Πανεπιστήμιο Πατρών Τμήμα Xημείας Αντωνία Ι. Αντωνίου Χημικός

Πανεπιστήμιο Πατρών Τμήμα Xημείας Αντωνία Ι. Αντωνίου Χημικός Σύνθεση μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων για εφαρμογές τους στην πεπτιδική σύνθεση σε στερεή φάση ΠΑΤΡΑ 2012

Uiversity of Patras Departmet of Chemistry Atoia I. Atoiou Chemist ythesis of uatural amio acids for applicatios i solid phase peptide sythesis Patra 2012

Πανεπιστήμιο Πατρών Τμήμα Χημείας Διατμηματικό Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών «Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων» Αντωνία Ι. Αντωνίου Χημικός Υποβλήθηκε στο Τμήμα Χημείας Τομέας Οργανικής Χημείας, Βιοχημείας & Χημείας Φυσικών Προϊόντων Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή : Κωνσταντίνος Αθανασόπουλος, Επιβλέπων, Επίκ. Καθηγητής Τμήματος Χημείας, Παν. Πατρών Διονύσιος Παπαϊωάννου, Καθηγητής Τμήματος Χημείας, Παν. Πατρών Θεόδωρος Τσέλιος, Επικ. Καθηγητής Τμήματος Χημείας, Παν. Πατρών

Uiversity of Patras Departmet of Chemistry Iterdepartmetal Program of Postgraduate tudies «Medicial Chemistry: Drug Desig & Developmet» Atoia I. Atoiou Chemist It was submitted i the Departmet of Chemistry ectio of rgaic Chemistry, Biochemistry ad atural Product s Chemistry Evaluatio Committee: Costatios Athaassopoulos, upervisor, Assist. Professor, Chemistry Depart., Uiv. Patras Dioissios Papaioaou, Professor, Chemistry Depart., Uiv. Patras Theodore Tselios, Assist. Professor, Chemistry Depart., Uiv. Patras

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ... 3 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ... 4 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 7 1. Αμινοξέα... 7 1.1 Γενικά... 7 1.2 Μη-πρωτεϊνικά αμινοξέα... 7 1.3 Η αλδεΰδη του Garer, μια ένωση κλειδί για τη σύνθεση μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων... 9 1.4 Εφαρμογές της αλδεΰδης του Garer... 12 1.4.1 Αντιδράσεις Grigard... 12 1.4.2 Αντιδράσεις Wittig... 13 1.4.3 Αντιδράσεις orer-wadsworth-emmos... 14 1.5 Συνθετικά μη-πρωτεϊνικά αμινοξέα με αρωματικούς και ετεροαρωματικούς δακτυλίους... 15 1.5.1 Σύνθεση μη πρωτεϊνικών αμινοξέων με αρωματικού δακτυλίους.... 16 1.5.2 Σύνθεση μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων με ετεροαρωματικούς δακτυλίους... 17 1.5.3 Σύνθεση μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων τα οποία φέρουν στην πλευρική τους αλυσίδα τριαζόλιο... 18 1.5.4 Σύνθεση αναλόγων της κυστεΐνης με ετεροκυκλικούς δακτυλίους στην πλευρική της αλυσίδα... 18 1.6 Αναγωγή Fukuyama, μια ήπια μέθοδος σύνθεσης α-αμινοαλδεϋδών... 20 1.7 Σύνθεση α-κετο-αμινοξέων μέσω αντίδρασης θειοεστέρων... 21 1.8 Συμμετοχή μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων στη σύνθεση φυσικών προϊόντων... 22 1.9 Προστατευτικές ομάδες... 22 1.9.1 Γενικά για τις προστατευτικές ομάδες της καρβοξυλομάδας... 23 1.9.2 Γενικά για τις προστατευτικές ομάδες της Ν α -αμινομάδας... 23 2. ΣΚΟΠΟΣ... 25 3. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 26 3.1 Μελέτες οξείδωσης της υδροξυλομάδας της Ν-τριτυλοσερίνης... 26 3.2 Αντίστροφη συνθετική ανάλυση με στόχο τις αλδεΰδες 61 και 62... 27 3.3 Σύνθεση της ένωσης κλειδί 61... 27 3. 3.1 Σύνθεση του αναλόγου 70... 30 1

3. 3.2 Σύνθεση του αναλόγου 76... 31 3.4 Προσπάθεια βελτίωσης πειραματικής πορείας... 33 3.5 Βελτίωση συνθετικής πορείας... 35 3.6 Σύνθεση της ένωσης κλειδί 84... 36 3.7 Σύνθεση του πλήρως προστατευμένου μη-πρωτεϊνικού αμινοξέος 87 μέσω αντίδρασης Wittig... 36 3.8 Σύνθεση του Fmoc-προστατευμένου μη-πρωτεϊνικού αμινοξέος 90, μέσω αντίδρασης WE... 37 3.9 Παρασκευή του Fmoc-προστατευμένου μη-πρωτεϊνικού αμινοξέος 91... 37 3.10 Κυκλοαφυδάτωση της αλδεΰδης 84 καταλυόμενη από silica gel... 38 3. 11 Σύνθεση του αναλόγου 93... 39 4. ΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΑ... 40 5. ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 63 ABTRACT... 64 2

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο ερευνητικό εργαστήριο Συνθετικής Οργανικής Χημείας του Τομέα Οργανικής Χημείας, Βιοχημείας και Φυσικών Προϊόντων του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του Διατμηματικού Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών «Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων» με επιβλέποντα τον Επίκουρο Καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Αθανασόπουλο. Πρώτα από όλους θα ήθελα να ευχαριστήσω τον καθηγητή μου κ. Κ. Αθανασόπουλο για την καθοδήγηση του και τις πολύτιμες συμβουλές του στη θεωρία και στο εργαστήριο, καθώς επίσης και για την συνεχή ηθική συμπαράσταση και εμπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπό μου καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης και συγγραφής της παρούσας διπλωματικής εργασίας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή του Τμήματος Χημείας κ. Δ. Παπαϊωάννου και τον Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Χημείας κ. Θ. Τσέλιο, μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, για το ενδιαφέρον και την ενθαρρυνσή τους. Θα ήθελα ακόμη να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τους συνεργάτες μου, διδάκτορες Γεώργιο Μαγουλά και Σταύρο Μπαριάμη για την υποστήριξη, την καλοπροαίρετη κριτική και την καθοδήγηση που μου παρείχαν καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της εργασίας αυτής. Θα ήταν παραλειψή μου να μην αναφέρω τις μεταπτυχιακές φοιτήτριες και συναδέλφους μου, Παναγιώτα Τσουκαλά και Βασιλική Παράσογλου, στις οποίες οφείλω ένα ευχαριστώ για την βοήθειά τους και για την άριστη συνεργασία που είχαμε στο χώρο του εργαστηρίου. Τις πιο θερμές ευχαριστίες, μου θέλω να εκφράσω στους γονείς μου Ιωάννη και Μαρία καθώς και στα αδέρφια μου Χρήστο και Δημήτρη για την κατανόηση, εμπιστοσύνη, αγάπη, ηθική και υλική στήριξη που μου προσέφεραν όλα αυτά τα χρόνια. Τέλος, ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στον αγαπημένο μου Γεώργιο Λουκόπουλο για την αμέριστη ηθική υποστήριξη και αγάπη που μου προσέφερε και συνεχίζει να μου προσφέρει. 3

ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ Οι συντμήσεις που χρησιμοποιούνται στην παρούσα διπλωματική έχουν προταθεί από την Επιτροπή Βιοχημικής Ονοματολογίας της Διεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρμοσμένης Χημείας (IUPAC) και της Διεθνούς Ένωσης Βιοχημείας (IUB). Οι προτάσεις αυτές ανακοινώθηκαν το 1972 και συμπληρώθηκαν σταδιακά μέχρι το 1989 1. Συντμήσεις αμινοξέων Ala Αλανίνη Leu Λευκίνη Arg Αργινίνη Lys Λυσίνη Asp Ασπαραγινικό οξύ Met Μεθειονίνη As Ασπαραγίνη Phe Φαινυλαλανίνη Cys Κυστεΐνη Pro Προλίνη Gl Γλουταμίνη er Σερίνη Gly Γλυκίνη Thr Θρεονίνη Glu Γλουταμινικό οξύ Trp Θρυπτοφάνη is Ιστιδίνη Tyr Τυροσίνη Ile Ισολευκίνη Val Βαλίνη Συντμήσεις προστατευτικών ομάδων Boc Τριτοταγής βουτοξυκαρβονυλομάδα Bzl Βενζυλομάδα t Bu Τριτοταγής βουτυλομάδα Fmoc 9-Φλουορενυλομεθοξυκαρβονυλομάδα Me Μεθυλομάδα t Bu Τριτοταγής βουτυλομάδα Trt Τριφαινυλομεθυλομάδα Άλλες συντμήσεις AcEt Ac Boc 2 CCl 3 Οξικός αιθυλεστέρας Οξικό οξύ Τριτ-βουτοξυκαρβονικός ανυδρίτης Χλωροφόρμιο 1. IUPAC-IUB Joit Commissio o Biochemical omeclature (JCB), omeclature ad ymbolism for Amioacids ad Peptides, Recommedatios, Eurοpea Joural of Biochemistry, (1984), 138, p. 9 ad Joural of Biological Chemistry, (1989), 264, p. 663. 4

