NOVA Lite HEp-2 External EB Kits Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση

NOVA Lite HEp-2 External EB Kits Για In Vitro Διαγνωστική Χρήση Κωδικός Προϊόντος: 704230, 704235 CLIA σύνθετος: ψηλός Σκοπό Χρήση Αυτό το προϊόν (διαγνωστικό σύνολο ή αντικειμενοφόρες πλάκες με υπόστρωμα) ενδείκνυται για τη χρήση στην ανίχνευση θετικών και την τιτλοποίηση κυκλοφορούντων αντιπυρηνικών αντισωμάτων, μέσω μιας εξέτασης ανοσοφθορισμού. Προορίζεται για την υποβοηθητική χρήση στην διάγνωση και την θεραπευτική αγωγή του συστηματικού ερυθηματώδους λύκου (ΣΕΛ), του συνδρόμου Sjögren, της ρευματοειδούς αρθρίτιδας και άλλων διαταραχών του συνδετικού ιστού. Περιληψη Και Αρχη Μεθοδου Αντιπυρηνικό αντίσωμα (ΑΝΑ) είναι ένας όρος ο οποίος περιγράφει μια ποικιλία αυτοαντισωμάτων κατά συστατικών των κυτταρικών πυρήνων που περιέχουν DNA, RNA και διάφορες πυρηνικές πρωτεΐνες 1. Αυτά τα ΑΝΑ βρίσκονται με υψηλή συχνότητα σε ασθενείς με νόσους συνδετικού ιστού ή ρευματικές νόσους και, ειδικότερα, ΣΕΛ. Υπάρχει υψηλή συσχέτιση θετικών ΑΝΑ και ΣΕΛ, και ένα αποτέλεσμα αρνητικών ΑΝΑ ουσιαστικά αποκλείει την νόσο. 2 Ωστόσο, ασθενείς με άλλες νόσους συνδετικού ιστού, όπως π.χ. ρευματοειδής αρθρίτις, σκληρόδερμα και δερματομυοσίτις είναι συχνά θετικοί για ΑΝΑ και χαμηλοί τίτλοι ΑΝΑ εμφανίζονται σε άλλες νόσους. Θετικά αποτελέσματα για ΑΝΑ έχουν επίσης αναφερθεί σε ανθρώπους υγιείς, μεγαλύτερης ηλικίας. Παρ ότι ο έμμεσος ανοσοφθορισμός είναι η μέθοδος επιλογής για την ανίχνευση των κυκλοφορούντων ΑΝΑ, συνιστάται όλα τα θετικά για ΑΝΑ δείγματα να τιτλοποιούνται απολύτως και να ερευνώνται περαιτέρω με πιο ειδικές εξετάσεις για αυτοαντισώματα κατά της διπλής αλύσου του DNA (dsdna) και διαλυτών πυρηνικών αντιγόνων (ΕΝΑ). Οι κατεψυγμένες τομές του ήπατος αρουραίου ήταν ιστορικά το πλέον δημοφιλές υπόστρωμα για την επίδειξη των ΑΝΑ αλλά τώρα έχουν αντικατασταθεί από διάφορους τύπους κυτταρικών σειρών. Τα κύτταρα HEp-2 3 είναι μια επιθηλιακή κυτταρική σειρά που χαρακτηρίζεται από εξαιρετικά μεγάλους πυρήνες συγκρινόμενα με άλλες κυτταρικές σειρές. Όταν χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση των ΑΝΑ τα πλεονεκτήματα των κυττάρων HEp-2 είναι ότι πρώτον: είναι ένα τυποποιημένο υπόστρωμα αντιγόνων με μικρότερη μεταβλητότητα μεταξύ παρτίδων από ότι παρουσιάζεται στις παρτίδες ιστού τρωκτικών δεύτερον, τα κύτταρα HEp-2 είναι μεγαλύτερα, καθιστώντας ευκολότερη την απεικόνιση της μορφολογίας του κυττάρου, με συνεπαγόμενη αύξηση στην ευαισθησία της ανάλυσης εν σχέση με τις τομές του ήπατος αρουραίου, και τέλος, πολλά κύτταρα HEp-2 είναι στην διαδικασία διαίρεσης, αποκαλύπτοντας έτσι αντιγόνα τα οποία δεν εκφράζονται φυσιολογικά στα κύτταρα-σε -ηρεμία των τομών ήπατος του αρουραίου 3. Αρχη Μεθοδου Μία τεχνική έμμεσου ανοσοφθορισμού 4 χρησιμοποιείται, όπου δείγματα ασθενών και κατάλληλοι οροί ελέγχου επωάζονται με υπόστρωμα HEp-2. Τα μη αντιδρώντα αντισώματα εκπλένονται και μετά τοποθετείται ένα κατάλληλο σύζευγμα σημασμένο με φλουροσκεΐνη. Το μη δεσμευμένο σύζευγμα εκπλένεται όπως πριν. