BIO408/BIO506 Απο την πρωτεΐνη στο πρωτεινωµα στις µοριακες µηχανες Tάσος Οικονόµου
Τι θα πούµε 1. Βασική πρωτεινική Βιοχηµεία 2. Πρωτεινες στο κυτταρικό περιβάλλον 3. Απο τις µεµονωµένες πρωτείνες στο Interactome Πως µελετάµε: 1. Πρωτεινες? 2. ιαπρωτεινικές επαφές? 3. ιαπρωτεινωµικες επαφες?
Τι θα πούµε 1. Βασική πρωτεινική Βιοχηµεία 2. Πρωτεινες στο κυτταρικό περιβάλλον 3. Απο τις µεµονωµένες πρωτείνες στο Interactome Πως µελεταµε: 1. Πρωτεινες? 2. ιαπρωτεινικές επαφές? 3. ιαπρωτεινωµικες επαφες?
H xηµεία της ζωής είναι χηµεία πολυµερών
4 γευσεις βιολογικων µακροµοριων ΑΤΑΞΙΑ ΑΤΟΜΑ Ν, Ο, C, S, P, H... (ΜΙΚΡΟ)ΜΟΡΙΑ Σάκχαρα Λιπαρά οξέα Νουκλεοτίδια Αµινοξέα ΜΑΚΡΟΜΟΡΙΑ Πολυσακχαρίτες Λιπίδια DNA, RNA Πρωτεΐνες ΜΑΚΡΟΜΟΡΙΑΚΑ ΣΥΜΠΛΟΚΑ ΤΑΞΗ (οργάνωση δοµών) µη πληροφοριακά πληροφοριακά
Τι δουλειές εκτελούν οι ΠPΩTEINEΣ? 1. Kατάλυση κυτταρικής χηµείας 2. Pύθµιση κυτταρικής χηµείας 3. οµικά στοιχεία κύτταρου
οµη αµινοξεων
οµή αµινοξέων-η οµαδα R +σεληνοκυστεινη +πυρολυσινη
Πεπτιδικος δεσµος
οµή πρωτεινών (πρωτοταγης) NH2-Ala-Leu-Arg-Phe-Gly-Asp-Asp- Glu-Arg-Met etc.------cooh Πεπτιδικος δεσµος
οµή πρωτεινών (δευτεροταγης) α-ελικα/α-ελικα
οµή πρωτεινών (δευτεροταγης) β-πτυχωτο φυλλο/β-sheet
οµή πρωτεινών (τριτοταγης)
οµή πρωτεινών (τεταρτοταγης)
Τι θα πούµε 1. Βασική πρωτεινική Βιοχηµεία 2. Πρωτεινες στο κυτταρικό περιβάλλον 3. Απο τις µεµονωµένες πρωτείνες στο Interactome Πως µελεταµε: 1. Πρωτεινες? 2. ιαπρωτεινικές επαφές? 3. ιαπρωτεινωµικες επαφες?