DBU DCC DCU DCM DIAD DIPEA DMAP DMF DM EDCI EI M Et 3 Et 2 Et FCC FT-IR h ΘΔ (rt) ipr IR MeC Me 3 icl Me mi a -BuLi MR x-cl PCC PDC Ph PhMe/ Tol Py Cl 2 Σ.Τ. TFA 1,8-διαζαδικυκλο[5.4.0]-ενδεκ-7-ένιο Ν,Ν -Δικυκλοεξυλοκαρβοδιιμίδιο Ν,Ν -Δικυκλοεξυλουρία Διχλωρομεθάνιο Διισοπροπυλαζωδικαρβοξυλικός εστέρας Διισοπροπυλαιθυλαμίνη 4-Διμεθυλαμινοπυριδίνη Διμεθυλοφορμαμίδιο Διμεθυλοσουλφοξειδιο Ν-(3-διμεθυλαμινοπροπυλ)- -αιθυλκαρβοδιιμίδιο Φασματομετρία μάζας με ιονισμό ψεκαζόμενου διαλύματος Τριαιθυλαμίνη Διαιθυλαιθέρας Αιθανοθειόλη Χρωματογραφία στήλης ταχείας ανάπτυξης Φασματοσκοπία υπερύθρου με μετατροπή Fourier Ώρες Θερμοκρασία Δωματίου (room temperature) Ισοπροπανόλη Φασματοσκοπία Υπερύθρου Ακετονιτρίλιο Τριμεθυλοχλωροπυρίτιο Μεθανόλη Λεπτά Υδροξείδιο του νατρίου Κανονικό βουτυλολίθιο Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού Οξαλυλοχλωρίδιο Χλωροχρωμική πυριδίνη Διχρωμική πυριδίνη Βενζόλιο Τολουόλιο Πυριδίνη Θειονυλοχλωρίδιο Σημείο Τήξης Τριφθοροξικό οξύ 5

TFE TF TLC TPP (Ph 3 P) TPP Trisyl UV Τριφθοροαιθανόλη Τετραϋδροφουράνιο Χρωματογραφία Λεπτής στοιβάδας Τριφαινυλοφωσφίνη Τριφαινυλοφωσφινοξείδιο 2,4,6-Τριισοπρόπυλοφαινυλοσουλφονυλ- Φασματοσκοπία Υπεριώδους 6

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Αμινοξέα 1.1 Γενικά Τα αμινοξέα είναι οι δομικές μονάδες των πρωτεϊνών. Ένα α-αμινοξύ αποτελείται από ένα κεντρικό άτομο άνθρακα (ονομάζεται α-άνθρακας), συνδεδεμένο με μια αμινομάδα, μια καρβοξυλομάδα, ένα άτομο υδρογόνου και μια χαρακτηριστική για το κάθε ένα πλευρική ομάδα R. Τα α-αμινοξέα είναι χειρόμορφα καθώς στο τετράεδρο του ατόμου του α-άνθρακα είναι συνδεδεμένες τέσσερις διαφορετικές ομάδες. Τα δυο κατοπτρικά είδωλα ονομάζονται D και L ισομερή. Μόνο τα L αμινοξέα απαντούν στις πρωτεΐνες. 2 R 2 R L-αμινοξύ D-αμινοξύ Εικόνα 1. Γενική δομή αμινοξέων. Τα φυσικά αμινοξέα τα οποία απαντώνται στις πρωτεΐνες είναι είκοσι και είναι τα εξής : Gly, Ala, Val, Ile, Leu, er, Thr, Cys, Met, As, Gl, Phe, Pro, Trp, Tyr, Asp, Glu, Arg, Lys, is. 1.2 Μη-πρωτεϊνικά αμινοξέα Τα μη-πρωτεϊνικά αμινοξέα είναι μη γενετικά κωδικοποιημένα αμινοξέα με ιδιαίτερη βιολογική σημασία, τα οποία είτε απαντώνται στη φύση, είτε συντίθενται χημικά και αποτελούν σημαντικά εργαλεία στη σύγχρονη έρευνα για την ανακάλυψη νέων φαρμάκων. 2 Επίσης λόγω της δομικής τους ποικιλίας και της λειτουργικής τους ευελιξίας χρησιμοποιούνται ευρέως και ως πρόδρομες χειρόμορφες ενώσεις. Τέλος, σημαντική είναι η συμβολή τους στην πεπτιδική χημεία, όπου χρησιμοποιούνται αντικαθιστώντας φυσικά αμινοξέα σε πεπτιδικές αλληλουχίες, με σκοπό τη βελτίωση της φαρμακοδυναμικής τους, της ενζυματικής τους σταθερότητας και της βιοδιαθεσιμότητάς τους. Επίσης αρκετά μη-πρωτεϊνικά αμινοξέα είναι φαρμακευτικά προϊόντα τα οποία διατίθενται στο εμπόριο. Για παράδειγμα, το L-Dopa χρησιμοποιείται για να ανακουφίσει ορισμένα συμπτώματα της νόσου του Parkiso, η D-κυκλοσερίνη ως αντιβακτηριακό και η D-πενικιλλαμίνη ως αντιρευματικό (Πίν. 1). 2.. James, Chimica ggi, (2003), p. 65. 7

Πίνακας 1. Μη-πρωτεϊνικά αμινοξέα με φαρμακευτικές ιδιότητες. Μη-πρωτεϊνικά αμινοξέα Θεραπευτική εφαρμογή 2 L-Dopa Κατά της νόσου του Parkiso 2 Αντιβακτηριακό D-Κυκλοσερίνη 2 D-Πενικιλλαμίνη Αντιρρευματικό Επιπλέον αξίζει να σημειωθεί ότι ορισμένα πολύ σημαντικά φάρμακα που κυκλοφορούν στο εμπόριο εμπεριέχουν στον σκελετό τους μη πρωτεϊνικά αμινοξέα. Στον παρακάτω Πίν. 2 παρουσιάζονται τέτοιου τύπου φάρμακα σε συνδιασμό με τη θεραπευτική δράση του κάθε ενός. Πίνακας 2. Μη πρωτεϊνικά αμινοξέα ως μέρος του σκελετού φαρμάκων. Συστατικό Φάρμακο Θεραπευτική δράση C D-2-aphthyalaie 2 C afareli Θεραπεία για την ενδομητρίωση 2 Amoxicilli Αντιβακτηριακό D-4-ydroxypheylglycie C 2 Ampicilli Αντιβακτηριακό D-Pheylglycie 8

Συστατικό Φάρμακο Θεραπευτική δράση C 2 Ealapril Αντιυπερτασικό L-omopheylalaie C 2 (2R,3)-Pheylisoserie Taxol Αντινεοπλασματικό 1.3 Η αλδεΰδη του Garer, μια ένωση κλειδί για τη σύνθεση μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων Το 1984 ο Garer δημοσίευσε 3 για πρώτη φορά τη μέθοδο σύνθεσης της αλδεΰδης 1, η οποία σήμερα είναι γνωστή ως αλδεΰδη του Garer. Έκτοτε, και τα δύο εναντιομερή της 1 έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς ως χειρόμορφα εκμαγεία στην ασύμμετρη σύνθεση. Η πρώτη σύνθεση της 1 από τον Philip Garer πραγματοποιήθηκε σε τέσσερα στάδια. Αρχικά, προστατεύτηκε η αμινομάδα της L-σερίνης (2) με Bocομάδα και το προκύπτον ανάλογο -Boc-σερίνη (3) κατεργάστηκε με διαζωμεθάνιο 4 ή στη πιο βελτιωμένη μορφή σύνθεσης, με μεθυλοϊωδίδιο και ανθρακικό κάλιο (Σχ. 1) 5 δίνοντας το μεθυλεστέρα 4. Στη συνέχεια, η υδροξυλομάδα της πλευρικής αλυσίδας του αμινοξέος προστατεύτηκε μέσω της δημιουργίας ενός δακτυλίου οξαζολιδίνης μετά από κατεργασία με Me 2 C(Me) 2 και Ts. Τέλος, λαμβάνεται η αλδεΰδη 1 με αναγωγή του εστέρα 5 με DIBAL σε τολουόλιο. 2 2 C 2 Boc 2 a 3 Boc C 2 MeI/ K 2 C 3 86% (2 steps) 4 Boc C 2 Me Me 2 C(Me) 2 Ts 70-86% 1 Boc C DIBAL PhMe 76% 5 Boc C 2 Me Σχήμα 1. Βελτιωμένη πορεία σύνθεσης της αλδεΰδης 1 από τον Garer. 3. P. Garer, Tetrahedro Letters, (1984), 25, p. 5855. 4. P. Garer, J. M. Park, Joural of the rgaic Chemistry, (1987), 52, p. 2361. 5. P. Garer, J. M. Park, rgaic ytheses, (1991), 70, p. 18. 9

Η οπτική καθαρότητα της 1 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με αναγωγή της προς την αντίστοιχη αλκοόλη, ακολουθούμενη από εστεροποίηση με το οξύ του Mosher προς τον αντίστοιχο εστέρα 6 (Εικ. 2). Μελέτες με MR του εστέρα αυτού έδειξαν πως η αλδεΰδη 1 είναι οπτικά καθαρή σε ποσοστό 93-95% ee. Ανάλογη πορεία ξεκινώντας από την D-σερίνη (7) οδηγεί στον αντίποδα της 1, δηλαδή την αλδεΰδη 8 (Εικ. 2). Me Boc CF3 Ph 2 C 2 Boc C 6 7 8 Εικόνα 2. Ο εστέρας 6, D-σερίνη (7) και η (R)-Garer αλδεΰδη 8 4. Λόγω της μεγάλης συνθετικής αξίας της 1, η πρωτότυπη σύνθεση του Garer (Σχ. 1), έχει μελετηθεί αρκετά από πολλές ομάδες ερευνητών. Οι McKillop et a.l 6 βελτίωσαν τα δύο πρώτα στάδια, την προστασία της αμινομάδας με Boc-ομάδα και την εστεροποίηση. Έτσι κατεργασία της 2 με Cl σε Me έδωσε το μεθυλεστέρα της σερίνης (9), οποίος αντέδρασε με (Boc) 2 και Et 3 δίνοντας το ανάλογο 4 σε συνολική απόδοση δύο σταδίων 90-94% (Σχ. 1). Επίσης, η μετατροπή της 4 στην οξαζολιδίνη 5 έχει βελτιωθεί από τους Moriwake et al. 7, οι οποίοι χρησιμοποίησαν BF 3 Et 3 ως καταλύτη στη θέση του Ts. Με την τροποποίηση αυτή η απόδοση αυτού του σταδίου αυξήθηκε στο 93%. Ωστόσο, οι περισσότερες προσπάθειες βελτίωσης έχουν γίνει στο στάδιο της αναγωγής του εστέρα 5 προς την αλδεΰδη 1. Έχει παρατηρηθεί πως η αναγωγή του 5 μπορεί δύσκολα να αναπαραχθεί και εξαρτάται από την ποιότητα του DIBAL που χρησιμοποιείται. Μια πιο αξιόπιστη διαδικασία θα ήταν η αναγωγή του εστέρα στην αντίστοιχη αλκοόλη 10 και έπειτα με οξείδωση wer πίσω στην αλδεΰδη 1. Έτσι το DIBAL αντικαταστάθηκε με την αλληλουχία αναγωγή με LiAl 4 -οξείδωση wer. Κατ αυτό τον τρόπο όμως η αλδεΰδη που προέκυψε δεν ήταν οπτικά καθαρή. Τη λύση έδωσαν οι Dodoi et al 8. αλλάζοντας τη βάση στην οξείδωση wer από Et 3 σε DIPEA (Σχ. 2), λαμβάνοντας τελικά την αλδεΰδη 1 με οπτική καθαρότητα 97% ee. Παρόλο που τα δύο αυτά στάδια έχουν μελετηθεί εκτενώς και μπορούν να πραγματοποιηθούν και με άλλα αντιδραστήρια, λαμβάνοντας το προϊόν σε καλή απόδοση και οπτικά καθαρό, εντούτοις αυξάνουν τα συνολικά στάδια της πορείας του Garer από τέσσερα σε πέντε. 6. A. McKillop, R. J. K. Taylor, R. J. Watso,. Lewis, ythesis, (1994), p. 31. 7. T. Moriwake,. I. amao,. aito,. Torii, Chemical Letters, (1987), p. 2085. 8. A. Dodoi, D. Perroe, ythesis, (1997), p. 527. 10