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες διαβάζονται με ένα μικροσκόπιο φθορισμού και τα θετικά δείγματα παράγουν φθορισμό χρώματος πράσινου-του-μήλου ο οποίος αντιστοιχεί σε περιοχές του κυττάρου HEp-2 όπου έχει δεσμευθεί το αυτοαντίσωμα. Αντιδραστηρια 1. HEP-2 ANA Πλάκες σε 6 ή 12 θέσεων (wells) 2. Θετικός ορός ελέγχου (ομοιογενής/στικτή διάταξη, 3+ ένταση χρώσης), περιέχων 0,09% νατραζίδιο. Πρααραιωμένο, έτοιμο προς χρήση. 3. Θετικός ορός ελέγχου (διάταξη κεντρόμερου, 3+ ένταση χρώσης), περιέχων 0,09% νατραζίδιο. Προαραιωμένο, έτοιμο προς χρήση. 4. Αρνητικός ορός ελέγχου (αρνητικό για όλα τα αυτο-αντισώματα), περιέχων 0,09% νατραζίδιο. Προαραιωμένο, έτοιμο προς χρήση. 5. FITC lgg (H+L), περιέχουσα 0,09% Νατραζίδιο. Προαραιωμένο, έτοιμο προς χρήση. 6. 1% Evans Blue, ως προαιρετική αντιχρωστική. 7. Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών-ορού (PBS II), συμπυκνωμένο επί 40 φορές σε υγρή μορφή. 9. Υλικό συγκόλλησης, περιέχον αντιαλλοιωτικό παράγοντα 10. Καλυπτρίδες. 1

Προσοχή/ Ειδικα Μετρα Αυτό το προϊόν (διαγνωστικά σύνολα) είναι για διαγνωστική χρήση In Vitro. Αυτό το προϊόν πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο από κατάλληλα εκπαιδευμένα πρόσωπα για τους κάτωθι λόγους. Συνιστάται προσκόλληση στην δεδομένη διαδικασία. Όλοι οι δότες του παρεχομένου ανθρώπινου ορού (μόνο διαγνωστικό σύνολο) εξετάστηκαν και διαπιστώθηκαν αρνητικοί για αντιγόνο επιφανείας Ηπατίτιδας Β και αντισώματα για τον ιό Ηπατίτιδας C και τον ιό ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV1 & 2). Εν τούτοις, αυτές οι εξετάσεις δεν μπορούν να εγγυηθούν την απουσία μολυσματικών παραγόντων. Θα πρέπει να προσδιοριστούν κατάλληλες μέθοδοι χειρισμού και απόρριψης για όλα τα εν δυνάμει μολυσματικά υλικά και μόνο προσωπικό επαρκώς εκπαιδευμένο σε τέτοιες μεθόδους, επιτρέπεται να διενεργεί τέτοιες διαδικασίες. Μερικά από τα συστατικά του διαγνωστικού συνόλου περιέχουν 0,09% νατραζίδιο ως συντηρητικό και χρειάζονται προσεκτικό χειρισμό μην επιτρέψετε να απορροφηθούν ή να έρθουν σε επαφή με το δέρμα ή με τις βλεννογόνους μεμβράνες. Αν, εν τούτοις, υπάρξει επαφή, πλύνετε με άφθονο νερό και αναζητήστε ιατρική συμβουλή. Με την επαφή με τον χαλκό και τον μόλυβδο των υδραυλικών σωληνώσεων, ενδέχεται να σχηματιστούν εκρηκτικά μεταλλικά αζίδια όταν πετάτε το αντιδραστήριο, περιχύστε το με άφθονη ποσότητα νερού ούτως ώστε να αποφευχθεί ο σχηματισμός αζιδίων. Αποθήκευση Τα διαγνωστικό σύνολο/ αντικειμενοφόρες πλάκες που δεν έχουν ανοιχθεί θα