ΕΚΦΕ Νέας Ιωνίας ΕΚΦΕ Χαλανδρίου Τοπικός διαγωνισμός EUSO2018 Πειραματική δοκιμασία Βιολογίας Βακτήρια μικροσκοπικά αλλά θαυματουργά! 9 Δεκεμβρίου 2017 ΣΧΟΛΙΚΗ ΜΟΝΑΔΑ: ΟΜΑΔΑ ΜΑΘΗΤΩΝ: 1) 2). 3)..
Βακτήρια μικροσκοπικά αλλά θαυματουργά! Τα βακτήρια είναι προκαρυωτικοί οργανισμοί με ευρύτατη ποικιλομορφία που μπορούμε να τους βρούμε παντού στη φύση! Το σχήμα των βακτηρίων μπορεί να είναι σφαιρικό (κόκκοι), ραβδοειδές (βάκιλοι) ή ελικοειδές (σπειρύλια). Τα βακτήρια είναι περισσότερο γνωστά για τις σοβαρές ασθένειες που μπορεί να προκαλούν. Ωστόσο, υπάρχουν βακτήρια που συμβιώνουν με τον οργανισμό, όπως η Εσερίχια κόλι (Escherichia coli) και οι γαλακτοβάκιλοι που αποτελούν μέρος της φυσιολογικής χλωρίδας του γαστρεντερικού σωλήνα και εμποδίζουν την εισβολή παθογόνων μικροβίων μέσω της πεπτικής οδού ή συμβάλουν στην παραγωγή βιταμινών. Επιπλέον τα βακτήρια χρησιμοποιούνται από τον άνθρωπο σε διάφορους τομείς. Οι γαλακτοβάκιλοι αξιοποιούνται κυρίως στην παρασκευή του γιαουρτιού, αλλά και θεραπευτικά ως προβιοτικά, ενώ η Escherichia coli είναι το συνηθέστερο εργαστηριακό εργαλείο στις τεχνικές της Γενετικής Μηχανικής! Παρά την τεράστια ποικιλομορφία τους, όλα τα βακτήρια μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο μεγάλες κατηγορίες ανάλογα με τη χρώση που ανέπτυξε ο Δανός μικροβιολόγος Christian Gram το 1884.Ορισμένα βακτήρια έχουν πυκνό κυτταρικό τοίχωμα, το οποίο απορροφά αμέσως μία χρωστική ιώδους χρώματος, το κρυσταλλικό ιώδες και αποκτούν ιώδες χρώμα. Όταν στη συνέχεια επιδράσει επάνω τους οινόπνευμα, τα βακτήρια αυτά δεν αποχρωματίζονται, γι αυτό ονομάζονται Gram θετικά. Άλλα βακτήρια με λεπτότερο κυτταρικό τοίχωμα, αποχρωματίζονται από το οινόπνευμα και όταν στη συνέχεια δεχτούν μια κόκκινη χρωστική, τη σαφρανίνη, βάφονται ροζ. Τα βακτήρια αυτά ονομάζονται Gram αρνητικά. 2
Στην παρούσα εργαστηριακή άσκηση, θα διακρίνετε μικροσκοπικά τα βακτήρια Escherichia coli που είναι βάκιλοι Gram αρνητικοί και τα βακτήρια του γιαουρτιού που είναι βάκιλοι και κόκκοι Gram θετικοί. Στη συνέχεια θα διερευνήσετε την επίδραση των οξέων στη διαλυτότητα της καζεΐνης, κύριας πρωτεΐνης του γάλατος, και θα τη συσχετίσετε με την επίδραση των βακτηρίων του γιαουρτιού στο γάλα. 1 η Πειραματική Διαδικασία: Χρώση με κυανό του μεθυλενίου Όργανα Ένα μόνιμο παρασκεύασμα βακτηρίων Μικροσκόπιο Υλικά Γάντια Πλαστικό λεκανίδιο Κυανό του