2 2 C 2 Me Cl 9 2 C 2 Me (Boc) 2 Et 3 Boc C 2 Me 4 90-94% (2 steps) i Pr 2 Et 5 Boc C 2 Me LiAl 4 Et 2 10 Boc (CCl) 2 DM 1 Boc C 94% (2 steps) Σχήμα 2. Βελτιωμένες μετατροπές της 2 στην 4 5 και της 5 στην 1 8. Για το λόγο αυτό και προκειμένου να βελτιώσουν την συνθετική πορεία της αλδεΰδης 1 και να μειώσουν ξανά τον αριθμό των σταδίων από πέντε σε τέσσερα οι Bold et al. 9 ήταν οι πρώτοι οι οποίοι αντικατέστησαν τον μεθυλεστέρα με το αντίστοιχο αμίδιο του Weireb 11 που επέτρεψε την άμεση αναγωγή του προς την αλδεΰδη (Σχ. 3). Οι αποδόσεις όμως δεν ήταν ικανοποιητικές, γι αυτό οι Cambell et al. 10 βελτίωσαν αυτή την πορεία σύνθεσης, συνθέτοντας το αμίδιο 11 με σύζευξη του οξέος 3 με MeMe παρουσία Ν-(3-διμεθυλαμινοπροπυλο)- -αιθυλοκαρβοδιιμίδιο (EDCI). πορεία αυτή βελτιώθηκε περαιτέρω, χρησιμοποιώντας BF 3 Et 2, ως καταλύτη στο στάδιο της κυκλοποίησης ανεβάζοντας έτσι τη συνολική απόδοση τριών σταδίων στο 88% (Σχ. 3). 2 2 C Boc 2 a Boc 3 C MeMe EDCI Boc Me 11 Me Me 2 C(Me) 2 BF 3 Et 2 Boc C LiAl 4 100% 12 Boc Me Me 88% (3 steps) Σχήμα 3. Σύνθεση της 1 μέσω αμιδίου Weireb με τις βελτιώσεις των Cambell et al. 1 9. G. Bold, T. Allmediger, P. erold, L. Moesch,. P. chär, R.. Duthaler, elvetica Chimica Acta, (1992), 78, p. 865. 10. A. D. Campbell, T. M. Rayham, R. J. K. Taylor, ythesis, (1998), p. 1707. 11

Σε μια προσπάθεια μείωσης του κόστους σύνθεσης της αλδεϋδης του Garer οι Kumar και Datta 11 δημοσίευσαν μια νέα πορεία έξι σταδίων χρησιμοποιώντας ως πρώτη ύλη την L-μεθειονίνη (Σχ. 4). 2 L-Met Me α 78% Boc 13 Me β 95% Boc 14 Me γ 93% Boc C ε 80% Boc δ 69% Boc Me 1 16 15 Σχήμα 4. Σύνθεση της 1 από τους Kumar και Datta. (α) 1. LiAl 4, TF, Δ, 2. (Boc) 2, DCM, Δ, (β) Me 2 C(Me) 2, BF 3 Et 2 (cat), acetoe, rt, (γ) ΝaI 4, ac 3, Me, 2, 0 0 C, (δ) PhCl 2, 175-180 0 C, 5-6h, (ε) 1. s 4, M, acetoe, rt, 2. ai 4 -i 2, DCM, rt. 1.4 Εφαρμογές της αλδεΰδης του Garer 1.4.1 Αντιδράσεις Grigard Εφαρμογές της αλδεΰδης του Garer στη σύνθεση μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων με εφαρμογή αντιδραστηρίων Grigard έχουν αναφερθεί από διάφορες ερευνητικές ομάδες. Συγκεκριμένα οι Wiliams et al. 12 μελέτησαν εκτενώς τη δραστικότητα και την στερεοεκλεκτικότητα των αντιδραστηρίων Grigard με την αλδεΰδη 1 και έδειξαν ότι η αντίδραση εξαρτάται τόσο από τη στερεοχημική παρεμπόδιση του οργανομαγνησιακού αντιδραστηρίου, όσο και από τη στερεοχημική παρεμπόδιση του δακτυλίου της οξαζολιδίνης της 1. Έτσι Et-, i Pr-, t Bu- ή C 6 11 - αλογονίδια του μαγνησίου οδήγησαν κυρίως στο syπροϊόν σε αναλογίες από 9:1 έως 15:1, ενώ αντίθετα τα πιο δραστικά C 3 - (1:2) και Ph- (1:8) αλογονίδια οδήγησαν κυρίως στο ati-προϊόν λόγω του γεγονότος πως η προσθήκη από την πλευρά της 1 είναι πιο γρήγορη από το σχηματισμό χηλικών παραγώγων. Αλλάζοντας το διαλύτη της αντίδρασης από TF σε Et 2, δηλ. ένα διαλύτη ο οποίος ευννοεί το σχηματισμό χηλικών παραγώγων, αυξήθηκε δραματικά η απόδοση των sy-προϊόντων. Μη-πρωτεϊνικά αμινοξέα όπως η β-υδροξυφαινυλαλανίνη, η β-υδροξυδιφαινυλαλανίνη και η διφαινυλαλανίνη (Εικ. 3) έχουν συντεθεί μέσω αντίδρασης Grigard της 1 με φαινυλομαγνήσιο βρωμίδιο και επακόλουθη οξείδωση της πρωτοταγής αλκοόλης του άνθρακα C-3. Η προσθήκη του αντιδραστηρίου Grigard έγινε ποσοτικά σε Et 2 στους 0 0 C και οδήγησε σε μίγμα 3:2 sy:ati προϊόντων. 13 11. J.. R. Kumar, A. Datta, Tetrahedro Letters, (1997), 38, p. 6779. 12. L. Williams, Z. Zhag, F. hao, P. J. Carroll, M. M. Joullié, Tetrahedro, (1996), 52, p. 11673. 13. A. M. P. Koskie,. assila, V. T. Myllymaeki, K. Rissae, Tetrahedro Letters, (1995), 36, p. 5619. 12

Boc Ph 2 Ph Ph Ph 2 2 Ph Ph 1.4.2 Αντιδράσεις Wittig 17 18 19 20 3:2 sy:ati Εικόνα 3. Μη-πρωτεϊνικά αμινοξέα από την 1 μέσω αντιδράσεων Grigard. 1.4.2.1 Αντιδράσεις Wittig με σταθεροποιημένα υλίδια του φωσφόρου Η αλδεΰδη του Garer έχει χρησιμοποιηθεί για τη σύνθεση σημαντικών πρόδρομων ενώσεων, όπως του εστέρα 21, ο οποίος έχει τις δυνατότητες να εμπλακεί σε αντιδράσεις όπως : προσθήκη Michael, αντίδραση Diels-Alder, εποξείδωση και διυδροξυλίωση. Ένας απλός τρόπος λοιπόν σύνθεσης του εστέρα 21 είναι μέσω αντίδρασης Wittig ενός σταθεροποιημένου υλιδίου με την 1. Στο σημείο αυτό αξίζει να σημειώσουμε πως η στερεοεκλεκτικότητα της αντίδρασης εξαρτάται από το διαλύτη που θα χρησιμοποιηθεί, όπως παρουσιάζεται και στον πίνακα 3. 14,15,16,17 Πίνακας 3. Επίδραση του διαλύτη στη στερεοεκλεκτικότητα της αντίδρασης Wittig. 8 Boc C Ph 3 P=CC 2 R Boc 21 C 2 R R Διαλύτης Απόδοση (%) Ε : Ζ Αναφορά Me Me 93 3 : 2 15 Et ΤΗF 72 1 : 0 16 Et Ph 100 1 : 0 17 Me Ph 95 1 : 0 18 1.4.2.2 Αντιδράσεις Wittig με μη σταθεροποιημένα υλίδια του φωσφόρου Στις αντιδράσεις Wittig με μη σταθεροποιημένα φωσφοράνια, το βήμα κλειδί είναι ο i situ σχηματισμός του φωσφορανίου από το αντίστοιχο φωσφονικό άλας. Η επιλογή της κατάλληλης βάσης εξαρτάται από την ανθεκτικότητα των δραστικών ομάδων του υποστρώματος, καθώς μπορεί να οδηγήσει σε παραπροϊόντα και συνεπώς σε χαμηλές αποδόσεις. Κατεργασία της 1 με ποικίλα υλίδια του φωσφόρου τα 14.. Priepke, R. Brücker, K. arms, Chemische Berichte, (1990), 123, p. 555. 15. Y.. o, Y. C. Chag, K. P. Chu, Joural of the Chiese Chemical ociety, (2000), 47, p. 91. 16. A. Barco,. Beetti, G. palluto, A. Casolari, G. P. Pollii, V. Zairato, Joural of the rgaic Chemistry, (1992), 57, p. 6279. 17. K. himamoto, Y. hfue, Tetrahedro Letters, (1990), 31, p. 4049. 13

