientificsupport@diesse.it 10. ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Ο αναλυτής Chorus υπολογίζει το αποτέλεσμα με βάση μια καμπύλη (ειδική για κάθε παρτίδα) που είναι αποθηκευμένη στη μνήμη του αναλυτή. Το αποτέλεσμα εκφράζεται σε αυθαίρετες μονάδες. Τα αποτελέσματα ανάλυσης των δειγμάτων ορού μπορούν να ερμηνευθούν ως εξής: ΘΕΤΙΚΟ όταν το αποτέλεσμα είναι > 18.0 AU/ml ΑΡΝΗΤΙΚΟ όταν το αποτέλεσμα είναι < 12.0 AU/ml ΑΜΦΙΒΟΛΟ/ΑΣΑΦΕΣ όταν το αποτέλεσμα βρίσκεται μεταξύ 12.0 και 18.0 AU/ml Αν το αποτέλεσμα είναι αμφίβολο, επαναλάβετε τη δοκιμασία. Αν το αποτέλεσμα παραμένει αμφίβολο, επαναλάβετε τη δειγματοληψία. 11. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑΣ Η δοκιμασία δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί αυτόνομα για κλινική διάγνωση. Το αρνητικό αποτέλεσμα δεν αποκλείει το ενδεχόμενο να νοσεί ο ασθενής.

9 GK 9/14 Το αποτέλεσμα της δοκιμασίας πρέπει να αξιολογείται σε συνδυασμό με το ιστορικό του ασθενή και/ή άλλες διαγνωστικές εξετάσεις. 12. ΕΥΡΟΣ ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΣΗΣ Ευρος Βαθμονομησης AU/ml. Για δείγματα >300 AU/ml, επαναλάβετε τη δοκιμασία, προαραιώνοντας το δείγμα με Negative Control Sample Diluent (PF δεν παρέχεται με το κιτ). 13. ΕΥΡΟΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Οι αναμενόμενες τιμές στο φυσιολογικό πληθυσμό, οι οποίες προσδιορίστηκαν κατόπιν ανάλυσης 120 δειγμάτων ορού από υγιείς δότες, κυμαίνονται μεταξύ 3.0 και 10.8 AU/ml. 14. ΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ Υποβλήθηκαν σε δοκιμασία 5 δείγματα (2 αρνητικά, 1 στην τιμή αποκοπής και 2 θετικά), στα οποία προστέθηκαν οι ακόλουθες ουσίες παρεμβολής: Ρευματοειδής παράγοντας ( UI/ml) Χολερυθρίνη (4.5 mg/dl 45 mg/dl) Τριγλυκερίδια (10 mg/ml 250 mg/ml) Αιμοσφαιρίνη (5 mg/ml 30 mg/ml) Η παρουσία των ανωτέρω ουσιών παρεμβολής στον εξεταζόμενο ορό δεν μεταβάλλει το αποτέλεσμα της δοκιμασίας προσδιορισμού, με εξαίρεση τον ρευματοειδή παράγοντα που μπορεί να επηρεάσει το αποτέλεσμα της ανάλυσης. 15. ΔΙΑΣΤΑΥΡΟΥΜΕΝΕΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ Υποβλήθηκαν σε δοκιμασία 3 δείγματα, θετικά για Scl-70, SS- B και Cenp-B. Δεν διαπιστώθηκαν σημαντικές διασταυρούμενες αντιδράσεις. 16. ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΚΑΙ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ Στο πλαίσιο εξωτερικής δοκιμής, υποβλήθηκαν σε δοκιμασία 117 δείγματα με το κιτ Diesse και με άλλο κιτ του εμπορίου. Παρακάτω αναφέρονται τα αποτελέσματα της δοκιμής: Diesse Αναφορά + - Σύνολο Σύνολο Ποσοστό συμφωνίας θετικών αποτελεσμάτων (~διαγνωστική ευαισθησία): 89.3% CI95%: Ποσοστό συμφωνίας αρνητικών αποτελεσμάτων: (~Διαγνωστική ειδικότητα): 97.8% CI95%: ΑΚΡΙΒΕΙΑ Εντός κύκλου Μεταξύ κύκλων αναλύσεων αναλύσεων Δείγμα Μ.Τ. Μ.Τ Μεταξύ παρτίδων Μεταξύ αναλυτών Δείγμα Μ.Τ. Μ.Τ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Dietrich W et al : 81997) Nat. Med. 3: Holtmeier W and Caspary WF (1998) Z. Gastroenterol. 36: Caspary WF, Holtmeier W (1999) Deutches Arzteblatt 96 (36): A Catassi C. et al (1994) Lancet 343: Volta U. et al (2008) Dig Dis Sci 53(6): Παρασκευάζεται από: DISE Diagnostica Senese S.p.A. Via delle Rose Monteriggioni (Siena) Italy

