ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών Εφαρμογές στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας Μεταπτυχιακή Εργασία Ανάπτυξη επισωματικού φορέα για τη γονιδιακή μεταφορά του τεχνητού μεταγραφικού παράγοντα ενεργοποίησης της γ- σφαιρίνης Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Αγλαία Αθανασιάδου Γεώργιος Δρύλλης Μοριακός Βιολόγος- Γενετιστής Πάτρα 2007

Επιβλέπουσα καθηγήτρια Αγλαία Αθανασιάδου Καθηγήτρια, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Τριμελής εξεταστική επιτροπή Αγλαία Αθανασιάδου Καθηγήτρια, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Νικόλαος Μοσχονάς Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Αδαμαντία Παπαχατζοπούλου Επίκουρη καθηγήτρια, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών

Ευχαριστίες Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία εκπονήθηκε κατά το χρονικό διάστημα Ιουνίου 2006- Ιουνίου 2007 στο Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών με επιβλέπουσα καθηγήτρια και τη διευθύντρια του εργαστηρίου κ. Αγλαία Αθανασιάδου. Θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους όσοι συνέβαλαν στην ολοκλήρωση αυτής της εργασίας: Καταρχάς, την καθηγήτρια κυρία Αγλαία Αθανασιάδου, επιβλέπουσα καθηγήτρια μου. Τον καθηγητή κύριο Νικόλαο Μοσχονά, μέλος της τριμελούς εξεταστικής μου επιτροπής. Την επίκουρη καθηγήτρια κυρία Αδαμαντία Παπαχατζοπούλου, μέλος της τριμελούς εξεταστικής μου επιτροπής. Την Ελεάννα Σταύρου, Χημικό και υποψήφια διδακτορική φοιτήτρια του εργαστηρίου Γενικής Βιολογίας για τη βοήθειά της. Την Μαρία Μπαβέλη, Βιολόγο και υποψήφια μεταπτυχιακή φοιτήτρια του εργαστηρίου Γενικής Βιολογίας, για τη βοήθειά της. Το Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών (Ι.Κ.Υ) του οποίου τυγχάνω υπότροφος από τον Οκτώβριο του 2006 εώς Οκτώβριο 2007. Το Εμπειρίκειο Ίδρυμα από τη στιγμή που η εργασία μου τυγχάνει μέρος του επιδοτούμενου,από αυτό το ίδρυμα, προγράμματος που εκπονείται στο Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας της καθηγήτριας κυρίας Αγλαίας Αθανασιάδου στο Τμήμα Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Τέλος, θα ήθελα να αφιερώσω τη συγκεκριμένη εργασία στην οικογένειά μου και στους φίλους μου. Δρύλλης Γεώργιος Μεταπτυχιακός φοιτητής του προγράμματος Εφαρμογές στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες Τομέας Γενικής Βιολογίας Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Πατρών Στο εξώφυλλο βλέπουμε μια πρότυπη εικόνα σχεδιασμού μεθόδου γονιδιακής θεραπείας (ref: www.stanford.edu/ kaylab)

Ευχαριστίες Περιεχόμενα ΜΕΡΟΣ I Περιεχόμενα σελ. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1- Α) ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1: Γενικά 2 1.2: Κατηγορίες φορέων 4 1.2.1: Ιϊκοί φορείς 5 1.2.2: Μη ιϊκοί φορείς 9 1.2.3 Γονιδιακή θεραπεία εφαρμοζόμενη σε διάφορες ασθένειες 10 1.2.4 Κλινικές δοκιμασίες γονιδιακής θεραπείας 12 1.3: Προβλήματα φορέων γονιδιακής θεραπείας 12 1.4 Αυτο-αναπαραγόμενοι επισωματικοί φορείς (Replicating Episomal Vectors, REV) 13 1.5 Το επισωματικό όχημα pcdna3- Zif- VP64 14 1.6 Το επισωματικό όχημα pepi-egfp 16 1.6.1 S/MAR (scaffold/matrix attachment region) 17 1.7 Το επισωματικό όχημα Zif- VP64- ΕΡ1 18 1.8 Ο υποκινητής psffv (Spleen focus-forming virus) 19 1.9 Ο υποκινητής pef1- HTLV σύνθεση δύο στοιχείων: του υποκινητή του Elongation Factor και του ενισχυτή του HTLV 20 1.10 Αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (Hematopoietic Stem Cells, HSC) 21 1.11 Αιμοσφαιρινοπάθειες- Γονιδιακή θεραπεία 22 1.11.1 Έκφραση των γονιδίων των αιμοσφαιρινών κατά την εξέλιξη 22 1.11.2 Γενικά- Αιμοσφαιρινοπάθειες-Μεσογειακή Αναιμία 23 1.11.3 β- Μεσογειακή Αναιμία 24 1.12 Κληρονομική Παραμονή Εμβρυικής Αιμοσφαιρίνης (HPFH) 26 1.13 Κυτταρική σειρά Κ562 29 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1- Β)ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ: 30 ΜΕΡΟΣ II ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2- ΥΛΙΚΑ-ΜΕΘΟΔΟΙ 31 2.1 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης 32 2.1.1 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης - Αρχή της μεθόδου 33

2.1.2 Αλυσιδωτη αντίδραση πολυμεράσης - Η διαδικασία 34 2.1.3 Ηλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωμα αγαρόζης 37 2.2 Βακτηριακά στελέχη και πλασμίδια- Θρεπτικά υλικά και συνθήκες ανάπτυξης - Αντιβιοτικά 39 2.3 Απομόνωση πλασμιδικού DNA 40 2.4 Κατάτμηση πλασμιδικού DNA με ένζυμα περιορισμού 42 2.5 Απομόνωση DNA από πηκτή αγαρόζης 42 2.6 Μετατροπή κολλωδών άκρων (sticky ends) σε τυφλά άκρα (blunt ends) 43 2.7 Σύνδεση περιοριστικών τμημάτων DNA (ligation) 44 2.8 Μετασχηματισμός (transformation) του e. Coli dh5a (competent cells) με πλασμιδιακό DNA (με θερμικό σοκ) 45 2.9 Εκτίμηση συγκέντρωσης του DNA με φωτομέτρηση (OD) 45 2.10 Διατήρηση βακτηριακών καλλιεργειών στους 80 ºc (φύλαξη stock γλυκερόλης) 45 2.11 Συνθήκες ανάπτυξης καθιερωμένων κυτταρικών σειρών 46 2.12 Διαμόλυνση ανθρώπινης κυτταρικής σειράς K562 46 2.12.1 Φύλαξη κυττάρων K562 στους 80 ºc 47 2.13 Απομόνωση γονιδιωματικού DNA από ευκαρυωτικά κύτταρα Κ562 47 2.14 Μεθοδος απομόνωσης κυτταροπλασματικού κλάσματος RNA από ευκαρυωτικά κύτταρα Κ562 48 2.15 Μέθοδος απομόνωσης ολικής πρωτείνης από ευκαρυωτικά κύτταρα Κ562 49 ΜΕΡΟΣ III- ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ- ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 52 3.1: Δημιουργία του οχήματος pcdna3-sffv 52 3.2: Δημιουργία του οχήματος pcdna3-ef1-htlv 54 3.3: Απομόνωση του πλασμιδίου pcdna3-zif-vp64 σε μεγάλη κλίμακα από 0,5L καλλιέργεια βακτηριακών κυττάρων 55 55 3.3.1: Διπλή κατάτμηση του pcdna3-zif-vp64 ταυτόχρονα με τα ένζυμα περιορισμού MluI- XhoI 55 3.4: Παρασκευή των ένθετων DNA 57

3.4.1: Σχεδιασμός κατάλληλων εκκινητών για πολλαπλασιασμό του υποκινητή psffv και του υποκινητή pef1-htlv με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης: PCR 57 3.4.2: Κατάτμηση των ένθετων DNA με τα ένζυμα περιορισμού MluI καιxhoi 59 3.4.3 Αντίδραση συνδετάσης (ligation) του οχήματος pcdna3- Zif- VP64* MluI*XhoI (vector) και του νέου υποκινητή psffv* MluI* XhoI (insert) 60 3.4.4 Αντίδραση συνδετάσης (ligation) του οχήματος pcdna3- Zif- VP64* MluI*XhoI (vector) και του νέου υποκινητή pef1/ HTLV* MluI* XhoI (insert) 60 3.4.5. Χημικός μετασχηματισμός (Transformation) κυττάρων E.Coli με το προιόν της αντίδρασης συνδετάσης 60 3.4.6. Προσδιορισμός της ταυτότητας του DNA μετά από απομόνωση μικρής κλίμακας 61 3.4.6.1. Κατατμήσεις του πλασμιδιακού DNA με διάφορα ένζυμα περιορισμού 61 3.5: Δημιουργία του οχήματος Zif-VP64-ΕΡ2 66 3.5.1: Διπλές κατατμήσεις του pcdna3- SFFV και του pepi-egfp με τα ένζυμα περιορισμού NsiI και DraIII 68 3.5.2 Διαδικασία blunt-ending και αντίδραση συνδετάσης (ligation) του οχήματος pcdna3- SFFVx NsiIx DraIII (πλασμιδιακό τμήμα) και του pcmvegfp- S/MARxNsiIx DraIII (ένθετο DNA) 70 3.5.3. Μετασχηματισμός (χημικός) (Transformation) κυττάρων E.Coli με το προιόν της αντίδρασης συνδετάσης 70 3.5.4. Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας 70 3.5.5. Προσδιορισμός της ταυτότητας του DNA μετά από απομόνωση μικρής κλίμακας 71 3.5.5.1. Κατατμήσεις του πλασμιδιακού DNA με διάφορα ένζυμα περιορισμού 71 3.5.6. Απομόνωση μεγάλης κλίμακας (maxipreps) 73 3.5.7: Απομόνωση του πλασμιδίου Zif-VP64-ΕΡ1 σε μεγάλη κλίμακα από 0,5L καλλιέργεια βακτηριακών κυττάρων 74 3.6 Διαμόλυνση κυττάρων Κ562 με το Zif-VP64-ΕΡ2 75 3.7 ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 79

ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ 83 ΜΕΡΟΣ IV ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 84

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Α) ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1

1. Α) ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1: Γενικά Ο όρος γονιδιακή θεραπεία, αφορά στη μεταφορά του θεραπευτικού γονιδίου ή πιο σωστά της θεραπευτικής κασέττας σε κύτταρα από ασθενείς. Η γονιδιακή θεραπεία υποδιαιρείται σε σωματική γονιδιακή θεραπεία που εφαρμόζεται με τη μεταφορά του θεραπευτικού γονιδίου σε σωματικά κύτταρα του ασθενούς και σε γαμετική γονιδιακή θεραπεία που αφορά την εισαγωγή του θεραπευτικού γονιδίου σε μια κατηγορία σωματικών κυττάρων που περιλαμβάνει και τα γαμετικά κύτταρα ωοθηκών ή όρχεων που δίνουν γέννεση σε ωοκύτταρα και σπερματοζωάρια αντίστοιχα. Όταν γίνεται λόγος για γονιδιακή θεραπεία τότε γίνεται αναφορά μόνο για τη σωματική γονιδιακή θεραπεία, διότι η γαμετική γονιδιακή θεραπεία δεν εφαρμόζεται για λόγους βιοηθικής στον άνθρωπο, αλλά εφαρμόζεται μόνο σε πειραματόζωαποντίκια (1). Δύο θεραπευτικές προσεγγίσεις γονιδιακής θεραπείας είναι δυνατές: Η in vivo ή ενδοσωματική γονιδιακή μεταφορά όπου ο φορέας εισάγεται στον ασθενή με ενδοαγγειακή ένεση ή με ένεση σε ειδικό ιστό. Η in vivo γονιδιακή θεραπεία προυποθέτει την ανάπτυξη φορέων μεταφοράς του θεραπευτικού γονιδίου που θα βρούν μέσα στον οργανισμό τα κύτταρα- στόχο και θα εισάγουν σε αυτά το θεραπευτικό γονίδιο (Εικόνα 1.1). Βασικά μειονεκτήματα της in vivo προσέγγισης αποτελούν: 1) ο μη έλεγχος των συνθηκών έκθεσης των κυττάρων του ασθενούς στο φορέα και 2) ο πιθανός κίνδυνος μη αντιστρεπτής μόλυνσης και των σωματικών κυττάρων που δίνουν γένεση στα κύτταρα της γαμετικής σειράς (1, 2). Η ex vivo ή εξωσωματική γονιδιακή μεταφορά όπου κατάλληλα κύτταρα του ασθενούς συλλέγονται και αναπτύσσονται έξω από τον οργανισμό (Εικόνα 1.2). Ακολούθως, εισάγεται το θεραπευτικό γονίδιο στα απομονωμένα κύτταρα. Εντέλει επιλέγονται, ελέγχονται και αυξάνονται τα γενετικά επιδιορθωμένα κύτταρα. Αφού συμβούν αυτά, τα γενετικά επιδιορθωμένα κύτταρα μπορούν να επανεισαχθούν στον 2

ασθενή. Βασικό πλεονέκτημα της ex vivo προσέγγισης αποτελεί ο ακριβής έλεγχος των συνθηκών έκθεσης των κυττάρων του ασθενούς σε κατάλληλη συγκέντρωση φορέα, ενισχύοντας με αυτόν τον τρόπο την αποτελεσματικότητα της μεθόδου (1, 3). Προκειμένου να επιτευχθούν και οι δύο παραπάνω θεραπευτικές στρατηγικές απαιτείται η χρήση του κατάλληλου μέσου μεταφοράς του θεραπευτικού γονιδίου. Αυτό το μέσο μεταφοράς του θεραπευτικού γονιδίου αναφέρεται ως φορέας (vector). Οι φορείς μπορεί να είναι είτε ιϊκοί είτε μη ιϊκοί (4, 5). Εικόνα 1.1: Παράδειγμα in vivo γονιδιακής θεραπείας (len.epfl.ch page 6322.html) 3

1 Κύτταρα αφαιρούνται από τον ασθενή 2 Στο εργαστήριο κατασκευάζεται ένας τρποοποιημένος ιός ώστε να μπορεί να αναπαράγεται 7 Τα γενετικά τροποποιημένα κύτταρα παράγουν την επιθυμητή πρωτείνη ή ορμόνη 3. Το γονίδιο που μας ενδιαφέρει προστίθεται στον ιό 6 Τα γενετικά τροποποιημένα κύτταρα επαναμφυτεύονται στον ασθενή Τα κύτταρα του ασθενούς μετατρέπονται σε γενετικώς τροποποιημένα 4.Ο τροποποιημένος ιός αναμειγνύεται με κύτταρα του ασθενούς Εικόνα 1.2: Παράδειγμα γονιδιακής θεραπείας ex vivo με χρήση ιϊκού συστήματος (Image Copyright Microsoft Encarta Online Concise Encyclopedia) 1.2 Κατηγορίες φορέων Η γενική ταξινόμηση των φορέων που έχουν αναπτυχθεί για τη μεταφορά γονιδίων περιλαμβάνει ιϊκά συστήματα και μη ιϊκά συστήματα. Οι ιϊκοί φορείς οδηγούν σε ενσωμάτωση του μεταφερόμενου γονιδίου στο γονιδίωμα. Οι μη ιϊκοί φορείς χωρίζονται επιπλέον βάση των φυσικών ή χηµικών µεθόδων µεταφοράς του θεραπευτικού γονιδίου το οποίο είτε ενσωματώνεται στο γονιδίωμα είτε παραμένει ελεύθερο ως επίσωμα (1). (σχήμα 1.1). Επιπλέον, θα πρέπει ο φορέας γονιδιακής θεραπείας να έχει κάποια σημαντικά πλεονεκτήματα προκειμένου να έχει τη μεγαλύτερη δυνατή αποτελεσματικότητα. Έτσι, με σειρά σημαντικότητας, θα πρέπει ο κατάλληλος φορέας γονιδιακής θεραπείας να επιτυγχάνει μακράς διάρκειας γονιδιακή έκφραση και μάλιστα γονιδιακή έκφραση κοντά στα φυσιολογικά επίπεδα 4

έκφρασης του γονιδίου, να είναι όσο το δυνατόν πιο ασφαλής για τον ασθενή (να υπάρχει όσο το δυνατόν λιγότερος κίνδυνος πρόκλησης μεταλλαξιγένεσης και ανοσολογικών αντιδράσεων), να έχει μεγάλη διαμολυσματική ικανότητα καθώς επίσης και να έχει μεγάλο εύρος στα κύτταρα-στόχους του (διαιρούμενα και μη διαιρούμενα) (1). Παρακάτω αναπτύσσονται αναλυτικά οι διάφοροι ιϊκοί και μη ιϊκοί φορείς που χρησιμοποιούνται σε πρωτόκολλα γονιδιακής θεραπείας μέχρι στιγμής με τα πλεονεκτήματα και τα ελαττώματά τους. 1) Ιϊκοί φορείς: Ρετροιικοί (RV) Αδενοιικοί φορείς (ΑV) Αδενο-συνδεόμενοι φορείς (ΑΑV) 2) Μη ιϊκοί φορείς : Μέθοδοι μεταφοράς μη ιϊκών φορέων: Α) Φυσικές μέθοδοι: ηλεκτροδιάτρηση (electroporation) χρήση στερεών σωματιδίων (biolistics) με ένεση Β) Χημικές μέθοδοι: calcium phosphate transfection DEAE-Dextran transfection (κατιονικό πολυμερές) Λιποσώματα 3) Αυτοαναπαραγόμενοι επισωματικοί φορείς Σχήμα 1.1: Φορείς γονιδιακής μεταφοράς 1.2.1: Ιϊκοί φορείς Τα ιικά συστήματα αποτελούν τους πιο αποδοτικούς φορείς γονιδιακής μεταφοράς εφόσον μέσω αυτών το μεταφερόμενο γονίδιο ενσωματώνεται στο ενδογενές γενετικό υλικό. Παρότι δεν έχουν όλα τα ιικά οχήματα τη δυνατότητα επιλεκτικής κυτταρικής στόχευσης, είναι τα μόνα που χρησιμοποιούνται σε κλινικά πρωτόκολλα γονιδιακής θεραπείας. 5

