Maxwell CSC RNA FFPE Kit

ΤΕΧΝΙΚΌ ΕΓΧΕΙΡΊΔΙΟ Maxwell CSC RNA FFPE Kit Οδηγίες χρήσης του προϊόντος AS1360 Προσοχή: Χειριστείτε τα φυσίγγια με προσοχή, τα άκρα σφράγισης ενδέχεται να είναι αιχμηρά. ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ ΤΟΥ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ AS1360 2800 Woods Hollow Rd. Madison, WI USA MDSS GmbH Schiffgraben 41 30175 Hannover, Germany Αναθεώρηση 10/18 TM404

Maxwell CSC RNA FFPE Kit Όλη η τεχνική τεκμηρίωση είναι διαθέσιμη στη διεύθυνση: www.promega.com/protocols/ Επισκεφτείτε την ιστοσελίδα για να βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιείτε την πιο πρόσφατη έκδοση του παρόντος τεχνικού εγχειριδίου. Αν έχετε απορίες σχετικά με τη χρήση του παρόντος συστήματος, επικοινωνήστε με την τεχνική υπηρεσία της Promega μέσω e-mail στη διεύθυνση: techserv@promega.com 1. Περιγραφή... 1 2. Στοιχεία προϊόντος, συνθήκες αποθήκευσης και επεξηγήσεις συμβόλων... 2 3. Προοριζόμενη χρήση προϊόντος... 4 4. Περιορισμοί χρήσης προϊόντος... 4 5. Πριν ξεκινήσετε... 4 5.A. Προετοιμασία δειγμάτων FFPE... 5 5.B. Προετοιμασία φυσιγγίου Maxwell CSC Cartridge... 6 6. Κύκλος λειτουργίας οργάνου... 8 7. Διαδικασία μετά τον καθαρισμό... 10 8. Αντιμετώπιση προβλημάτων... 11 9. Παράρτημα... 12 9.A. Δημιουργία περιβάλλοντα χώρου ελεύθερου από ριβονουκλεάσες... 12 9.B. Βιβλιογραφία... 13 10. Περίληψη αλλαγών... 13 Το Maxwell CSC RNA FFPE Kit είναι διαθέσιμο μόνο σε συγκεκριμένες χώρες. Το παρόν προϊόν πληροί τις βασικές απαιτήσεις της Οδηγίας της Ευρωπαϊκής Ένωσης 98/79/ΕΚ για τα ιατροτεχνολογικά βοηθήματα που χρησιμοποιούνται στη διάγνωση in vitro. 1. Περιγραφή Το Maxwell CSC RNA FFPE Kit χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με το όργανο Maxwell CSC και παρέχει μια εύκολη μέθοδο για αποτελεσματικό, αυτοματοποιημένο καθαρισμό RNA από δείγματα ανθρώπινου ιστού μαστού, πνεύμονα ή κόλον FFPE (που έχει μονιμοποιηθεί σε φορμόλη και εγκλειστεί σε παραφίνη). Το όργανο Maxwell CSC διαθέτει ήδη προγραμματισμένες μεθόδους καθαρισμού. Έχει σχεδιαστεί για χρήση με τα προδιανεμημένα φυσίγγια αντιδραστηρίων και πρόσθετα αντιδραστήρια που παρέχονται με το κιτ, εξασφαλίζοντας απλές και εύκολες διαδικασίες. Το όργανο μπορεί να επεξεργαστεί έως 16 δείγματα σε λιγότερο από 60 λεπτά, και το κεκαθαρμένο RNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί απευθείας σε μια σειρά εφαρμογών που βασίζονται στην ενίσχυση, όπως το RT-PCR. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Αριθμός χωρίς χρέωση στις Η.Π.Α. 800-356-9526 Τηλέφωνο 608-274-4330 Φαξ 608-277-2516 1 www.promega.com TM404 Αναθεώρηση 10/18

1. Περιγραφή (συνέχεια) Το Maxwell CSC RNA FFPE Kit εκτελεί καθαρισμό του νουκλεϊκού οξέος χρησιμοποιώντας παραμαγνητικά σωματίδια, που παρέχουν μια κινητή σταθερή φάση για τη βελτιστοποίηση της δέσμευσης δείγματος, πλύσης και καθαρισμού του RNA. Το όργανο Maxwell CSC είναι ένα όργανο χειρισμού μαγνητικών σωματιδίων. Αυτό το σύστημα επιτρέπει την ικανοποιητική δέσμευση του RNA στα παραμαγνητικά σωματίδια στο πρώτο βύθισμα ενός προγεμισμένου φυσιγγίου και μετακινεί το δείγμα μεταξύ των βυθισμάτων του φυσιγγίου, με ανάμιξη κατά την επεξεργασία. Αυτή η προσέγγιση μαγνητικής δέσμευσης αποφεύγει τα συνήθη προβλήματα που προκύπτουν σε συστήματα που χειρίζονται υγρά όπως φραγμένα ακροφύσια ή μερική μεταφορά αντιδραστηρίου, που έχουν ως αποτέλεσμα τη μη βέλτιστη επεξεργασία καθαρισμού από άλλα αυτόματα συστήματα συχνής χρήσης. 2. Στοιχεία προϊόντος, συνθήκες αποθήκευσης και επεξηγήσεις συμβόλων ΠΡΟΪΌΝ ΜΈΓΕΘΟΣ ΑΡ. ΚΑΤ. Maxwell CSC RNA FFPE Kit 48 preps AS1360 Για διαγνωστική χρήση in vitro. Μόνο για επαγγελματική χρήση. Επαρκεί για 48 αυτόματες απομονώσεις από δείγματα FFPE. Τα φυσίγγια Maxwell CSC Cartridges προορίζονται για μία μόνο χρήση. 