10 10/14 earliest serological marker for pediatricians when diagnosing celiac disease. INSTRUCTIONS FOR USE CHORUS DEAMIDATED GLIADIN-G For the semiquantitative determination of IgG antibodies against deamidated Gliadin For In Vitro Diagnostic Use Only 1. INTDED USE Immunoenzymatic method for the semiquantitative determination of IgG antibodies against deamidated Gliadin in human serum, using a disposable device applied on the Chorus and Chorus TRIO instruments. 2. INTRODUCTION Gluten-sensitive enteropathy or celiac disease is characterized by atrophy of the small intestinal villi leading to a so-called flat mucosa. It is caused by a pathological intolerance to Gliadin, the alcohol-soluble fraction of gluten in wheat, rye and barley. As celiac disease is caused by the intake of gluten, consequently a gluten-free diet cures the disease completely and thus has to be maintained throughout life. Renewed consumption of Gliadin leads to a return of the symptoms. The disease is HLA-associated (>95% of patients have DQ2 encoded by DQA1*0501 and DQB1*0201) and manifests at any age with a peak onset in early childhood, even in newborn babies. The incidence ranges from 1 in 4000 to 1 in 300 in European countries. Diagnosis of celiac disease is made by small intestinal biopsy (demonstrating the flat mucosa) supported by serological markers. Antibodies against Gliadin and tissue Transglutaminase (ttg) are of major significance. ttg has been identified as the major target antigen of EMA antibodies binding to endomysium (extracellular constituent of smooth muscle) in indirect immunofluorescence test (IFT), which has so far been an important tool for the diagnosis of celiac diseases. In the second half of the 2000s anti-gliadin deamidated peptide antibodies (DGP) were discovered: they react with peptides derived from the digestion of gliadin and subsequently are deamidated by ttg. The kits for the detection of anti-dgp antibodies, therefore, are more sensitive and more specific for the diagnosis of GSE compared to the classic kit for anti-gliadin antibodies. The determination of IgG antibodies is very important especially for the patients with IgA deficiency, in which, therefore, antideamidated gliadin antibodies may not be detected by the evaluation of IgA concentration. Antibodies to Gliadin may be the only serological marker in newborns as anti-ttg and EMA autoantibodies are not present at this age. Consequently anti-gliadin antibodies are the 3. PRINCIPLE OF THE METHOD The Deamidated Gliadin-G devices are ready to use for the assay of IgG antibodies against deamidated Gliadin in the CHORUS instruments. The test is based on the ELISA principle (Enzyme linked Immunosorbent Assay). The antigen, composed of highly purified deamidated gliadin, is bound to the solid phase. The specific immunoglobulins are bound to the antigen through incubation with diluted human serum. After washings to eliminate the proteins which have not reacted, incubation is performed with the conjugate, composed of anti-human immunoglobulins conjugated to horse radish peroxidase. The unbound conjugate is eliminated, and the peroxidase substrate added. The blue colour which develops is proportional to the concentration of specific antibodies present in the serum sample. The disposable devices contain all the reagents to perform the test when applied on the Chorus instruments. 4. WARNINGS AND PRECAUTIONS FOR IN VRO DIAGNOSTIC USE ONLY This kit contains materials of human origin which have been tested and gave a negative response by FDAapproved methods for the presence of HBsAg and for anti- HIV-1, anti-hiv-2 and anti-hcv antibodies. As no diagnostic test can offer a complete guarantee regarding the absence of infective agents, all material of human origin must be handled as potentially infectious. All precautions normally adopted in laboratory practice should be followed when handling material of human origin. Waste disposal: serum samples, calibrators and strips once used must be treated as infectious residuals and eliminated according to law. Health and Safety Information 1. Do not pipette by mouth. 