Τα κυριότερα ιικά οχήματα είναι τα εξής: 1) Ρετροιϊκοί φορείς (retroviral vectors, RV): Η γενετική πληροφορία στο γονιδίωμα από RNA των ρετροιών οργανώνεται σε έξι τμήματα: Στο 5 άκρο βρίσκεται το 5 LTR που περιέχει ρυθμιστικές αλληλουχίες για την έκφραση των γονιδίων του ιού, ακολουθεί μια μη κωδική περιοχή που ονομάζεται ψ και η οποία είναι απαραίτητη για το πακετάρισμα του ιϊκού RNA στην κάψα του ιού, και τρία γονίδια που κωδικοποιούν αντίστοιχα για την πρωτείνη της κάψας (gag), την αντίστροφη μεταγραφάση (pol) και τις πρωτείνες του φακέλου (env) (6). Για την κατασκευή των ρετροιϊκών οχημάτων και εφόσον οι ρυθμιστικές και κωδικές αλληλουχίες είναι χωροθετημένες με διακριτό τρόπο, αντικαθίσταται το σύνολο των κωδικών αλληλουχιών από ξένο γενετικό υλικό και διατηρούνται μόνο οι ρυθμιστικές 5 LTR και 3 LTR καθώς και η ψ αλληλουχία πακεταρίσματος. Σε αυτή τη διαμόρφωση ο ρετροιός δεν πολλαπλασιάζεται κάτι που είναι επιθυμητό για λόγους ασφαλείας. Προκειμένου να πολλαπλασιαστούν οι ανασυνδυασμένοι ιοί που φέρουν το θεραπευτικό γονίδιο μεταφέρονται σε ειδικές κυτταρικές σειρές που έχουν τροποποιηθεί γενετικά για να παράγουν τις πρωτείνες της κάψας του φακέλου. Σε αυτές τις κυτταρικές σειρές είναι ενσωματωμένα σε διαφορετικές χρωμοσωμικές θέσεις ένα τμήμα του ιϊκού DNA που φέρει τις αλληλουχίες 5 LTR- gag- 3 LTR και ένα άλλο που φέρει τις αλληλουχίες 5 LTR- pol env- 3 LTR. Τα RNA που μεταγράφονται από αυτές τις αλληλουχίες δεν μπορούν να πακεταρισθούν διότι δεν έχουν την αλληλουχία ψ (1). Η επιμόλυνση των κυττάρων αυτών με όχημα: 5 LTR- ψ θεραπευτικό γονίδιο- 3 LTR οδηγεί στη μεταγραφή ικανών για πακετάρισμα ανασυνδυασμένων ρετροιικών RNA (7, 8). Μια ειδική κατηγορία ρετροιϊκών φορέων αφορούν αυτά που κατασκευάστηκαν βάσει του ιού HIV (Lenti-ιικά οχήματα) που έχει το πλεονέκτημα ότι επιτρέπει τη μεταγωγή και σε μη διαιρούμενα κύτταρα (9, 10, 11). Γενικότερα, οι ρετροιϊκοί φορείς μπορούν να παραχθούν σε υψηλούς τίτλους, έχουν εύρος τροπισμού αλλά τουναντίον ενσωματώνουν μόνο 8Kb ξένο γενετικό υλικό και επιμολύνουν κυρίως πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα (1, 5). 6

2) Αδενοιϊκοί φορείς (adenovirus): Οι αδενοιοί είναι παθογόνοι ιοί για τον άνθρωπο, έχουν δίκλωνο DNA για γενετικό υλικό και μπορούν να μολύνουν πολλούς διαφορετικούς τύπους κυττάρων οδηγώντας σε ήπιο κρυολόγημα στους ασθενείς. Ο τρόπος κατασκευής των αδενοιϊκών φορέων είναι ο εξής: Τα σημαντικά γονίδια για τον κύκλο ζωής του αδενοιού αφαιρούνται από το γονιδίωμα του φυσιολογικού αδενοιού και έτσι δημιουργείται ελεύθερος χώρος για την ενσωμάτωση του θεραπευτικού γονιδίου. Από τη στιγμή που ο αδενοιός σε αυτή την κατάσταση είναι ανίκανος να πολλαπλασιαστεί, στη συνέχεια μεταφέρεται σε ειδικές κυτταρικές σειρές πακεταρίσματος που,όπως στην περίπτωση των ρετροιικών οχημάτων, μπορούν να αναπληρώσουν τους παράγοντες που χρειάζεται ο ανασυνδυασμένος ιός προκειμένου να πακεταριστεί σε μολυσματικά ιικά σωματίδια (1, 12) (εικόνα 1.3). Στα θετικά των αδενοιϊκών φορέων συγκαταλέγονται η δυνατότητα παραγωγής υψηλού τίτλου, η παροδική έκφραση πολύ υψηλών επιπέδων του θεραπευτικού γονιδίου, η ικανότητά τους να επιμολύνουν μη πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα και η δυνατότητα ενσωμάτωσης μεγάλων μεγεθών ξένου DNA. Στα αρνητικά συμπεριλαμβάνονται η πιθανή φλεγμονώδης ή τοξική ή ανοσολογική αντίδραση, η παρουσία ήδη στον οργανισμό ή η δημιουργία αδρανοποιητικών αντισωμάτων καθώς και το ότι είναι ακατάλληλοι για εφαρμογές που απαιτούν μακρόχρονη έκφραση του θεραπευτικού γονιδίου (1, 12, 13, 14). Εικόνα 1.3: Η χρήση ενός αδενοιού ως φορέα γονιδιακής θεραπείας (U.S National Library of Medicine (www.alsa.org)) 7

3) AAV ιϊκοί φορείς(adeno-associated virus): Ο AAV είναι ένας parvovirus του οποίου ο πολλαπλασιασμός εξαρτάται από την παρουσία βοηθού ιού π.χ αδενοιού. Το γενετικό υλικό του είναι μονόκλωνο μόριο DNA μεγέθους 4.7kb. Παρουσία βοηθού ιού το DNA του AAV πολλαπλασιάζεται επισωματικά σχηματίζοντας καινούρια ιικά σωμάτια. Απουσία ιού βοηθού το DNA του AAV ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του κυττάρου. Στο 70% περίπου των περιπτώσεων ενσωματώνει το DNA του στο χρωμόσωμα 19 (19q13-qter). Οι μόνες αλληλουχίες που είναι απαραίτητες για την ενσωμάτωση του DNA στην κάψα είναι τα δύο Inverted Terminal Repeats στα άκρα του ιού. Αυτό επιτρέπει την ενσωμάτωση ξένου γενετικού υλικού περίπου 4kb, οριακή χωρητικότητα τόσο για ενσωμάτωση θεραπευτικών γονιδίων όσο και για ενσωμάτωση των κατάλληλων υποκινητών και ρυθμιστών της μεταγραφής (1, 15, 16, 17). Η χρήση ενός AAV ως φορέα γονιδιακής θεραπείας φαίνεται στην εικόνα 1.4, όπου το θεραπευτικό γονίδιο ενσωματώνεται στην κάψα του AAV, στη συνέχεια ο AAV απελευθερώνει το γονίδιο μες στα κύτταρα-στόχους που έχουν ληφθεί από τον ασθενή και στη συνέχεια αυτά επαναμφυτεύονται στον ασθενή. Γονιδιακή θεραπεία Ο AAV απελευθερ ώνει το γονίδιο μες στο Κύτταροστόχος Πρωτείνη υποδοχέας Γονίδιο (DNA) Γονίδιο ενσωματωμένο στην κάψα του AAV Το μεταφερόμενο γονίδιο εκφράζει πρωτείνες Εκκρινόμενη πρωτείνη Εικόνα 1.4: Η χρήση ενός AAV ως φορέα γονιδιακής θεραπείας (www.med.upenn.edu) 8

4) Ιός του απλού έρπητα (HSV): Τέλος, έχουν προταθεί φορείς με βάση και άλλους ιούς όπως ο ερπητοιός (HSV: HERPES SIMPLEX VIRUS). Έχει δίκλωνο DNA για γενετικό υλικό. Θετικά στοιχεία του είναι ότι μπορεί να ενσωματώσει πολύ μεγάλο μέγεθος ξένου DNA (30kb), δεν ενσωματώνεται στο γονιδίωμα (όπως και οι αδενοιοί) και διατηρείται σε λανθάνουσα μορφή για μεγάλο χρονικό διάστημα σε νευρωνικά κύτταρα (1, 18). Εκτός από τους παραπάνω, μελετούνται και άλλοι ιοί ως πιθανοί ιϊκοί φορείς γονιδιακής θεραπείας όπως είναι ο ιός της δαμαλίτιδας και ο ιός της γρίπης (1). 1.2.2: Μη ιϊκοί φορείς: Οι μη ιϊκοί φορείς μεταφέρουν γενετικό υλικό μέσα στα κύτταρα χωρίς την ύπαρξη μολυσματικών, ανασυνδυασμένων, ιικών σωματιδίων. Η μεταφορά του DNA στα κύτταρα των θηλαστικών σε αυτές τις περιπτώσεις μπορεί να επιτευχθεί ως εξής με χημικές διαδικασίες: Με τη διαδικασία calcium phosphate transfection όπου έχουμε σχηματισμό συμπλόκου μεταξύ φωσφορικού ασβεστίου και DNA το οποίο καθιζάνει στα κύτταρα και απορροφάται από τη μεμβράνη με ενδοκύττωση (19). Με τη διαδικασία DEAE-Dextran transfection όπου το DEAE-Dextran είναι ένα κατιονικό πολυμερές που επενδύει το DNA, το προστατεύει από τη δράση νουκλεασών και διευκολύνει την εισαγωγή του στα κύτταρα (20). Σε άλλες περιπτώσεις, χρησιμοποιούνται φυσικές διαδικασίες όπως: Η ηλεκτροδιάτρηση (electroporation) όπου μέσω της χρήσης ηλεκτρικού παλμού ανοίγουν παροδικά οπές στην κυτταρική μεμβράνη, εισέρχεται στο κύτταρο το μεταφερόμενο DNA και ακολουθεί επιδιόρθωση της κυτταρικής μεμβράνης στο σημείο της εισόδου (1, 21). 9