15 C 30 C 6010TB 48 Περιλαμβάνει: 25ml Mineral Oil 20ml Lysis Buffer 2 1ml Proteinase K 100µl Blue Dye 2 1ml MnCl 2, 0.09M 1ml DNase Buffer 3 vials DNase I (lyophilized) 48 Maxwell FFPE Cartridges 50 CSC/RSC Plungers 50 Elution Tubes (0.5ml) 25ml Nuclease-Free Water Συνθήκες αποθήκευσης: Αποθηκεύστε το κιτ Maxwell CSC RNA FFPE Kit σε θερμοκρασία περιβάλλοντος (15 30 C). Αποθηκεύστε την ανα-υδρογονωμένη DNase I σε -10 έως -30 C. Μην εκτελέσετε ψύξη-απόψυξη περισσότερες από 10 φορές. Πληροφορίες ασφαλείας: Τα φυσίγγια αντιδραστηρίων περιέχουν αιθανόλη και ισοπροπανόλη. Αυτές οι ουσίες είναι δυνητικά εύφλεκτες, επιβλαβείς και ερεθιστικές. 2 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Αριθμός χωρίς χρέωση στις Η.Π.Α. 800-356-9526 Τηλέφωνο 608-274-4330 Φαξ 608-277-2516 TM404 Αναθεώρηση 10/18 www.promega.com

Τα φυσίγγια Maxwell CSC Cartridges έχουν σχεδιαστεί για χρήση με δυνητικά μολυσματικές ουσίες. Χρησιμοποιήστε κατάλληλο προσωπικό προστατευτικό εξοπλισμό (π.χ. γυαλιά και γάντια) κατά το χειρισμό μολυσματικών ουσιών. Ακολουθήστε τις κατευθυντήριες οδηγίες του ιδρύματός σας σχετικά με το χειρισμό και την απόρριψη όλων των μολυσματικών ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν με το σύστημα αυτό. Προσοχή: Χειριστείτε τα φυσίγγια με προσοχή, τα άκρα σφράγισης ενδέχεται να είναι αιχμηρά. Περισσότερες πληροφορίες: Τα στοιχεία του κιτ Maxwell CSC RNA FFPE Kit είναι κατάλληλα και πιστοποιημένα μέσω ποιοτικού ελέγχου για την αλληλεπίδρασή τους. Δεν συνιστάται η ανάμιξη στοιχείων κιτ διαφορετικών παρτίδων. Χρησιμοποιείτε μόνο στα στοιχεία που παρέχονται σε κάθε κιτ. Επεξηγήσεις συμβόλων Σύμβολο Επεξήγηση Σύμβολο Επεξήγηση In vitro διαγνωστική ιατρική συσκευή Εξουσιοδοτημένος αντιπρόσωπος 15 C 30 C Αποθήκευση στους 15-30 C. 2800 Woods Hollow Rd. Madison, WI USA Κατασκευαστής Προσοχή Ερεθιστικό Καρκινογόνο Τα περιεχόμενα επαρκούν για «n» εξετάσεις Ευρωπαϊκή Συμμόρφωση Προειδοποίηση. Βιολογικός κίνδυνος. Προειδοποίηση. Κίνδυνος σύνθλιψης. Αριθμός καταλόγου Αριθμός παρτίδας Μην κάνετε επαναληπτική χρήση Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Αριθμός χωρίς χρέωση στις Η.Π.Α. 800-356-9526 Τηλέφωνο 608-274-4330 Φαξ 608-277-2516 3 www.promega.com TM404 Αναθεώρηση 10/18

3. Προοριζόμενη χρήση προϊόντος Το κιτ Maxwell CSC RNA FFPE Kit προορίζεται για χρήση, σε συνδυασμό με το όργανο Maxwell CSC και τη μέθοδο καθαρισμού Maxwell CSC RNA FFPE, ως μια ιατρική συσκευή για διάγνωση in vitro (IVD) για την εκτέλεση αυτόματης απομόνωσης RNA από ανθρώπινα δείγματα ιστού μαστού, πνεύμονα ή κόλον FFPE (που έχει μονιμοποιηθεί σε φορμόλη και εγκλειστεί σε παραφίνη). Το κεκαθαρμένο RNA είναι κατάλληλο για χρήση σε διαγνωστικές εξετάσεις in vitro που βασίζονται στην ενίσχυση. Το κιτ Maxwell CSC RNA FFPE Kit προορίζεται για χρήση σε θερμοκρασία μεταξύ 15 30 C. Η χρήση εκτός αυτού του εύρους θερμοκρασίας ενδέχεται να μην εμφανίσει τα βέλτιστα αποτελέσματα. Τα δείγματα FFPE που προετοιμάζονται χρησιμοποιώντας 10% φορμόλης ουδέτερου ρυθμιστικού διαλύματος μπορούν να χρησιμοποιηθούν με το κιτ Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Το κιτ Maxwell CSC RNA FFPE Kit δεν προορίζεται για χρήση στο πλαίσιο μιας συγκεκριμένης διαγνωστικής εξέτασης. Το κιτ Maxwell CSC RNA FFPE Kit προορίζεται αποκλειστικά για επαγγελματική χρήση. Τα διαγνωστικά αποτελέσματα που προκύπτουν με τη χρήση κεκαθαρμένου RNA σε αυτό το σύστημα πρέπει να ερμηνεύονται σε συνδυασμό με άλλα κλινικά ή εργαστηριακά δεδομένα. 