ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΤΕΣΣΑΡΩΝ ΤΡΟΠΩΝ ΘΑΝΑΤΩΣΗΣ ΣΤΗΝ ΚΑΤΑΠΟΝΗΣΗ ΕΝΤΑΤΙΚΑ ΕΚΤΡΕΦΟΜΕΝΗΣ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ (Sparus aurata). Πίκουλας Θ., Παναγιωτάκη Π., Εξαδάκτυλος Α., Γκολομάζου Ε., Μαλανδράκης Ε.Ε., Μαρτσικάλης Π., Ντανταλή Ο., Κλαουδάτος Σ., Νεοφύτου Χ. Τμήμα Γεωπονίας Ιχθυολογίας και Υδάτινου Περιβάλλοντος, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας ppanag@uth.gr Περίληψη Σκοπός της παρούσας έρευνας ήταν η σύγκριση της καταπόνησης από την επίδραση διαφορετικών τρόπων θανάτωσης (ασφυξία, χτύπημα στο κεφάλι, εμβάπτιση σε παγόνερο, αναισθησία με διοξείδιο του άνθρακα και μετέπειτα εμβάπτιση του ψαριού σε παγόνερο) σε εντατικά εκτρεφόμενες τσιπούρες. Τα επίπεδα καταπόνησης καθορίστηκαν μέσω της ανίχνευσης του κατακερματισμένου DΝΑ σε ηπατοκύτταρα και ερυθροκύτταρα με τη βοήθεια της μοριακής τεχνικής, «ανάλυση κομητών» (comet assay), ενώ εκτιμήθηκε και η επιδιόρθωση του DNA. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα καταπόνηση παρατηρήθηκε για όλους τους τρόπους θανάτωσης. Η τεχνική Comet είναι μία πρακτική τεχνική προκειμένου να εκτιμηθεί η καταπόνηση στα ψάρια. Η ασφυξία παρουσίασε τη μεγαλύτερη καταπόνηση. Λέξεις κλειδιά: υδατοκαλλιέργειες, μέθοδοι θανάτωσης, τσιπούρα, τεχνική comet. COMPARISON OF FOUR SLAUGHTERING METHODS ON STRESS RESPONSE OF INTENSIVELY CULTURED GILTHEAD SEABREAM (Sparus aurata). Pikoulas T., Panagiotaki P., Exadactylos A., Golomazou E., Malandrakis E.E., Martsikalis P., Dadali O., Klaoudatos S., Neofitou C. Department of Ichthyology and Aquatic Environment, University of Thessaly ppanag@uth.gr Abstract The purpose of this study was to investigate and compare stress response induced by four slaughtering methods (asphyxia, mechanical stunning, immersion in ice-water and CO 2 in combination with ice-water immersion) of farmed sea bream. Stress responses were established by detection of fragmented DNA from hepatocytes and erythrocytes, while DNA repair was also evaluated, using single-cell gel electrophoresis technique (Comet Assay), which can detect primary DNA damage in individual cells. Results showed stress response for all slaughtering methods used. Comet Assay is a practical technique that could be used to assess stress response in fish. Asphyxia recorded the highest levels of stress, compared to the other slaughtering methods applied. Keywords: aquaculture, slaughtering methods, sea bream, Comet assay.
1. Εισαγωγή Αντικείμενο της παρούσας εργασίας είναι η διερεύνηση της καταπόνησης με τη χρησιμοποίηση τεσσάρων τρόπων θανάτωσης σε εντατικά εκτρεφόμενη τσιπούρα (ασφυξία, χτύπημα στο κεφάλι, εμβάπτιση σε παγόνερο, αναισθησία με διοξείδιο του άνθρακα και μετέπειτα εμβάπτιση του ψαριού σε παγόνερο). Η φυσιολογική ανταπόκριση και προσαρμογή των ιχθύων στην καταπόνηση είναι ανάλογη με αυτή των ανώτερων σπονδυλωτών. Χαρακτηρίζεται από μεταβολές στο αίμα και στους ιστούς ανεξάρτητα από το αν η καταπόνηση προέρχεται από ανθρώπινους χειρισμούς (τεχνικές εκτροφής, μεταφορά, θεραπεία ασθενειών), αλλαγές στις συνθήκες του περιβάλλοντος (θολερότητα, μόλυνση, θερμοκρασιακές μεταβολές του νερού) ή της ηθολογίας (επιβολή ιεραρχίας, αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ατόμων). Οι διάφορες φυσιολογικές μεταβολές που συμβαίνουν, καθώς το ψάρι προσπαθεί να ανταπεξέλθει στην καταπόνηση, είναι αντισταθμιστικές (π.