ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ Ι * ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΣΚΗΣΗ: ΔΥΝΑΜΙΚΟ ΕΝΕΡΓΕΙΑΣ Υπεύθυνος: Κων/νος Παπαθεοδωρόπουλος, Αναπληρωτής καθηγητής ΑΣΚΗΣΗ 1. ΕΞΑΣΚΗΣΗ ΣΤΗ ΝΕΥΡΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ ΜΕ ΠΟΛΥΜΕΣΑ ΚΑΙ ΠΡΟΣΟΜΟΙΩΣΕΙΣ * Α. Απαραίτητες γνώσεις: 1. Διεγερσιμότητα: Ορισμός, ρόλος. 2. Δυναμικό Ενέργειας (ΔΕ): Ορισμός & παράμετροι απεικόνισης του φαινομένου, Ιοντικός μηχανισμός δημιουργίας ΔΕ, Ιοντικά Ρεύματα Νατρίου/Καλίου Ρόλος. 3. Κατώφλιο δυναμικό ή Ουδός στη δημιουργία του ΔΕ: Ορισμός, Μηχανισμός. 4. Περίοδος Σχετικής και Απόλυτης Ανερεθιστότητας: Ορισμός, Μηχανισμός, Λειτουργικός Ρόλος. Β. Εκπαιδευτικοί Στόχοι: 1. Μεθοδολογία που ακολουθείται για την μέτρηση δυναμικού ενεργείας από ένα νευρικό ή μυϊκό κύτταρο. Προσομοίωση της σχετικής πειραματικής διαδικασίας με τη χρήση προγράμματος Η/Υ. 3. Κατώφλιο ή Βαλβιδικό πειραματικό ερέθισμα. 4. Πειραματικοί τρόποι διερεύνησης των χαρακτηριστικών των δύο ρευμάτων Να + και Κ + 5. Περίοδος Σχετικής και Απόλυτης Ανερεθιστότητας: Μεθοδολογία υπολογισμού. 6. Διεγερσιμότητα: Μέθοδοι υπολογισμού. Πειραματική ποσοτικοποίηση της διεγερσιμότητας. Ρεοβάση Χροναξία: Ορισμός και πειραματικός προσδιορισμός. Γ. Πορεία Άσκησης Παρουσίαση-συζήτηση επί των βασικών εννοιών και φαινομένων που αφορούν στην Άσκηση (βλ. Α & Β). Παρουσίαση του προγράμματος προσομοίωσης. Επεξήγηση της χρήσης του και της απαιτούμενης πειραματικής διαδικασίας. Εκτέλεση πειράματος με τη χρήση του προγράμματος προσομοίωσης. Συμπλήρωση του ειδικού φυλλαδίου με τα αποτελέσματα του πειράματος. 1
Δ. Έννοιες και Μεθοδολογία στην πειραματική διερεύνηση του ΔΕ ενός κυττάρου (ιοντικού μηχανισμού και φαρμακολογίας) και του ποσοτικού προσδιορισμού της διεγερσιμότητας. 1. Πειραματικά υλικά στην πρόκληση & καταγραφή της ηλεκτρικής δραστηριότητας νευρικού κυττάρου. Προκειμένου να μελετηθούν οι ιδιότητες και ο μηχανισμός γένεσης του ΔΕ ενός κυττάρου θα πρέπει να καταγράφεται συνεχώς η διαφορά δυναμικού μεταξύ της ενδοκυττάριας και εξωκυττάριας πλευράς της κυτταρικής μεμβράνης. Αυτό είναι πρακτικά εφικτό με την χρησιμοποίηση δύο (ηλεκτρικά αγώγιμων) ηλεκτροδίων, όπου το ένα ηλεκτρόδιο θα εισχωρεί εντός του κυττάρου ενώ το άλλο θα βρίσκεται στο εξωκυττάριο (αγώγιμο) υδατικό μέσο και θα συνιστά το ηλεκτρόδιο αναφοράς. Με αυτές τις συνθήκες θα καταγράφεται το δυναμικό της ενδοκυττάριας μεμβρανικής περιοχής σε σχέση με την εξωκυττάρια, το δυναμικό της οποίας θεωρείται ίσο με μηδέν. Έτσι, η καταγραφή αντανακλά την ενδοκυττάρια ηλεκτρική δραστηριότητα. Ενώ το εξωκυττάριο ηλεκτρόδιο αναφοράς μπορεί να είναι κατασκευασμένο από απλό μεταλλικό υλικό, το ενδοκυττάριο ηλεκτρόδιο συνίσταται από έναν εξαιρετικά οξύληκτο γυάλινο κύλινδρο πληρωμένο με ηλεκτρολυτικό διάλυμα (π.