πρέπει να αποθηκεύονται στους 2-8 C και μπορούν να χρησιμοποιηθούν έως την αναγραφόμενη στο κουτί της συσκευασίας ημερομηνία λήξεως. ΜΗΝ ΚΑΤΑΨΥΧΕΤΕ. Μόλις οι αντικειμενοφόρες πλάκες αφαιρούνται από τον φάκελο αλουμινίου, πρέπει να χρησιμοποιηθούν αμέσως. Το αραιωμένο PBS II μπορεί να αποθηκευτεί για έως και ένα μήνα στους 2-8 C. Το σύζευγμα φλουροσκεϊνης πρέπει να φυλάσσεται μακριά από το φως του ήλιου, φθορίζον ή υπεριώδες φως, όποτε είναι αυτό δυνατό. Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να φυλάσσονται σε 2-8 C. Δείγματα Τα δείγματα αίματος πρέπει να συλλέγονται με αιμοληψία, να αφήνονται να πήζουν φυσιολογικά και να διαχωρίζεται ο ορός το συντομότερο δυνατόν για να αποτραπεί η αιμόλυση. Ο ορός μπορεί να φυλάσσεται στους 2-8 C για έως και 7 ημέρες πριν την εξέταση 11, ή για παρατεταμένη φύλαξη να μοιράζεται σε σωληνάρια και να φυλάσσεται στους -20 C ή χαμηλότερα. ΜΗΝ καταψύχετε και αποψύχετε τους ορούς περισσότερο από μία φορά. Αποφύγετε την χρήση ορών λιπαιμικών, αιμολυμένων, ή μικροβιακά μολυσμένων, διότι μπορεί να προκύψουν μειωμένοι τίτλοι ή μη καθαρές διατάξεις χρώσης. Διαδικασία Υλικά που παρέχονται 704230 10 HEp-2 ANA Substrate Slide (6-well) (αντικειμενοφόρες πλάκες HEp-2 ANA, 6 βυθισμάτων) 1 1mL Homo. Ptn. (use w/conj. 504070 or 504088) (θετικός ορός ελέγχου, ομοιογενής χρήση με το σύζευγμα 504070 ή 504088), προαραιωμένος) 1 1mL Centromere Positive Control (ANA θετικός ορός ελέγχου, κεντρόμερο, προαραιωμένος) 1 1mL IFA System Negative Control (Αρνητικός ορός ελέγχου, προαραιωμένος) 1 7mL FITC IgG (H+L) HEp Conjugate (fluorescein), (FITC IgG (H+L) HEp με φλουροσκεϊνη (σύζευγμα) 1 3mL 1% Evans Blue Counterstain (1% Evans Blue αντιχρωστική) 2 25mL PBS II concentrate (x40) (PBS II συμπυκνωμένο, x40) 1 3mL PVA Mounting Medium (Υλικό συγκόλλησης) 1 10 Coverslips (Καλυπτρίδες) 704235 20 HEp-2 ANA Substrate Slide (12-well) (αντικειμενοφόρες πλάκες HEp-2 ANA, 12 βυθισμάτων) 1 1mL Homo. Ptn. (use w/conj. 504070 or 504088) (θετικός ορός ελέγχου, ομοιογενής χρήση με το σύζευγμα 504070 ή 504088), προαραιωμένος) 1 1mL Centromere Positive Control (ANA θετικός ορός ελέγχου, κεντρόμερο, προαραιωμένος) 1 1mL IFA System Negative Control (Αρνητικός ορός ελέγχου, προαραιωμένος) 1 7mL FITC IgG (H+L) HEp Conjugate (fluorescein), (FITC IgG (H+L) HEp με φλουροσκεϊνη (σύζευγμα) 1 3mL 1% Evans Blue Counterstain (1% Evans Blue αντιχρωστική) 2 25mL PBS II concentrate (x40) (PBS II συμπυκνωμένο, x40) 1 3mL PVA Mounting Medium (Υλικό συγκόλλησης) 1 20 Coverslips (Καλυπτρίδες) Αντιδραστήρια και εξοπλισμός που δεν συμπεριλαμβάνονται 1. Αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό για την αραίωση του συμπυκνωμένου PBS II. 2. Δοχείο για το αραιωμένο Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών-ορού (PBS II) και πλαστικό δοχείο μαλακό για την αρχική πλύση με PBS II. 3. Μικροπιπέττες και ρύγχη μιας χρήσης για την τοποθέτηση των δειγμάτων των ασθενών. 4. Υγρός θάλαμος για τα στάδια επώασης 5. Μικροσκόπιο Φθορισμού με φίλτρο διέγερσης σε μήκος κύματος 495nm και φίλτρο φραγής σε μήκος κύματος 515nm. 2