χ. προσαρμοστικές) και απαραίτητες για να επιτευχθεί εγκλιματισμός στις νέες συνθήκες. Όλες αυτές οι φυσιολογικές αλλαγές συνολικά, αναφέρονται ως Γενικό Σύνδρομο Προσαρμογής (General Adaptation Syndrome - GAS) (Παπουτσόγλου, 1998). Τα ψάρια προσπαθούν να αντιδράσουν απέναντι στον παράγοντα καταπόνησης, χρησιμοποιώντας τα ενεργειακά τους αποθέματα (Lines & Frost 1999). Κατά το τελευταίο στάδιο της παραγωγικής διαδικασίας της εντατικής ιχθυοκαλλιέργειας όπου ουσιαστικά πραγματοποιείται η εξαλίευση και η θανάτωση των ψαριών, εφαρμόζονται διάφοροι τρόποι θανάτωσης με σκοπό την ελαχιστοποίηση αποφυγή της καταπόνησης του οργανισμού, καθώς και τη διατήρηση καλής εμφάνισης του προϊόντος, λίγο πριν την προώθηση του στην κατανάλωση. 2. Υλικά και Μέθοδοι Επελέγησαν τέσσερις τρόποι θανάτωσης των ψαριών (χτύπημα στο κεφάλι, εμβάπτιση σε παγόνερο, αναισθητοποίηση με διοχέτευση CO 2 και στη συνέχεια εμβάπτιση σε παγόνερο και ασφυξία). Τα ψάρια που χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα προήλθαν από μονάδα εντατικής εκτροφής, από την ίδια παρτίδα, χωρίς σημαντικές διαφορές στο μέσο βάρος τους και διατηρήθηκαν σε τέσσερις δεξαμενές για ένα μήνα πριν την έναρξη των δειγματοληψιών (περίοδος προσαρμογής). Καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος τα ψάρια ήταν υγιή και δεν παρατηρήθηκαν θνησιμότητες, ενώ ταΐζονταν καθημερινά με εμπορικά σύμπηκτα (pellets) κατάλληλα για τσιπούρα. Για κάθε μεταχείριση υπήρχαν τέσσερις επαναλήψεις. Τα επίπεδα καταπόνησης καθορίστηκαν μέσω της ανίχνευσης του κατακερματισμένου DΝΑ σε ηπατοκύτταρα και ερυθροκύτταρα με τη βοήθεια της μοριακής τεχνικής, «ανάλυση κομητών» (comet assay). Η διαδικασία απομόνωσης των ηπατοκυττάρων περιλάμβανε δύο στάδια. Η διαδικασία απομόνωσης των ερυθροκυττάρων πραγματοποιήθηκε με άμεση λήψη αίματος μετά τη θανάτωση του ψαριού (2μl). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε λύση και ηλεκτροφόρηση των κυττάρων (Hartmann et al., 2003, McKelvey-Martin et al., 2003). Για τη διαδικασία της επιδιόρθωσης του DNA, ηπατοκύτταρα απομονώθηκαν και επωάστηκαν σε υγρή καλλιέργεια με θρεπτικό υλικό Leibovitz L-15. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στην υγρή καλλιέργεια σε θερμοκρασία δωματίου (22 ο C) για δύο ώρες (Lawrence et al., 1991). Για την εκτίμηση της βλάβης του γενετικού υλικού, ακολούθησε μικροσκοπική παρατήρηση των πλακών, όπου διακρινόταν το γενετικό υλικό των πυρήνων. Η χρώση του DNA έγινε με τη χρωστική SYBR Green I, η οποία χρωματίζει τους πυρήνες με έντονο φωτεινό πράσινο χρώμα. Σε κάθε δείγμα μετρήθηκαν 100 κομήτες (1600 κομήτες συνολικά). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το ειδικό λογισμικό CASP v.1.2.2 (Comet Assay Software Project). Στη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν τα TM Tail Moments (Villarini et al., 2000) και το Γενικό Γραμμικό