Tι είναι το κύτταρο? Γιαννης Χηµικοπουλος Xµµµµ. ένα σακκουλάκι µε οργανικά χηµικά Μαρια Εντροπιδου Xµµµµ. µία εντροπική µηχανή ενέργεια ζωή θερµότητα
ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΥΛΟΣ Xηµεία - H 2 O - 4 πολυµερή Tι είναι το κύτταρο? DNA RNA Πολυπεπτίδια Πολυσακχαρίτες Σύνθετα Λιπίδια Πόσα? (% dry weight) 3.1 20.5 55 6 9.1 - µονοµερή - διάφορα (στοιχεία, προσθετικές οµάδες κλπ) } 4
ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΥΛΟΣ Tι είναι το κύτταρο? Kαθορ ισµένη χηµ ικά οντότητα µε ποσοτικά ορ ισµένο περ ιεχόµενο
ΚΥΤΤΑΡΟΠΟΥΛΟΣ Tι είναι το κύτταρο? Kαθορ ισµένη χηµ ικά οντότητα µε ποσοτικά ορ ισµένο περ ιεχόµενο Mπαµµµ!!!!! H B ιολογ ία µετατρέπετα ι σε πραγµατική επ ιστήµη
Πως δουλεύει το κύτταρο? ηµήτρης Γενετικάκης Xµµµµ....είναι γεµάτο γονίδια Mάκης Bιοχηµικάκης Xµµµµ....είναι γεµάτο πρωτείνες...τα γονίδια "δίνουν" πρωτείνες...οι πρωτείνες καταλύουν χηµικές αντιδράσεις, ρυθµίζουν και δηµιουργούν δοµές
Mycoplasma genitalium 482 γονίδια 440 πρωτείνες + 42 δοµικά RNA
M. genitalium Γονίδιο 1 1 mrna 1 Πολυπεπτίδιο 1 Πρωτο+ δευτεροταγής δοµή Τριτοταγής δοµή-aναδίπλωση Τροποποιήσεις Υποκυτταρική στόχευση Tεταρτοταγής δοµή ενέργεια ζωή θερµότητα
Τι θα πούµε 1. Βασική πρωτεινική Βιοχηµεία 2. Πρωτεινες στο κυτταρικό περιβάλλον 3. Απο τις µεµονωµένες πρωτείνες στο Interactome Πως µελεταµε: 1. Πρωτεινες? 2. ιαπρωτεινικές επαφές? 3. ιαπρωτεινωµικες επαφες?
Λίγες πρωτείνες δρουν κατά µόνας π.χ. Υδρολάσες µικρών µορίων
Οι περισσότερες πρωτείνες ζούν σε αλληλεπίδραση µε άλλες π.χ. RNA πολυµεράσες, ριβόσωµα, µοριακές µηχανές
θερµότητα M. genitalium Γονίδιο 1 mrna 1 Πολυπεπτίδιο 1 Γονίδιο 2 mrna 2 Πολυπεπτίδιο 2 Γονίδιο 3 mrna 3 Πολυπεπτίδιο 3 Πρωτο+ δευτεροταγής δοµή Τριτοταγής δοµή-aναδίπλωση τροποποιήσεις Υποκυτταρική στόχευση Mοριακή Mηχανή ή Πολυµερικό Eνζυµο Tεταρτοταγής δοµή Tεταρτοταγής δοµή ενέργεια ζωή
Mycoplasma genitalium 482 γονίδια 440 πρωτείνες + 42 δοµικά RNA <100 µοριακές Mηχανές π.χ. - µαστίγιο ~50 υποµ. - ριβόσωµα ~50 υποµ. - F1ATPase ~8 υποµ. - DNApol ~10 υποµ. - SecTranslocase ~9
Tι είναι το κύτταρο? Molecular Crowding 200-500 mg/ml πολυπεπτιδια
Molecular Crowding Tι είναι το κύτταρο? ενα Interactome
Η βιολογική πολυπλοκότητα πατά πάνω στην πρωτεινική πολυπλοκότητα
- Θυµισου!!!!!!!!!! - Σε σχεση µε το γονιδιωµα το πρωτεινωµα ειναι πολυ πιο δυναµικο - Πρωτεινικη πολυπλοκοτητα>>γονιδιακη πολυπλοκοτητα
Tι είναι το κύτταρο? Γιαννης Χηµικοπουλος Xµµµµ. ένα σακκουλάκι µε οργανικά χηµικά Μαρια Εντροπιδου Xµµµµ. µία εντροπική µηχανή ενέργεια ζωή θερµότητα
Τι ειναι το κύτταρο?..ένα εργοστάσ ιο δυναµ ικών µορ ιακών µηχανών που αλληλεπ ιδρούν Για να το κατανοήσω πρέπει να αποκτήσω πλήρη γνώση: 1. των ξεχωριστών ~100 µοριακών µηχανών (...το µονοπάτι της φώτισης..) 2. των επιδράσεων µεταξύ των µοριακών µηχανών 3. της κινητικής της δράσης των µοριακών µηχανών.