2. Wear disposable gloves and eye protection while handling specimens. 3. Wash hands thoroughly after placing the devices in the CHORUS instrument. 4. The following reagents contain low concentrations of harmful or irritant substances: a) The conjugate contains phenol b) The substrate is acid If any of the reagents come into contact with the skin or eyes, wash the area extensively with water. 5. Neutralized acids and other liquid waste should be decontaminated by adding a sufficient volume of sodium hypochlorite to obtain a final concentration of at least 1%. A 30 minute exposure to 1% sodium hypochlorite may be necessary to ensure effective decontamination.

11 11/14 6. Spillage of potentially infectious materials should be removed immediately with adsorbent paper tissue and the contaminated area swabbed with, for example, 1.0% sodium hypochlorite before work is continued. Sodium hypochlorite should not be used on acid-containing spills unless the spill area is first wiped dry. Materials used to clean spills, including gloves, should be disposed of as potentially biohazardous waste. Do not autoclave materials containing sodium hypochlorite. Analytical Precautions Bring the devices to room temperature (18-30 C) before use; use within 60 min. 1. Discard devices which show the substrate (well 4) blue colored. 2. Adding the sample into the well verify that it is perfectly distributed on the bottom. 3. Check for the presence of the reagents in the device and that the device is not damaged; do not use devices which are lacking a reagent. 4. The devices are for use with the Chorus instrument; the instructions for use must be carefully followed and the instrument operating manual must be consulted. 5. Check that the Chorus instrument is set up correctly (see Chorus Operating Manual). 6. Do not alter the bar code placed on the handle of the device in order to allow correct reading by the instrument. 7. Avoid using self-defrosting freezers for the storage of the samples. 8. Defective barcodes can be inserted manually in the instrument. 9. Do not expose the devices to strong light or to hypochlorite vapors during storage and use. 10. The use of strongly hemolyzed samples or samples presenting microbial contamination may all constitute sources of error. 11. Before inserting the devices in the instrument, check that the reaction well does not contain foreign bodies. 12. Pipette the test serum (50 μl) in well 1 of the device (see figure). 13. Do not use the device after the expiry date. 14. Make sure that the instrument is connected to the Washing Buffer Autoimmunity REF K COMPOSION AND REAGT PREPARATION The kit is sufficient for 36 tests (REF 86100). The kit is sufficient for 12 tests (REF 86100/12). DD DEVIC 6 packages each containing 6 devices (REF 86100). 2 packages each containing 6 devices (REF 86100/12). Description: Position 8: Space for application of bar code label Position 7: Empty Position 6: MICROPLATE WELL Coated with deamidated gliadin Position 5: Uncoated MICROPLATE WELL Position 4: SUBSTRATE TMB Contents: Tetramethylbenzidine 0.26 mg/ml and H2O2 0.01% stabilized in 0.05 mol/l citrate buffer (ph 3.8) Position 3: SAMPLE DILUT Contents: Proteic solution containing Tween % and Proclin 0.1%. Position 2: CONJUGATE Contents: monoclonal antibodies anti-human IgG labelled with peroxidase in phosphate buffer containing phenol 0.05% and Bronidox 0.02%. Position 1: EMY WELL In which the operator must place the undiluted serum Use: equilibrate a package at room temperature, open the package and remove the required devices; replace the others in the bag with the