4. Περιορισμοί χρήσης προϊόντος Το κιτ Maxwell CSC RNA FFPE Kit προορίζεται μόνο για χρήση με δείγματα ιστού FFPE που συλλέγονται από ανθρώπινο μαστό, πνεύμονα ή κόλον. Δεν προορίζεται για χρήση με δείγματα ιστού μη-ffpe, όπως φρέσκα ή κατεψυγμένα δείγματα ιστού, ή με δείγματα ιστού FFPE που δεν έχουν συλλεγεί από ανθρώπινο μαστό, πνεύμονα ή κόλον. Το κιτ Maxwell CSC RNA FFPE Kit δεν προορίζεται για χρήση με άλλους τύπους δειγμάτων, συμπεριλαμβανομένων δειγμάτων μη ανθρώπινης προέλευσης, ή για τον καθαρισμό DNA. Το κιτ Maxwell CSC RNA FFPE Kit δεν προορίζεται για χρήση με δείγματα ιστού που έχουν προετοιμαστεί με άλλα στερεωτικά διαλύματα πλην της 10% φορμόλης ουδέτερου ρυθμιστικού διαλύματος. Η απόδοση του κιτ Maxwell CSC RNA FFPE Kit έχει αξιολογηθεί με απομόνωση του RNA από δείγματα ιστού FFPE με εύρος μεγέθους από 0,1 2,0 mm 3. Δεν προορίζεται για χρήση με δείγματα εκτός αυτού του εύρους. Ο χειριστής είναι υπεύθυνος για τον καθορισμό των χαρακτηριστικών απόδοσης που απαιτούνται για την εκτέλεση διαγνωστικών εφαρμογών downstream. Κατάλληλοι οροί ελέγχου θα πρέπει να περιλαμβάνονται σε όλες τις διαγνωστικές εφαρμογές downstream χρησιμοποιώντας κεκαθαρμένο RNA χρησιμοποιώντας το κιτ Maxwell CSC RNA FFPE Kit. 5. Πριν ξεκινήσετε Υλικά που παρέχονται από το χειριστή μικροφυγοκέντρηση πιπέτες και ακροφύσια πιπετών για προεπεξεργασία και μεταφορά δειγμάτων στα προγεμισμένα φυσίγγια αντιδραστηρίων 4 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Αριθμός χωρίς χρέωση στις Η.Π.Α. 800-356-9526 Τηλέφωνο 608-274-4330 Φαξ 608-277-2516 TM404 Αναθεώρηση 10/18 www.promega.com

σωλήνες 1,5 2,0 ml για επώαση δειγμάτων (π.χ. Microtube, 1,5 ml; Κατ. αρ. V1231) θερμαντικές πλάκες στους 56 C και στους 80 C (Σημείωση: Η θερμαντική πλάκα θα πρέπει να ρυθμίζεται στην απαιτούμενη θερμοκρασία. Η πραγματική θερμοκρασία της θερμαντικής πλάκας θα πρέπει να μετράται σε θερμοκρασία εντός των προδιαγραφών βαθμονόμησης του θερμόμετρου που χρησιμοποιείται για τη μέτρηση.) δείγματα FFPE με συνολικό όγκο ιστού 0,1 2,0 mm 3. Το πάχος του τμήματος δεν θα πρέπει να υπερβαίνει τα 5 µm (Σημείωση: Τα δείγματα θα πρέπει να αποθηκεύονται σε θερμοκρασία δωματίου [15 30 C].) λεπίδες ξυραφιού (Σημείωση: Να είστε προσεχτικοί κατά τη χρήση των λεπίδων για την απομάκρυνση δείγματος από το πλακίδιο.) Αν απαιτείται, εκτελέστε ανασύσταση ενός λυοφιλιωμένου φιαλιδίου DNase I με 275 µl νερού χωρίς νουκλεάσες. Αναποδογυρίστε το φιαλίδιο για έκπλυση της DNase I από το κάτω μέρος του πώματος και στροβιλίστε απαλά για να αναμίξετε. Μην αναδεύετε. 5.A. Προετοιμασία δειγμάτων FFPE Προεπεξεργασία δειγμάτων ενότητας 1. Τοποθετήστε την ενότητα σε ένα σωλήνα μικροφυγοκέντρησης 1,5 ml. Αν χρησιμοποιείτε ενότητες ιστού σε πλακίδια, ξύστε την ενότητα από το πλακίδιο χρησιμοποιώντας μια καθαρή λεπίδα ξυραφιού. 2. Προσθέστε 300 µl ορυκτέλαιου στους σωλήνες δείγματος. Αναδεύστε για 10 δευτερόλεπτα. 3. Θερμάνετε τα δείγματα στους 80 C για 2 λεπτά. Τοποθετήστε τα δείγματα σε θερμοκρασία δωματίου όσο προετοιμάζεται το κύριο μίγμα. 4. Προετοιμάστε ένα κύριο μίγμα ρυθμιστικού διαλύματος λύσης, πρωτεϊνάσης K και μπλε χρώσης όπως εμφανίζεται παρακάτω: Αντιδραστήριο Ποσότητα/Αντιδράσεις Αντιδράσεις (Αριθμός προς εκτέλεση +1) Ολικό Ρυθμιστικό διάλυμα λύσης 224 µl n+1 224 µl (n+1) Πρωτεϊνάση K 25 µl n+1 25 µl (n+1) Μπλε χρώση 1 µl n+1 1 µl (n+1) 5. Προσθέστε 250 µl κύριου μίγματος σε κάθε σωλήνα δείγματος και αναδεύστε για 5 δευτερόλεπτα. 6. Εκτελέστε φυγοκέντρηση των σωλήνων δείγματος στα 10.000 g για 20 δευτερόλεπτα για διαχωρισμό των στρωμάτων. Αν υπάρχει καθίζημα στο υδατικό στρώμα (χαμηλότερο, μπλε στρώμα), αναμίξτε απαλά για αναδιανομή του καθιζήματος. Αφήστε και τις δύο φάσεις στο σωλήνα. 7. Μεταφέρετε τους σωλήνες δείγματος σε θερμαντική πλάκα στους 56 C και εκτελέστε επώαση για 15 λεπτά. 8. Μεταφέρετε τους σωλήνες δείγματος σε θερμαντική πλάκα στους 80 C και εκτελέστε επώαση για 1 ώρα. 9. Αφαιρέστε τους σωλήνες δείγματος από τη θερμαντική πλάκα και αφήστε τα δείγματα να κρυώσουν σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά. Όσο τα δείγματα κρυώνουν, προετοιμάστε το κοκτέιλ DNase όπως περιγράφεται στο Βήμα 10. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Αριθμός χωρίς χρέωση στις Η.Π.Α. 800-356-9526 Τηλέφωνο 608-274-4330 Φαξ 608-277-2516 5 www.promega.com TM404 Αναθεώρηση 10/18