Αν χρησιμοποιείτε αντικειμενοφόρες πλάκες με υπόστρωμα μόνο, τα ακόλουθα υλικά μπορείτε να τα προμηθευτείτε από την INOVA: θετικοί οροί ελέγχου π.χ. ομοιογενής Homo. Ptn. (χρήση με το σύζευγμα 504070 ή 504088) (504090), κεντρόμερο (508184), αρνητικός ορός ελέγχου (508186), σύζευγμα αντιανθρώπινης IgG (H+L) FITC (504088, 504070 προαραιωμένο, έτοιμο προς χρήση, ή 504032 (αραιώστε 1/50-1/200 προς χρήση) PBS II (508998), Evans Blue (504049 προαιρετικό), υλικό συγκόλλησης (504046, 504047), καλυπτρίδες. Διαδικασία Ποιοτικός έλεγχος Οι θετικοί και αρνητικοί οροί ελέγχου πρέπει να χρησιμοποιούνται κάθε φορά που εξετάζονται δείγματα 1. Υλικό συγκόλλησης: Αφαιρέστε το υλικό συγκόλλησης από το ψυγείο και αφήστε το να φτάσει σε θερμοκρασία δωματίου (18-28ºC) πριν το χρειαστείτε. 2. Αραιώστε το συμπυκνωμένο PBS II. Αραιώστε το συμπυκνωμένο PBS II με αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό (1 μέρος του συμπυκνωμένου PBS II + 39 μέρη αποσταγμένου ή μη ιονισμένο νερό) και ανακατέψτε. ΣΗΜ. Χρησιμοποιείστε την συνολική ποσότητα του PBS II του Διαγνωστικού Συνόλου μόνο αν ολόκληρο το διαγνωστικό σύνολο πρόκειται να χρησιμοποιηθεί μέσα σε ένα μήνα. Το PBS II χρησιμοποιείται για την αραίωση των δειγμάτων των ασθενών καθώς επίσης και ως πλυστικό. 3. Αραίωση των δειγμάτων των ασθενών. Ανίχνευση θετικών: Αραιώνετε τα δείγματα των ασθενών 1/40 προσθέτοντας 25µL ορού σε 975µL ρυθμιστικού Διαλύματος ορού-φωσφορικού οξέος (PBS II). Τιτλοποίηση: Κάνετε διαδοχικές αραιώσεις θετικών δειγμάτων με Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών-ορού (PBS II) (π.χ. 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 και 1/640 κ.λ.π.). Για παράδειγμα: Πάρτε 500µL του 1/40 αραιωμένου δείγματος του ασθενούς, ανακατέψτε με 500µL του PBS II για να δώσει μία 1/80 αραίωση. Επαναλάβετε την διαδικασία για περαιτέρω διπλασιασμό των αραιώσεων. 4. Αντικειμενοφόρες πλάκες με υπόστρωμα. Αφήστε τις αντικειμενοφόρες πλάκες με υπόστρωμα να φτάσουν σε θερμοκρασία δωματίου (18-28 C) για περίπου 30 λεπτά πριν αφαιρεθούν από τους φακέλους. Σημάνετε τις αντικειμενοφόρες πλάκες καταλλήλως, τοποθετείστε σε υγρό θάλαμο και διανείμετε μία σταγόνα από τους δύο θετικούς ορούς ελέγχου και τον ένα αρνητικό ορό ελέγχου που βρίσκονται μέσα στο διαγνωστικό σύνολο, στα βυθίσματα 1, 2 και 3 αντιστοίχως. Διανέμετε 25µL του αραιωμένου ορού του ασθενούς στα εναπομείναντα βυθίσματα. 