χ. άλας Κ + ). Η απαίτηση του οξύληκτου του ενδοκυττάριου ηλεκτροδίου(διάμετρος αιχμής ~ 1μm) επιβάλλεται από τις σχετικά μικρές διαστάσεις των σωμάτων των νευρικών κυττάρων (~ 10-50 μm) και την αναγκαιότητα να διατηρηθεί η δομική ακεραιότητα του κυττάρου κατά την είσοδο του ηλεκτροδίου εντός του ενδοκυττάριου χώρου. Με αυτόν τον τρόπο, οι μεταβολές του (ενδοκυττάριου, θα εννοείται πλέον) μεμβρανικού δυναμικού θα άγονται μέσω του ενδοκυττάριου ηλεκτροδίου σε έναν ενισχυτή ηλεκτρικών σημάτων και θα γίνονται ορατές επί της οθόνης παλμογράφου. Κάτω από πειραματικές συνθήκες, λόγω της σχετικής ηρεμίας των νευρικών κυττάρων, η δημιουργία ΔΕ συνήθως απαιτεί την επέμβαση του πειραματιστή για την πρόκλησή του. Αυτό είναι δυνατόν με την επίδοση τετραγωνικών παλμών ηλεκτρικού ρεύματος εντός του κυττάρου με ένα ενδοκυττάριο ηλεκτρόδιο. Το εγχεόμενο (θετικό) ρεύμα θα εκπολώσει την μεμβράνη και εάν είναι αρκετό-βαλβιδικό (βλ. πιο κάτω) θα προκαλέσει την έκλυση ΔΕ. 2. Διεγερσιμότητα: Μέθοδοι υπολογισμού. Πειραματική ποσοτικοποίηση της διεγερσιμότητας. Οποιοσδήποτε ηλεκτρικός παλμός έχει συγκεκριμένο πλάτος (ένταση) και διάρκεια. Είναι αντιληπτό ότι υπάρχει ένας πολύ μεγάλος συνδυασμός πλάτους και διάρκειας παλμών οι οποίοι δύνανται να προκαλέσουν ΔΕ βαλβιδικών ή υπερ-βαλβιδικών παλμών, με τους τελευταίους να είναι πρακτικά άπειροι. Ωστόσο, η διεγερσιμότητα ενός κυττάρου μπορεί να ποσοτικοποιηθεί μέσω μόνον των βαλβιδικών παλμών, δηλαδή εκείνων που αντιστοιχούν σε συνδυασμούς πλάτους/διάρκειας ρεύματος που μόλις 2
επαρκούν για την πρόκληση ΔΕ. Το ποσό του ρεύματος (γινόμενο πλάτους Χ διάρκεια) είναι ίδιο για όλα τα ζεύγη των κατώφλιων παλμών. Το ορισμένο και σχετικά μικρό σύνολο των βαλβιδικών ερεθισμών συνιστά μια καμπύλη επί του καρτεσιανού χώρου που ορίζεται από το πλάτος και την διάρκεια των παλμών και για κάθε κύτταρο παρουσιάζει συγκεκριμένα χαρακτηριστικά. Μέσω της κατασκευής της καμπύλης αυτής μπορεί έτσι να ποσοτικοποιηθεί η διεγερσιμότητα κάθε κυττάρου. Προκειμένου να κατασκευαστεί η καμπύλη της διεγερσιμότητας θα πρέπει να βρεθούν οι παλμοί εκείνοι των οποίων ο συνδυασμός πλάτους/διάρκειας μόλις θα επαρκεί για την πρόκληση ΔΕ. Προκειμένου να βρεθούν τα ζεύγη πλάτους/διάρκειας των (μόλις) βαλβιδικών παλμών επιδίδονται παλμοί οι οποίοι κάθε φορά μεταβάλλονται κατά μία μόνον παράμετρο (πλάτος ή διάρκεια) και από αυτούς επιλέγονται αυτοί οι οποίοι είναι μόλις επαρκείς για την πρόκληση ΔΕ. Επιλέγονται δηλαδή εκείνα τα ζεύγη (ποικίλου) πλάτους/διάρκειας που μόλις επαρκούν για την έκλυση ΔΕ. Κάθε ζεύγος αναπαρίσταται με σημείο σε διάγραμμα που έχει στον άξονα των «Χ» τη διάρκεια σε msec και στον άξονα των «Ψ» το πλάτος σε ma. Η εκθετική καμπύλη που διέρχεται απο τα σημεία αυτά είναι η καμπύλη διεγερσιμότητας. Οσο πιο αριστερά και κάτω είναι η καμπύλη τόσο πιο μεγάλη η διεγερσιμότητα. Πρακτικά μας αρκεί να προσδιορίσουμε την θέση της αριστερά-δεξιά. Ετσι η καμπύλη διεγερσιμότητας