5.A. Προετοιμασία δειγμάτων FFPE (Συνέχεια) 10. Προετοιμάστε ένα κοκτέιλ MnCl 2, ρυθμιστικού διαλύματος DNase και DNase I με την παρακάτω σειρά: Αντιδραστήριο 1 Ποσότητα/ Αντιδράσεις Αντιδράσεις (Αριθμός προς εκτέλεση +1) Ολικό MnCl 2, 0,09M 26 µl n+1 26 µl (n+1) Ρυθμιστικό διάλυμα DNase 2 14 µl n+1 14 µl (n+1) DNase I 3 10 µl n+1 10 µl (n+1) 1 Αν τα αντιδραστήρια του κοκτέιλ DNase έχουν προστεθεί χειροκίνητα στους σωλήνες δείγματος, βεβαιωθείτε ότι έχουν προστεθεί με τη σειρά που περιγράφεται παραπάνω. Ενσωματώστε κάθε αντιδραστήριο με προσεχτική μεταφορά με πιπέτα πριν την προσθήκη του επόμενου αντιδραστηρίου. 2 Αποθηκεύστε το ρυθμιστικό διάλυμα DNase στους 15 30 C. Μπορεί να εμφανίσει καθίζηση αν έχει αποθηκευτεί σε χαμηλότερη θερμοκρασία. Αν το ρυθμιστικό διάλυμα περιέχει κατακρήμνισμα, διαλυτοποιήστε ξανά το κατακρήμνισμα θερμαίνοντας στους 56 C για 2 λεπτά και στη συνέχεια αναδεύστε στιγμιαία για ανάμιξη. 3 Αποθηκεύστε την υπολειπόμενη ανασυσταμένη DNase I στους 30 έως 10 C. 11. Προσθέστε 50 µl κοκτέιλ DNase σε κάθε σωλήνα δείγματος. Αναμίξτε με πιπέτα 10 φορές. 12. Εκτελέστε επώαση των σωλήνων δειγμάτων για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (15 30 C). 13. Εκτελέστε φυγοκέντρηση των σωλήνων δείγματος με μέγιστη ταχύτητα σε μικροφυγοκέντρηση για 5 λεπτά. 14. Αμέσως μετά μεταφέρετε τη μπλε, υδατική φάση στο βύθισμα αρ.1 ενός φυσιγγίου Maxwell CSC Cartridge. Ανατρέξτε στην Ενότητα 5.B. για οδηγίες προετοιμασίας φυσιγγίου. 5.B. Προετοιμασία φυσιγγίου Maxwell CSC Cartridge 1. Αλλάξτε γάντια πριν το χειρισμό των φυσιγγίων Maxwell CSC, των εμβόλων CSC/RSC και των σωλήνων έκπλυσης. Τα φυσίγγια είναι τοποθετημένα στο δίσκο πλατφόρμας Maxwell CSC Deck Tray έξω από το όργανο και ο δίσκος πλατφόρμας που περιλαμβάνει τα φυσίγγια και τα δείγματα μεταφέρεται στο όργανο για καθαρισμό. Τοποθετήστε τα φυσίγγια που θα χρησιμοποιηθούν στο δίσκο πλατφόρμας Maxwell CSC Deck Tray (Εικόνα 2). Τοποθετήστε κάθε φυσίγγιο στο δίσκο πλατφόρμας με βύθισμα αρ.1 (το βαθύτερο βύθισμα στο φυσίγγιο) όσο πιο μακρυά γίνεται από τους σωλήνες έκπλυσης. Πιέστε το φυσίγγιο προς τα κάτω για να ασφαλίσει στη θέση του. Βεβαιωθείτε ότι και τα δύο άκρα του φυσιγγίου έχουν τοποθετηθεί σωστά στο δίσκο πλατφόρμας. Αφαιρέστε προσεκτικά τη σφράγιση, μέχρι να αφαιρεθεί ολόκληρη η πλαστική σφράγιση από το πάνω μέρος του φυσιγγίου. Βεβαιωθείτε ότι έχει αφαιρεθεί όλη η ταινία σφράγισης και τυχόν υπολείμματα κολλώδους ουσίας από το φυσίγγιο. Προσοχή: Χειριστείτε τις κασέτες με προσοχή. Τα άκρα σφράγισης ενδέχεται να είναι αιχμηρά. 2. Τοποθετήστε ένα έμβολο στο βύθισμα αρ.8 σε κάθε φυσίγγιο. Σημείωση: Χρησιμοποιείτε μόνο τα έμβολα που παρέχονται στο κιτ Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Τα έμβολα για τα κιτ Maxwell 16 LEV και SEV Kits δεν είναι συμβατά με το όργανο Maxwell CSC. 6 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Αριθμός χωρίς χρέωση στις Η.Π.Α. 800-356-9526 Τηλέφωνο 608-274-4330 Φαξ 608-277-2516 TM404 Αναθεώρηση 10/18 www.promega.com

3. Τοποθετήστε ένα κενό σωλήνα έκπλυσης στη θέση σωλήνα έκπλυσης για κάθε φυσίγγιο στο δίσκο πλατφόρμας Maxwell CSC Deck Tray. Σημείωση: Χρησιμοποιείτε μόνο τους σωλήνες έκπλυσης που παρέχονται στο κιτ Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Άλλοι σωλήνες έκπλυσης ενδέχεται να μην είναι συμβατοί με το όργανο Maxwell CSC και ενδέχεται να επηρεάσουν την απόδοση καθαρισμού RNA. 4. Προσθέστε 50 µl νερού χωρίς νουκλεάσες στον πυθμένα κάθε σωλήνα έκπλυσης. Οι σωλήνες έκπλυσης θα πρέπει να παραμένουν ανοιχτοί κατά τον καθαρισμό RNA. Σημείωση: Χρησιμοποιείτε μόνο νερό χωρίς νουκλεάσες που παρέχεται στο κιτ Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Η χρήση άλλων ρυθμιστικών διαλυμάτων έκπλυσης ενδέχεται να επηρεάσουν την απόδοση του καθαρισμού RNA ή τη χρήση εφαρμογών downstream. Σημειώσεις προετοιμασίας φυσιγγίου Maxwell FFPE Cartridge 1. Εάν επεξεργάζεστε λιγότερα από 16 δείγματα, τοποθετήστε τα φυσίγγια στο κέντρο του δίσκου πλατφόρμας. 