ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ ΜΕ ΤΗ ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΟΙΒΑΔΑΣ ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΟΙΒΑΔΑΣ Η τεχνική της χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας (Thin Layer Chromatography, TLC) αναπτύχθηκε από τον Egon Stahl τον περασμένο αιώνα και μέχρι σήμερα βρίσκει μεγάλη εφαρμογή. Κατά τη μέθοδο αυτή η ακίνητη ή στατική φάση επιστρώνεται με κατάλληλο τρόπο επάνω σε γυαλί ή φύλλο αλουμινίου ή πλαστικού (φορέας επίστρωσης). Το πάχος επίστρωσης μπορεί να είναι από 0.15 mm (αναλυτική TLC) μέχρι 2 mm (παρασκευαστική TLC). Στο εμπόριο κυκλοφορούν έτοιμα πλακίδια επιστρωμένα με διάφορα υλικά και πάχος επίστρωσης και σε διάφορες διαστάσεις (5cm X 10cm, 10cm X 20cm, 20cm X 20cm). Σαν υλικά επίστρωσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν Silica gel, Alumina, κυτταρίνη ή κάποιο άλλο υλικό με προσροφητικές ιδιότητες (πίνακας Ι) ή ακόμη και ρητίνες με ιονισμένες ομάδες (υλικά με ιονανταλλακτικές ιδιότητες). Όλα αυτά τα υλικά είναι συνήθως αναμεμιγμένα με μικρή ποσότητα γύψου (10-15%) για καλύτερη προσκόλληση πάνω στο φορέα επίστρωσης. ΠΙΝΑΚΑΣ Ι. Προσροφητικά υλικά Alumina (Al 2 3.νH 2 ) Silica gel (πολυμερές Si 2 ) Αύξηση Μαγνησία (Mg) Προσροφητικής Ανθρακικό ασβέστιο (CaC 3 ) ικανότητας Κυτταρίνη [(C 6 Η 10 Ο 5 ) ν ] Σαν κινητή φάση μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφοροι διαλύτες (πίνακας ΙΙ) ή μίγματα διαλυτών. Στη χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας η κινητή φάση λέγεται διαλύτης ανάπτυξης. Όταν ο διαλύτης ανάπτυξης είναι κάποιος οργανικός διαλύτης ή τις περισσότερες φορές μίγμα οργανικών διαλυτών, τότε ο διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος γίνεται κυρίως βάσει του μηχανισμού προσρόφησης. ΠΙΝΑΚΑΣ ΙΙ. Μερικοί από τους διαλύτες που χρησιμοποιούνται στη χρωματογραφία προσρόφησης. Αύξηση Ικανότητας μετακίνησης Διαλύτης ανάπτυξης Εξάνιο Τολουόλιο Διχλωρομεθάνιο Χλωροφόρμιο Αιθανόλη Οξικός αιθυλεστέρας Ακετόνη Μεθανόλη Ακετονιτρίλιο Νερό Δείκτης πολικότητας 0.1 2.4 3.1 4.0 4.3 4.4 5.1 5.1 5.8 10.2 Οι χρωματογραφούμενες ουσίες προσροφώνται στην στατική φάση και κατόπιν εκροφώνται (επιστρέφουν στην κινητή δυναμική ισορροπία). Η ίδια διαδικασία επαναλαμβάνεται άπειρες φορές σε νέες θέσεις της στατικής φάσης κάθε φορά λόγω της ανάπτυξης της κινητής. Έτσι ουσίες που προσροφώνται ισχυρά μετακινούνται πιο αργά από