οποία προήλθαν από τα αντίστοιχα φωσφονικά άλατα, παρείχαν αλκένια με διαμόρφωση κυρίως Ζ (Πιν. 4) 18. Πίνακας 4. Παρουσίαση αποτελεσμάτων αντιδράσεων Wittig της 1 με μη σταθεροποιημένα φωσφοράνια. Boc C Ph 3 P=CR 1 R 2 Boc R 1 R 2 1 R 1 R 2 Βάση Απόδοση (%) Ζ Me Η -BuLi 62 93 -C 5 11 Η -BuLi 78 >98 C 2 C 2 Ph Η -BuLi 96 >98 (C 2 ) 2 C Η LiMD 73 >98 Et Me LiMD 50 70 1.4.3 Αντιδράσεις orer-wadsworth-emmos Το ανάλογο 21 μπορεί επίσης να παρασκευαστεί μέσω αντιδράσεως orer-wadsworth-emmos (ΗWE) της αλδεΰδης 1 και του φωσφονικού εστέρα 22, παρουσία υδατικού διαλύματος K 2 C 3 και Bu 4 + I - (Σχ. 5). Η απόδοση της αντίδρασης αυτής υπερβαίνει το 80% και επιπλέον η στερεοεκλεκτικότητά της ανέρχεται στο >95:5. Επίσης η αντίδραση WE υπερτερεί της Wittig, καθώς η διαλυτότητα του παραπροϊόντος (Et) 2 P() - K + στο νερό, καθιστά την κατεργασία του μίγματος της αντίδρασης πιο εύκολη. 19,20,21 Boc C Et + P Et C 2 Et aq. K 2 C 3 / Bu 4 + I - rt, 88% Boc C 2 Et + Et P - K Et + 1 22 21 Σχήμα 5. Αντίδραση WE παρουσία υδατικού διαλύματος K 2 C 3 και Bu 4 + I -. 18. P. L. Beaulieu, J.. Duceppe, C. Johso, Joural of the rgaic Chemistry, (1991), 56, p. 4196. 19. I. Jako, P. Uiber, A. Ma, C. G. Wermuth, T. Boulager, B. orberg, G. Evrard, F. Durat, Joural of the rgaic Chemistry, (1991), 56, p. 5729. 20. A. R. Jurges, Tetrahedro Letters, (1992), 33, p. 4727. 21. C. G. Wermuth, A. Ma, A. choefelder, R. A. Wright, B. G. Johso, J. P. Burett,. G. Maye, D. D. choepp, Joural of Medicial Chemistry, (1996), 39, p. 814. 14

Η αντίδραση WE της αλδεΰδης 1 και ενός φωσφονικού εστέρα θα μπορούσε επίσης να γίνει παρουσία άλλης βάσης όπως για παράδειγμα το DBU. Στην περίπτωση αυτή το προϊόν της αντίδρασης είναι μόνο το Ε ισομερές, όμως η απόδοση μειώνεται στο 71% (Σχ 6). 22 Boc C + Et P Me Et Et DBU/ LiCl C 3 C 71% Boc Me C 2 Et 1 23 24 Σχήμα 6. Αντίδραση WE παρουσία DBU και LiCl. Στο σημείο αυτό θα πρέπει να σημειώσουμε πως έπειτα από αντιδράσεις σύζευξης για την επέκταση της πλευρικής αλυσίδας του αμινοξέος, όπως Wittig ή WE θα πρέπει η υδροξυλομάδα να αποπροστατευτεί και στη συνέχεια να οξειδωθεί ώστε το νέο μη-πρωτεϊνικό αμινοξύ που θα προκύψει να είναι κατάλληλο για πεπτιδική σύνθεση. Κύριο μειονέκτημα όμως της σύνθεσης μη φυσικών αμινοξέων μέσω της αλδεΰδης του Garer είναι ότι τελικά καταλήγουμε να λάβουμε ένα αμινοξύ με ανεστραμμένη τη στερεοχημεία του, συγκρινόμενο με το αμινοξύ που χρησιμοποιήθηκε ως πρώτη ύλη. Αυτό έχεις ως αποτέλεσμα τη χρήση υψηλού κόστους πρώτων υλών, όπως είναι τα D-αμινοξέα, για να συντεθούν τα συνήθως επιθυμητά L-μη-πρωτεϊνικά αμινοξέα. 1.5 Συνθετικά μη-πρωτεϊνικά αμινοξέα με αρωματικούς και ετεροαρωματικούς δακτυλίους Το ενδιαφέρον των μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων συνεχώς αυξάνεται. Αντικατάσταση αρωματικών ή/και ετεροαρωματικών πρωτεϊνικών αμινοξέων από αρωματικά ή/και ετεροαρωματικά μη-πρωτεϊνικά αμινοξέα σε πεπτιδικές αλληλουχίες έχει ως σκοπό τη βελτίωση της φαρμακοδυναμικής, της ενζυματικής σταθερότητας και της βιοδιαθεσιμότητάς του νέου φαρμάκου. Στη συνέχεια αναφέρονται ορισμένες μελέτες σύνθεσης μη πρωτεϊνικών αμινοξέων για τη δημιουργία πεπτιδίων με βιολογικό ενδιαφέρον. 22. C.. Lee, C. J. Forsyth, Tetrahedro Letters, (1996), 37, p. 6449. 15

1.5.1 Σύνθεση μη πρωτεϊνικών αμινοξέων με αρωματικού δακτυλίους. Η L-διφαινυλαλανίνη (25a) είναι ένα μη-πρωτεϊνικό αμινοξύ το οποίο συντέθηκε με τη μεθοδολογία Evas 23 και μελετήθηκε από τους Goel et al 25 ως πιθανός θεραπευτικός παράγοντας. Η πορεία σύνθεσης του ξεκινά με τη μετατροπή του διφαινυλοπροπιονικού οξέος (26) στον ανυδρίτη 28 με την επίδραση πιβαλόϋλο χλωριδίου (29) παρουσία DIPEA σε TF στους -78 0 C. Στη συνέχεια η επιλογή της στερεοχημείας του επόμενου αντιδραστηρίου καθορίζει τη στερεοχημεία του αμινοξέος. Αν λοιπόν χρησιμοποιηθεί η (4,5R)- 4-μεθυλο-5-φαινυλο-2-οξαζολιδινόνη (29a), τότε το αμινοξύ θα έχει την L-διαμόρφωση, ενώ αντίθετα αν χρησιμοποιηθεί η (4R, 5)-4-μεθυλο-5-φαινυλο-2-οξαζολιδινόνη (29b), θα έχει τη D-διαμόρφωση. Η συνολική πειραματική πορεία σύνθεσης της L-διφαινυλαλανίνης παρουσιάζεται στο Σχ. 7, όπου το τελικό αμινοξύ παραλαμβάνεται με τη μορφή υδροχλωρικού άλατος. Ph Ph 26 + t Bu Cl 27 DIPEA/ TF -78-0 o C Ph Ph 28 tbu Ph TF/ -78-0 o C 82% 29α Ph Ph 30 Ph 1.KMD/ TF/ -78 o C 2.Trisyl 3 94% Ph Ph 2 Cl 25α 2 / Pd-C TF/ Cl 77% Ph Ph 3 32 Li/ 2 TF/ 2 / 0 o C 99% Ph Ph 3 31 Ph Σχήμα 7. Πορεία σύνθεσης L-διφαινυλαλανίνης από τους Goel et al. 24 Μια πιο βελτιωμένη μεθοδολογία σύνθεσης μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων με αρωματικούς δακτυλίους δημοσιεύτηκε από τους Athaassopoulos et al 25. Η ένωση κλείδι σε αυτή τη σύνθεση είναι ο τριτυλιωμένος κυκλικός ανυδρίτης του ασπαραγινικού οξέος (33), ο οποίος μέσω αντιδράσεων Grigard δίνει μια ποικιλία νέων μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων με αρωματικούς δακτυλίους σε υψηλές αποδόσεις (Σχ. 8). 23. α) D. A. Evas, T. C. Britto, J. A. Ellma, R. I. Dorrow, Joural of the America Chemistry ociety, (1990), 112, p. 4011. β) D. A. Evas, J. A. Ellma, Joural of the America Chemistry ociety (1989), 111, p. 1063. 24.. P. Goel, uai G. Che, V. G. Beyli, M. Marlatt, B. Leja, Tetrahedro Letters,(1992), 33, p. 3293. 25. C. Athaassopoulos, C. Tzavara, D. Papaioaou, G. idoa,. L.. Maia, Tetrahedro,(1995), 51, 9, p. 2679. 16

2 1. Me 3 icl/ DCM, 40 o C 2. Et 3, 0-40 o C DCC, 0 o C - rt 3. ipr, -10 o C TF/AcEt (2:1) 4. Et 3 / TrtCl, 0 - rt 80% L-Asp 34 33 1. 2PhMgBr or ArMgBr TF, -78 o C - rt 2. DCC / TF 70-75% G G 35, G = Ph 36, G = Ar 2, Pd-C 10% EtAc/Me (1:1) 3-5h 2 G G 37, G = Ph 38, G = Ar Σχήμα 8. Πορεία συνθεσης αρωματικών μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων από τους Athaassopoulos et al. 1.5.2 Σύνθεση μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων με ετεροαρωματικούς δακτυλίους Η εξασφάλιση φθηνών πρώτων υλών καθώς και η διατήρηση της στερεοδομής του αρχικού στερεογονικού κέντρου, είναι δύο από τα βασικά ζητήματα τα οποία απασχολούν τους ερευνητές στην αναζήτηση νέων μεθόδων παρασκευής μη φυσικών αμινοξέων. Το δεύτερο ζήτημα μπορεί να αντιμετωπιστεί με προσεχτική επιλογή των αντιδραστηρίων και των συνθηκών αντίδρασης. Ένα τέτοιο παράδειγμα είναι η σύνθεση του μη φυσικού αμινοξέος ()-(-)-3-(2-καρβοξυπυρρολ-4-υλ)αλανίνη (39) από τους Adamczyk et al. 26, η οποία ξεκινά από το εμπορικά διαθέσιμο και χαμηλού κόστους υδροχλωρικό άλας του διμεθυλεστέρα του L-ασπαραγινικού οξέος (40) (Σχ. 9). Me 2 C 2 Cl C 2 Me 40 (i) (Boc) 2 / Et 3 / TF (ii) (Boc) 2 / TF (iii) DIBAL/ Et 2 (iv) ab 4 / Me (v) Ph 3 P/ I 2 (Boc) 2 Me 2 C I ( )-(-)-41 a 2 / DMF 52% (Boc) 2 Me 2 C 2 ( )-(-)-42 1. (C 2 ) / TMG MeC 2. Ac 2 / DMAP TF Me 2 C (Boc) 2 R 2 43, R =, 48% 44, R = Ac, 72% CC 2 C 2 Me DBU/ TF 58% Me 2 C (Boc) 2 ( )-(-)-45 C 2 Me (i) TFA/ DCM (ii) Li/ TF/ 2 59% Me 2 C 2 ( )-(-)-39 C 2 Σχήμα 9. Σύνθεση της ()-(-)-3-(2-καρβοξυπυρρολ-4-υλ)αλανίνη (39) από τους Adamczyk et al. 25 26. Μ. Adamczyk, D. D. Johso, R. E. Reddy, Tetrahedro Asymmetry, (2000), 11, p. 3063-3068. 17