2. Καθαρίστε διαρροές δείγματος ή αντιδραστηρίου σε οποιοδήποτε σημείο του Maxwell CSC Deck Tray όπως υποδεικνύεται στο εγχειρίδιο λειτουργίας του οργάνου Maxwell CSC. Μη χρησιμοποιείτε λευκαντικό σε κανένα μέρος του οργάνου. 1 2 3 4 5 6 7 8 1. Διάλυμα δέσμευσης 2. Μαγνητικά σωματίδια 3. Διάλυμα έκπλυσης 4. Διάλυμα έκπλυσης 5. Διάλυμα έκπλυσης 6. Διάλυμα έκπλυσης 7. Κενό 8. Κενό 11339TC Προσθήκες περιεχομένων βυθισμάτων από χειριστή 1. Προεπεξεργασμένα δείγματα 8. Έμβολο CSC/RSC Εικόνα 1. Φυσίγγιο Maxwell CSC Cartridge. Αυτή η εικόνα εμφανίζει τα περιεχόμενα ενός φυσιγγίου. Το προεπεξεργασμένο δείγμα FFPE προστίθεται στο βύθισμα αρ.1 και ένα έμβολο προστίθεται στο βύθισμα αρ.8. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Αριθμός χωρίς χρέωση στις Η.Π.Α. 800-356-9526 Τηλέφωνο 608-274-4330 Φαξ 608-277-2516 7 www.promega.com TM404 Αναθεώρηση 10/18

10828TB Εικόνα 2. Ρυθμίσεις και διαμόρφωση του δίσκου πλατφόρμας Maxwell CSC Deck Tray. Νερό χωρίς νουκλεάσες προστίθεται στους σωλήνες έκπλυσης όπως υποδεικνύεται. 6. Κύκλος λειτουργίας οργάνου Η μέθοδος Maxwell CSC RNA FFPE Method μπορεί να ληφθεί σε τοπικό δίσκο από τον ιστότοπο της Promega, μεταβαίνοντας στη διεύθυνση: www.promega.com/resources/tools/maxwellcscmethod. Για πιο λεπτομερείς πληροφορίες, ανατρέξτε στο τεχνικό εγχειρίδιο Maxwell CSC Methods Installation #TM401. Αν υποψιάζεστε ότι το όργανο ενδέχεται να μολυνθεί από ριβονουκλεάσες, καθαρίστε το όργανο πριν την λειτουργία του χρησιμοποιώντας ένα καθαριστικό διάλυμα όπως το Steris LpH. Ακολουθήστε τις οδηγίες στην ενότητα Καθαρισμός και συντήρηση του εγχειριδίου λειτουργίας οργάνου Maxwell CSC. 1. Ενεργοποιήστε το όργανο Maxwell CSC και το Tablet PC. Η διεπαφή χρήστη του οργάνου ξεκινάει αυτόματα και το όργανο εκτελεί αυτοδιαγνωστικό έλεγχο και μετακίνηση όλων των κινούμενων μερών στην αρχική τους θέση. 2. Επιλέξτε «Εναρξη» στην αρχική οθόνη. 3. Σαρώστε ή πληκτρολογήστε το γραμμοκώδικα μεθόδου στην ετικέτα Maxwell CSC RNA FFPE Kit για αυτόματη επιλογή της μεθόδου προς εκτέλεση (Εικόνα 3). Σημείωση: Ο γραμμοκώδικας μεθόδου Maxwell CSC RNA FFPE Kit απαιτείται για τον καθαρισμό RNA στο όργανο Maxwell CSC. Η ετικέτα κιτ περιλαμβάνει δύο γραμμοκώδικες. Ο γραμμοκώδικας μεθόδου υποδεικνύεται στην Εικόνα 3. Αν ο γραμμοκώδικας δεν μπορεί να σαρωθεί, επικοινωνήστε με την τεχνική υπηρεσία της Promega. 8 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Αριθμός χωρίς χρέωση στις Η.Π.Α. 800-356-9526 Τηλέφωνο 608-274-4330 Φαξ 608-277-2516 TM404 Αναθεώρηση 10/18 www.promega.com

12053TA Εικόνα 3. Η ετικέτα κιτ που υποδεικνύει το γραμμοκώδικα μεθόδου για σάρωση. Το κόκκινο πλαίσιο υποδεικνύει το γραμμοκώδικα μεθόδου για σάρωση στην ετικέτα κιτ για έναρξη του κύκλου λειτουργίας καθαρισμού. 4. Επιλέξτε τις θέσεις φυσιγγίου για κύκλο λειτουργίας (βλέπε εγχειρίδιο λειτουργίας οργάνου Maxwell CSC) και σαρώστε ή εισάγετε χειροκίνητα τις απαιτούμενες πληροφορίες παρακολούθησης δείγματος. Αποεπιλέξτε τις θέσεις που δεν χρησιμοποιούνται. Επιλέξτε «Συνέχεια» όταν έχουν καταχωρηθεί όλες οι πληροφορίες δειγμάτων. 5. Στο Tablet PC, βεβαιωθείτε ότι τα δείγματα έχουν προστεθεί στο βύθισμα αρ.1 των φυσιγγίων (όπως υποδεικνύεται στην Ενότητα 5.Α), ότι τα φυσίγγια είναι τοποθετημένα στο όργανο, ότι οι σωλήνες έκπλυσης που περιέχουν 50 µl νερού χωρίς νουκλεάσες υπάρχουν και είναι ανοιχτά και ότι τα έμβολα βρίσκονται στο βύθισμα αρ.8. 6. Μεταφέρετε το δίσκο πλατφόρμας Maxwell CSC που περιλαμβάνει τα προετοιμασμένα φυσίγγια στην πλατφόρμα του οργάνου Maxwell CSC. Βεβαιωθείτε ότι ο δίσκος πλατφόρμας είναι τοποθετημένος στο όργανο Maxwell CSC με τους σωλήνες έκπλυσης σε μικρή απόσταση από τη θύρα. Η τοποθέτηση του δίσκου πλατφόρμας στο όργανο είναι δυνατή μόνο σε αυτόν τον προσανατολισμό. Αν συναντάτε δυσκολία κατά την τοποθέτηση του δίσκου πλατφόρμας στην πλατφόρμα, επιβεβαιώστε το σωστό προσανατολισμό. Βεβαιωθείτε ότι ο δίσκος πλατφόρμας βρίσκεται σε απόλυτα οριζόντια θέση στην πλατφόρμα οργάνου. Σημείωση: Κρατήστε το δίσκο πλατφόρμας Maxwell CSC Deck Tray από τις πλευρές του για αποφυγή απόσπασης των φυσιγγίων από τον υποδοχέα. Προειδοποίηση: Κίνδυνος σύνθλιψης. 7. Βεβαιωθείτε ότι όλες οι διαδικασίες προεπεξεργασίας που υποδεικνύονται έχουν εκτελεστεί, και πατήστε στο «Εναρξη» για κλείσιμο της θύρας οργάνου και την έναρξη της επεξεργασίας. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Αριθμός χωρίς χρέωση στις Η.Π.Α. 800-356-9526 Τηλέφωνο 608-274-4330 Φαξ 608-277-2516 9 www.promega.com TM404 Αναθεώρηση 10/18