Η χρήση στερεών σωματιδίων (biolistics) όπου έχουμε εισαγωγή του γενετικού υλικού μέσω βομβαρδισμού των κυττάρων με σωματίδια περιβλημένα με το μεταφερόμενο DNA (22). Κυρίως όμως η μεταφορά του γενετικού υλικού γίνεται με τη χρήση των λιποσωμάτων, τα οποία σχηματίζουν σύμπλοκα με το DNA, παρά το γεγονός ότι έχουν μικρό όγκο στο εσωτερικό τους. Έχουν αναπτυχθεί λιποσώματα με βάση λιπίδια που φέρουν θετικό φορτίο στην υδρόφιλη κεφαλή τους έτσι ώστε αυτά να αντιδρούν πιο αποτελεσματικά με το αρνητικά φορτισμένο DNA και να το διευκολύνουν έτσι κατά τη μεταφορά του στο εσωτερικό του κυττάρου (1, 23). Στην κατηγορία των μη ιϊκών φορέων ανήκουν και οι επισωματικοί αυτόαναπαραγώμενοι φορείς που χρησιμοποιούν ορισμένα μόνο τμήματα του γενετικού υλικού των ιών και παρουσιάζονται αναλυτικά παρακάτω, διότι χρησιμοποιούνται στην εργασία αυτή (παράγραφος 1.4 της εισαγωγής). 1.2.3: Γονιδιακή θεραπεία εφαρμοζόμενη σε διάφορες ασθένειες Η γονιδιακή θεραπεία μπορεί να εφαρμοστεί σε διάφορες ασθένειες που αφορούν τόσο κληρονομούμενα νοσήματα (επικρατείς ή υπολειπόμενες μεταλλάξεις), διάφορες μεταβολικές διαταραχές όσο και στην αντιμετώπιση του καρκίνου. Παρακάτω αναπτύσσονται αναλυτικά οι διάφορες προσεγγίσεις γονιδιακής θεραπείας: Αντικατάσταση του γονιδίου ή προσθήκη του ( gene addition, gene replacement, gene augmentation ). Αφορά προσθήκη του φυσιολογικού γονιδίου στα κύτταρα πάσχοντος σε περιπτώσεις υπολειπόμενων μονογονιδιακών ασθενειών, ενώ είναι παρόν και το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (24, 1). Αναστολή της έκφρασης ενός γονιδίου που προκαλεί ασθένεια ( gene knock down ) και που εκφράζεται στο κύτταρο-στόχο π.χ ογκογονίδιο. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί είτε με χρήση ριβοένζυμων 10

(25) που μπορούν να τροποποιηθούν κατάλληλα ώστε να κόβουν σε μια ειδική αλληλουχία και με τον τρόπο αυτό να αδρανοποιούν ένα mrna στόχο είτε με sirnas (small interfering RNAs) (26, 27) είτε με Antisence DNA (ολιγονουκλεοτίδια συμπληρωματικού νοήματος) (28) είτε με τη χρήση morpholinos (29) που μπλοκάρουν συγκεκριμένες περιοχές αλληλεπίδρασης άλλων μορίων με το RNA. Έκφραση μιας τοξίνης στο κύτταρο-στόχο, που συχνά είναι καρκινικό κύτταρο. Τέτοιο παράδειγμα αποτελεί η θυμιδιλική κινάση (thymidine kinase, TK) του ιού του απλού έρπητα που μετατρέπει το συνήθως μη τοξικό φάρμακο ganciglovir σε τοξική ουσία για τα κύτταρα των θηλαστικών. Άρα, η μεταφορά του γονιδίου θυμιδιλικής κινάσης σε ένα καρκινικό κύτταρο το καθιστά ευαίσθητο σε επακόλουθη χρήση ganciglovir (30, 31). Έχει αναπτυχθεί η εφαρμογή γονιδιακής θεραπείας με διόρθωση µεταλλάξεων µέσω τροποποίησης του γονοτύπου (genome editing). Πρόκειται για νεότερη προσέγγιση και αφορά τη μεταφορά γονιδίων νουκλεασών µε δοµή δακτύλων ψευδαργύρου (ZFNs) που οδηγούν σε στοχευµένη θραύση της αλυσίδας του DNA στη θέση της µετάλλαξης. Πρόκειται για μια μέθοδο που έχει κύρια εφαρμογή σε περιπτώσεις μονογονιδιακών ασθενειών (32). Επίσης μια νεότερη προσέγγιση γονιδιακής θεραπείας αφορά στην ανάπτυξη τεχνητού µεταγραφικού παράγοντα, στοχευµένου προς συγκεκριµένη περιοχή του DNA (υποκινητή γονιδίου) στα κατάλληλα κύτταρα με συνέπεια την ενεργοποίηση ενός συγκεκριμένου γονιδίου, για θεραπευτικούς σκοπούς (33). Γενικότερα, η κάθε στρατηγική γονιδιακής θεραπείας εξαρτάται από τη φύση της ασθένειας που προσπαθεί να αντιμετωπίσει. 11

1.2.4 Κλινικές δοκιμασίες γονιδιακής θεραπείας Παρακάτω υπάρχουν διάφορα παραδείγµατα ασθενειών στις οποίες έχουν γίνει κλινικές δοκιµές, από το: Journal of Gene Medicine Clinical Trial Database:http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical Μονογονιδιακές ασθένειες, Κυστική ίνωση, SCID, Αιμοφιλία Α και Β, Σύνδρομο Hurler, Σύνδρομο Hunter, Χορεία Huntington, Μυική Δυστροφία Duchenne, Ασθένεια Canavan, Χρόνια κοκκιωματώδης ασθένεια, Οικογενής Υπερχοληστεραιμία, Ασθένεια Gaucher, Αναιμία Fanconi, Ανεπάρκεια Πουρινικής νουκλεοσιδικής φωσφορυλάσης, Ανεπάρκεια Τρανσκαρβαμουλάσης της Ορνιθίνης, Εpidermolysis Βullosa Καρκίνος: Γυναικολογικά: μαστός, ωοθήκες, Νευρικό σύστημα: γλοιοβλάστωμα, γλοίωμα, αστροκύττωμα, νευροβλάστωμα, Γαστροεντερικά: κόλον, ηπατικές μεταστάσεις, μετα-ηπατιτιδικός καρκίνος του ήπατος, Ουροποιητικό- Γεννητικό σύστημα: προστάτης, νεφρά, Δέρμα: μελάνωμα, Κεφαλή και Λαιμός, Πνεύμονες: αδενοκαρκίνωμα, Μεσοθηλίωμα, Αιματολογικά: λευχαιμία, λέμφωμα Μυέλωμα, Σάρκωμα, Καρκίνος γεννητικών κυττάρων 1.3: Προβλήματα φορέων γονιδιακής θεραπείας Σε σοβαρά προβλήματα πρέπει να βρεθεί λύση για να γίνει η γονιδιακή θεραπεία ένας αποτελεσματικός τρόπος θεραπείας. Πρώτο και πιο συχνό πρόβλημα αποτελεί η βραχύβια φύση της γονιδιακής θεραπείας όπου δεν έχει βρεθεί ακόμα τρόπος ώστε το εισαχθέν DNA στα κύτταρα-δέκτες να παραμένει λειτουργικό στον πυρήνα για πολλά χρόνια επιτυγχάνοντας σταθερότητα και μακροβιότητα. Έτσι οι ασθενείς θα χρειάζονται επαναλαμβανόμενους κύκλους γονιδιακής θεραπείας. Δεύτερο και εξίσου συχνό πρόβλημα αποτελεί το ενδεχόμενο της ανοσο-απάντησης (immune 12

response) όπου το μεταφερόμενο DNA μπορεί να ενεργοποιήσει το ανοσοποιητικό σύστημα και να μειώσει έτσι την αποδοχή της γονιδιακής θεραπείας, κάτι που δυσκολεύει και την πιθανή επανάληψη γονιδιακής θεραπείας στον ίδιο ασθενή εφόσον αποτύχει η πρώτη (34, 1). Ειδικότερα, σημαντικά προβλήματα υπάρχουν κατά τη χρήση ιϊκών συστημάτων όπου παρότι αυτά έχουν επιλεγεί σε πολλές περιπτώσεις γονιδιακής θεραπείας, παρουσιάζουν διάφορα προβλήματα για τον ασθενή, όπως τοξικότητα, μεταλλαξιγένεση λόγω της ενσωμάτωσης σε τυχαίες θέσεις του χρωμοσωμικού DNA του κυττάρου-στόχου (5), αποσιώπηση της έκφρασης του εξωγενούς γονιδίου λόγω αλλαγών στη δομή της χρωματίνης, ακόμα και η πιθανότητα ενεργοποίησης του ίδιου του ιού που χρησιμοποιείται ως όχημα και η πρόκληση ογκογένεσης. Τέλος με τη χρήση γονιδιακής θεραπείας δεν μπορούν να αντιμετωπιστούν πολυγονιδιακές και πολυπαραγοντικές ασθένειες διότι προκαλούνται αυτές από το συνδυασμό πολλών γονιδίων (34, 1). 1.4 Αυτο-αναπαραγόμενοι επισωματικοί φορείς (Replicating Episomal Vectors, REV) Στην κατηγορία των μη ιικών φορέων γονιδιακής μεταφοράς ανήκουν και οι επισωματικοί αυτο-αναπαραγόμενοι φορείς που βασίζονται σε ιούς χρησιμοποιώντας όμως μόνο ορισμένα τμήματα του γενετικού υλικού αυτών. Διάφοροι DNA ιοί αναπαράγονται επισωματικά σε κύτταρα θηλαστικών, όπως ο SV40, o EBV ή BPV εκμεταλευόμενοι και το μηχανισμό αντιγραφής των κυττάρων-ξενιστών σε συνδυασμό με τους trans-acting ιικούς παράγοντες. Οι επισωματικοί αυτο-αναπαραγόμενοι φορείς (Replicating Episomal Vectors, REV) έχουν την ιδιότητα πέρα από το να αναπαράγονται παραμένοντας επισωματικά, να παραμένουν επί μακρό χρονικό διάστημα στα κύτταρα χωρίς ενσωμάτωση στο γονιδιωματικό DNA του κυττάρου, επιτυγχάνοντας γονιδιακή έκφραση τόσο σε εμβρυονικά κύτταρα ανθρώπου, όσο και σε καθιερωμένες κυτταρικές σειρές ποντικών (35). 13