5. Επώαση των πλακών. Επωάστε τις πλάκες για 30 λεπτά σε υγρό θάλαμο σε θερμοκρασία δωματίου (18-28 C). (Υγρά φύλλα χάρτου στον πυθμένα του θαλάμου θα διατηρήσουν την υγρασία.) 6. Πλύσιμο με PBS II. Αφαιρείτε τις πλάκες από τον υγρό θάλαμο και ξεπλένετε σύντομα με το πλαστικό μπουκάλι με PBS II. Μην εκτοξεύετε απ ευθείας πάνω στα βυθίσματα. Τοποθετήστε τα πλακίδια σε ένα δοχείο Coplin με αραιωμένο ρυθμιστικό διάλυμα PBS II ή σε ράβδο εμβαπτισμένη σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS II για χρονικό διάστημα έως και 5 λεπτών. 7. Διανομή του φθορίζοντος συζεύγματος. Επιστρέψτε τις πλάκες στον υγρό θάλαμο και αμέσως καλύψτε κάθε βύθισμα με μια σταγόνα φθορίζοντος συζεύγματος. MΗΝ ΑΦΗΝΕΤΕ ΤΑ ΒΥΘΙΣΜΑΤΑ ΑΚΑΛΥΠΤΑ ΓΙΑ ΠΕΡΙΣΣΟΤΕΡΟ ΑΠΟ 15 ΔΕΥΤΕΡΟΛΕΠΤΑ. Η ΑΦΥΓΡΑΝΣΗ ΤΟΥ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ ΕΠΗΡΕΑΖΕΙ ΣΟΒΑΡΑ ΤΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 8. Επώαση των πλακών. Επωάστε τις πλάκες για 30 λεπτά σε έναν υγρό θάλαμο σε θερμοκρασία δωματίου (18-28 C) στο σκοτάδι. 9. Πλυστικό PBS II. Πλένετε ξανά όπως έχει περιγραφεί στο στάδιο 6. Προαιρετικό αντιχρωστικό: Διανείμετε 2-3 σταγόνες του 1% Evans Blue ανά 100mL του PBS II πριν από τη βύθιση των πλακών. 10. Συγκόλληση με καλυπτρίδα. Αφαιρείτε μία πλάκα τη φορά από το πλυστικό PBS II. Γρήγορα αφυγράνετε γύρω από τα βυθίσματα χρησιμοποιώντας στυπτικές ταινίες και διανείμετε μία σταγόνα υλικού συγκόλλησης σε κάθε βύθισμα. Προσεκτικά χαμηλώστε την πλάκα πάνω στην καλυπτρίδα, αποφεύγοντας τις φυσαλίδες αέρα, αλλά αν δημιουργηθούν μην επιχειρήσετε να τις αφαιρέσετε. 11. Διαβάστε τις πλάκες με ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Οι πλάκες που έχουν τελειώσει, πρέπει να διαβαστούν το συντομότερο δυνατό, ωστόσο μπορούν να αποθηκευτούν σε 2-8 C στο σκοτάδι επί έως και μια εβδομάδα, χωρίς σημαντική απώλεια του φθορισμού. Ποιοτικός έλεγχος Ο ομοιογενής θετικός ορός ελέγχου του διαγνωστικού σύνόλου πρέπει να δώσει μία ομοιογενή διάταξη χρώσης πράσινου-του-μήλου, στους πυρήνες των κυττάρων, έντασης 3+. Ο θετικός ορός ελέγχου για το κεντρόμερο πρέπει να δώσει μία διακριτή στικτή διάταξη 3+ (συνήθως σε πολλαπλάσια του 46). Ο αρνητικός ορός ελέγχου του διαγνωστικού συνόλου πρέπει να δώσει χρώση θολού πράσινου σε όλα τα κύτταρα HEp-2, χωρίς διακριτό φθορισμό. Αν οι οροί ελέγχου δεν εμφανισθούν όπως έχουν περιγραφεί, η εξέταση είναι άκυρη και πρέπει να επαναληφθεί.σημ.: Αν χρησιμοποιηθεί το Evans Blue ως αντιχρωστική, ένα αρνητικό δείγμα θα δώσει ένα θολό πορτοκαλο-κόκκινο χρώμα. Αν είναι θετικό, οι πυρήνες θα χρωματιστούν σε πράσινο του μήλου, σύμφωνα με την εμφανισθείσα διάταξη του ΑΝΑ και οι μη χρωματισμένες περιοχές του κυττάρου θα έχουν χρώση θολού κόκκινου. 3