καθορίζεται από δύο πειραματικά μεγέθη: αρχικά την ρεοβάση και τελικά την χροναξία. Ρεοβάση είναι η ελάχιστη (κατώφλια) ένταση ρεύματος που απαιτείται για την πρόκληση ΔΕ ανεξάρτητα της διάρκειας ερεθισμού. Δηλαδή, υπάρχει μία ελάχιστη ένταση ερεθισμού κάτω από την οποία δεν είναι δυνατή η πειραματική πρόκληση ΔΕ παρόλο που μπορεί να αυξηθεί η ποσότητα του επιδιδόμενου ρεύματος (μέσω αύξησης της διάρκειας του παλμού). Μπορείτε να σκεφθείτε γιατί συμβαίνει αυτό? Χροναξία είναι η διάρκεια εκείνου του ερεθισμού του οποίου η ένταση αντιστοιχεί στο διπλάσιο της ρεοβάσης. Στην υπασβεστιαιμική τετανία περιμένετε να αλλάξει η χροναξία και γιατί; 3. Πειραματικοί τρόποι διερεύνησης των χαρακτηριστικών των δύο ρευμάτων Να + και Κ + Προκειμένου να προσδιοριστούν τα χαρακτηριστικά των ιοντικών ρευμάτων στα οποία οφείλεται το ΔΕ χρησιμοποιείται η ηλεκτροφυσιολογική τεχνική της καθήλωση δυναμικού κατά την οποία με πειραματικό τρόπο καθηλώνεται το δυναμικό του κυττάρου σε μία συγκεκριμένη τιμή. Αυτό πραγματοποιείται με (πειραματική) κάθε στιγμή επίδοση ρεύματος ίσου και αντίθετου απαιτούμενου για την αναίρεση των (κυτταρικών) ιοντικών ρευμάτων τα οποία και θα προκαλούσαν ανάλογες μεταβολές του μεμβρανικού δυναμικού. 3
Με τον τρόπο αυτό γίνεται δυνατόν να μελετηθούν ξεχωριστά τα ρεύματα που οφείλονται σε διαφορετικά ιόντα. Στην περίπτωση αυτή χρησιμοποιούνται μεθοδολογίες επιλεκτικού αποκλεισμού των διαφόρων ιοντικών διαύλων. 4. Περίοδος Σχετικής και Απόλυτης Ανερεθιστότητας: Μεθοδολογία υπολογισμού. Ο προσδιορισμός της περιόδου σχετικής ανερεθιστότητας πραγματοποιείται επιδίδοντας δύο διαδοχικούς βαλβιδικούς παλμούς ίδιας έντασης/διάρκειας με σταδιακά μειούμενο δια-παλμικό διάστημα και ευρίσκοντας το διάστημα εκείνο στο οποίο ο δεύτερος ερεθισμός αποτυγχάνει να προκαλέσει ΔΕ. Ο προσδιορισμός της περιόδου απόλυτης ανερεθιστότητας πραγματοποιείται επιδίδοντας δύο διαδοχικούς παλμούς εκ των οποίων ο πρώτος είναι βαλβιδικός ενώ ο δεύτερος είναι αυξανόμενης έντασης και ευρίσκοντας το διάστημα εκείνο στο οποίο ο δεύτερος ερεθισμός αποτυγχάνει να προκαλέσει ΔΕ όσο μεγάλη και αν είναι η έντασή του. {Γίνεται σαφές ότι η διαδικασία προσδιορισμού της περιόδου απολύτου ανερεθιστότητας θα περιλαμβάνει δια-παλμικά διαστήματα μικρότερα αυτών που εξετάσθηκαν για τον προσδιορισμό της περιόδου σχετικής ανερεθιστότητας.} Ε. Πρόγραμμα Η/Υ Προσομοίωσης Πειράματος Βασικά στοιχεία χρήσης Όλα τα πιο πάνω περιγραφόμενα θα πραγματοποιηθούν με την χρήση ειδικού λογισμικού Η/Υ: Neurosim II (W.J. Heitler, 1992), και ειδικά με την εφαρμογή ΗΗ με την οποία προσομοιώνεται το πείραμα των Hodgkin & Huxley (1952) που πραγματοποιήθηκε στον γιγαντιαίο άξονα του καλαμαριού (διάμετρος 1mm, σε σύγκριση με τους άξονες των νευρώνων των θηλαστικών: 1-25 μm). Το κύτταρο καθώς και τα απαραίτητα όργανα (ηλεκτρόδια, ενισχυτής παλμογράφος) αναπαρίστανται