μεθυλενίου Ποτήρι για τα υγρά έκπλυσης Υδροβολέας με απιοντισμένο νερό Απορροφητικό χαρτί Είστε φοιτητής/τρια και έχετε φτιάξει ένα μόνιμο μικροσκοπικό παρασκεύασμα για να μελετήσετε τα βακτήρια του γαστρεντερικού σωλήνα. Έχετε πληροφορηθεί από τον καθηγητή Μικροβιολογίας ότι το δείγμα περιλαμβάνει το είδος Escherichia coli, αλλά και είδη συγγενικά με τα βακτήρια του γιαουρτιού. Στην αίθουσα της μικροσκοπίας, κάνετε χρώση με κυανό του μεθυλενίου, ώστε να παρατηρήσετε πιο εύκολα τα βακτήρια. ΠΡΟΣΟΧΗ: Οι χρωστικές λεκιάζουν τα ρούχα! Kάνετε όλες τις διαδικασίες χρώσης μέσα στο πλαστικό λεκανίδιο και όλες τις εκπλύσεις μέσα στο ποτήρι! Όλες οι εκπλύσεις θα γίνουν με τον υδροβολέα χωρίς μεγάλη πίεση. Μετά από κάθε έκπλυση να σκουπίζετε τις αντικειμενοφόρους από κάτω και γύρω-γύρω. 1. Ρίξε από μία σταγόνα κυανού του μεθυλενίου στο μόνιμο παρασκεύασμα. 2. Μετά από 3 λεπτά, πλύνε προσεκτικά το παρασκεύασμα με απιοντισμένο νερό. 3. Άφησε το παρασκεύασμα να στεγνώσει τελείως ΚΕΚΛΙΜΕΝΟ επάνω σε απορροφητικό χαρτί και στο μεταξύ προχώρησε στη 2 η Πειραματική Διαδικασία. 4. Δεν θα χρησιμοποιήσετε καλυπτρίδα για να παρατηρήσετε τα βακτήρια. Όταν τα παρατηρήσετε στη μεγέθυνση Χ400, να καλέσετε τον επιβλέποντα/-ουσα. Στο ένα ημικύκλιο του παρακάτω κύκλου να σχεδιάσετε με μολύβι αντιπροσωπευτικά βακτήρια από κάθε τύπο βακτηρίων του δείγματος του γαστρεντερικού σωλήνα. Μεγέθυνση προσοφθάλμιου: Μεγέθυνση αντικειμενικού: Συνολική μεγέθυνση: Χ400 Ποιες ομοιότητες και ποιες διαφορές παρατηρείτε στο σχήμα και στο μέγεθος του δείγματος βακτηρίων του γαστρεντερικού σωλήνα;.. 3
2 η Πειραματική Διαδικασία: Χρώση κατά Gram Όργανα Λύχνος Μπούνσεν, αναπτήρας* Δύο αντικειμενοφόροι πλάκες Α, Β Δύο μπατονέτες* 2 ξύλινες λαβίδες* Μωβ και ροζ ξυλομπογιά *στον πάγκο του επιβλέποντα Για να ταυτοποιήσετε τα βακτήρια, θα φτιάξετε δύο ακόμα μόνιμα παρασκευάσματα και στη συνέχεια θα τα βάψετε με την εμπειρική μέθοδο της χρώσης κατά Gram. Το ένα παρασκεύασμα θα προέρχεται από το ίδιο δείγμα βακτηρίων του γαστρεντερικού σωλήνα που χρησιμοποιήσατε προηγουμένως. Με το δεύτερο θα ταυτοποιήσετε τα βακτήρια του γιαουρτιού που θα χρησιμοποιήσετε στη διπλωματική σας εργασία για τη μελέτη της γαλακτικής ζύμωσης. Μονιμοποίηση παρασκευασμάτων Χρώση Υλικά Δύο δείγματα με αραιωμένα βακτήρια Α, Β* Κρυσταλλικό ιώδες Lugol Αλκοόλη Σαφρανίνη 1. Με τη μπατονέτα τοποθέτησε μια μικρή σταγόνα από το δείγμα Α πάνω από τον κύκλο της αντικειμενοφόρου πλάκας Α. Παράλληλα ένας άλλος από εσάς μπορεί να ακολουθεί την ίδια διαδικασία για το δείγμα Β. 2. Αφήστε τις πλάκες να στεγνώνουν στον αέρα και στο μεταξύ προχωρήστε στην 3 η Πειραματική Διαδικασία. 