Ανάλυση και Αξιολόγηση Αποτελεσμάτων Αρνητική αντίδραση. Ένα δείγμα θεωρείται αρνητικό αν η ειδική χρώση του πυρήνα είναι ίση ή μικρότερη από αυτή του βυθίσματος του αρνητικού ορού ελέγχου. Θετική αντίδραση. Ένα δείγμα είναι θετικό αν η χρώση του πυρήνα παρατηρείται να είναι μεγαλύτερη από αυτήν του βυθίσματος του αρνητικού ορού ελέγχου, και είναι ορατή μία διακριτή χρώση στα περισσότερα κύτταρα του HEp-2. Οι οροί ελέγχου του διαγνωστικού συνόλου είναι συνήθως 3+ σε ένταση. Ο ακόλουθος πίνακας δίνει μια ποικιλία διατάξεων πυρηνικής χρώσης οι οποίες μπορεί να παρατηρηθούν ανάλογα με τους τύπους και τις σχετικές ποσότητες αυτοαντισωμάτων παρόντων στο δείγμα: ΔΙΑΤΑΞΗ Ομοιογενής Στικτή Πυρινίσκου Κεντρόμερου Μιτοχονδρίου Jo-1 ΕΜΦΑΝΙΣΗ Συμπαγής πυρηνική χρώση (Το Scl-70 μπορεί να έχει κοκκιώδη τύπο φθορισμού) Λεπτά ή κοκκιώδη (τραχεία) στίγματα συνήθως χωρίς χρώση των πυρηνίσκων Μεγάλα τραχεία στίγματα (συνήθως λιγότερα από 6 στίγματα ανά πυρήνα, μετά ή άνευ λεπτών στιγμάτων) Διακριτικά στίγματα (συνήθως πολλαπλάσιο του 46) Τραχεία κοκκώδης ινώδης κυτταροπλασματική στικτή διάταξη εκτεινόμενη γύρω από τους πυρήνες και σε όλο το κυτταρόπλασμα Λεπτός κοκκιώδης φθορισμός συγκεντρωμένος γύρω από τον πυρήνα ΣΧΕΤΙΖΟ-ΜΕΝΑ ΑΝΤΙΓΟΝΑ ds DNA ss DNA Ιστόνες Scl-70 SS-A SS-B Sm RNP + άλλα Pm-Scl Νουκλεολί-νη Ku και άλλα άγνωστα πυρηνικά αντιγόνα Χρωμοσω-ματικά Κεντρόμερο M2 9,10 Jo-1 (ιστυλ-trna συνθετάση) ΚΥΡΙΕΣ ΣΧΕΤΙΖΟΜΕ-ΝΕΣ ΝΟΣΟΙ Υψηλοί τίτλοι: ΣΕΛ Χαμηλοί τίτλοι: ΣΕΛ ή άλλες διαταραχές του συνδετικού ιστού 5 Υψηλοί τίτλοι: σύνθετο σύνδρομο Sjögren s-sicca ΣΕΛ Μεικτή νόσος συνδετικού ιστού Σκηρόδερμα Χαμηλοί τίτλοι: άλλες νόσοι συνδετικού ιστού Υψηλοί τίτλοι: Σκληρόδερμα και Σύνδρομο Sjögren 6 Σύνδρομο CREST 7 Πρωτογενής χολική κίρρωση (συνήθης) Σκληρόδερμα (40%) και περιστασιακά σε μικτά σύνδρομα Πλυομυοσίτις, Δερματομυοσίτις. Σχετίζεται με πνευμονικό νόσημα Όρια της Διαδικασίας 1. Ο υψηλός τίτλος για ΑΝΑ είναι ισχυρή ένδειξη για νόσο συνδετικού ιστού, αλλά πρέπει επίσης να λαμβάνονται υπ όψη το κλινικό ιστορικό των ασθενών και άλλα αποτελέσματα από ορολογικές εξετάσεις, πριν καταλήξουμε σε διάγνωση. 2. Ένα μικρό ποσοστό ασθενών με ΣΕΛ ενδέχεται να είναι αρνητικό για ANA με τη μέθοδο του έμμεσου ανοσοφθορισμού αλλά να έχουν ΑΝΑ με άλλες μεθόδους 8. 3. Ασθενείς με φαρμακογενή ΣΕΛ ενδέχεται να έχουν θετικά, ομοιγενή ή περιφερικά ANA. Αντίθετα οι ασθενείς που υποβάλλονται σε θεραπεία με στεροειδή ενδέχεται να δώσουν αρνητικά ANA με άλλες μεθόδους 8. 4. Περισσότερα από ένα αυτοαντισώματα ενδέχεται να είναι παρόντα στο δείγμα κάποιου ασθενούς. Με την αραίωση του ορού, οι διαφορετικές διατάξεις χρώσεις μπορεί να είναι ευκολότερα διακριτές. Ομοίως, σε πολύ υψηλούς τίτλους, το φαινόμενο προζώνης ενδεχομένως να καλύψει την πραγματική ένταση της αντίδρασηςι. Όλα τα ύποπτα ή τα φαινομενικά χαμηλά δείγματα πρέπει να αραιώνονται περαιτέρω. 5. Η πηγή φωτός, τα φίλτρα και τα οπτικά μέρη των διαφόρων μικροσκοπίων φθορισμού επηρεάζουν την ευαισθησία του διαγνωστικού συνόλου. Η απόδοση του μικροσκοπίου επηρεάζεται σημαντικά από την σωστή συντήρηση ειδικά από το σωστό κεντράρισμα της λυχνίας ατμού ιωδίου και την αλλαγή της λυχνίας μετά την συνιστώμενη χρονική περίοδο. 4