άλλες που προσροφώνται λιγότερο ισχυρά. Η προσρόφηση οφείλεται κυρίως σε αλληλεπιδράσεις διπόλου-διπόλου και δεσμούς υδρογόνου. Οι περισσότερο πολικές ενώσεις προσροφώνται ισχυρότερα από τις λιγότερο πολικές ή τις άπολες. Επιπλέον, διαλύτες ανάπτυξης με μεγαλύτερο δείκτη πολικότητας μετακινούν πιο γρήγορα τις χρωματογραφούμενες ουσίες, διότι οι αλληλεπιδράσεις διπόλου διπόλου αυτών με τα μόρια του διαλύτη γίνονται ισχυρότερες. Η συσκευή που απαιτείται για τη χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας αποτελείται από ένα γυάλινο δοχείο με κάλυμμα (δοχείο ανάπτυξης). Μέσα στο δοχείο αυτό τοποθετείται ο διαλύτης ανάπτυξης (στοιβάδα διαλύτη ~0.5 cm) και το δοχείο κλείνεται αεροστεγώς για να κορεστεί ο χώρος από τους ατμούς του διαλύτη (Σχήμα 1). Για να γίνει γρήγορα ο κορεσμός, τοποθετείται στο πλαϊνό τοίχωμα του δοχείου κοινό διηθητικό χαρτί εμποτισμένο με διαλύτη ανάπτυξης, το άκρο του οποίου είναι εμβαπτισμένο στον διαλύτη. (Ι) (ΙΙ) (ΙΙΙ) Σχήμα 1. Τοποθέτηση δείγματος (Ι), Θάλαμος χρωματογραφίας (ΙΙα) και ποτήρι ζέσεως καλυμμένο με αλουμινόχαρτο ως μια απλούστερη εκδοχή (IIβ), πλάκα χρωματογραφίας μετά την εμφάνιση (ΙΙΙ).
Το προς χρωματογράφηση δείγμα διαλύεται σε κάποιο διαλύτη ή καλύτερα στην κινητή φάση ( δείγματος σε 1 ml διαλύτη). Η τοποθέτηση του δείγματος επάνω στο πλακίδιο, συνήθως μήκους 10 cm, γίνεται με τριχοειδές σωληνάκι υπό μορφή κηλίδας διαμέτρου μικρότερης των 5 mm. Επάνω στο ίδιο πλακίδιο μπορούν να τοποθετηθούν σε διαφορετικές θέσεις περισσότερες από μία κηλίδες (διαφορετικών δειγμάτων), όλες όμως στο ίδιο ύψος (περίπου 1 cm) από τη βάση του πλακιδίου καθώς και σε ίσες αποστάσεις μεταξύ τους και τα πλάγια άκρα του πλακιδίου (Σχήμα 1). Μετά την ξήρανση της κηλίδας, το πλακίδιο τοποθετείται στο δοχείο ανάπτυξης. Τα υγρό ανάπτυξης δεν πρέπει να διαβρέχει τη θέση που τοποθετήθηκε η κηλίδα του δείγματος. Ο διαλύτης ανάπτυξης ανεβαίνει ομοιόμορφα στο πλακίδιο αργά-αργά, λόγω τριχοειδών φαινομένων συμπαρασύροντας και τα συστατικά του δείγματος σε διαφορετικές αποστάσεις. Η διαδικασία αυτή λέγεται ανάπτυξη του χρωματογραφήματος. Όταν το μέτωπο ανάπτυξης του διαλύτη πλησιάζει το επάνω άκρο του πλακιδίου τότε αυτό απομακρύνεται από το θάλαμο ανάπτυξης και σημειώνεται αμέσως το μέτωπο του διαλύτη με μολύβι. Μετά την ανάπτυξη του χρωματογραφήματος, το πλακίδιο ξηραίνεται και κατόπιν γίνεται ο προσδιορισμός της νέας θέσης κάθε κηλίδας. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται εμφάνιση του χρωματογραφήματος. Η εμφάνιση του χρωματογραφήματος μπορεί να γίνει με πολλούς τρόπους: α) Με υπεριώδη ακτινοβολία, όταν χρησιμοποιούνται ειδικές πλάκες φθορίζουσες στο υπεριώδες φως και η ουσία απορροφά στο UV (η πλάκα φθορίζει στο υπεριώδες φως, ενώ στις θέσεις που υπάρχει ουσία, που απορροφά, εμφανίζονται σκούρες κηλίδες). β) Δια ψεκασμού με ειδικά αντιδραστήρια, όταν οι ουσίες που χρωματογραφούνται μπορούν να δώσουν έγχρωμα παράγωγα με τα αντιδραστήρια που ψεκάζονται. Παράδειγμα: Τα αμινοξέα μπορούν να ανιχνευθούν με νινυδρίνη. H H 2 N R C 2 H + 2 H H 3 H 2 N H R + H + C 2 έγχρωμο παράγωγο Τα παράγωγα που σχηματίζονται κάθε φορά είναι έγχρωμα (βιολετί, μπλε, κίτρινα). γ) Με ιώδιο. Σε ποτήρι 2 lt τοποθετείται 1 gr περίπου στερεού ιωδίου. Το ποτήρι καλύπτεται με γυάλινη πλάκα ή πλαστικό και αφήνεται για ½ h, ώστε να κορεστεί ο χώρος με ατμούς ιωδίου. Κατόπιν τοποθετείται η πλάκα πλαγίως και με κατεύθυνση τέτοια ώστε η στοιβάδα του προσροφητικού να «βλέπει» προς τον πυθμένα του ποτηριού. Στις θέσεις που υπάρχει οργανική ουσία σχηματίζονται κηλίδες καφέ χρώματος. Επειδή το χρώμα εξαφανίζεται σχετικά γρήγορα, η θέση των κηλίδων θα πρέπει να σημειωθεί με μολύβι δ) Διά ψεκασμού με διάλυμα θειικού οξέος (H 2 S 4 : H 2, 1:2, v/v) και θέρμανσης της πλάκας στους 120 150 ο C. Οι οργανικές ουσίες απανθρακώνονται (εκτός των κορεσμένων υδρογονανθράκων) και δίνουν μαύρες κηλίδες. Με τη μέθοδο της χρωματογραφίας λεπτής στοιβάδας μπορεί να βρεθεί: i) Εάν μία ένωση είναι χημικώς καθαρή (εμφάνιση μιας κηλίδας σε διαδοχικά χρωματογραφήματα με διαφορετικό διαλύτη ανάπτυξης κάθε φορά). ii) Από πόσα συστατικά αποτελείται ένα μίγμα.
iii) Nα γίνει ποιοτική μελέτη της πορείας μιας χημικής αντίδρασης (εξαφάνιση της κηλίδας του αντιδρώντος και εμφάνιση κάποιας νέας κηλίδας, του προϊόντος) iv) Nα ταυτοποιηθεί μία άγνωστη ένωση από την τιμή R f, χρησιμοποιώντας δείγματα αναφοράς. Ως τιμή R f ορίζεται ο λόγος της απόστασης που διάνυσε η κηλίδα (α) προς την απόσταση που διάνυσε ο διαλύτης ανάπτυξης (β), R f = α/β Οι αποστάσεις μετρώνται από το κέντρο κάθε κηλίδας (σχήμα 1).. ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΥΛΙΚΑ ΠΟΣΟΤΗΤΑ Γλυκίνη Φαινυλαλανίνη Λυσίνη Αιθανόλη 10 ml 1-βουτανόλη 100 ml νινυδρίνη 0.3g Προετοιμασία δειγμάτων Σε μικρούς δοκιμαστικούς σωλήνες ετοιμάζονται τα δείγματα Α, Β, Γ και Δ με διάλυση αμινοξέος σε 1mL νερό. Α = γλυκίνη (Gly), Η 2 Ν-CH 2 -CH Β= φαινυλαλανίνη (Phe), Η 2 Ν-CH-CH CH 2 C 6 H 5 Γ= λυσίνη (Lys), Η 2 Ν-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH-CH NH 2 Δ= μίγμα με κάποια από τα παραπάνω αμινοξέα. Αντιδραστήριο νινυδρίνης: 0.3 g νινυδρίνης διαλύονται σε 100 ml 1-βουτανόλης. Κινητή φάση Α: 12 ml αιθανόλης αναμιγνύονται με 3 ml νερού (διάλυμα αιθανόλης 80%) Κινητή φάση Β: 14 ml αιθανόλης αναμιγνύονται με 1 ml νερού (διάλυμα αιθανόλης 93.3%) Κινητή φάση Γ: 10 ml αιθανόλης αναμιγνύονται με 5 ml νερού (διάλυμα αιθανόλης 66.7%) Προετοιμασία του θαλάμου ανάπτυξης Σε ποτήρι ζέσεως των 250 ml προστίθενται 15 ml περίπου κινητής φάσης (ύψος φάσης 3-5 mm) και κατόπιν τοποθετείται περιμετρικά των τοιχωμάτων διηθητικό χαρτί έτσι ώστε να βυθίζεται 1-2 mm στην κινητή φάση. Η κινητή φάση (υγρό ανάπτυξης) αποτελείται από
υδατικό διάλυμα αιθανόλης 80%. Τέλος καλύπτεται το επάνω μέρος του ποτηριού με αλουμινόχαρτο και αφήνεται να κορεστεί ο χώρος με ατμούς. Ανάπτυξη και εμφάνιση του χρωματογραφήματος Σε πλάκα επιστρωμένη με Silica gel επί φύλλου αλουμινίου σημειώνονται με μολύβι η γραμμή εκκίνησης και τα σημεία τοποθέτησης των δειγμάτων σε αποστάσεις τουλάχιστον 1cm από κάτω και τα άκρα. Με τριχοειδή σωλήνα γίνεται η τοποθέτηση κάθε δείγματος. Μόλις ξεραθούν οι κηλίδες η πλάκα τοποθετείται στο θάλαμο ανάπτυξης. Mετά την ανάπτυξη του χρωματογραφήματος, σημειώνεται με μολύβι η θέση του μετώπου του υγρού ανάπτυξης και η πλάκα ξεραίνεται στο πυριαντήριο στους 100 o C. Η εμφάνιση γίνεται πρώτα με UV (σημειώνονται με μολύβι οι κηλίδες) και κατόπιν δια ψεκασμού με αντιδραστήριο νινυδρίνης και τοποθέτησης της πλάκας στο πυριαντήριο στους 110 ο C για 5 min. Να προσδιοριστούν οι τιμές R f των ουσιών. Να γίνει σύγκριση των χρωματογραφημάτων που ελήφθησαν με διαφορετική κινητή φάση και να αιτιολογηθεί το αποτέλεσμα. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ Επί πλάκας silica gel και με διαλύτη ανάπτυξης μίγμα χλωροφορμίου: μεθανόλης (9:1, v/v) διαχωρίστηκαν οι παρακάτω ουσίες: κυκλοεξανόλη, κυκλοεξένιο, κυκλοεξανοκαρβοξυλικό οξύ και L-αλανίνη (αμινοξύ). α) Να σχεδιάσετε ένα πιθανό χρωματογράφημα TLC και να αιτιολογήσετε τη σειρά των κηλίδων. β) Τι περιμένετε να συμβεί στις τιμές R f αν αντικατασταθεί ο παραπάνω διαλύτης ανάπτυξης από μίγμα τολουολίου οξικού αιθυλεστέρα (9:1, v/v); Αιτιολογήστε στηριζόμενοι στις τιμές των δεικτών πολικότητας των διαλυτών (ΠΙΝΑΚΑΣ ΙΙ). γ) Θα μπορούσατε με τα παραπάνω χρωματογραφικά συστήματα να διαχωρίσετε την D- αλανίνη από την L-αλανίνη; (οπτικοί αντίποδες).