1.5.3 Σύνθεση μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων τα οποία φέρουν στην πλευρική τους αλυσίδα τριαζόλιο Ξεκινώντας από Ν- και C- προστατευμένο ασπαραγινικό ή γλουταμινικό οξύ, οι Fehretz et al 26 συνέθεσαν νέα μη-πρωτεϊνικά αμινοξέα τα οποία περιέχουν στην πλευρική τους αλυσίδα 3,4,5- τριυποκατεστημένα 1,2,4-τριαζόλια. Τα αμινοξέα αυτά θεωρείται πως λόγω του ετεροκυκλικού δακτυλίου θα μπορούν εύκολα να ενσωματωθούν σε πεπτιδικές ακολουθίες και να τροποποιήσουν ή να βελτιώσουν τις φαρμακοκινητικές ιδιότητες του πεπτιδίου. Η πειραματική τους πορεία ξεκινά με το σχηματισμό ενός αμιδικού δεσμού μεταξύ μιας πρωτοταγούς αμίνης και της καρβοξυλομάδας της πλευρικής αλυσίδας του αμινοξέος. Ακολουθεί μετατροπή του καρβονυλίου σε θειοκαρβονύλιο με το αντιδραστήριο του Lawesso (LR) και τέλος το προκύπτον θειοαμίδιο αντιδρά με το επιθυμητό υδραζίδιο για το σχηματισμό του ετεροκυκλικού δακτυλίου, όπως φαίνεται στο Σχ. 10 σε αποδόσεις από 11-78%. PG C CR 1 CR 1 2 R 1 LR/ DME C t Bu BP/ DIPEA C t Bu 80 0 C C t Bu PG PG 46 47 48 PG = Fmoc or Cdz Asp, = 1 Glu, = 2 PG 2 2 CR 2 AgBz/ Ac/ DCM 1 4 R 1 R2 C t Bu 49 Σχήμα 10. Σύνθεση μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων τα οποία περιέχουν 3,4,5-τριυποκατεστημένο 1,2,4- τριαζόλιο στην πλευρική του αλυσίδα, από τους Fehretz et al 27. 1.5.4 Σύνθεση αναλόγων της κυστεΐνης με ετεροκυκλικούς δακτυλίους στην πλευρική της αλυσίδα Πρόσφατα οι Joes et al 28 μελέτησαν τη σύνθεση αναλόγων της κυστεΐνης, τα οποία περιέχουν στην πλευρική τους αλυσίδα ετεροαρωματικούς δακτυλίους. Η στρατηγική που υιοθέτησαν παρουσιάζεται στο Σχ. 11, μέσω της αντιθετικής ανάλυσης, και σύμφωνα με αυτή το άτομο του θείου της κυστεΐνης αλκυλιώνεται με τη χρήση ενός ετεροκυκλικού αλογονιδίου. Επιλέγοντας κάθε φορά ένα διαφορετικό 27. J. A. Fehretz, A. L. Blayo, F. Bruel, J. Martiez, Europea Joural of rgaic Chemistry, (2011), p. 4293. 28. R. C. F. Joes, L. J. Crumplig, J.. Iley, Arivoc, (2011), p. 82. 18

αλογονίδιο, κατάφεραν να συνθέσουν ομόλογες σειρές (Σχ. 12 και Εικ. 4) μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων, οι οποίες ενδέχεται να έχουν βιολογικό ενδιαφέρον. eterocycle eterocycle X eterocycle 52 2 C 2 2 C 2 Boc C 2 Et 50, = 1, 2,3 51 Σχήμα 11. Αντιθετική ανάλυση ετεροκυκλικών αναλόγων της κυστεΐνης. eterocycle Boc 51 C 2 Et + X a/ TF 0-20 0 C/ 5-20mi RX Boc C 2 Et 53, = 1, 2, 3 Σχήμα 12. Γενική συνθετική πορεία ετεροκυκλικών αναλόγων της κυστεΐνης. Ph Boc C 2 Et Boc C 2 Et Boc C 2 Et 53α 53β 53γ = 1, 2, 3 Εικόνα 4. Ενδεικτικά παραδείγματα μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων, τα οποία συντέθηκαν μέσω της πορείας του Σχ. 12. Στη συνέχεια, προσπάθησαν με την ίδια μεθοδολογία να συνθέσουν μη-πρωτεϊνικά αμινοξέα τα οποία αυτή τη φορά να φέρουν στη θέση του θείου, οξυγόνο, χωρίς όμως επιτυχία. 19

1.6 Αναγωγή Fukuyama, μια ήπια μέθοδος σύνθεσης α-αμινοαλδεϋδών Η μετατροπή καρβοξυλικών οξέων σε αλδεΰδες έχει γίνει αντικείμενο εντατικής έρευνας της συνθετικής οργανικής χημείας εδώ και πολλά χρόνια. Ο καθηγητής Tohru Fukuyama 29 και οι συνεργάτες του, στην προσπάθεια τους να συνθέσουν φυσικά προϊόντα ανακάλυψαν μια εξαιρετικά ήπια μετατροπή θειοεστέρων στις αντίστοιχες αλδεΰδες, χρησιμοποιώντας ως αναγωγικό το τριαιθυλοσιλάνιο παρουσία καταλύτη Pd(C). Αργότερα διαπίστωσαν πως η μετατροπή θειοεστέρων σε αλδεΰδες είχε ήδη πραγματοποιηθεί από τα μέσα της δεκαετίας του 1940 από τους Wolfrom και Karabio 30. Οι Fukuyama et al 28 διέδωσαν την ανακάλυψη, των ήπιων συνθηκών αναγωγής, Et 3 i-pd/c, για τη σύνθεση υψηλά ενεργοποιημένων αλδεϋδών. Στο σημείο αυτό αξίζει να επισημάνουμε την επίδραση του διαλύτη στην απόδοση και στο χρόνο αντίδρασης της αναγωγής του θειοεστέρα προς την αντίστοιχη αλδεΰδη (Πιν. 5). Πίνακας 5. Επίδραση του διαλύτη στην αναγωγή και το χρόνο της αντίδρασης αναγωγής θειοεστέρα προς αλδεΰδη. R DCC, Et cat. DMAP DCM R Et Eti 10% Pd/C solvet, rt R R =, Me (C 2 ) 3 Διαλύτης Χρόνος (mi) Aπόδοση % Ακετόνη 10 97% DMF 10 71% MeC 30 98% DCM 30 89% TF 30 97% PhMe 60 98% EtAc 120 78% 29. (α) T. Fukuyama,. C. Li, L. Li, Joural of the America Chemistry ociety, (1990), 112, p. 7050. (β). Tokuyama,. Yokoshima,. C. Li, L. Li, T. Fukuyama, ythesis, (2002), p. 1121. (γ). Tokuyama,. Yokoshima, T. Yamashita,. C. Li, L. Li, T. Fukuyama, Joural of the Brazilia Chemical ociety, (1998), 9, p. 381. (δ) T. Fukuyama, Joural of ythetic rgaic Chemistry of Japa, (2003), 61, p. 620. (ε). Tokuyama, Yakugaku Zasshi, (2003), 123, p. 1007. 30. (α) M. L. Wolfrom, J. V. J. Karabios, Joural of the America Chemistry ociety (1946), 68, p. 1455. (β) M. L. Wolfrom, J. V. J. Karabios, Joural of the America Chemistry ociety (1946), 68, p. 724. 20

1.7 Σύνθεση α-κετο-αμινοξέων μέσω αντίδρασης θειοεστέρων Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η σύνθεση κετο-αναλόγων μέσω αντίδρασης ενός θειοεστέρα με ένα οργανοψευδραργυρικό αντιδραστήριο, παρουσία καταλύτη. Συγκεκριμένα, αποτελέσματα πειραμάτων 31 έχουν δείξει πως ανάλογα θειοεστέρων Ν-προστατευμένων α-αμινοξέων μπορούν να μετατραπούν στα αντίστοιχα α-κετοαμινοξέα σε καλές έως υψηλές αποδόσεις. Για παράδειγμα, από τον οπτικά καθαρό θειοεστέρα της Ν-Cbz-L-φαινυλαλανίνης λαμβάνεται χωρίς αξιόλογη ρακεμείωση το αντίστοιχο κετοαμινοξύ (Πιν. 6). Επίσης, συνδυασμοί οργανομεταλλικών αντιδραστηρίων και προστατευμένων θειεστέρων παραγώγων του L-γλουταμινικού οξέος ή της L-προλίνης, οδήγησαν σε αμινοκετόνες με σημαντικό δομικό ενφιαφέρον. Πίνακας 6. Σύνθεση α-κετοαμινοξέων από L-α-αμινοθειοεστέρες. R Cbz Et R'ZI PdCl 2 (PPh 3 ) 2 PhMe, rt R Cbz α/α Θειοεστέρας a R ZI (ισοδύναμα) Χρόνος R' (mi) Απόδοση % 1 Cbz Ph Et EtZI 2.5 15 88 b 2 -//- IZ C 2 Et 2.0 40 88 c 3 -//- IZ 2.0 15 82 d 4 -//- PhZI 3.0 90 58 d 5 -//- IZ Phth 3.0 90 64 d 6 Cbz Et Me 2 C EtZI 2.0 90 82 d 7 -//- IZ C 2 Et 2.0 90 82 d 8 Cbz Et 9 -//- IZ C 2 Et EtZI 2.0 180 73 e 2.0 110 64 d a Για α/α =1-5 και 8-9, η ee των θειοεστέρων ήταν 99%, b 99% ee, c 98% ee. d Δεν καθορίστηκε για τα προϊόντα ee. e 99% ee, [α] D - 43.8 0, (c 1.26, CCl 3 ). 31.. Tokuyama,. Yokoshima, T. Yamashita,.C. Li, L. Li, T. Fukuyama, Joural of the Brazilia Chemical ociety (1998), 9, 4, p. 381. 21