6. Χαμηλοί τίτλοι ANA μπορεί να ανιχνευτούν σε ασθενείς με κλινική εικόνα άλλη από ρευματοειδείς νόσους ή νόσους του συνδετικού ιστού. Η συχνότητα θετικών αποτελεσμάτων για ANA αυξάνεται με την ηλικία στον φυσιολογικό πληθυσμό. 7. Κατά την ερμηνεία των διατάξεων χρώσης, πρέπει να λαμβάνεται υπ όψη η πιθανή παρουσία περισσότερων της μιας ειδικότητας αυτοαντισωμάτων. Συνδιασμοί αυτοαντισωμάτων μπορεί να προκαλέσουν ομοιογενείς ή στικτές διατάξεις χρώσης και συνιστάται να διενεργούνται ειδικές εξετάσεις για dsdνα και ΕΝΑ σε όλα τα ομοιογενή δείγματα. 8. Αν και η 1/40 προαραίωση του ορού του ασθενούς χρησιμοποιείται στην ρουτίνα αρχικά, είναι πιθανό ότι χαμηλοί τίτπλοι μη ειδικού φθορισμού των πυρήνων μπορεί να υπάρξει σε ορισμένα δείγματα σε μικρές αραιώσεις. 9. Η εξέταση για ΑΝΑ είναι απλώς ένα διαγνωστικό υποβοήθημα, και σε καμιά περίπτωση δεν αποτελεί από μόνη της διαγνωστικό εργαλείο. Τα αποτελέσματα της εξέτασης πρέπει να ερμηνευθούν ως μέρος μιας ολοκληρωμένης κλινικής εικόνας. Τα πλακίδια που πωλούνται χωριστά κατηγοριοποιούνται ως "Ειδικά αντιδραστήρια για αναλυτές". Πέραν τις ιδιότητάς του ως συστατικού του Κιτ, τα χαρακτηριστικά ανάλυσης και επιδόσεων δεν έχουν αποδειχτεί. Χαρακτηριστικά Απόδοσης Ακρίβεια Η διαδικασία ποιοτικού ελέγχου για κάθε παρτίδα περιλαμβάνει τον έλεγχο πολλλών πλακιδίων με γνωστό ορό ελέγχου που έχει αραιωθεί ως το τελικό σημείο. Κάθε παρτίδα δίνει αποτελέσματα στον προκαθορισμένο τίτλο τελικού σημείου. Αυτό αποδεικνύει ότι δεν υπάρχει σημαντική διαφορά στην απόδοση μεταξύ των πλακιδίων της ίδιας παρτίδας ή διαφορετικών παρτίδων. Ευαισθησία Η ευαισθησία των εξετάσεων και το όριο ανίχνευσης εξαρτάται από το χρησιμοποιούμενο μικροσκόπιο. Δεν υπάρχει διαθέσιμο διεθνώς αποδεκτό αντιδραστήριο βαθμονόμησης για τυποποίηση. Ειδικότητα Μία ομάδα πάνω από 50 κλινικών δειγμάτων διαφόρων ειδικοτήτων που περιλαμβάνει τουλάχιστον 10 αρνητικά δείγματα, εξετάστηκαν με το διαγνωστικό σύνολο The Binding Site s HEp-2 και με ένα αντίστοιχο εμπορικά διαθέσιμο διαγνωστικό σύνολο HEp-2. Η απόδοση του διαγνωστικού συνόλου The Binding Site ήταν συγκρίσιμη με αυτή του αντίστοιχου διαγνωστικού συνόλου ως προς την ειδικότητα και την ένταση. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ 1. Εξισορροπείστε το υλικό συγκόλλησης σε θερμοκρασία δωματίου. 2. Αραιώστε το PBS II 1/40 με αποσταγμένο ή μη ιονισμένο νερό. 3. Αραιώστε τους ορούς ασθενών 1/40 με PBS II. 4. Αφαιρέστε τις πλάκες από το ψυγείο και εξισορροπείστε σε θερμοκρασία δωματίου (18-28 C). 