Τι θα πούµε 1. Βασική πρωτεινική Βιοχηµεία 2. Πρωτεινες στο κυτταρικό περιβάλλον 3. Απο τις µεµονωµένες πρωτείνες στο Interactome Πως µελεταµε: 1. Πρωτεινες? 2. ιαπρωτεινικές επαφές? 3. ιαπρωτεινωµικες επαφες?
Τι θέλω να µάθω µελετώντας πρωτείνες κατά µόνας...6 easy pieces...
Τι θέλω να µάθω µελετώντας πρωτείνες κατά µόνας...6 easy pieces... 1. οµές σε ατοµική λεπτοµέρεια
Τι θέλω να µάθω µελετώντας πρωτείνες κατά µόνας...6 easy pieces... 1. οµές σε ατοµική λεπτοµέρεια 2. Πρόσδεση υποστρωµάτων+κατάλυση
Τι θέλω να µάθω µελετώντας πρωτείνες κατά µόνας...6 easy pieces... 1. οµές σε ατοµική λεπτοµέρεια 2. Πρόσδεση υποστρωµάτων+κατάλυση 3. ιαπρωτεινικές επαφές
Τι θέλω να µάθω µελετώντας πρωτείνες κατά µόνας...6 easy pieces... 1. οµές σε ατοµική λεπτοµέρεια 2. Πρόσδεση υποστρωµάτων+κατάλυση 3. ιαπρωτεινικές επαφές 4. Κρίσιµα αµινοξέα
Τι θέλω να µάθω µελετώντας πρωτείνες κατά µόνας...6 easy pieces... 1. οµές σε ατοµική λεπτοµέρεια 2. Πρόσδεση υποστρωµάτων+κατάλυση 3. ιαπρωτεινικές επαφές 4. Κρίσιµα αµινοξέα 5. ευτερογενείς µετατροπές
Τι θέλω να µάθω µελετώντας πρωτείνες κατά µόνας...6 easy pieces... 1. οµές σε ατοµική λεπτοµέρεια 2. Πρόσδεση υποστρωµάτων+κατάλυση 3. ιαπρωτεινικές επαφές 4. Κρίσιµα αµινοξέα 5. ευτερογενείς µετατροπές 6. Στερεοδιατακτική δυναµική
Τι θέλω να µάθω µελετώντας πρωτείνες κατά µόνας...6 easy pieces... 1. οµές σε ατοµική λεπτοµέρεια 2. Πρόσδεση υποστρωµάτων+κατάλυση 3. ιαπρωτεινικές επαφές 4. Κρίσιµα αµινοξέα 5. ευτερογενείς µετατροπές 6. Στερεοδιατακτική δυναµική ZEN
Εργαλειοθήκη Πρωτεινικης Αναλυσης
Εργαλειοθήκη Πρωτεινικης Αναλυσης 1. Ενζυµολογια-Βιοχηµεία 2. Κρυσταλλογραφια 3. NMR 4. Μοριακη γενετικη 5. Βιοφυσικες/Φυσικοχηµικες µεθοδοι 6. Πρωτεινωµατική
Ηλεκτροφοριση 2 διαστασεων pi MW
Bιοφυσικές Mέθοδοι Xαρακτηρισµού µακροµορίων
Τι θα πούµε 1. Βασική πρωτεινική Βιοχηµεία 2. Πρωτεινες στο κυτταρικό περιβάλλον 3. Απο τις µεµονωµένες πρωτείνες στο Interactome Πως µελεταµε: 1. Πρωτεινες? 2. ιαπρωτεινικές επαφές? 3. ιαπρωτεινωµικες επαφες?