Με τη χρήση των επισωματικών αυτό-αναπαραγόμενων φορέων αποφεύγεται το φαινόμενο της in vitro μεταλλαξιγένεσης (insertional mutagenesis) όπως συμβαίνει με τα ιικά οχήματα. Επιπλέον με αυτά μπορούν να μεταφερθούν μεγάλα τμήματα DNA μέχρι και 300kb (36) και η έκφραση των οποίων θα εξαρτάται μόνο από το σύστοιχο υποκινητή τους που έχει μεταφερθεί στο όχημα και όχι από το χρωματινικό περιβάλλον, με αποτέλεσμα η έκφρασή τους να είναι ρυθμιζόμενη (36). Έτσι παρέχουν μεγαλύτερη ασφάλεια και διευκολύνουν τους ερευνητές περισσότερο από τεχνικής πλευράς. Ωστόσο, δεν έχουν ανεπτυγμένη τη δυνατότητα κυτταρικής στόχευσης, έχουν χαμηλότερη απόδοση της διαδικασίας διαμόλυνσης των κυττάρωνστόχων (transfection efficiency) και μικρότερη διάρκεια διατήρησης του επισώματος στον πυρήνα του ξενιστικού κυττάρου σε σχέση με ιϊκά οχήματα μεταφοράς. 1.5 Το επισωματικό όχημα pcdna3- Zif- VP64 To πρώτο επισωματικό όχημα που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία και βασίζεται στον ιό SV40, αναφέρεται ως pcdna3- Zif- VP64 (σχήμα 1.2) και αναπτύχθηκε από την ερευνητική ομάδα του Carlos F. Barbas III (33). Η προσέγγιση αυτή αφορά στην ανάπτυξη τεχνητού µεταγραφικού παράγοντα, στοχευµένου προς συγκεκριµένη περιοχή του DNA (υποκινητή γονιδίου) στα κατάλληλα κύτταρα με συνέπεια την ενεργοποίηση του εν λόγω γονιδίου, για θεραπευτικούς σκοπούς. Τέτοια είναι η περίπτωση της ανάπτυξης τεχνητού µεταγραφικού παράγοντα για την ενεργοποίηση in trans του γονιδίου της γ σφαιρίνης µε σκοπό τη γονιδιακή θεραπεία της β θαλασσαιµίας και της δρεπανοκυτταρικής αναιµίας. Tο συγκεκριμένο όχημα περιέχει την αφετηρία αντιγραφής SV40ori, γονίδιο ανθεκτικότητας στην αμπικιλλίνη και τον τεχνητό μεταγραφικό παράγοντα για την ενεργοποίηση in trans του γονιδίου της γ σφαιρίνης: Zif- VP64 όπου αποτελείται από την gg1 DNA binding domain περιοχή και την περιοχή του ενισχυτή του VP64, υπό τον υποκινητή pcmv (33). 14

gg1 VP64 Σχήμα 1.2: Το επισωματικό όχημα pcdna3- Zif- VP64 Ο συγκεκριμένος τεχνητός μεταγραφικός παράγοντας έχει ως στόχο πρόσδεσης την θέση περίπου γύρω από την -117 περιοχή του υποκινητή του Αγ-γονιδίου. Η θέση -117 του Αγ γονιδίου είναι μια μετάλλαξη που οδηγεί σε σύνδρομο κληρονομικής παραμονής της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HPFH). Όπως φαίνεται και στο σχήμα 1.3 η gg1 DBD (DNA Binding Domain) επιλέχθηκε ως πιο αποτελεσματική για την πρόσδεση στο DNA και την ενεργοποίηση του ανθρωπίνου γ-γονιδίου σε σχέση με τις gg2 και gg3. Επίσης στο σχήμα φαίνεται και η αλυσίδα του DNA στην οποία προσδένεται και άρα η κατέυθυνση πρόσδεσης της αντίδρασης. H δράση του καταδείχθηκε από την ερευνητική ομάδα του Carlos F. Barbas III το 2004 (33) που κατασκεύασε το συγκεκριμένο μεταγραφικό παράγοντα. Δείχθηκε ότι πράγματι ενισχύεται η παραγωγή της γ-σφαιρίνης και άρα της HbF (α2γ2 αλυσίδες) με διαμολύνσεις με το φορέα pcdna3- Zif- VP64 σε ανθρώπινα κύτταρα ερυθρολευχαιμικής σειράς Κ562. Παρατηρήθηκε 16 φορές μεγαλύτερη παραγωγή της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης HbF σε σχέση με μη διαμολυσμένα με το φορέα Κ562 κύτταρα. Ωστόσο, δεν έχει αποδειχθεί ακόμα το αν ο συγκεκριμένος τεχνητός μεταγραφικός παράγοντας 15

προσδένεται και κάπου αλλού στη χρωματίνη πέρα από τη θέση -117 του υποκινητή του γ-γονιδίου. DNA Σχήμα 1.3: Η -117 περιοχή του υποκινητή του γ-γονιδίου όπου προσδένεται η gg1 DBD του τεχνητού Zinc Finger καθώς και η αλληλουχία της 1.6 Το επισωματικό όχημα pepi-egfp To δεύτερο επισωματικό όχημα που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία και βασίζεται στον ιό SV40, αναφέρεται ως pepi-egfp (σχήμα 1.4) και περιέχει την αφετηρία αντιγραφής SV40ori, γονίδιο ανθεκτικότητας στην καναμυκίνη, και την μεταγραφική κασέττα: υποκινητής pcmv, γονίδιο της egfp (Enhanced Green Fluorescent Protein) και μια αλληλουχία S/MAR (Scaffold/ Matrix Attached Region), που προέρχεται από το 5 άκρο του ανθρώπινου γονιδίου της ιντερφερόνης β ώστε το S/MAR να μεταγράφεται (37, 21) (αναλυτικότερα για το S/MAR στην παράγραφο 1.6.1). 16

pcmv egfp pepi-egfp 6767 bp S/MAR Σχήμα 1.4: Το επισωματικό όχημα pepi-egfρ 1.6.1 S/MAR(scaffold/matrix attachment region) Τα S/MARs (scaffold/matrix attachment regions) είναι εκείνες οι DNA περιοχές, μεγέθους από 300 εώς μερικές χιλιάδες βάσεις, που εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση με την πυρηνική θεμέλια ουσία. Είναι πλούσιες κατά 70% σε αλληλουχίες με αδενίνη και θυμίνη. Μέσω των S/MAR αλληλουχιών προσδένεται η χρωματίνη στον πυρηνικό σκελετό. Επιπλέον, παίζουν ρόλο στο σχηματισμό της ίνας χρωματίνης των 30 nm, ενώ οι αλληλουχίες S/MARs>1 kb διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη σωστή πυρηνική λειτουργία (37). Βάση των διαφόρων πειραματικών δεδομένων, τα S/MARs φαίνεται ότι παίζουν ρόλο στη µεταγραφική ενίσχυση με ή χωρίς την ανάγκη παρουσίας ενισχυτών, ενώ διαθέτουν μονωτική δραστηρότητα (insulators), δηλαδή την ικανότητα να εμποδίζουν την αλληλεπίδραση μεταξύ του ενισχυτή και του υποκινητή in vivo, καθορίζοντας τα όρια μεταξύ αυτόνομων χρωματινικών περιοχών. Γενικότερα, οι S/MAR περιοχές παίζουν έναν πολύ σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της δομής και της λειτουργίας των χρωμοσωμάτων στα ευκαρυωτικά κύτταρα. 17

Η πρώτη πειραματική απόδειξη για τη δυνατότητα επισωματικής κατάστασης που προσδίνει το S/MAR είναι η διατήρηση του pepi-1 σε επισωματική κατάσταση σε κύτταρα ποντικού (CHO κύτταρα), για περισσότερες από 100 γενιές και χωρίς τη χρήση του μέσου επιλογής (38). Στο συγκεκριμένο όχημα έγινε αντικατάσταση του γονιδίου του µεγάλου Τ- αντιγόνου του SV40 µε την αλληλουχία S/MAR που προέρχεται από το 5 άκρο του ανθρώπινου γονιδίου της ιντερφερόνης β (38). Το S/MAR στη περίπτωση του pepi-1 φαίνεται στρατολογεί παράγοντες όπως ο παράγοντας hnrnp-u SAF-A (Scaffold Attachment Factor-A) (39), οπότε προσκολλάται σε αυτή την πρωτείνη της πυρηνικής θεμέλιας ουσίας in vivo και επιτυγχάνεται μιτωτική σταθερότητα. Επιπλέον, μπορεί να στρατολογεί και άλλους πυρηνικούς παράγοντες όπως τοποισομεράση ΙΙ (40) ή λαμίνη Β1 (41) που οδηγούν σε ξετύλιγμα της διπλής έλικας του DNA προκειμένου να συγκροτηθεί η αντιγραφική μηχανή στην αφετηρία αντιγραφής. Μάλιστα, μια σημαντική παρατήρηση αποτελεί πως όταν αφαιρεθεί το S/MAR, το όχημα ενσωματώνεται µε τυχαίο τρόπο στο γονιδίωµα. Το pepi-1 µε ήπια τροποποίηση (egfp enhanced GFP αντί της GFP) οδήγησε στη δημιουργία του pepi-egfp, όπου αποτέλεσε και την πρώτη γονιδιακή µεταφορά σε αιµοποιητικά προγονικά κύτταρα ανθρώπου µε επισωµατικό όχηµα βασισµένο σε στοιχείο S/MAR (21). 1.7 Το επισωματικό όχημα Zif- VP64- ΕΡ1 To τρίτο επισωματικό όχημα που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία είναι το Zif- VP64-ΕΡ1 (σχήμα 1.5) με βάση το επισωματικό όχημα pcdna3- Zif- VP64 όπου σε αυτό έχει προστεθεί η μεταγραφική κασέττα pcmv-egfρ- S/MAR (4kb) που προέρχεται από το επισωματικό όχημα pepi-egfρ προκειμένου να μπορεί να παρακολουθηθεί η πορεία του μέσα στα Κ562 κύτταρα μέσω της έκφρασης της egfρ και παράλληλα να του προσδοθούν οι δυνατότητες διατήρησης της επισωματικής του κατάστασης μέσω του S/MAR. 18