5. Αφαιρέστε την πλάκα από τον φάκελο αλουμινίου και τοποθετείστε σε υγρό θάλαμο. Προσθέστε 25µL ορών ελέγχου και αραιωμένων ορών των ασθενών. Επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου (18-28 C). 6. Ξεπλένετε τις πλάκες με άφθονο PBS II. Πλύνετε τις πλάκες για 5 λεπτά σε σχάρα ή Δοχείο Coplin. 7. Ξπιστρέφετε την πλάκα σε υγρό θάλαμο και αμέσως προσθέτετε μία σταγόνα φθορίζοντος συζεύγματος. 8. Επωάζετε τις πλάκες επί 30 λεπτά. 9. Πλένετε ξανά όπως περιγράφηκε στο στάδιο 6. 10. προσθέτετε υλικό συγκόλλησης σε κάθε βύθισμα και καλύψτε με καλυπτρίδα. 11. Διαβάστε τις πλάκες με μικροσκόπιο φθορισμού. 5

Βιβλιογραφία 1. Tan, E.M. (1982): Autoantibodies to nuclear antigens: Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology. 33: 167-23. 2. Tan, E.M. et al (1982): The 1982 revised criteria for classification of systemic lupus erythematosus. Arth and rheum. 25: 1271-1277. 3. Miyachi, K., Fritzler, M.J., Tan, E.M. (1978): Autoantibody to nuclear antigen in proliferating cells. J. Immunol. 121: 2228-2234. 4. Weller, T.H., Coons, A.H. (1954): Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes Zoster propagated in vitro: Prov. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 789-794. 5. Notman, D.D., Kurata, N., Tan, E.M. (1975): Profiles of antinuclear antibodies in systemic rheumatic diseases. Ann. Int. Med. 83: 464-469. 6. Ritchie, R.F. (1970): Antinuclear antibodies. Their frequency and diagnostic application. N. Enr. J. Med. 282: 1174-1178. 7. Tan, E.M., Rodman, G.P., Garcia, I. (1980) et al: Diversity of antinuclear antibodies in progressive systemic sclerosis. Arthritis Rheum. 23: 617-625. 8. Gladman, D.D., Chalmers, A., Urowitz, M.B. (1978): Systemic lupus erythematosus with negative LE cells and anitnuclear factors. J. Rheum.: 142-147. 9. MacKay, I.R., Gershwin, M.E. (1989): Molecular basis of mitochondrial autoreactivity in primary biliary cirrhosis. Immunol.Today: 10: 9: 315-318. 10. Laung, P.S.C., MacKay, I., Gershwin, M.E. (1994): Mitochondrial autoantigens. Man Biol. Mark; B8.1,1-14. Eds W.J.Van Venrooij and R.N. Maini. Kluwer Academic Pubs. Netherlands. 11. Protein Refence Unit Handbook of Autoimmunity (3 rd Edition) 2004. Ed A Milford Ward. J Sheldon, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14. Κατασκευαστής: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : 877-829-4745 Technical Service (Outside the U.S.) : 1 858-805-7950 support@inovadx.com Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com 624230GRC Rev. 5 January 2014 Οι επωνυμίες NOVA Lite και INOVA Diagnostics, Inc. είναι σήματα κατατεθέντα. Πνευματικά δικαιώματα 2013 Με επιφύλαξη κάθε νόμιμου δικαιώματος 6