Τι θέλω να µάθω µελετώντας πρωτείνες οµαδόν...4 easy pieces... 1. Ποιος δεσµεύεται µε ποιόν 2. Που δεσµεύεται ο κάθε εταίρος 3. Βιοφυσική της δέσµευσης 4. Λειτουργικές επιπτώσεις ZEN
Εργαλειοθήκη ιαπρωτεινικων Επιδρασεων
Ποιός δεσµεύεται µε ποιόν 2 εταίροι
Ποιός δεσµεύεται µε ποιόν 2 εταίροι Γενετικά εργαλεία 1. Yeast 2-hybrid 2. Genetics (extragenic suppressors, multi-copy suppresion, synthetic phenotype) 3. Phage display Βιοχηµικά εργαλεία 1. Co-purification/Co-fractionation/Co-sedimentation/Co-purification 2. Far-western 3. Size-exclusion chromatography 4. Native PAGE 5. Rate zonal centrifugation 6. Chemical cross-linking 7. Protease footprinting 8. Peptide scans 9. Enzymatic assays
Yeast 2-hybrid
Genetic suppression
Dominance
Phage Display
Affinity Chromatography
Chemical cross-linking
Ποιός δεσµεύεται µε ποιόν 2 εταίροι Βιοφυσικά εργαλεία 1. Κρυσταλλογραφία 2. NMR 3. Aναλυτική Υπερφυγοκέντριση- Sedimentation Equilibrium 4. Light Scattering 5. Surface Plasmon Resonance and other biosensors 6. Fluorescence (e.g. FRET) 7. Circular dichroism 8. Isothermal Titration Calorimetry 9. Mass spectrometry
Isothermal Titration Calorimetry -Affinity -Stoichiometry -Thermodynamics
Surface Plasmon Resonance
Bιοφυσικές Mέθοδοι Xαρακτηρισµού µακροµορίων
Μελετη του Interactome
Τι θα πούµε 1. Βασική πρωτεινική Βιοχηµεία 2. Πρωτεινες στο κυτταρικό περιβάλλον 3. Απο τις µεµονωµένες πρωτείνες στο Interactome Πως µελεταµε: 1. Πρωτεινες? 2. ιαπρωτεινικές επαφές? 3. Ενδοπρωτεινωµικες επαφες?
Ποιός δεσµεύεται µε ποιόν n εταίροι
Εργαλειοθήκη ιαπρωτεινωµατικων Επιδρασεων
Ποιός δεσµεύεται µε ποιόν n εταίροι 1. Yeast 2-hybrid 2. Protein+immuno microarrays 3. Multidimensional chromatography 4. Protein tagging+ms
Protein chips immobilize probe detect
Protein chips Προβληµατα protein chips - Περιπλοκη χηµεια διασυνδεσης - Ασταθεια δεσµευµενων πολυπεπτιδιων - Steel spotter µη καταλληλος - Χαµηλοτερη πυκνοτητα (1000 proteins/cm 2 vs ~ 400,000 DNA oligos/cm 2 )
Πολυπεπτιδικος διαχωρισµος πολλαπλων διαστασεων
ισδιαστατη αποµονωση πολυπεπτιδιων
Πολύτιµες πληροφορίες από πρωτεινωµατικη αναλυση - Σχετικές συγκεντρώσεις πολυπεπτιδιων στο κύτταρο - Kινητική έκφρασης - ιαπρωτεινικές επαφές (ταυτόχρονες και εν παραλλήλω) - Mετα-µεταφραστικές τροποιήσεις
Πρωτεινωµατικα εργαλεια σαν διαγνωστικα - Σε σχεση µε το γονιδιωµα το πρωτεινωµα ειναι πολυ πιο δυναµικο - Πρωτεινικη πολυπλοκοτητα>>γονιδιακη πολυπλοκοτητα Oι περισσοτερες ασθενειες δεν εχουν ξεκαθαρο γενετικο υποβαθρο ιαγνωστικα βασισµενα σε συστοιχιες DNA ειναι περιορισµενης αποτελεσµατικοτητας