3. Ανάψτε το λύχνο. 4. Καλέστε τον επιβλέποντα/-ουσα. Με την ξύλινη λαβίδα πιάστε την άκρη της κάθε αντικειμενοφόρου πλάκας που έχει την ετικέτα και περάστε γρήγορα την κάτω πλευρά της άκρης με τη σταγόνα 3-4 φορές επάνω από τη φλόγα. Προσέξτε να μην υπερθερμανθεί η σταγόνα! Με τη διαδικασία αυτή τα βακτήρια στερεώνονται πάνω στην αντικειμενοφόρο πλάκα. 1. Στα μονιμοποιημένα παρασκευάσματα καλύψτε με κρυσταλλικό ιώδες την άκρη με τα βακτήρια για 1 λεπτό. 2. Πλύνετε τα παρασκευάσματα προσεκτικά με νερό και τινάξτε τα καλά. 3. Καλύψτε πλήρως με Lugol την άκρη με τα βακτήρια για 1 λεπτό. 4. Χύστε το διάλυμα Lugol στο ποτήρι έκπλυσης. 5. Κρατήστε το πρώτο παρασκεύασμα υπό γωνία και ρίξτε σταγόνα σταγόνα αιθανόλη για μόλις 10 δευτερόλεπτα, ώστε να το αποχρωματίσετε. Αμέσως ξεπλύνετε με νερό, ώστε να απομακρυνθεί η αιθανόλη. 6. Επαναλάβετε το βήμα 6 για το δεύτερο παρασκεύασμα. 7. Καλύψτε πλήρως με σαφρανίνη την άκρη με τα βακτήρια για 10 δευτερόλεπτα. 8. Πλύνετε καλά με νερό, σκουπίστε καλά την κάτω πλευρά των αντικειμενοφόρων και αφήστε να στεγνώσουν τελείως ΚΕΚΛΙΜΕΝΕΣ επάνω στο απορροφητικό χαρτί. 9. Παρατηρείστε τα παρασκευάσματα στη μεγέθυνση Χ400. Εξηγείστε στον επιβλέποντα ποιους τύπους βακτηρίων θετικών και αρνητικών κατά Gram παρατηρείτε. 4
Στο δεύτερο ημικύκλιο της διαδικασίας 1 (των βακτηρίων του γαστρεντερικού σωλήνα) να σημειώσετε με μωβ και με ροζ τα θετικά και τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια αντίστοιχα. Στον παρακάτω κύκλο να σχεδιάσετε και να χρωματίσετε βακτήρια από κάθε τύπο του δείγματος γιαουρτιού. Μεγέθυνση προσοφθάλμιου: Μεγέθυνση αντικειμενικού: Συνολική μεγέθυνση: Ποιους διαφορετικούς τύπους βακτηρίων του γιαουρτιού μπορέσατε να διακρίνετε;.... Παρατηρήσατε βακτήρια ενωμένα μεταξύ τους στο γιαούρτι; Αν ναι, πόσα ήταν ενωμένα και σε τι σχηματισμούς;.... Σύμφωνα με το σύνολο των παρατηρήσεών σας, να εξηγήσετε ποιους συγκεκριμένους τύπους βακτηρίων διακρίνατε στο μικροβιολογικό δείγμα του γαστρεντερικού σωλήνα.... Είχε δίκιο ο καθηγητής σας σχετικά με την ομοιότητα των βακτηρίων του γαστρεντερικού σωλήνα και των βακτηρίων του γιαουρτιού;.. 