8. Ο κύκλος λειτουργίας καθαρισμού στο όργανο Maxwell CSC ξεκινάει άμεσα. Η οθόνη εμφανίζει τα βήματα που εκτελούνται καθώς και τον χρόνο που υπολείπεται, κατά προσέγγιση, για την ολοκλήρωση του κύκλου λειτουργίας. Σημείωση: Αν ο κύκλος λειτουργίας ακυρωθεί πριν την ολοκλήρωσή του, το όργανο εκτελεί έκπλυση των σωματιδίων από τα έμβολα και τα έμβολα εξωθούνται στο βύθισμα αρ. 8 του φυσιγγίου. Τα δείγματα χάνονται. Μην επιχειρήσετε να εκτελέσετε εκ νέου καθαρισμό των δειγμάτων από κύκλο λειτουργίας οργάνου που έχει ακυρωθεί. 9. Όταν ολοκληρωθεί ο αυτοματοποιημένος κύκλος λειτουργίας καθαρισμού, θα εμφανιστεί στην οθόνη Tablet PC το μήνυμα «Ολοκλήρωση κύκλου λειτουργίας» που θα ενημερώνει ότι η μέθοδος ολοκληρώθηκε. Τέλος κύκλου λειτουργίας 10. Μετά την ολοκλήρωση του κύκλου λειτουργίας ακολουθήστε τις οδηγίες που εμφανίζονται στην οθόνη για να ανοίξετε τη θύρα. Βεβαιωθείτε ότι τα έμβολα βρίσκονται στο βύθισμα αρ.8 του φυσιγγίου κατά την ολοκλήρωση του κύκλου λειτουργίας. Αφαιρέστε το δίσκο πλατφόρμας από το όργανο και αφαιρέστε τα δείγματα έκπλυσης από το δίσκο πλατφόρμας. Αν όλα τα έμβολα δεν έχουν αφαιρεθεί από τη ράβδο εμβόλων: Ακολουθήστε τις ερωτήσεις στην οθόνη για εκτέλεση της μεθόδου καθαρισμού για ένα κύκλο λειτουργίας που ακυρώθηκε. Εναλλακτικά, επιλέξτε τη μέθοδο καθαρισμού από την οθόνη ρυθμίσεων για ένα κύκλο λειτουργίας που ολοκληρώθηκε με επιτυχία για απομάκρυνση των υπόλοιπων εμβόλων. 11. Τοποθετήστε ένα πώμα και αφαιρέστε τους σωλήνες έκπλυσης που περιέχουν RNA αμέσως μετά τον κύκλο λειτουργίας για την αποφυγή εξάτμισης των προϊόντων έκπλυσης. Αφαιρέστε το δίσκο πλατφόρμας Maxwell CSC από το όργανο. Σημείωση: Για να αφαιρέσετε τον υποδοχέα από την πλατφόρμα οργάνου, κρατήστε τον υποδοχέα από τις πλευρές του. Βεβαιωθείτε ότι έχετε αφαιρέσει τα δείγματα από το όργανο πριν εκτελέσετε το πρωτόκολλο αποστείρωσης του οργάνου με ακτινοβολία UV, ώστε να αποφευχθεί τυχόν αλλοίωση του κεκαθαρμένου νουκλεϊκού οξέος. Τα δείγματα RNA μπορούν να αποθηκευτούν κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 30 έως 10 C, ή σε χαμηλότερη θερμοκρασία από 60 C για μακροπρόθεσμη αποθήκευση. 12. Αφαιρέστε τα φυσίγγια και τα έμβολα από το δίσκο πλατφόρμας Maxwell CSC και απορρίψτε τα ως επικίνδυνα απορρίμματα, σύμφωνα με τις διαδικασίες του ιδρύματός σας. Τα φυσίγγια, τα έμβολα και οι σωλήνες έκπλυσης προορίζονται για μία μόνο χρήση. Μην επαναχρησιμοποιείτε τα φυσίγγια Maxwell CSC, τα έμβολα CSC/RSC ή τους σωλήνες έκπλυσης. 7. Διαδικασία μετά τον καθαρισμό Βεβαιωθείτε ότι η απόδοση του δείγματος κεκαθαρμένου RNA και καθαρότητας πληρούν τις απαιτήσεις εισαγωγής για τη διαγνωστική ανάλυση downstream πριν τη χρήση σε αυτή την ανάλυση. Η απόδοση του κιτ αξιολογήθηκε με βάση τον καθαρισμό του ενισχυμένου RNA. Άλλοι τρόποι ποσοτικοποίησης, συμπεριλαμβανομένων της απορρόφησης ή της δέσμευσης φθορίζουσας χρώσης, ενδέχεται να μην σχετίζονται με την ενίσχυση (1). Οι ενδείξεις απορρόφησης για τα δείγματα FFPE ενδέχεται να υπερεκτιμούν την απόδοση. Συνιστάται η χρήση πιο εξειδικευμένων μεθόδων για τον καθορισμό της απόδοσης (1). 10 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Αριθμός χωρίς χρέωση στις Η.Π.Α. 800-356-9526 Τηλέφωνο 608-274-4330 Φαξ 608-277-2516 TM404 Αναθεώρηση 10/18 www.promega.com