pcmv Zif VP64 Zif- VP64- EP1 10446 bp S/MAR pcmv egfp Σχήμα 1.5: Το επισωματικό όχημα Zif- VP64- ΕΡ1 1.8 Ο υποκινητής του Spleen focus-forming virus (psffv) Ο εντοπισμός του ρετροιού Spleen focus-forming virus (SFFV) έγινε μέσω εμπλοκής σε οξεία ερυθρολευχαιμία ποντικών. Ανάλυσή του έδειξε ότι ο psffv ευθύνεται για την οξεία ερυθρολευχαιμία εξαιτίας της μοναδικής γλυκοπρωτείνης gp55 του πρωτεινικού του φακέλου. Στη συνέχεια, παρατηρήθηκε ότι παρότι προσβάλλει πολλούς διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους, απορύθμιση προκαλεί μόνο στα ερυθροειδικά κύτταρα επειδή η gp55 γλυκοπρωτείνη αλληλεπιδρά με το σύμπλεγμα του EpoR υποδοχέα και με τον υποδοχέα κινάσης τυροσίνης sf- Stk,οδηγώντας σε ενεργοποίηση της κινάσης και ακολούθως σε ενεργοποίηση και των υπολοίπων σηματοδοτικών μορίων του συγκεκριμένου μονοπατιού. Επίσης, έχει αποδειχτεί (42) ότι η χρήση του psffv, υποστηρίζει την υψηλότερη έκφραση,σε σχέση με άλλους υποκινητές, σε ινοβλάστες και CD34+ κύτταρα όταν χρησιμοποιήθηκε για έλεγχο του γονιδίου της egfp. Στην παρούσα εργασία, ο υποκινητής psffv περιέχεται σε κυκλικό όχημα με μέγεθος 6568kb το οποίο φέρει την ονομασία pepi-sffv, κατασκευάστηκε 19

στο εργαστήριο της κυρίας καθηγήτριας Αγλαίας Αθανασσιάδου με αντικατάσταση του υποκινητή pcmv στο επισωματικό όχημα pepi-egfp από τον υποκινητή psffv και φαίνεται χαρακτηριστικά στο σχήμα 1.6 (43). psffv egfp pepi-sffv 6568 bp S/MAR Σχήμα 1.6: Το επισωματικό όχημα pepi-sffv 1.9 Ο υποκινητής pef1- HTLV σύνθεση δύο στοιχείων: του υποκινητή του Elongation Factor και του ενισχυτή του HTLV Ο υποκινητής pef1- HTLV αποτελεί σύνθεση δύο στοιχείων: του υποκινητή του Elongation Factor (EF1-a) και του ενισχυτή του HTLV (Human T-lymphotropic virus) και παρουσιάζει εξαιρετικό ερευνητικό ενδιαφέρον στο κατά πόσο θα ενίσχυε την έκφραση ενός γονιδίου που ενδιαφέρει στα Κ562 κύτταρα και MEL αρχικά και στη συνέχεια σε ινοβλάστες και CD34+ κύτταρα. Στην παρούσα εργασία, ο υποκινητής pef1- HTLV περιέχεται σε κυκλικό όχημα με μέγεθος 6854kb το οποίο φέρει την ονομασία pepi- EF1/HTLV,κατασκευάστηκε με αντικατάσταση του υποκινητή pcmv στο 20

pef1/htlv επισωματικό όχημα pepi-egfp από τον υποκινητή pef1- HTLV και φαίνεται χαρακτηριστικά στο σχήμα 1.7 (43). egfp pepi-ef1/htlv 6854 bp S/MAR Σχήμα 1.7: Το επισωματικό όχημα pepi-ef1/ HTLV 1.10 Αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (Hematopoietic Stem Cells, HSC) Η διαμόλυνση των HSC (αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων) αποτελεί ζωτικής σημασίας στάδιο στην ανάπτυξη συστημάτων γονιδιακής θεραπείας για τις αιμοσφαιρινοπάθειες. Ο λόγος που κύριο στόχο γονιδιακής θεραπείας αποτελούν τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (CD34+) είναι ότι είναι πολυδύναμα (από τα αρχέγονα αιμοποιητικα κύτταρα προέρχονται τα ώριμα κύτταρα όλων των αιμοποιητικών σειρών) (Εικόνα 1.5), αυτοαναπαράγονται και μπορούν να αποκαταστήσουν ολόκληρο το αιμοποιητικό σύστημα μόνιμα, εφόσον τροποποιηθούν γενετικά και το μεταφερόμενο γονίδιο επιτυγχάνει φυσιολογική έκφραση σε αυτά (44). Οι μη ιϊκοί φορείς γονιδιακής μεταφοράς σε πρωτόκολλα γονιδιακής θεραπέιας σε HSC (CD34+ κύτταρα) είναι πολύ σημαντικοί εξαιτίας της 21

μεγαλύτερης ασφάλειας τους, παρότι ερευνητικά έχουν χρησιμοποιηθεί κυρίως ιϊκοί φορείς εξαιτίας της μεγαλύτερης διαμολυσματικής ικανότητάς τους. Ωστόσο έχουν διενεργηθεί (21) και αναμένεται να διενεργηθούν διάφορες προσπάθειες για μεταφορά γονιδίων σε ανθρώπινα CD34+ κύτταρα και με αυτοαναπαραγόμενους επισωματικούς φορείς, με πολλές πιθανότητες επιτυχίας. Λεμφικό πρόδρομο κύτταρο T- λεμφοκύτταρο ΝΚ λεμφοκύτταρο Πολυδύναμο πρόδρομο κύτταρο Β- λεμφοκύτταρο Πλασματοκύτταρο Ερυθροκύτταρο Μεγακαρυοκύτταρο Μυελικό πρόδρομο κύτταρο Μονοκύτταρο Αιμοπετάλιο Μακροφάγο Εικόνα 1.5: Τα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα δίνουν γένεση στα ώριμα κύτταρα όλων των αιμοποιητικών σειρών (www.biology.arizona.edu) 1.11 ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ- ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ 1.11.1 Έκφραση των γονιδίων των αιμοσφαιρινών Κατά τη διάρκεια της ζωής του ανθρώπου δεν παρατηρείται σύνθεση όλων των σφαιρινικών αλυσίδων. Η αιμοσφαιρίνη που παράγεται καθορίζεται από την ηλικία του ανθρώπου. 22

Κατά τους τρεις πρώτους μήνες της ζωής του εμβρύου εκφράζονται τα ε-γονίδιο από την οικογένεια των γονιδίων β-σφαιρίνης και ζ-γονίδιο από την οικογένεια των γονιδίων α-σφαιρίνης, οδηγώντας στη σύνθεση των εμβρυονικών αιμοσφαιρινών Hb Gower 1(ζ 2 ε 2 ) και Hb Gower 2(α 2 ε 2 ). Μια μικρή αύξηση της έκφρασης των γ-γονιδίων, οδηγεί στην εμβρυονική αιμοσφαιρίνη Hb Portland (ζ 2 γ 2 ) (45, 1). Αυτές οι αιμοσφαιρίνες που συναντάμε τους τρείς πρώτους μήνες της εμβρυικής ζωής, ονομάζονται πρωτοεμβρυικές. Μετά τον τρίτο μήνα της εμβρυικής ζωής, τα γ-γονίδια εκφράζονται σε υψηλές ποσότητες και παράγουν Hb F τετραμερή(α 2 γ 2 ) με αναλογία Gγ/Αγ:7/3. Το εβρυικό αίμα, πέρα από τις αιμοσφαιρίνες α 2 Αγ 2 και α 2 Gγ 2, περιέχει ακόμα την HbF 1(10-15%) που προέρχεται από την HbF με ακετυλίωση της αμινοτελικής γλυκίνης της γ-αλυσίδας. Κατά τον όγδοο μήνα της κυοφορίας, η έκφραση των β-γονιδίων αυξάνεται σε μεγάλο βαθμό και αυτή των γ-γονιδίων σχεδόν καταστέλλεται. Η μεταστροφή από την εμβρυική στην ενήλικη αιμοσφαιρίνη, συμβαίνει μετά την γέννηση. Κατά την ενήλικη ζωή, τα β-γονίδια εκφράζονται σε υψηλές ποσότητες(περίπου 97% της ολικής αιμοσφαιρίνης είναι η HbA), ενώ η έκφραση των γ-γονιδίων είναι ελάχιστη(1%) με αναλογία Gγ/Αγ:2/3. Τέλος, η δ-αλυσίδα αρχίζει να παράγεται μετά τη γέννηση του εμβρύου και η σύνθεσή της εξακολουθεί και στον ενήλικα, αλλά σε μικρά ποσά. Έτσι, η HbA 2 (α 2 δ 2 ) αποτελεί ένα μικρό ποσοστό, περίπου 2,5-3% της αιμοσφαιρίνης του ενηλίκου. Τα ερυθροκύτταρα ενηλίκου περιέχουν αιμοσφαιρίνη Α:97%, Α 2 :2,5% και HbF:0,003-0,7% (45, 1). 1.11.2 Γενικά- Αιμοσφαιρινοπάθειες-Μεσογειακή αναιμία Οι αιμοσφαιρινοπάθειες προκαλούνται από μια ποικιλία μεταλλάξεων που επηρεάζουν ένα γονίδιο αιμοσφαιρίνης κάθε φορά. Οι πιο κοινές περιπτώσεις είναι οι αντικαταστάσεις αμινοξέων που αλλάζουν το ηλεκτρικό φορτίο του μορίου, ωστόσο υπάρχουν και περιπτώσεις όπου συνοδεύονται από 23