1.8 Συμμετοχή μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων στη σύνθεση φυσικών προϊόντων Η (+)-κυανοκυκλίνη Α 32 (54) είναι ένα αντιβιοτικό το οποίο απομονώθηκε από το βακτήριο treptomyces flavogriseus. Αρκετοί ερευνητές 33 πρότειναν μηχανισμούς και πειραματικές πορείες για τη σύνθεση αυτού του αντιβιοτικού. Μία από αυτές είναι του Tohru Fukuyamα, ο οποίος πρότεινε μια ολική ασύμμετρη σύνθεση της (+)-κυανοκυκλίνης Α, αποσαφηνίζοντας έτσι την απόλυτη στερεοχημεία του φυσικού προϊόντος. Στο Σχ. 13, φαίνεται πως η πειραματική πορεία σύνθεσης ξεκινά από ένα αμινοξύ, το L- γλουταμινικό οξύ, το οποίο στη συνέχεια μετατρέπεται σε ένα μη-πρωτεϊνικό αμινοξύ 55. Τελικά έπειτα από 32 συνολικά στάδια οι Tohru Fukuyam et al 34 κατάφεραν να συνθέσουν την (+)-κυανοκυκλίνη Α σε συνολική απόδοση 1.8%. Cl 2 C C 2 Me 1. Boc 2 / Et 3 2. Et/ DCC/ DMAP 93% Boc CEt C 2 Me Eti/ Pd/C acetoe, rt, 0.5-1h Boc C 2 Me γ-me-l-glu 56 57 C(Me) 3 CA 95% Me Me C 2 C Me 3 C Me 2 C Boc 55 C(Me) 2 Boc C(Me) 2 1. LDA 2. Ac 2 3. CA, quiolie 77% C 2 Me 58 54 Σχήμα 13. Ολική σύνθεση (+)-Cyaocyclie A από τους Tohru Fukuyam et al. 1.9 Προστατευτικές ομάδες Η προστασία μίας ή και δύο δραστικών ομάδων ενός αμινοξέος είναι απαραίτητη όταν αυτό χρησιμοποιείται ως δομικό στοιχείο σε χημικούς μετασχηματισμούς. Η προστασία αφορά κυρίως την αμινομάδα και την καρβοξυλομάδα της α-θέσης, ωστόσο ανάλογα με της ανάγκες της σύνθεσης προστατεύονται και οι πλευρικές ομάδες του αμινοξέος. Η προστασία των διαφόρων ομάδων συνήθως πρέπει να είναι ορθογωνική, δηλαδή να μπορεί να απομακρυνθεί μια προστατευτική ομάδα σε συνθήκες που οι υπόλοιπες μένουν ανεπηρέαστες. Στη συνέχεια θα αναφερθούν οι πλέον χρησιμοποιούμενες προστατευτικές ομάδες, τόσο του καρβονυλίου όσο και της αμινομάδας. 32. M. J. Zmijewski, M. Goebel, The Joural of Atibiots, (1982), 35, p. 524. 33. J. D. cott, R. M. Williams, Chemical Reviews, (2002), 102, p. 1669. 34. T. Fukuyama,. C. Li, L.Li, Joural of the America Chemistry ociety, (1990), 112, p. 7050. 22

1.9.1 Γενικά για τις προστατευτικές ομάδες της καρβοξυλομάδας Η εστεροποίηση είναι ο πιο απλός και συνηθισμένος τρόπος προστασίας της καρβοξυλομάδας, αφού μπορεί να μετασχηματισθεί εύκολα σε εστέρα χρησιμοποιώντας κλασσικές μεθόδους εστεροποίησης. Οι περισσότερο χρησιμοποιούμενοι εστέρες είναι οι μεθυλεστέρες και οι αιθυλεστέρες οι οποίοι παραμένουν ανεπηρέαστοι κατά το στάδιο αποπροστασίας της αμινομάδας. Οι εστέρες αυτοί μπορούν εύκολα να απομακρυνθούν κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες αλκαλικής υδρόλυση. 35,36 Άλλοι εστέρες οι οποίοι χρησιμοποιούνται επίσης για την προστασία του καρβοξυλίου είναι : α) οι βενζυλ(bzl)-εστέρες, οι οποίοι απομακρύνονται με καταλυτική υδρογονόλυση, 37 με a/ 38 3 και με Br/Ac υπό ορισμένες συνθήκες. 39 β) οι τριτοταγείς βουτύλ(bu t )-εστέρες, οι οποίοι παρουσιάζουν σταθερότητα σε βασικά διαλύματα και στην καταλυτική υδρογονόλυση. 40 Απομακρύνονται με ήπιες όξινες συνθήκες (50% TFA σε DCM ή Cl σε Ac) και λόγω της αντίστασης των τριτοταγών βουτυλεστέρων σε νουκλεόφιλη προσβολή, εμφανίζουν την χαμηλότερη τάση για παράπλευρες αντιδράσεις σε σχέση με τους βενζυλεστέρες. 1.9.2 Γενικά για τις προστατευτικές ομάδες της Ν α -αμινομάδας Η προστασία της α-αμινομάδας ενός αμινοξέος είναι απαραίτητη ώστε να αποφευχθεί η συμμετοχή της ως πυρηνόφιλο αντιδραστήριο σε διάφορες παράπλευρες αντιδράσεις. Οι ομάδες οι οποίες θα χρησιμοποιηθούν για την προστασία της α-αμινομάδας θα πρέπει να πληρούν τα εξής κριτήρια και προϋποθέσεις : 1) Να εισάγονται εύκολα και σε ικανοποιητική απόδοση. 2) Να είναι σταθερές στις συνθήκες της σύνθεσης. 3) Να μην εμφανίζουν ανεπιθύμητη δραστικότητα. 4) Να επιτρέπουν την εκλεκτική απομάκρυνση άλλων προστατευτικών ομάδων. 5) Να απομακρύνονται εύκολα, ποσοτικά και χωρίς παράπλευρες αντιδράσεις. 6) Να διατηρούν τη στερεοχημική διάταξη του ασύμμετρου ατόμου άνθρακα. Πολλές α-αμινοπροστατευτικές ομάδες πληρούν τις παραπάνω προϋποθέσεις. Ωστόσο, εν συνεχεία παραθέτουμε ορισμένες εξ αυτών. Καταρχάς, η τριτοταγής βουτοξυκαρβονυλομάδα (Boc) 41,42,43 η οποία είναι σταθερή στην καταλυτική υδρογόνωση, σε βασικά διαλύματα και σε νάτριο σε αμμωνία. Ωστόσο, 35. I. J. arris, J.. Fruto, Joural of Biological Chemistry, (1951), 191, p. 143. 36. E. aslam, Tetrahedro, (1980), 36, p. 2409. 37. J. D. Cipera, R. V. V. icholls, Chemistry & Idustry (Lodo), (1955), p. 16. 38. C. W. Roberts, Joural of the America Chemistry ociety, (1959), 81, p. 5691. 39. D. Be-Ishai, A. Berger, Joural of the rgaic Chemistry, (1952), 17, p. 1564. 40. P. ieber, B. Riiker, B. Brugger, B. Kamber, W. Rittel, elvetica Chimica Acta, (1970), 53, p. 2135. 41. L. A. Carpio, Joural of the America Chemistry ociety, (1957), 79, p. 4427. 42. G. W. Aderso, A. C. McGregor, Joural of the America Chemistry ociety, (1957), 79, p. 6180. 43. F. C. McKay,. F. Albertso, Joural of the America Chemistry ociety, (1957), 79, p. 4686. 23

είναι ευαίσθητη σε οξέα και απομακρύνεται εύκολα με ψυχρό CF 3 C. 44 Επιπλέον, η τριφαινυλομεθυλομάδα (Trt) είναι επίσης πολύ σταθερή στις βάσεις, ενώ απομακρύνεται με καταλυτική υδρογόνωση και με αραιά διαλύματα οξέων. 45 Τέλος, μια ακόμη α-αμινοπροστατευτική ομάδα είναι η 9- φλουορενυλομεθοξυκαρβονυλομάδα (Fmoc) 46 η οποία είναι πολύ σταθερή σε όξινα αντιδραστήρια, ενώ απομακρύνεται με ασθενείς βάσεις κυρίως δευτερογενείς αμίνες, 47 όπως η πιπεριδίνη. Για τους λόγους αυτούς η Fmoc ομάδα συνδυάζεται με ομάδες ευαίσθητες σε οξέα και έτσι χρησιμοποιείται όλο και περισσότερο στη σύνθεση πεπτιδίων και ιδιαιτέρα σε στερεή φάση. 44. B. F. Ludt,. L. Johase, A. Volud, J. Markusse, Iteratioal Joural of Peptide ad Protei Research, (1978), 12, p. 258. 45. L. Zerbas, D. Theodoropoulos, Joural of the America Chemistry ociety, (1956), 78, p. 1359. 46. L. A. Carpio, G. Y. a, Joural of the America Chemistry ociety, (1970), 92, p. 5748; Joural of the rgaic Chemistry, (1972), 37, p. 3404. 47.M. Bodaszky,.. Deshmae, J. Martiez, Joural of the rgaic Chemistry, (1979), 44, p. 1622. 24

