ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΦΥΤΑ (ΜΑΘΗΜΑ 4ο) 1
ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA ΣΤΑ ΦΥΤΑ Agrobacterium tumefaciens (οικ. Rhizobiaceae) 2
Agrobacterium - ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA Agrobacterium tumefaciens (οικ. Rhizobiaceae) κορονωτός κάλλος: φυτικά κύτταρα που χάνουν τη φυσιολογική τους λειτουργία και αποκτούν ανεξέλεγκτη διαίρεση υπεύθυνα γονίδια του βακτηρίου που ενσωματώνονται στο φυτό το μόνο γνωστό παράδειγμα δι-ειδικής μεταφοράς DNA στη φύση και μάλιστα μεταξύ δύο βασιλείων 3
Agrobacterium - ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA Agrobacterium tumefaciens (οικ. Rhizobiaceae) κορονωτός κάλλος: Τα καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται και απουσία του βακτηρίου Υπεύθυνο το T-DNA Εικ. 2.5 4
Agrobacterium - ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA Agrobacterium tumefaciens (οικ. Rhizobiaceae) Ti πλασμίδιο (tumor inducing): μέγεθος ~ 200 kb η τοξικότητα των βακτηρίων χάνεται όταν χάνουν το πλασμίδιο (πχ σε 37 o C, αντί της άριστης 28 o C) που επανακτάται με είσοδο του πλασμιδίου για την επαγωγή του κάλλου απαραίτητα και άλλα γονίδια του βακτηρίου χρωμοσωμικής προέλευσης 5
Agrobacterium - ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA Agrobacterium tumefaciens (οικ. Rhizobiaceae) κορονωτός κάλλος: το T-DNA των καρκινικών κυττάρων επάγει την παραγωγή ειδικών ενώσεων αμινοξέων και σακχάρων που ονομάζονται ΟΠΙΝΕΣ (οκτοπίνη νοπαλίνη αγροπίνη) Πηγές C και Ν για τα βακτήρια (δεν μπορούν να παραχθούν από τα βακτήρια) Κάθε πλασμίδιο είναι εξειδικευμένο για διαφορετική οπίνη(ες) 6
Agrobacterium - ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA Ti πλασμίδια: T L T R γονίδια υπεύθυνα για τη μεταφορά του T-DNA (vir) T-DNA: γονίδια καταβολισμού οπινών αρχή αντιγραφής πλασμιδίου (ori) T L : αριστερός βραχίονας και γονίδια που επάγουν το σχηματισμό όγκου T R : δεξιός βραχίονας και γονίδια που επάγουν το σχηματισμό οπινών 7
Agrobacterium - ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA Ti πλασμίδια: oκτοπίνης (190 kb) νοπαλίνης (210 kb) γονίδια σύνθεσης: args: αγροπίνης ocs: οκτοπίνης nos: νοπαλίνης γονίδια καταβολισμού: occ: οκτοπίνης agc: αγροπίνης noc: νοπαλίνης ογκογόνα γονίδια: shi: στο βλαστό roi: στη ρίζα 8 Εικ. 2.10
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΩΝ ΜΕΣΩ Τ- DNA 1. Αφοπλισμός Τi πλασμιδίου: L ογκογoνικά γονίδια γονίδια οπινών R Ti πλασμίδιο αφοπλισμένο πλασμίδιο πλασμίδιο 9
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΩΝ ΜΕΣΩ Τ- DNA 2. Ανασυνδυασμός αφοπλισμένου Τi πλασμιδίου με «ξένο» γονίδιο, γονίδιο αντοχής σε ζιζανιοκτόνο και γονίδιο αντοχής σε αντιβιοτικό : γονίδιο αντοχής σε ζιζανιοκτόνο γονίδιο αντοχής σε αντιβιοτικό ξένο γονίδιο ξένο γονίδιο αφοπλισμένο πλασμίδιο 10
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΩΝ ΜΕΣΩ Τ- DNA 3. Μεταμόρφωση Agrobacterium DNA ανασυνδυασμένο Ti πλασμίδιο πολλαπλασιασμός σε θρεπτικό μέσο με αντιβιοτικό 11
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΩΝ ΜΕΣΩ Τ- DNA 4. Μόλυνση φυτικών ιστών ανασυνδυασμένο Ti πλασμίδιο φυτικό κύτταρο μεταμορφωμένο φυτικό κύτταρο 12 πολλαπλασιασμός σε θρεπτικό μέσο με ζιζανιοκτόνο