Μοντέλο (GLM - UniANOVA). Για τις πολλαπλές συγκρίσεις των μέσων όρων χρησιμοποιήθηκε το κριτήριο Tukey HSD. 3. Αποτελέσματα Η ασφυξία είχε σαν αποτέλεσμα να παρατηρηθούν οι υψηλότερες τιμές ΤΜ (P<0.05), ενώ οι μικρότερες τιμές που καταγράφηκαν για τα ερυθροκύτταρα διαπιστώθηκαν στη μέθοδο θανάτωσης με παγόνερο (Σχ. 1). Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκε κάποια στατιστικώς σημαντική διαφορά που να υποδεικνύει πως το παγόνερο είναι αποτελεσματικότερος τρόπος θανάτωσης σε σύγκριση με τη θανάτωση με χτύπημα στο κεφάλι και με CO 2 /παγόνερο. Οι τιμές των ΤΜ για τη Σχ. 1 Γραφική απεικόνιση των μέσων τιμών ΤΜ ερυθροκυττάρων και στατιστικές διαφορές (a,b) για τους τέσσερις διαφορετικούς τρόπους θανάτωσης θανάτωση με παγόνερο, θανάτωση με CO 2 /παγόνερο και θανάτωση με χτύπημα στο κεφάλι δεν παρουσιάζουν μεταξύ τους στατιστικά σημαντικές διαφορές (Ρ > 0.05). Στα ηπατοκύτταρα δεν εντοπίστηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στις τιμές των ΤΜ όσον Σχ. 2 Γραφική απεικόνιση των μέσων τιμών ΤΜ ηπατοκυττάρων και στατιστικές διαφορές (a,b) για τους τέσσερις διαφορετικούς τρόπους θανάτωσης
αφορά στους εφαρμοζόμενους τρόπους θανάτωσης με παγόνερο, CO2/παγόνερο και χτύπημα στο κεφάλι, αν και οι μικρότερες τιμές ΤΜ που καταγράφηκαν ήταν στη μέθοδο θανάτωσης με CO2/παγόνερο (Σχ. 2). Αντίθετα, κατά τη θανάτωση με ασφυξία παρατηρήθηκαν οι υψηλότερες τιμές ΤΜ (P<0.05). Σχ. 3 Γραφική απεικόνιση των μέσων τιμών ΤΜ επιδιόρθωσης ηπατοκυττάρων και στατιστικές διαφορές (a,b) για τους τέσσερις διαφορετικούς τρόπους θανάτωσης Κατά την διαδικασία επιδιόρθωσης των ηπατοκυττάρων, παρόμοιες χαμηλές τιμές παρατηρήθηκαν στη θανάτωση με παγόνερο και θανάτωση με CO 2 /παγόνερο, ενώ οι τιμές της μεθόδου θανάτωσης με ασφυξία ήταν μεγαλύτερες, με στατιστικά σημαντικές διαφορές ακολουθούμενες από τις τιμές της θανάτωσης με χτύπημα στο κεφάλι (Σχ. 3). 4. Συμπεράσματα/Συζήτηση Σύμφωνα με τους Ottera et al., (2001) οι διάφοροι εφαρμοζόμενοι τρόποι θανάτωσης θα πρέπει να οδηγούν σε μια ταχύτατη και αμετάκλητη απώλεια συνείδησης (Southgate and Wall, 2001). Αρκετές από τις πρακτικές θανάτωσης που χρησιμοποιούνται στην εντατική ιχθυοκαλλιέργεια δεν αναπτύχθηκαν ώστε να μειωθεί η καταπόνηση αλλά για να διασφαλιστεί η αποτελεσματικότητα, η ποιότητα του τελικού προϊόντος και η ασφάλεια του ανθρώπινου δυναμικού (Conte, 2004). Όταν τα ψάρια θανατώνονται γρήγορα η καταπόνηση μειώνεται, ενώ παράλληλα βελτιστοποιείται αντίστοιχα η ποιότητα της σάρκας του ψαριού. Αξίζει να σημειωθεί ότι η επιλογή της κατάλληλης τεχνικής θανάτωσης εξαρτάται από το είδος του ψαριού και τις φυσιολογικές του λειτουργίες (αντοχή σε χαμηλές θερμοκρασίες, οξυγόνο κ.α) (Morzel et al., 2003). Η Comet assay βρίσκει ευρεία εφαρμογή ως μια απλή και ευαίσθητη τεχνική εκτίμησης της ex vivo, καθώς και της in vitro βλάβης του DNA σε διαφορετικούς ιστούς (βράγχια, συκώτι, αίμα) ψαριών εκτεθειμένων σε ποικίλους παράγοντες στο υδρόβιο περιβάλλον. Από την παρούσα έρευνα προέκυψε ότι η καταπόνηση από όλους τους διαφορετικούς τρόπους θανάτωσης, αποτυπώθηκε τόσο στον έλεγχο των ηπατοκυττάρων όσο και στον έλεγχο των ερυθροκυττάρων κατά την ex vivo διαδικασία. Ωστόσο στην in vitro διαδικασία της επιδιόρθωσης των ηπατοκυττάρων παρατηρήθηκε διαφοροποίηση. Τα αποτελέσματα από τα ψάρια που θανατώθηκαν με ασφυξία έδειξαν τα μεγαλύτερα επίπεδα καταπόνησης και στους τρείς ελέγχους που πραγματοποιήθηκαν (ερυθροκύτταρα, ηπατοκύτταρα, επιδιόρθωση ηπατοκυττάρων) σε σχέση