2. ΣΚΟΠΟΣ Η χρήση μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων στη σύγχρονη έρευνα για την ανακάλυψη νέων φαρμάκων έχει αυξήση τα τελευταία χρόνια το ενδιαφέρον για ανάπτυξη νέων μεθοδολογιών συνθεσής τους. Σκοπός της παρούσας ερευνητικής εργασίας είναι η ανάπτυξη μιας νέας μεθοδολογίας σύνθεσης μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων, με την χρήση α-αμινοξέων ως χειρόμορφων εκμαγείων και την μετατροπή τους σε κατάλληλα συνθόνια. Τα συνθόνια αυτά θα μπορούν, μέσω αντιδράσεων Wittig, WE και Grigard, να δώσουν μια ποικιλία νέων αμινοξέων, κατάλληλων για εφαρμογές σε πεπτιδική σύνθεση σε στερεή φάση, τα οποία θα φέρουν στην πλευρική τους αλυσίδα ακόρεστους εστέρες ή αρωματικά ή ετεροκυκλικά τμήματα. Το συνθόνιο στόχος για μια τέτοια μεθοδολογία θεωρήσαμε ότι πρέπει να είναι ένα κατάλληλα προστατευμένο α-αμινοξύ με αλδεϋδομάδα στην πλευρική του αλυσίδα. Έτσι αποφασίσαμε ότι τα αμινοξέα σερίνη, ασπαραγινικό οξύ και γλουταμινικό οξύ αποτελούν ιδανικά εκμαγεία, διότι θα μπορούσαν μέσω οξείδωσης ή αναγωγής της πλευρικής τους λειτουργικής ομάδας να οδηγήσουν σε μια σειρά ομόλογων αλδεϋδών που θα διαφέρουν κατά ένα άτομο-c και κατά συνέπεια στη σύνθεση μιας αντίστοιχης ομόλογης σειράς μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων. Στο σημείο αυτό αποφασίσαμε πως η καταλληλότερη προστατευτική ομάδα για το άτομο του αζώτου είναι η τριτυλομάδα καθώς προσφέρει εξαιρετική σταθερότητα στη στερεοχημική διάταξη των χειρόμορφων παραγώγων α-αμινοξέων 48,49 λόγω του μεγάλου όγκου της. Επιπλέον, τα Ν-τριτυλιωμένα ενδιάμεσα είναι πολύ λιπόφιλα, γεγονός το οποίο διευκολύνει τις διαδικασίες υδατικής κατεργασίας και καθαρισμού τους με χρωματογραφία στήλης ταχείας ανάπτυξης (FCC). erie or Aspartic acid or er, =0 R Glutamic acid Asp, =1 Glu, =2 Συνθόνια στόχοι R Fmoc Y Μη-πρωτεϊνικά Αμινοξέα στόχοι Y = R, Ar or et er, =0 Asp, =1 Glu, =2 Εικόνα 5. Δομές συνθονίων και μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων στόχων. 48. K. Barlos, D. Papaioaou,. Patriaakou, T. Tsegeidis, Liebigs Aale der Chemie, (1986), p. 1950. 49. J. E. Baldwi, M. orth, A. Fli, M. G. Moloey, Tetrahedro, (1989), 45, p. 1453. 25

3. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Μελέτες οξείδωσης της υδροξυλομάδας της Ν-τριτυλοσερίνης Προκειμένου να συνθέσουμε το πρώτο συνθόνιο στόχο 59 με βάση την L-σερίνη, μελετήσαμε την οξείδωση της πλευρικής της υδροξυλομάδας προς την αντίστοιχη αλδεΰδη 59, ώστε στη συνέχεια μέσω μιας ποικιλίας αντιδράσεων όπως Grigard, Wittig, WE και άλλες, να συνθέσουμε μια σειρά μηπρωτεϊνικών αμινοξέων κατάλληλων για εφαρμογές στην πεπτιδική σύνθεση σε στερεά φάση. Για το σκοπό αυτό αφού συνθέσαμε την Trt-er-, προστατέψαμε την α-καρβοξυλομάδα ως μεθυλεστέρα με κατεργασία με DCC/DMAP/Me (μέθοδος teglich) στους 0 ο C και αρχικά δοκιμάσαμε οξείδωση wer με κατεργασία με x-cl και Et 3 σε DM/DCM (1:2) στους -63 ο C. Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε καμία μετατροπή της Τrt-er(ΟΗ)-Me (60) ακόμη και όταν το μίγμα της αντίδρασης αφέθηκε υπό ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου για αρκετές ώρες. Τα ίδια ακριβώς αποθαρρυντικά αποτελέσματα είχε και η προσπάθεια οξείδωσης με το αντιδραστήριο Dess-Marti καθώς επίσης και η προσπάθεια με το σύστημα DM/ DCC (μέθοδος Pfitzer-Moffatt) (Σχ. 14). Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω αποτελέσματα αποφασίσαμε να δοκιμάσουμε άλλου τύπου οξειδώσεις όπως με το σύστημα PCC/ C 3 Ca ή πυριδίνη σε DCM αλλά και με PDC/ C 3 C σε DCM. Και σε αυτές τις περιπτώσεις τα αποτελέσματα δεν ήταν τα επιθυμητά καθώς λαμβάνονταν πολύπλοκα μίγματα (Σχ. 14). 59 Me PDC/ C 3 C DCM Me Me x-cl, TEA DM/DCM (1:2) Dess-Marti, Pyr C 3 Cl 60 Me DCC Py/TFA DM/Bezee (1:1) Me PCC/ C 3 Ca DCM PCC/ Py DCM Me Me Σχήμα 14. Προσπάθειες σύνθεσης της αλδεΰδης της σερίνης. 26

3.2 Αντίστροφη συνθετική ανάλυση με στόχο τις αλδεΰδες 61 και 62 Έχοντας εξαντλήσει όλες τις επιλογές οξείδωσης της υδροξυλομάδας της σερίνης προς την αντίστοιχη αλδεΰδη 60, αποφασίσαμε να μελετήσουμε την δυνατότητα σύνθεσης των άλλων δύο ομόλογων συνθονίων 62 και 63 με βάση την παρακάτω αντιθετική ανάλυση. 61, =1=Asp 62, =2=Glu PG = Me Πορεία 1 PG PG PG Πορεία 2 PG PG Cl 2 PG PG 2 Σχήμα 15. Αντιθετική ανάλυση των ομόλογων συνθονίων 61και 62. + Et Ο καταλληλότερος δρόμος προς τις επιθυμητές ομόλογες αλδεΰδες, θεωρήσαμε ότι θα περιλαμβάνει αναγωγή τύπου Fukuyama (πορεία 1) και αυτό γιατί η εναλλακτική πορεία 2, δηλ. με αναγωγή του πλευρικού εστέρα ή του αντίστοιχου πλευρικού αμιδίου του Weireb θα είχε μειωμένες πιθανότητες επιτυχίας, λόγω της συναγωνιστικής αναγωγής του α-εστέρα. 3.3 Σύνθεση της ένωσης κλειδί 61 Ξεκινώντας σύμφωνα με την αντιθετική μας ανάλυση από το L-ασπαραγινικό και το L-γλουταμινικό οξύ, προστατέψαμε τις καρβοξυλομάδες τους ως μεθυλεστέρες με κατεργασία με Cl 2 σε Me στους 0 ο C και λάβαμε τα αντίστοιχα υδροχλωρικά άλατα 40, 63 υπό μορφή λευκού στερεού σε απόδοση 92-98%. Ακολούθως, προστατέψαμε την αμινομάδα, με την ογκώδη τριτυλομάδα, με κατεργασία με TrtCl και Et 3 σε CCl 3 στους 0 ο C. Η αντίδραση διήρκησε 1,5 h και τα πλήρως προστατευμένα αμινοξέα λαμβάνονται ως πορτοκαλόχρωμος αφρός σε απόδοση 94% για το ασπαραγινικό και 75% για το γλουταμινικό (Σχ. 16). Η επιλογή αυτή βασίστηκε στο γεγονός ότι στη συνέχεια θα μπορούσαμε να σαπωνοποιήσουμε εκλεκτικά στη β- ή στη γ-θέση τους παραπάνω εστέρες, σύμφωνα με πρωτόκολλα που έχουν δημοσιευτεί παλαιότερα από τους D. Papaioaou et al. 50 50. D. Papaioaou, M. ivas, E. Kouvelas, G. W. Fracis, D. W. Akses, Acta Chemica cadiavica, (1994), 48, p. 831. 27

2 Cl 2, Me 0 o C, 12h, 98% Asp, =1 Glu, =2 Cl 2 Me TrtCl, Et 3 Me Me C 3 Cl, 0 o C Me 4h, 75% 40, 63 64, 65 Σχήμα 16. Αντιδράσεις προστασίας δραστικών ομάδων του L-Asp και L-Glu. Πράγματι η εκλεκτική σαπωνοποίηση ήταν επιτυχής και έδωσε τους α-μονοεστέρες 66 και 67 σε αποδόσεις 90-95% μετά από κατεργασία των αντίστοιχων διεστέρων με 2 Νa σε διοξάνη/ μεθανόλη (1:1) σε θερμοκρασία δωματίου για 2h. Τα παράγωγα 66 και 67 κατεργάστηκαν στην συνέχεια με DCC/ Et, παρουσία καταλυτικής ποσότητας DMAP σε C 2 Cl 2 στους 0 ο C rt, δίνοντας μετά από ολονύχτια ανάδευση τους θειοεστέρες 68 και 69 υπό μορφή λευκού κρυσταλλικού στερεού και αφρού αντίστοιχα σε απόδοση 90-95% (Σχ. 17). Me Me a 2 Dioxa/ Me (1:1) 2h, rt, 90-95% Me Et/ DCC/ DMAP C 2 Cl 2, 0 o C-rt, 12h 90-95% Me 64, 65 66, 67 68, 69 Asp, =1 Glu, =2 Σχήμα 17. Σύνθεση των θειοεστέρων 68 και 69 από Trt-AA(Me)-Me. Τέλος, μέσω αναγωγής Fukuyama με Et 3 i σε TF στους 0 ο C και χρησιμοποιώντας ως καταλύτη 10% Pd-C καταφέραμε να συνθέσουμε την μια από τις δύο αναμενόμενες αλδεΰδες, εκείνη του ασπαραγινικού οξέος 61, αφού στην περίπτωση της αναγωγής του 69 λαμβάναμε πολύπλοκα μίγματα. Ωστόσο τα προβλήματα της σύνθεσης των «συνθονίων στόχων» εξακολουθούσαν να μας απασχολούν. Έτσι ενώ κατέστη δυνατή η σύνθεση της αλδεΰδης 61, η απόδοση δεν ήταν καθόλου ικανοποιητική καθώς ανερχόταν μόλις στο 35%. Μια νέα σειρά πειραμάτων ξεκίνησε για την βελτιστοποίηση των συνθηκών της αντίδρασης μελετώντας τις μεταβολές στην θερμοκρασία και τον διαλύτη, όπως αυτές παρουσιάζονται στον παρακάτω Πιν. 7. Τελικά η βέλτιστη απόδοση σύνθεσης της αδεΰδης 61 ήταν 70% και επετεύχθηκε μετά από κατεργασία του θειοεστέρα 68 σε συνθήκες αναγωγής Fukuyama για 30 mi στους 0 ο C και σε διαλύτη TF//Ph (8:2) (Σχ. 18). 28