silica gel, expel the air and seal by pressing the closure. Store at 2-8 C. CALIBRATOR CALIBRATOR 1 x ml Contents: Diluted human serum, at known antibody concentration containing Proclin and Gentamycin. Liquid, ready for use. CONTROL + POSIVE CONTROL 1 x ml Contents: Diluted human serum, at known antibody concentration containing Proclin and Gentamycin. Liquid, ready for use. MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED WASHING BUFFER AUTOIMMUNY REF CLEANING SOLUTION 2000 REF SANIZING SOLUTION REF CHORUS NEGATIVE CONTROL/SAMPLE DILUT REF Distilled or deionised water Normal laboratory glassware: cylinders, test-tubes etc. Micropipettes for the accurate collection of µl solution Disposable gloves Sodium Hypochlorite solution (5%) Containers for collection of potentially infectious materials 6. STORAGE AND STABILY OF REAGTS Reagents must be stored at 2/8 C. In the case of storage at an incorrect temperature the calibration must be repeated and the run validated using the control serum (see section 9, Test validation). The expiry date is printed on each component and on the kit label.

12 12/14 Reagents have a limited stability after opening: DEVIC CALIBRATOR POSIVE CONTROL 8 weeks at 2/8 C 8 weeks at 2/8 C 8 weeks at 2/8 C 7. SPECIM COLLECTION AND STORAGE The sample is composed of serum collected in the normal manner from the vein and handled with all precautions dictated by good laboratory practice. The fresh serum may be stored for 4 days at 2/8 C, or frozen for longer periods at 20 C, and can be thawed a maximum of 3 times. Do not keep the samples in auto-defrosting freezers. Heat-inactivation can rise to erroneous results. Defrosted samples must be shaken carefully before use. The quality of the sample can be seriously affected by microbial contamination which leads to erroneous results. Strongly lipemic, icteric, hemolyzed or contaminated samples cannot be used. The test cannot be applied to plasma. 8. ASSAY PROCEDURE 1. Open the package (on the side containing the pressureclosure), remove the number of devices required and seal the rest in the bag after expelling the air. 2. Check the state of the device according to the indications reported in chapter 4, Analytical Precautions. 3. Dispense 50 µl of undiluted test serum in well no. 1 of each device; at each change of batch, use a device for the calibrator. 4. Place the devices in the Chorus instrument. Perform the calibration (if necessary) and the test as reported in the Chorus Operating Manual. 9. TT VALIDATION Use the control serum to check the validity of the results obtained. It should be used as reported in the operating manual. If the instrument signals that the control serum has a value outside the acceptable range, the calibration must be repeated. The previous results will be automatically corrected. If the result of the control serum continues to be outside the acceptable range, contact the Scientific Support. Tel: Fax: scientificsupport@diesse.it 10. INTERPRETATION OF THE RULTS The Chorus instrument expresses the result in AU/ml calculated on the basis of a batch-dependent curve stored in the instrument. The test serum can be interpreted as follows: POSIVE: when the ratio is > 18.0 AU/ml NEGATIVE: when the ratio is < 12.0 AU/ml DOUBTFUL/EQUIVOCAL: for all values between 12.0 and 18.0 AU/ml In the case of a doubtful result, repeat the test. If the test remains doubtful, collect a new sample. 11. LIMATIONS The test cannot be used as only method for a clinical diagnosis. Negative results may not exclude an eventual infection. The test results should be interpreted in conjunction with information available from the clinical evaluation and other diagnostic procedures. 