8. Αντιμετώπιση προβλημάτων Για τυχόν ερωτήσεις που δεν περιλαμβάνονται στο παρόν, επικοινωνήστε με το τοπικό υποκατάστημα ή αντιπρόσωπο της Promega. Πληροφορίες επικοινωνίας διατίθενται στη διεύθυνση: www.promega.com. E-mail: techserv@promega.com Πρόβλημα Συγκέντρωση RNA χαμηλότερη από την αναμενόμενη σε προϊόν έκπλυσης (Μια τυπική ενότητα FFPE θα πρέπει να έχει απόδοση ενισχυμένου RNA ανάλογα με το μέγεθος του ιστού, την κυτταρικότητα, τη συνθήκη στερεωτικού φορμόλης και το χειρισμό.) Ποιότητα χαμηλότερη από την αναμενόμενη. (Το προϊόν έκπλυσης περιέχει κατακερματισμένο RNA ή αναστολείς αναλύσεων downstream.) Αίτια και σχόλια Η απόδοση του κιτ έχει αξιολογηθεί με απομόνωση του RNA από δείγματα ιστού FFPE με εύρος μεγέθους από 0,1 mm 3 έως 2,0 mm 3. Δεν έχει σχεδιαστεί για χρήση με δείγματα εκτός αυτού του εύρους. Χρησιμοποιήστε ενότητες που εμπίπτουν σε αυτό το εύρος. Το κιτ έχει σχεδιαστεί μόνο για χρήση με δείγματα ιστού FFPE που συλλέγονται από ανθρώπινο μαστό, πνεύμονα ή κόλον. Δεν έχει σχεδιαστεί για χρήση με δείγματα ιστού μη-ffpe, όπως φρέσκα ή κατεψυγμένα δείγματα ιστού, ή με δείγματα ιστού FFPE που δεν έχουν συλλεγεί από ανθρώπινο μαστό, πνεύμονα ή κόλον. Οι χρόνοι επώασης και οι θερμοκρασίες έχουν δοκιμαστεί μόνο για ανθρώπινο μαστό, πνεύμονα και κόλον. Χρησιμοποιείτε μόνο ανθρώπινο μαστό, πνεύμονα και κόλον. Το κιτ δεν έχει σχεδιαστεί για χρήση με δείγματα ιστού που έχουν προετοιμαστεί με άλλα στερεωτικά διαλύματα πλην της 10% φορμόλης ουδέτερου ρυθμιστικού διαλύματος. Βεβαιωθείτε ότι δεν έχει χρησιμοποιηθεί άλλο στερεωτικό διάλυμα. Ενδέχεται να έχουν εισαχθεί ριβονουκλεάσες κατά την επεξεργασία ή την ποσοτικοποίηση του δείγματος. Ανατρέξτε στην Ενότητα 9 για πληροφορίες σχετικά με τη δημιουργία περιβάλλοντα χώρου ελεύθερου από ριβονουκλεάσες. Χρησιμοποιήθηκε ιστός από χρωσμένο πλακίδιο ή ενότητα. Δεν υπάρχουν αξιώσεις για χρωσμένα πλακίδια ή ενότητες. Επαναλάβετε τον καθαρισμό με μη χρωσμένο πλακίδιο ή ενότητα. Η απόδοση του κιτ αξιολογήθηκε με βάση τον καθαρισμό του ενισχυμένου RNA. Άλλοι τρόποι ποσοτικοποίησης, συμπεριλαμβανομένων της απορρόφησης ή της δέσμευσης φθορίζουσας χρώσης, ενδέχεται να μην σχετίζονται με την ενίσχυση. Χρησιμοποιήστε μια μέθοδο ποσοτικοποίησης ενίσχυσης για αξιολόγηση της απόδοσης. Το στερεωτικό φορμόλης και η επακόλουθη αντιστροφή διασταυρούμενης σύνδεσης crosslink θα κατακερματίσουν το RNA. Αν το RNA έχει κατακερματιστεί πριν την εξαγωγή/καθαρισμό, το κατακερματισμένο RNA θα καθαριστεί με αυτό το κιτ. Επαναλάβετε με μια παρακείμενη ενότητα για να αξιολογήσετε αν υπάρχει πρόβλημα με την επιλεγμένη ενότητα ή με τη διαδικασία. Μερικές αναλύσεις ενίσχυσης είναι εξαιρετικά ευαίσθητες στην παρουσία αναστολέων. Οροί ελέγχου αναλύσεων downstream θα πρέπει να αναγνωρίζουν την παρουσία ενός αναστολέα ενίσχυσης στο προϊόν έκπλυσης. Ο χειριστής είναι υπεύθυνος για τον έλεγχο συμβατότητας του προϊόντος με όλες τις αναλύσεις downstream. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Αριθμός χωρίς χρέωση στις Η.Π.Α. 800-356-9526 Τηλέφωνο 608-274-4330 Φαξ 608-277-2516 11 www.promega.com TM404 Αναθεώρηση 10/18

8. Αντιμετώπιση προβλημάτων (Συνέχεια) Πρόβλημα Παρουσία DNA σε προϊόντα έκπλυσης. (Τα προϊόντα έκπλυσης έχουν μολυνθεί με DNA, που ενδέχεται να επηρεάσουν τις αναλύσεις downstream.) Αίτια και σχόλια Το κοκτέιλ DNase που προστέθηκε στο δείγμα παρέχει πλεονάζουσα δραστηριότητα DNase όταν χρησιμοποιείται με δείγματα ιστού FFPE με εύρος μεγέθους από 0,1 mm 3 έως 2,0 mm 3. Δεν έχει σχεδιαστεί για δείγματα εκτός αυτού του εύρους και ενδέχεται να μην εμφανίσει βέλτιστα αποτελέσματα. Χρησιμοποιήστε ενότητες που εμπίπτουν σε αυτό το εύρος. Η ανεπαρκής ανάμιξη του κοκτέιλ DNase στο δείγμα κατά την προεπεξεργασία μπορεί να προκαλέσει ατελή αποδόμηση DNA. Βεβαιωθείτε για την επαρκή ανάμιξη του κοκτέιλ DNase στο δείγμα. Αν τα στοιχεία του κοκτέιλ DNase προστίθενται στο δείγμα ξεχωριστά, βεβαιωθείτε ότι η προσθήκη τους εκτελείται σύμφωνα με τη σειρά που υποδεικνύεται στην Ενότητα 5.A, Βήμα 10. Επιπλέον, βεβαιωθείτε για την επαρκή ανάμιξη κάθε στοιχείου κατά την προσθήκη του. Η προσθήκη στοιχείων με διαφορετική σειρά ή η ατελής ανάμιξη ενδέχεται να απενεργοποιήσουν την DNase. 