σχηματικά επί της οθόνης Η/Υ (Εικόνα), ενώ οι διάφοροι πειραματικοί χειρισμοί θα πραγματοποιούνται με την χρήση του πληκτρολογίου. Συγκεκριμένα, στο ένα από τα δύο παράθυρα (με τον τίτλο «setup») της εφαρμογής απεικονίζεται σχηματικά η πειραματική διάταξη που περιλαμβάνει ένα σφαιρικό κύτταρο, τις ενδοκυττάριες και εξωκυττάριες συγκεντρώσεις των ιόντων νατρίου και καλίου, τα δύο ηλεκτρόδια καταγραφής (recording) και ερεθισμού (stimulating) καθώς και την θερμοκρασία εκτέλεσης του πειράματος. Περιέχονται επίσης και προεπιλεγμένες τιμές των παθητικών ηλεκτρικών ιδιοτήτων της μεμβράνης (membrane properties) οι οποίες θα διατηρούνται σταθερές. 4
Η καταγραφή θα αφορά εις το δυναμικό της μεμβράνης, του οποίου οι μεταβολές εμφανίζονται στο πρώτο διάγραμμα (άξονας Υ Volt ) του παραθύρου με τον τίτλο Results που προσομοιώνει την οθόνη παλμογράφου. Στην περιοχή ελέγχου του ερεθισμού (stimulating) θα ελέγχονται το πλάτος (amp: amplitude) και η διάρκεια (dur: duration) δύο διαδοχικών ερεθισμών (pulse 1, pulse 2). Επίσης θα καθορίζεται και η χρονική απόσταση (delay) μεταξύ των δύο διαδοχικών ερεθισμών. Σημειώνεται ότι δύο διαδοχικοί ερεθισμοί είναι σκόπιμο να χρησιμοποιηθούν στην περίπτωση που θα ελεγχθεί η διάρκεια της σχετικής και απόλυτης περιόδου ανερεθιστότητας. Σε όλους τους άλλους πειραματικούς ελέγχους θα επιδίδεται ένας ερεθισμός. Ο αποκλεισμός επίδοσης δεύτερου ερεθισμού γίνεται με μηδενισμό του πλάτους του. Παρατηρούμε τις μονάδες μέτρησης των διαφόρων παραμέτρων στους άξονες Υ {δυναμικό (mv), ρεύμα ερεθισμού (μα), μεμβρανικό ρεύμα (μα) και αγωγιμότητα (μs)} και του χρόνου (ms) στον άξονα Χ. Για την εκτέλεση επίδοσης ερεθισμού και καταγραφής πιέζουμε το πλήκτρο start είτε στην περιοχή recording είτε στην περιοχή Results. Για «καθαρισμό» της οθόνης πιέζουμε το πλήκτρο clear. Αυτό είναι απαραίτητο κάθε φορά που θέλουμε να αλλάξουμε την κλίμακα του Χ ή Υ άξονα. 5
Πειραματικά βήματα ρουτίνας: 1. «Καθαρίζουμε» την οθόνη του παλμογράφου στην περίπτωση που έχει υπάρξει προηγούμενα καταγραφή. 2. Επιλέγουμε τις συγκεντρώσεις Να + & Κ +. 3. Ρυθμίζουμε την θερμοκρασία στους 20 ο C. 4. Επιλέγουμε το πλάτος και την διάρκεια του ηλεκτρικού παλμού (ή παλμών) ερεθισμού. 5. Επιλέγουμε την καθυστέρηση μεταξύ των δύο παλμών στην περίπτωση που ελέγχουμε την διάρκεια της σχετικής και απόλυτης περιόδου ανερεθιστότητας. 6. Σε ορισμένα πειραματικά στάδια που θα εξετάζεται η φύση των ιοντικών ρευμάτων που συμμετέχουν στην δημιουργία του ΔΕ θα απαιτηθεί η προσθήκη στο εξωκυττάριο διάλυμα ειδικών ουσιών-τοξινών (τετροδοτοξίνη, τετρααιθυλαμμώνιο, τοξίνη σκορπιού). 7. Παρατηρούμε στην οθόνη του παλμογράφου τα διαγράμματα που απεικονίζονται οι μεταβολές των διαφόρων παραμέτρων, και σημειώνουμε τις παρατηρήσεις μας. Σημειώνεται ότι σε κάθε πειραματικό έλεγχο μεταβάλλουμε μία μόνον μεταβλητή σε σχέση με τα αρχικά δεδομένα (γιατί?). 6