με τους άλλους τρόπους θανάτωσης. Παρόμοια αποτελέσματα αναφέρονται στη βιβλιογραφία (Ribas et al., 2007, Acerete et al., 2009). Μια τυπική κατάταξη των τρόπων θανάτωσης που εξετάστηκαν, ως προς την καταπόνηση που προκαλούν στα ψάρια, αλλά και ως προς την ευζωία γενικότερα θα μπορούσε να περιλαμβάνει την ασφυξία ως χείριστη μέθοδο θανάτωσης με τους άλλους τρόπους να ακολουθούν. Η χρήση του διοξειδίου του άνθρακα αν και αποτελεσματική στην παρούσα εργασία έχει δείξει ότι προκαλεί μείωση της ποιότητας της σάρκας (Roth et al., 2002). Επιπλέον το κτύπημα στο κεφάλι μπορεί να προκαλέσει αλλοιώσεις οι οποίες θα καταστήσουν το προϊόν μη εμπορεύσιμο. Η ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος θανάτωσης στην ιχθυοκαλλιέργεια (παγόνερο) φαίνεται να εισάγει χαμηλή καταπόνηση ισοδύναμη με αυτή που εισάγουν οι τρόπους που επιφέρουν θανάτωση σε σχετικά μικρό χρονικό διάστημα. Τέλος αξίζει να σημειωθεί ότι από τις τεχνικές θανάτωσης με τη χαμηλότερη καταπόνηση η ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδος του παγόνερου συνδυάζει την ευκολία, τη μαζικότητα και έχει το ελάχιστο δυνατό κόστος. 5. Βιβλιογραφικές Αναφορές Acerete, A., Reig, L., Alvarez, D., Flos, R., Tort, L., 2009. Comparison of two stunning/slaughtering methods on stress response and quality indicators of European sea bass (Dicentrarchus labrax). Aquaculture, 287:139-144. Conte, F.S., 2004. Stress and the welfare of cultured fish. Applied Animal Behavour Science, 86: 205 223. Hartmann, A., Herkomme,r K., Glόck, M. & Speit, G., 1995. The DNA-damaging effect of cyclophosphamide on human blood cells in vivo and in vitro studied with the single cell gel test (SCG). Environmental and Molecular Mutagenesis, 25:180-187. Lawrence, J.N., Foster, B., Benford, D.J., 1991. The application of a wedge perfusion technique to the in vivo-in vitro rat hepatocyte DNA-repair assay. Mutation Research, 252:129-137. Lines, J.A. & Frost, A.R., 1999. Review of opportunities for low stress and selective control of fish. Aquaculture Engineering, 20:211-230. McKelvey-Martin, V.J., Green, M.H.L., Schmezer, P., Pool-Zobel, B.L., De Meo, M.P.& Collins A., 1993. The single cell gel electrophoresis assay (comet assay): A European review. Mutation Research, 288:47-63. Morzel, M., Sohier, D., Van de Vis, H., 2003. Evaluation of slaughtering methods for turbot with respect to animal welfare and flesh quality. Journal of the Science of Food and Agriculture. 83: 19 28. Ottera, H., Roth, B., Torrissen, O.J., 2001. Do killing methods affect the quality of Atlantic Salmon? In: Kestin, S.C., Warriss P.D. (Eds.), Farmed Fish Quality. Blackwell Science Ltd, Oxford, pp. 398-399. Παπουτσόγλου, Σ.Ε., 1998. Ενδοκρινολογία Ιχθύων, Εκδόσεις Α. Σταμούλης, Αθήνα, σελ. 179, 517-518. Ribas, L., Flos, R., Reig, L., MacKenzie, S., Barton, B.A., Tort, L. 2007. Comparison of methods for anaesthetizing Senegal sole (Solea senegalensis) before slaughter: Stress responses and final product quality. Aquaculture, 269:250-258. Roth, B., Moeller, D., Veland, J.O., Imsland, A., Slinde, E., 2002. The effect of stunning methods on rigor mortis and texture properties of Atlantic salmon (Salmo salar). Journal of Food Science, 67: 1462 1466 Southgate, P., Wall, T., 2001. Welfare of farmed fish at slaughter. In Practice,23: 277-284 Villarini M., Scassellati-Sforzolini G., Moretti M. and Pasquini R., 2000. In vitro genotoxicity of terbutryn evaluated by the alkaline single-cell microgel-electrophoresis "comet" assay. Cell Biology and Toxicology 16: 285-292.