9. Παράρτημα 9.A. Δημιουργία περιβάλλοντα χώρου ελεύθερου από ριβονουκλεάσες Οι ριβονουκλεάσες είναι εξαιρετικά δύσκολες να απενεργοποιηθούν. Φροντίστε για την αποφυγή εισαγωγής δραστηριότητας ριβονουκλεάσεων στα δείγματα RNA κατά τη διάρκεια και μετά την απομόνωση. Αυτό είναι εξαιρετικά σημαντικό αν το αρχικό υλικό είναι διαθέσιμο σε περιορισμένη ποσότητα. Οι παρακάτω οδηγίες μπορούν να βοηθήσουν στην αποφυγή τυχαίας μόλυνσης των δειγμάτων από ριβονουκλεάσες. 1. Οι δύο πιο κοινές πηγές μόλυνσης από ριβονουκλεάσες είναι τα χέρια του χειριστή και τα βακτήρια ή μύκητες που ενδέχεται να υπάρχουν σε αιωρούμενα σωματίδια σκόνης. Για την αποφυγή μόλυνσης από αυτές τις πηγές, χρησιμοποιείτε τεχνική ασηψίας κατά το χειρισμό των αντιδραστηρίων που παρέχονται με αυτό το σύστημα. Φοράτε πάντα γάντια. Αλλάξτε γάντια μετά από κάθε τυχόν επαφή με ριβονουκλεάσες. 2. Όποτε είναι εφικτό, χρησιμοποιείτε αποστειρωμένα πλαστικά υλικά μιας χρήσης για το χειρισμό RNA. Αυτά τα υλικά είναι γενικά ελεύθερα από ριβονουκλεάσες και δεν απαιτούν προεπεξεργασία για την απενεργοποίηση των ριβονουκλεάσεων. 3. Φροντίστε ώστε τα μη αποστειρωμένα γυάλινα και τα πλαστικά υλικά να είναι κατάλληλα πριν τη χρήση, διασφαλίζοντας ότι είναι ελεύθερα από ριβονουκλεάσες. Τοποθετήστε τα γυάλινα υλικά σε φούρνο στους 200 C κατά τη διάρκεια της νύχτας, και πλύνετε σχολαστικά τα πλαστικά υλικά με 0,1N NaOH, 1mM EDTA, και στη συνέχεια με νερό χωρίς ριβονουκλεάσες. Τα εμπορικά διαθέσιμα προϊόντα αφαίρεσης ριβονουκλεάσεων μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 12 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Αριθμός χωρίς χρέωση στις Η.Π.Α. 800-356-9526 Τηλέφωνο 608-274-4330 Φαξ 608-277-2516 TM404 Αναθεώρηση 10/18 www.promega.com

4. Επεξεργαστείτε διαλύματα που δεν παρέχονται με το σύστημα προσθέτοντας DEPC σε 0,1% σε συλλέκτη αναθυμιάσεων. Εκτελέστε επώαση κατά τη διάρκεια της νύχτας με ανάδευση στο συλλέκτη, σε θερμοκρασία δωματίου. Τοποθετήστε στο αυτόκαυστο για 30 λεπτά για απομάκρυνση αποτυπωμάτων ανίχνευσης DEPC. Προσοχή: Το DEPC είναι δυνητικά καρκινογόνο και θα πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο σε συλλέκτη χημικών αναθυμιάσεων. Το DEPC αντιδρά γρήγορα με αμίνες και δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ρυθμιστικά διαλύματα Tris. Σημείωση: Για όλες τις εφαρμογές downstream, είναι σημαντικό να συνεχίσετε να προστατεύετε τα δείγματα RNA από ριβονουκλεάσες. 9.B. Βιβλιογραφία 1. Bonin, S. et al. (2010) Multicentre validation study of nucleic acids extraction from FFPE tissues. Virchows Arch. 457, 309 17. 10. Περίληψη αλλαγών Η παρακάτω αλλαγή έχει γίνει στην αναθεώρηση 10/18 του παρόντος εγγράφου: 1. Ενημερώθηκε για συμπερίληψη των απαιτήσεων της Οδηγίας της Ευρωπαϊκής Ένωσης IVD (98/79/ΕΚ). 2013, -8 Promega Corporation. Με την επιφύλαξη παντός δικαιώματος. Η ονομασία Maxwell είναι κατοχυρωμένο εμπορικό σήμα της Promega Corporation. Τα προϊόντα ενδέχεται να καλύπτονται από διπλώματα ευρεσιτεχνίας που εκκρεμούν ή έχουν εκδοθεί ή ενδέχεται να έχουν συγκεκριμένους περιορισμούς. Για περισσότερες πληροφορίες, επισκεφτείτε την ιστοσελίδα μας. Όλες οι τιμές και οι προδιαγραφές υπόκεινται σε αλλαγές χωρίς προηγούμενη ειδοποίηση. Αξιώσεις που αφορούν το προϊόν υπόκεινται σε αλλαγές. Για τις πιο πρόσφατες πληροφορίες σχετικά με τα προϊόντα της Promega, επικοινωνήστε με την τεχνική υπηρεσία της Promega ή επισκεφτείτε τον κατάλογο της Promega στο διαδίκτυο. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI 53711-5399 USA Αριθμός χωρίς χρέωση στις Η.Π.Α. 800-356-9526 Τηλέφωνο 608-274-4330 Φαξ 608-277-2516 13 www.promega.com TM404 Αναθεώρηση 10/18