3 η Πειραματική Διαδικασία: Η επίδραση της μεταβολής του ph στη διαλυτότητα των πρωτεϊνών του γάλατος Όργανα Πεχάμετρο Υλικά Διάλυμα φρέσκου γάλατος Κουταλάκι Διάλυμα διηθημένου γιαουρτιού HCl 1M Όταν προσθέτουμε λίγο γιαούρτι στο γάλα και το φυλάξουμε σε κλειστό δοχείο, τότε τα βακτήρια που βρίσκονται στο γιαούρτι, μετατρέπουν τη γλυκόζη του γάλατος σε γαλακτικό οξύ με αποτέλεσμα το γάλα να γίνεται γιαούρτι. Η πορεία αυτή λέγεται γαλακτική ζύμωση. Το γάλα «κόβει», γιατί τα μόρια της καζεΐνης συσσωματώνονται, αφού η πρωτεΐνη είναι πρακτικά αδιάλυτη στο νερό. 5
Πριν μελετήσετε την γαλακτική ζύμωση με τα βακτήρια που ταυτοποιήσατε, ο καθηγητής σας πρότεινε την ακόλουθη πειραματική δοκιμασία: 1. Με τη βοήθεια του πεχαμέτρου, μετρήστε το ph του αραιωμένου γάλατος. ph αραιωμένου γάλατος = 2. Προσθέστε σταγόνα-σταγόνα το διάλυμα HCl 1M αναδεύοντας ήπια με το κουταλάκι μέχρι να δείτε ότι «κόβει» το γάλα. 3. Μόλις παρατηρήσετε ότι το γάλα «έκοψε», να καταγράψετε την τιμή του ph. ph γάλατος μόλις «έκοψε»=... 4. Να πλύνετε καλά το ηλεκτρόδιο του πεχαμέτρου με τον υδροβολέα. 5. Να μετρήσετε το ph του αραιωμένου γιαουρτιού ph του αραιωμένου γιαουρτιού=. Να συγκρίνετε το ph του αραιωμένου γιαουρτιού με το ph που μετρήσατε μόλις «έκοψε» το γάλα. Παρατηρείστε την κατακρήμνιση των συσσωματωμάτων της καζεΐνης μέσα στο δοχείο. Με βάση το πείραμα που πραγματοποιήσατε, μπορείτε να εξηγήσετε γιατί το αποτέλεσμα της γαλακτικής ζύμωσης θα είναι η ορατή μετατροπή του γάλατος (υγρό) σε γιαούρτι (στερεό);.... Τα θέματα επιμελήθηκε: Η υπεύθυνη του ΕΚΦΕ Χαλανδρίου κ. Β. Κωνσταντινοπούλου Ευχόμαστε Επιτυχία! 6
ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΜΟΝΑΔΕΣ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ ΕΠΙΤΗΡΗΤΩΝ ΒΑΘΜΟΛΟΓΙΑ Χρήση μικροσκοπίου 6 Χρώση κυανού του μεθυλενίου 5 Σχέδιο κυανού του μεθυλενίου 5 Σχήμα-Μέγεθος ομοιότητες-διαφορές 5 Μονιμοποίηση παρασκευασμάτων 10 Χρώση Gram 10 Ερμηνεία με έγχρωμο σχήμα 5 Σχέδιο γιαουρτιού 5 Τύποι βακτηρίων γιαουρτιού 5 Ενωμένα ή όχι-αριθμός, σχηματισμοί 3 Τύποι βακτηρίων γαστρεντερικού 6 Ομοιότητα δύο δειγμάτων 4 Χρήση πεχαμέτρου-ph αραιωμένου γάλατος 6 Διαδικασία πηξήματος και προσδιορισμός ph 10 Πλύσιμο-μέτρηση γιαουρτιού 5 Σύγκριση 5 Εξήγηση αποτελέσματος γαλακτικής ζύμωσης 5 Σύνολο 100 ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ ΕΠΙΤΗΡΗΤΩΝ 7