12. CALIBRATION RANGE Calibration range AU/ml. For samples with a titer > 300AU/ml repeat the test pre-diluting the sample with Negative Control/Sample Diluent (PF83607 not supplied with the kit). 13. REFERCE RANGE Among the normal population the expected values, which have been determined by examining 120 sera from healthy donors, were between 3.0 and 10.8 AU/ml. 14. ANALYTICAL SPECIFICY 5 samples (2 negative, 1 Cut-Off and 2 Positive) containing the following interfering substances were tested: Rheumatoid Factor ( UI/ml) Bilirubin (4.5 mg/dl 45 mg/dl) Triglycerides (10 mg/ml 250 mg/ml) Hemoglobin (5 mg/ml 30 mg/ml) The presence in the tested serum of the interfering substances listed above did not alter the results of the test, except for Rheumatoid Factor that can influence the result of the analysis. 15. CROSS-REACTIONS 3 samples, positive to Scl-70, SS-B and Cenp-B were tested. No significant cross-reactions were found. 16. DIAGNOSTIC SSIVY AND SPECIFICY In an external experimentation 117 samples were tested with the Diesse kit and with another commercial kit. The results are summarized in the following table: Diesse Reference + - Total Total Percent Positive Agreement (~Diagnostic Sensitivity): 89.3% CI95%: Percent Negative Agreement: (~Diagnostic Specificity): 97.8% CI95%:

13 13/ PRECISION Within-run Precision Betweeen-run precision Sample Mean Mean Sample Precision between Precision between batches instruments Mean Mean REFERC 1. Dietrich W et al : 81997) Nat. Med. 3: Holtmeier W and Caspary WF (1998) Z. Gastroenterol. 36: Caspary WF, Holtmeier W (1999) Deutches Arzteblatt 96 (36): A Catassi C. et al (1994) Lancet 343: Volta U. et al (2008) Dig Dis Sci 53(6): Manufactured by DISE Diagnostica Senese S.p.A. Via delle Rose Monteriggioni (Siena) Italy

14 14/14 Date of manufacture Fecha de fabricación Data di fabbricazione Date de fabrication Ημερομηνία Παραγωγής Data de fabrico Use By Fecha de caducidad Utilizzare entro Utiliser jusque Ημερομηνία λήξης Prazo de validade Do not reuse No reutilizar Non riutilizzare Ne pas réutiliser Μην κάνετε επαναληπτική χρήση Não reutilizar Caution,consult accompanying documents Atención,ver instrucciones de uso Attenzione, vedere le istruzioni per l'uso Attention voir notice d'instructions Προειδοποίηση, συμβουλευτείτε τα συνοδά έντυπα Atenção, consulte a documentação incluída Manufacturer Fabricante Fabbricante Fabricant Κατασκευαστής Fabricante Contains sufficient for <n> tests Contenido suficiente para <n> ensayos Contenuto sufficiente per "n" saggi Contenu suffisant pour "n"tests Περιεχόμενο επαρκές για «ν» εξετάσεις Conteúdo suficiente para n ensaios Temperature limitation Límite de temperatura Limiti di temperatura Limites de température Περιορισμοί θερμοκρασίας Limites de temperatura Consult Instructions for Use Consulte las instrucciones de uso Consultare le istruzioni per l'uso Consulter les instructions d'utilisation Συμβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης Consulte as instruções de utilização Biological risks Riesgo biológico Rischio biologico Risques biologiques Βιολογικοί κίνδυνοι Risco biológico Catalogue number Número de catálogo Numero di catalogo Référence du catalogue Αριθμός καταλόγου Referência de catálogo In Vitro Diagnostic Medical Device Producto sanitario para diagnóstico in vitro Dispositivo medico-diagnostico in vitro Dispositif médical de diagnostic in vitro In Vitro Διαγνωστικό Ιατροτεχνολογικό προϊόν Dispositivo médico para diagnóstico in vitro Batch code Código de lote Codice del lotto Code du lot Αριθμός Παρτίδας Código do lote