σημαντικές αλλαγές στη φυσικοχημική λειτουργικότητα του μορίου. Τέτοιες περιπτώσεις είναι:α) αιμοσφαιρίνη S-αντικατάσταση γλουταμινικού οξέος από βαλίνη στο κωδικόνιο 6, β)αιμοσφαιρίνη C-αντικατάσταση γλουταμινικού οξέος από λυσίνη στο κωδικόνιο 6, γ)αιμοσφαιρίνη Ε-αντικατάσταση γλουταμινικού οξέος από λυσίνη στο κωδικόνιο 26. Οι κυριότερες κατηγορίες αιμοσφαιρινοπαθειών είναι: 1) αιμολυτικές αναιμίες, που οφείλονται σε ασταθείς αιμοσφαιρίνες, 2) ερυθροκυττάρωση, που οφείλεται σε ανώμαλη συγγένεια με το οξυγόνο, 3) μεθαιμοσφαιριναιμία, που οφείλεται στη γρήγορη οξείδωση της αιμοσφαιρίνης, 4) δρεπανοκυτταρικές διαταραχές, που οφείλονται σε διαταραχές της μεμβράνης του ερυθροκυττάρου από την HbS. Με τον όρο μεσογειακή αναιμία (θαλασσαιμία) ονομάζουμε ένα σύνολο κληρονομικών αναιμιών, που χαρακτηρίζονται από μειωμένη παραγωγή κάποιας από τις αλυσίδες των αιμοσφαιρινών. Περιλαμβάνουν βλάβες που αφορούν όλες τις αλυσίδες, ωστόσο κλινικό ενδιαφέρον παρουσιάζουν μόνο οι περιπτώσεις που αφορούν τις α και β αλυσίδες, οι οποίες συνθέτουν την κύρια αιμοσφαιρίνη HbA. Η μεσογειακή αναιμία είναι γενετική νόσος και ακολουθεί Μεντελικό τρόπο κληρονόμησης, ενώ η σοβαρότητα της κλινικής εικόνας πολλές φορές εξαρτάται όχι τόσο από την έλλειψη μιας αλυσίδας όσο από την περίσσεια της άλλης, δηλαδή από τη διαταραχή της ισορροπίας παραγωγής αιμοσφαιρινικών υπομονάδων (45). 1.11.3 β- Μεσογειακή αναιμία Οι β-θαλασσαιμίες είναι γενετικά σύνδρομα που χαρακτηρίζονται από ελαττωμένη παραγωγή β-αλυσίδων ή πλήρη έλλειψή των. Το σύμπλεγμα των β-σφαιρινικών γονιδίων εδράζεται στο χρωμόσωμα 11. Έχουμε τους φορείς της β-θαλασσαιμίας (ελάσσων β-θαλασσαιμία), όπου το ένα από τα δύο γονίδια είναι αλώβητο, ενώ η βλάβη στο χρωμόσωμα που εδράζεται το β- 24

γονίδιο του ομόλογου χρωμοσώματος διακρίνεται σε δύο τύπους: α) β0 με πλήρη έλλειψη σύνθεσης β-αλυσίδας και β) β+ με ελαττωμένη σύνθεση β- αλυσίδας. Πρόκειται για άτομα-φορείς με ετερόζυγη κατάσταση β/β+ ή β/β0, όπου είναι συνήθως ασυμπτωματική κατάσταση και μόνο η κύηση ή κάποιες λοιμώξεις μπορεί να προκαλέσουν εμφάνιση αναιμίας. Τα άτομα με ομόζυγη β-θαλασσαιμία (μείζων β-θαλασσαιμία) εμφανίζουν βαριά αναιμία. Η πλήρης έλλειψη και υποπαραγωγή των β- αλυσίδων οδηγεί σε περίσσεια α-αλυσίδων που σχηματίζουν ομοτεραμερή α4 τα οποία μετακινούνται και καθιζάνουν πάνω στη μεμβράνη του ερυθροκυττάρου, επιταχύνοντας την καταστροφή του. Έτσι προκαλείται αιμολυτική αναιμία. Στην ομόζυγη αναιμία τύπου β0/β0, οι αιμοσφαιρίνες που βρίσκουμε στο αίμα είναι η HbF και HbA2, ενώ σε αυτή του τύπου β+/β+ βρίσκουμε και HbA και το ίδιο συμβαίνει και στους διπλούς ετεροζυγώτες β+/β0 (45, 1). Τρίτον, υπάρχει και η ενδιάμεση β-θαλασσαιμία (intermedia), ένας όρος που χρησιμοποιείται κλινικά για τα άτομα που είναι σε σημαντικό βαθμό αναιμικά και έχουν συμπτώματα αλλά δε χρειάζονται μετάγγιση (46, 1). Τέλος, σε σπάνιες περιπτώσεις, η έλλειψη μπορεί να αφορά και το δ-γονίδιο(δβ θαλασσαιμία), ενώ στην ομόζυγο μορφή δ 0 β 0 σε μεγάλο ποσοστό η αιμοσφαιρίνη που βρίσκουμε στο αίμα είναι η HbF (46). Από τα παραπάνω μπορούμε να συμπεράνουμε ότι στη β-θαλασσαιμία οι προοπτικές της γονιδιακής θεραπείας προσανατολίζονται στις εξής κατευθύνσεις: Στο να γίνει προσθήκη του φυσιολογικού β-γονιδίου σε άτομα που πάσχουν από μείζονα β-θαλασσαιμία. Πρόκειται για πρωτόκολλο γονιδιακής θεραπείας που αφορά τη μεταφορά του φυσιολογικού β- γονιδίου σε αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα. Προς αυτή την κατεύθυνση έχουν γίνει σχεδόν όλες οι προσπάθειες για γονιδιακή θεραπεία στη β-μεσογειακή αναιμία. Από μελέτες που έγιναν, δείχθηκε πως η ενσωμάτωση ολόκληρου του ανθρώπινου β- γονιδίου με τον υποκινητή του και τους ενισχυτές του σε ιϊκό φορέα δε δύναται να επάγει γονιδιακή έκφραση με θεραπευτικά αποτελέσματα σε ποντίκια. Σε αυτές τις περιπτώσεις η γονιδιακή έκφραση ήταν χαμηλή (< 1% από την έκφραση του ενδογενούς β-γονιδίου). 25

Περαιτέρω μελέτες σε διαγονιδιακά ποντίκια κατέδειξαν πως απαιτείται και η ενσωμάτωση του locus control region (LCR) του β-γονιδίου στους ιϊκούς φορείς, προκειμένου να επιτευχθεί υψηλότερη γονιδιακή έκφραση. Σταθμό για τη γονιδιακή θεραπεία για την αντιμετώπιση της β- θαλασσαιμίας, αποτέλεσαν οι έρευνες που έκανε ερευνητική ομάδα του Sadelain το 2002 (47) σε διαγονιδιακά ποντίκια. Η συγκεκριμένη ερευνητική ομάδα κατασκεύασε ένα lenti-ιϊκό φορέα: TNS9, στον οποίο κλωνοποιήθηκε ένα μεγάλο τμήμα του β-γονιδίου που περιλαμβανε την περιοχή του υποκινητή από τη θέση -618 μέχρι την +2484, τον ενισχυτή που βρίσκεται στο 3 άκρο του β-γονιδίου, σε συνδυασμό με συγκεκριμένα τμήματα από τις HS2 (840bp), HS3 (1308bp) και HS4 (1069bp) περιοχές του ανθρώπινου LCR του β-γονιδίου. Ο συγκεκριμένος φορέας ενσωματώθηκε σε HSCs (αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα) ποντικού και οδήγησε σε αυξημένη έκφραση του β-γονιδίου που έφτασε μέχρι και 16% της έκφρασης του ενδογενούς β- γονιδίου (47). Στο να γίνει ενεργοποίηση του γ-γονιδίου εξαιτίας του ότι παρατηρείται το σύνδρομο HPFH σε ενηλίκους(κληρονομική παραμονή εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης), μια κλινική κατάσταση που χαρακτηρίζεται από υψηλά επίπεδα της αιμοσφαιρίνης F σε άτομα που πάσχουν από ενδιάμεση β-θαλασσαιμία και τα οποία άτομα είναι συμπτωματικά χωρίς ανάγκη μετάγγισης (αναλυτικότερα παράγραφος 1.12). Τα υψηλά επίπεδα της HbF και κατ επέκταση της γ-σφαιρίνης δρουν εξισοροπιστικά στην ποσοτική ανεπάρκεια των β-σφαιρινών και κατ επέκταση στα χαμηλά ποσοστά HbΑ. Παρακάτω, αναπτύσσονται με περισσότερες λεπτομέρειες οι προσπάθειες που γίνονται στο πεδίο αυτό. 1.12 Κληρονομική Παραμονή της Εμβρυικής Αιμοσφαιρίνης Μια σημαντική ομάδα μεταλλάξεων είναι εκείνη όπου τροποποιούνται οι αναπτυξιακά ρυθμιζόμενοι χρόνοι παραγωγής της σφαιρίνης. Σε άτομα με κληρονομική παραμονή της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης (HPFH) υπάρχουν 26