68, 69 Me Et 3 i, Pd-C 10% TF/Bezee (8:2) 30mi, 0 0 C Asp, =1 Glu, =2 Me 61 Me 62 (Πολύπλοκο μίγμα) Σχήμα 18. Αντίδραση παρασκευής της αλδεΰδης 61. Πίνακας 7. Επίδραση του διαλύτη και της θερμοκρασίας στην απόδοση της αναγωγής του θειοεστέρα 68 προς την αλδεΰδη 61. Me Et 3 i, Pd-C 10% Me Διαλύτης Θερμοκρασία 0 C Απόδοση % ακετόνη 0 <20 TF 0 - rt 35 DCM rt <20 Ph rt 0 AcEt rt <20 TF/Ph (8:2) rt 50 TF/Ph (8:2) 0 65-70 Ο πιθανός μηχανισμός σχηματισμού της αλδεΰδης, όπως αυτός έχει προταθεί από τον Fukuyama et. al. περιλαμβάνει αρχικά την οξειδωτική προσθήκη του Pd(0) στον C(sp 2 )- δεσμό και έπειτα ακολουθεί τρανσμεταλλίωση των ακυλο-παλλάδιο παραγώγων με Et 3 i. Αναγωγική απόσπαση από το ακυλοπαλλάδιο-υδριδίο οδηγεί στην επιθυμητή αλδεΰδη και στην αναγέννηση του Pd(0) (Σχ.19). 29

R Pd(0) R Et R Pd R Pd Et Et-iEt 3 -iet 3 Σχήμα 19. Προτεινόμενος μηχανισμός αναγωγής θειοεστέρων με Et 3 i και καταλύτη 10% Pd/C. 3. 3.1 Σύνθεση του αναλόγου 70 Αφού καταφέραμε να συνθέσουμε την αλδεΰδη του Asp σε ικανοποιητική απόδοση, το επόμενο βήμα ήταν η εφαρμογή της στην παρασκευή μια ποικιλίας αρωματικών, ετεροαρωματικών και μη αμινοξέων μέσω αντιδράσεων Wittig και orer Wadsworth Emmos (WE). Aρχικά, δοκιμάσαμε την αντίδραση Wittig (Σχ. 20) με ένα απλό σταθεροποιημένο φωσφοράνιο, το PPh 3 CC 2 Bu t (71) σε θερμοκρασία δωματίου και διαλύτη DCM, λαμβάνοντας το αναμενόμενο αλκένιο 70 σε απόδοση όμως 45%. Μεταβάλλοντας το διαλύτη από DCM σε TF και θερμαίνοντας ελαφρά (45 ο C) το μίγμα της αντίδρασης μετά από ολονύχτια ανάδευση, βελτιώσαμε την απόδοση στο 55%. Έτσι λήφθηκε το προϊόν ως μίγμα γεωμετρικών ισομερών με αναλογία E/Z= 95:5, το οποίο στη συνέχεια υποβλήθηκε σε διαχωρισμό με χρωματογραφία στήλης και λάβαμε το κύριο ισομερές 70 σε απόδοση 52% (Σχ.20). 61 Me + Ph 3 P 71 Διαλύτης, 12h Ph 3 P= Me 70 Σχήμα 20. Αντίδραση παρασκευής του αναλόγου 70. 30

Ph 3 P R 1 R 2 Ph 3 P R 1 R 2 Ph 3 P R 1 R 2 Ph 3 P R 1 R 2 R 2 R 1 + Ph 3 P Σχήμα 21. Μηχανισμός αντίδρασης Wittig με σταθεροποιημένο φωσφοράνιο. 3. 3.2 Σύνθεση του αναλόγου 76 Στη συνέχεια, επιχειρήσαμε να συνθέσουμε μέσω αντιδράσεως Wittig ανάλογα του ασπαραγινικού οξέος τα οποία να φέρουν στην πλευρική τους αλυσίδα αρωματικούς και ετεροαρωματικούς δακτυλίους. Αρχικά, δοκιμάσαμε την αντίδραση Wittig με το φωσφονικό άλας 72 παρουσία βάσης. Η παρασκευή του 72 ξεκινά με τη δημιουργία του βενζοθειαζολικού δακτυλίου μέσω αντίδρασης της 2-αμινοθειοφαινόλης (73) με το βρομοακετυλοβρωμίδιο (74) σε TF. Έπειτα από θέρμανση κατ αντιρροή για 4h και ολονύχτια ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου, λαμβάνεται το βρομίδιο 75 ως καφέ στερεό σε απόδοση 75%, έπειτα από καθαρισμό με FCC. Ακολούθως, αυτό κατεργάζεται με TPP σε C 3 C/TF (8:5) για 3h, δίνοντας το φωσφονικό άλας 72 σε απόδοση 79%, (Σχ. 22). 2 + Br Br TF 4h reflux/ 12h/ rt 75% 75 Br 73 74 TPP C 3 C/ TF (8:5) 3h/ 79% PPh 3 Br Σχήμα 22. Σύνθεση φωσφονικού άλατος 72. 72 Αρχικά για την αντίδραση Wittig χρησιμοποιήσαμε ως βάση C 3 a και διαλύτη DMF (Σχ. 23) όπου μετά από ολονύκτια ανάδευση, παραλάβαμε ένα πολύπλοκο μίγμα. Δυστυχώς το ίδιο αποτέλεσμα παρατηρήσαμε και στην περίπτωση που χρησιμοποιήσαμε ως βάση 1,2-εποξυβουτάνιο σε DMF με ανάδευση του μίγματος αρχικά σε rt και στη συνέχεια στους 60 ο C, υπό ολονύκτια θέρμανση (Σχ. 23). 31

PPh 3 + Br Me 72 61 1,2-buteoxide DMF, 60 o C,12h C 3 a DMF, rt, 12h Me 76 Σχήμα 23. Προσπάθειες σύνθεσης του προστατευμένου αμινοξέος 76. Στη συνέχεια, είχαμε δύο επιλογές, είτε να προσπαθήσουμε να παρασκευάσαμε το φωσφοράνιο 77, ώστε στη συνέχεια με μια αντίδραση Wittig με την αλδεΰδη 61, χωρίς την βοήθεια βάσης, να λάβουμε το ανάλογο 76, είτε να συνθέσουμε το φωσφονικό εστέρα 78 και να λάβουμε το επιθυμητό παράγωγο 76 μέσω αντίδρασης WE. Έτσι λοιπόν, η κατεργασία του φωσφονικού άλατος 72 με t-buk σε Ph για 5h σε θερμοκρασία δωματίου, έδωσε το σταθεροποιημένο φωσφοράνιο 77 σε απόδοση 90% (Σχ. 24). Ενώ μετά από κατεργασία του βρωμιδίου 75 με (Et) 3 P στους 100-130 ο C για 2.5h συνθέσαμε το φωσφονικό εστέρα 78 σε απόδοση 88% (Σχ. 25). PPh 3 Br t-buk/ Ph/ 5h 90% PPh 3 72 77 Σχήμα 24. Αντίδραση σύνθεσης του σταθεροποιημένου φωσφορανίου 77. Br (Et) 3 P eat 100-130 o C 88% 75 78 Et P Et Σχήμα 25. Αντίδραση σύνθεσης του φωσφονικού εστέρα 78. Ακολούθως, συνθέσαμε το ανάλογο 76 με αντίδραση Wittig της αλδεΰδης 61 με το 77 σε DCM για 12h σε θερμοκρασία δωματίου, όπως φαίνεται στο Σχ. 26. Ωστόσο, τα αποτελέσματα δεν ήταν ικανοποιητικά καθώς η απόδοση του αναλόγου 76, μετά από καθαρισμό με FCC, ανερχόταν μόλις στο 22%. Από την άλλη πλευρά, η αντίδραση WE της αλδεΰδης 61 παρουσία βάσης είτε Νa, είτε C 3 a σε διαλύτη TF, έδωσε το ανάλογο 76 σε αποδόσεις 45% και 40% αντίστοιχα. (Σχ. 27). 32

PPh 3 DCM/ rt + Me 12h/ 22% Me 77 61 76 Σχήμα 26. Παρασκευή του προστατευμένου μη-πρωτεϊνικού αμινοξέως 76. Et P + a or C 3 a Et Me TF/ 0-rt/ 40-45% Me 78 61 76 Σχήμα 27. Σύνθεση του προστατευμένου μη-πρωτεϊνικού αμινοξέως 76 μέσω αντιδράσεως WE. R 1 P EWG R 2 + R 2 R 3 R 1 R 1 P R 2 EWG R 3 R = R 1 P R 1 EWG R2 R = R 3 EWG R 2 R 3 R 1 R 1 P EWG R 2 R 3 R 1 P R 1 R 2 EWG R 3 EWG R 2 R 3 Σχήμα 28. Μηχανισμός αντίδρασης ΗWE. 3.4 Προσπάθεια βελτίωσης πειραματικής πορείας Έχοντας υπόψιν πως η ιδανική σύνθεση των παραγόμενων μη-πρωτεϊνικών αμινοξέων θα πρέπει να οδηγεί σε κατάλληλα προστατευμένα παράγωγα (-Fmoc-προστατευμένα αμινοξέα) για εφαρμογές σε πεπτιδική σύνθεση σε στερεή φάση, αποφασίσαμε να βελτιώσουμε την πορεία σύνθεσης τους με επιλογή καταλληλότερης προστατευτικής ομάδας για την α-καρβοξυλομάδα και να μειώσουμε έτσι τον αριθμό των 33