αυξημένες ποσότητες HbF (>1% της συνολικής) σε ώριμη ηλικία. Αυτή η περίπτωση δεν συγχέεται με καταστάσεις αυξημένης HbF σε άτομα με μείζονα β-θαλασσαιμία, που οφείλεται και στην επιλεκτική επιβίωση των F- κυττάρων στο περιφερικό αίμα. Η HPFH (Heriditary Persistence of Fetal Hemoglobin) συνιστά μια ήπια κλινική κατάσταση, και τέτοια άτομα συνήθως αγνοούν την ύπαρξη ανωμαλίας στην αιμοσφαιρίνη του (1). Επιπλέον, είναι χρήσιμη η κατανόηση των μηχανισμών ελέγχου της έκφρασης του γονιδίου της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης. Η γνώση που μπορεί να προκύψει από τέτοιες μελέτες μπορεί να έχει ευεργετικά αποτελέσματα για άτομα που πάσχουν από δρεπανοκυτταρική αναιμία ή β-θαλασσαιμία, εξαιτίας του γεγονότος ότι θα μπορούσε να είναι εφικτή η επανενεργοποίηση των γονιδίων της εμβρυικής σφαιρίνης. Η κληρονομική παραμονή της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης μπορεί να οφείλεται είτε α) σε ελλείψεις του DNA, είτε β) σε σημειακές μεταλλάξεις. Όσο αφορά στην ελλειπτική μορφή της HPFH υπάρχουν άτομα με μεγάλες ελλείψεις στα δ- και β-γονίδια σε απόσταση προς το 3 άκρο (48), όπου τα εμβρυικά γ-γονίδια συνεχίζουν να μεταγράφονται σε υψηλά επίπεδα καθόλη τη διάρκεια της ζωής χωρίς να σταματούν κατά τη γέννηση (ο εν λόγω μηχανισμός δεν είναι κατανοητός). Ωστόσο, όλα αυτά τα σύνδρομα εμφανίζουν σημαντική ετερογένεια, τόσο σε φαινοτυπικό επίπεδο όσο και σε μοριακή βάση. Η ύπαρξη μεγάλων ελλείψεων που απαλείφουν τα δ- και β-γονίδια δεν οδηγεί πάντα σε φαινότυπο HPFH.Δεν είναι κατανοητό ακόμα γιατί ορισμένες ελλείψεις οδηγούν σε HPFH και άλλες σε θαλασσαιμία. Εν προκειμένω, εφόσον τα δ- και β-γονίδια λείπουν στο προσβεβλημένο χρωμόσωμα, ο φαινότυπος είναι δβ-θαλασσαιμία (45). Διάφορες μελέτες για τα δύο αυτά σύνδρομα, δηλαδή για τη δβ-θαλασσαιμία και την κληρονομική παραμονή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης έχουν οδηγήσει στον εντοπισμό διάφορων cisρυθμιστικών αλληλουχιών, οι οποίες εδράζονται στο σύμπλεγμα των β- γονιδίων και οι οποίες τροποποιούν την έκφραση των επιμέρους γονιδίων της σφαιρίνης. H ανακάλυψη αυτών των cis αλληλουχιών έχει βοηθήσει στην κατανόηση ορισμένων φαινομένων της γονιδιακής έκφρασης. Δύο από τις υποθέσεις που έχουν διατυπωθεί για να εξηγήσουν τους φαινοτύπους της δβ- 27

θαλασσαιμίας και της HPFH κάνουν λόγο η πρώτη για διαμετάθεση ενισχυτών και η δεύτερη για αφαίρεση αποσιωπητών γονιδιακής έκφρασης. Μιά άλλη υπόθεση αναφέρει πως η ενεργοποίηση του γονιδίου της γ-σφαιρίνης επιτυγχάνεται από θέσεις ενισχυτή, που φυσιολογικά εδράζονται στο 3 άκρο του συμπλέγματος των β-γονιδίων και εξαιτίας των ελλείψεων στο 3 άκρο του συμπλέγματος, μετακινούνται δίπλα στα γ-γονίδια (49, 50, 51). Σε άλλα άτομα που εμφανίζουν HPFH, δεν υπάρχουν μείζονες ελλείψεις στην ομάδα των β-σφαιρινών. Σε αυτή την περίπτωση, συνήθως, υπάρχει υπερπαραγωγή είτε Gγ είτε Αγ. Τα άτομα αυτά είτε φέρουν σημειακές μεταλλάξεις στην περιοχή του υποκινητή του υπερεκφραζόμενου γονιδίου της εμβρυικής σφαιρίνης, είτε φέρουν μεταλλάξεις σε περιοχές του υποκινητή που πριν δεν είχε υποπτευθεί κανείς ότι ήταν σημαντικές για τον έλεγχο της έκφρασης του γονιδίου. Οι σημειακές μεταλλάξεις που έχουν αποκαλυφθεί εώς τώρα είναι: -202 θέση του υποκινητή της γ-σφαιρίνης, -198, -196, -195, - 175, -158, -117 (52) και -114. Αυτές οι θέσεις μάλλον αντιστοιχούν σε σημειακές αλληλουχίες ελέγχου, αλλά οι περισσότερες δεν αφορούν τις συνήθεις αλληλουχίες του υποκινητή (CACCC, CCAAT ή ΤΑΤΑ). Οι σημειακές μεταλλάξεις για HPFH είναι διασκορπισμένες σε μια περιοχή 5 ως προς την αρχή της μεταγραφής του γονιδίου και φαίνεται πως προσδιορίζουν αλληλουχίες που εμπλέκονται στο φυσιολογικό μηχανισμό της αναπτυξιακής ρύθμισης της έκφρασης των β και δ γονιδίων. Σε αυτή τη δεύτερη περίπτωση, μια υπόθεση συνίσταται στην εμφάνιση μεταλλάξεων σε μια θέση πρόσδεσης ενός καταστολέα που φυσιολογικά σχετίζεται με την καταστολή της παραγωγής της εμβρυικής σφαιρίνης, ο οποίος δεν προσδένεται όταν υπάρχει αυτή η μετάλλαξη (1). Εντέλει, τα συμπεράσματα από μια ανάλυση μεταλλάξεων HPFH μπορεί, τελικά, να έχει κλινική χρησιμότητα στην προσπάθεια ανάπτυξης αποτελεσματικών θεραπειών για τη δρεπανοκυτταρική αναιμία και τη β- θαλασσαιμία (33). 28

1.13 ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΣΕΙΡΑ Κ562 Η κυτταρική σειρά Κ562 συνίσταται σε αθανατοποιημένα κύτταρα που προέρχονται από κύτταρα ανθρώπινου λεμφοβλαστώματος από ασθενή με χρόνια μυελογενή λευχαιμία. Επιπλέον, η σειρά αυτή είναι ανευπλοειδική, εμφανίζει τρισωμία του χρωμοσώματος 11 έτσι ώστε να υπάρχουν 3 αντίγραφα του συμπλέγματος του β-γονιδίου (53). Η κυτταρική σειρά Κ562 κατά την έρευνα της γονιδιακής θεραπείας στις αιμοσφαιρινοπάθειες χρησιμεύει κυρίως στη μελέτη έκφρασης του β- σφαιρινικού γονιδίου το οποίο μεταφέρεται στα Κ562 κύτταρα μέσω ιικών ή αυτοαναπαραγόμενων επισωματικών φορέων ή πλασμιδίων εξαιτίας του ότι δεν εκφράζει το ενδογενές γονίδιο της β-σφαιρίνης (εν αντιθέση με τα εμβρυικά σφαιρινικά γονίδια ε και γ). Όσο αφορά την έκφραση της γ-σφαιρίνης η συγκεκριμένη κυτταρική σειρά χρησιμοποιείται στην παρούσα εργασία προκειμένου να ελεγθεί η διαμολυσματικότητα και η λειτουργικότητα της τελικής δομής (construct) που πρόκειται να κατασκευαστεί και αποτελεί σκοπό της συγκεκριμένης εργασίας. 29

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1. Β) ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Η παρούσα εργασία αφορά στην κατασκευή φορέων γονιδιακής μεταφοράς στο πλαίσιο της μεταφοράς τεχνητών µεταγραφικών παραγόντων και ειδικότερα στην ανάπτυξη τεχνητού µεταγραφικού παράγοντα για την ενεργοποίηση in trans του γονιδίου της γ-σφαιρίνης µε σκοπό τη θεραπεία της β θαλασσαιµίας και της δρεπανοκυτταρικής αναιµίας. Η διερεύνηση των συνθηκών διαμόλυνσης αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων: CD34+ με το όχημα pepi-egfp, έδειξε ότι σε ημιστερεές αποικίες που προκύπτουν από τα διαμολυσμένα κύτταρα δεν παρατηρείται ανιχνεύσιμος πράσινος φθορισμός, ενώ ανιχνεύεται η έκφραση της egfp με RT-PCR. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι υπάρχει έκφραση της egfp στα κύτταρα αυτά αλλά, αυτή είναι πολύ χαμηλή, τόσο ώστε να μην μπορεί να παρατηρηθεί φθορισμός. Ένας παράγοντας που θα μπορούσε να ευθύνεται για το φαινόμενο αυτό είναι ο pcmv υποκινητής, στον οποίο υπόκειται το γονίδιο της egfp, o οποίος είναι συνήθως ισχυρός υποκινητής αλλά υπάρχουν πληροφορίες ότι στα CD34+ κύτταρα δεν λειτουργεί ικανοποιητικά. Το πλασμίδιο Zif-VP64-EP1 φέρει τον pcmv υποκινητή μπροστά από το γονίδιο του τεχνητού μεταγραφικού παράγοντα Zif-VP64. 1. Σκοπός της μελέτης είναι η αντικατάσταση του pcmv υποκινητή του Zif-VP64 στο πλασμίδιο Zif-VP64-EP1: α) από έναν γνωστό ως πιο ισχυρό υποκινητή για τα Stem Cells, τον psffv υποκινητή (42) και β) από έναν νέο υποκινητή, τον pef1/ HTLV που είναι σύνθεση δύο στοιχείων, του υποκινητή του Elongation Factor και του ενισχυτή του HTLV. 2. εισαγωγή της τριπλέτας pcmv- egfp- S/ MAR στο πλασμίδιο με τον psffv υποκινητή στο Zif-VP64, έτσι ώστε στη συνέχεια να ελεγθεί η λειτουργικότητα της νέας αυτής δομής (construct) με μεταφορά του σε κύτταρα ανθρώπου Κ562. 30