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΩΝ ΜΕΣΩ Τ- DNA 5. Ανάπτυξη μεταμορφωμένων φυτών πολλαπλασιασμός σε θρεπτικό μέσο με ζιζανιοκτόνο ριζοβολία σε θρεπτικό μέσο μεταφύτευση 13
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΩΝ ΜΕΣΩ Τ- DNA Κληρονόμιση ξένου γονιδίου? 1/4 Χ 1/2 ξένο γονίδιο 1/4 14
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΩΝ ΜΕΣΩ Τ- DNA Ταυτοποίηση διαγονιδιακών φυτών 1. Υβριδισμός κατά Southern: Εικ. 15 1.11
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΩΝ ΜΕΣΩ Τ- DNA Ταυτοποίηση διαγονιδιακών φυτών 1. Υβριδισμός κατά Southern: Α Β 1 Β 2 Β 3 Α: Φυτό μάρτυρας (μη μεταμορφωμένο) Β: Μεταμορφωμένα φυτά με 1, 2, 4 αντίγραφα του ξένου γονιδίου 16
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΩΝ ΜΕΣΩ Τ- DNA Ταυτοποίηση διαγονιδιακών φυτών 2. Μέθοδος PCR (μηχανή αναπαραγωγής του γονιδίου): H PCR βοηθάει στην παραγωγή πολλών αντιγράφων DNA από τα εξεταζόμενα φυτά, χρησιμοποιώντας μεταξύ των άλλων και εκκινητές με ομολογία με το γονίδιο «στόχος». Στη συνέχεια αυτά θα ηλεκτροφορηθούν και αν ένα φυτό είναι μεταμορφωμένο θα εμφανίζει επιπλέον ζώνη από τα μη μεταμορφωμένα, που θα αντιστοιχεί στο γονίδιο «στόχος». Αν μάλιστα οι επιπλέον ζώνες είναι περισσότερες αυτό σημαίνει περισσότερα αντίγραφα του γονιδίου «στόχος». 17
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΩΝ ΜΕΣΩ Τ- DNA Ταυτοποίηση διαγονιδιακών φυτών 2. Μέθοδος PCR (μηχανή αναπαραγωγής του γονιδίου): 5 3 DNA στόχος 3 5 5 5 3 3 3 3 5 5 DNA πολυμεράση 5 3 5 3 3 5 3 5 18
ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΩΝ ΜΕΣΩ Τ- DNA Ταυτοποίηση διαγονιδιακών φυτών Μετά την ταυτοποίηση επιλέγονται διαγονιδιακά φυτά που στο γενετικό του υλικό έχει εισέλθει ένα αντίγραφο. Διαγονιδιακά με πολλά αντίγραφα απορρίπτονται γιατί σ αυτά είναι αυξημένη η πιθανότητα μεταλλάξεων (από ενθέσεις που διακόπτουν κρίσιμες αλληλουχίες, πχ ενός σημαντικού γονιδίου). Σε κάθε περίπτωση τα επιλεγόμενα αξιολογούνται φαινοτυπικά για τον έλεγχο έκφρασης μεταλλάξεων. 19
ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Καλαμπόκι με ανθεκτικότητα σε έντομα Καλαμπόκι με αντοχή σε ζιζανιοκτόνο 20
ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Καπνός που φέγγει 21
ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ - Ποιός είναι ο μηχανισμός προσβολής των Σολανωδών από το Agrobacterium tumefaciens; - Τι είναι ο κορονωτός κάλλος, που οφείλεται και ποια είναι τα χαρακτηριστικά των κυττάρων του κάλλου; Να περιγραφεί ο πειραματισμός που πιστοποιεί ότι δεν είναι η παρουσία του Agrobacterium αυτή καθ αυτή που προκαλεί τη δημιουργία του κάλλου, αλλά τμήμα του DNA του. Να γίνει περιγραφή του Ti πλασμιδίου, τι γονίδια φέρει και ποια τα χαρακτηριστικά του; Ποια είναι τα στάδια της γενετικής τροποποίησης των φυτών μέσω Τ-DNA; Τι είναι το αφοπλισμένο Τ-DNA καιτιοενδιάμεσοςφορέας, ποια γονίδια φέρουν; Σε τι εξυπηρετούν τα γονίδια αντοχής σε αντιβιοτικό και ζιζανιοκτόνο που πρέπει να φέρει το ανασυνδυασμένο αφοπλισμένο DNA; Ποια η διαδικασία μόλυνσης φυτικών ιστών κατά τη γενετική τροποποίηση φυτών μέσω Τ-DNA; Ποια η διαδικασία ανάπτυξης μεταμορφωμένων φυτών κατά τη γενετική τροποποίηση φυτών μέσω Τ-DNA; Πώς κληρονομείται το ξένο γονίδιο στα γενετικά μέσω Τ-DNA τροποποιημένα φυτά; Ταυτοποίηση διαγονιδιακών φυτών με τη μέθοδο της PCR (από Γενετική). Ταυτοποίηση διαγονιδιακών φυτών με τη μέθοδο του υβριδισμού κατά Southern Γιατί κατά την ταυτοποίηση διαγονιδιακών φυτών απορρίπτουμε αυτά που έχουν πολλά αντίγραφα του ξένου γονιδίου; 22
4. ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗ ΦΥΤΩΝ ΜΕΣΩ Agrobacterium 2-3 Τα Agrobacterium είναι φυσικοί παθογόνοι κυρίως της οικογένειας των Σολανωδών. Αποτελούν ένα παράδειγμα φυσικής δι-ειδικής γενετικής τροποποίησης γιατί με την προσβολή γονίδια τους ενσωματώνονται στο γένωμα του φυτού. Προσβάλλοντας φυτικούς ιστούς και όταν έλθουν σε επαφή με το φυτικό κύτταρο σχηματίζουν ένα λεπτό σωλήνα από πρωτείνη ο οποίος διαπερνά το φυτικό κυτταρικό τοίχωμα και μέσω αυτού εισάγουν στα φυτικά κύτταρα ένα τμήμα DNA από πλασμίδιο που φέρουν και το οποίο ονομάζεται Ti πλασμίδιο. Το τμήμα αυτό ονομάζεται T- DNA στο οποίο βρίσκονται γονίδια που επάγουν τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των προσβεβλημένων κυττάρων με αποτέλεσμα τη δημιουργία κάλων. Τα κύτταρα του κάλου εκφράζουν και άλλα γονίδια του βακτηρίου, ώστε να παράγουν θρεπτικά συστατικά για τα βακτήρια, τις οπίνες. Η ιδιότητα αυτή αξιοποιήθηκε στην εισαγωγή «ξένων» γονιδίων στα φυτά. 4 Το σχήμα δείχνει ότι η ανάπτυξη του κάλου γίνεται και απουσία των βακτηρίων αρκεί να προηγηθεί η προσβολή των φυτικών ιστών με αυτά. Αυτό συμβαίνει γιατί με την προσβολή έχει ήδη εγκατασταθεί μέσα στα φυτικά κύτταρα το Τ-DNA του βακτηρίου και τελικά είναι αυτό που προκαλεί τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και όχι το ίδιο το βακτήριο.. 5 Το γεγονός ότι ο σχηματισμός του κάλου οφείλεται στο Τ-DNA επιβεβαιώνεται από το γεγονός ότι βακτήρια που στερούνται του Ti πλασμιδίου δεν είναι σε θέση να προκαλέσουν κάλο, δηλ. χάνουν την τοξικότητά τους όταν χάνουν το πλασμίδιο. Αν όμως επανακτήσουν το πλασμίδιο επανακτούν και την τοξικότητα. 6 Το Τ-DNA που εγκαθίσταται στα προσβεβλημένα κύτταρα φέρει γονίδια που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή των οπινών (οκταπίνη, νοπαλίνη και αγροπίνη), αλλά δεν εκφράζονται στα βακτήρια. Αντίθετα εκφράζονται στα προσβεβλημένα κύτταρα τα οποία παράγουν τις οπίνες που αποτελούν πηγές άνθρακα και αζώτου για τα βακτήρια. 7 Το Τ-DNA στα άκρα του φέρει τον αριστερό βραχίονα στον οποίο βρίσκονται τα γονίδια που είναι υπεύθυνα για το σχηματισμό του κάλου και το δεξιό βραχίονα στον οποίο βρίσκοντια τα γονίδια που εκφράζουν τις οπίνες. 8 Στην εικόνα δίνονται δύο τύποι Ti πλασμιδίων, το πρώτο φέρει γονίδια σύνθεσης αγροπίνης και οκτοπίνης και το δεύτερο γονίδιο σύνθεσης νοπαλίνης στο Τ-DNA. Τα πλασμίδια επίσης φέρουν και τα αντίστοιχα γονίδια καταβολισμού των οπινών εκτός Τ-DNA. Στο Τ-DNA επίσης φέρουν τα ογκογόνα γονίδια για σχηματισμό κάλου στο βλαστό ή στη ρίζα.
9 Για τη γενετική τροποποίηση των φυτών χρησιμοποιήθηκε το Τ-DNA ως φορέας του «ξένου» γονιδίου. Το πρώτο στάδιο περιλαμβάνει την προετοιμασία του Ti πλασμιδίου με αφοπλισμό του, δηλαδή απομάκρυνση από το Τ-DNA των ογκογόνων γονιδίων και αυτών που παράγουν τις οπίνες. 10 Στο δεύτερο στάδιο το αφοπλισμένο Ti πλασμίδιο ανασυνδυάζεται ώστε να συμπεριλάβει το «ξένο» γονίδιο, αλλά και ένα γονίδιο αντοχής σε αντιβιοτικό όπως και ένα γονίδιο αντοχής σε ζιζανιοκτόνο. Το γονίδιο αντοχής σε αντιβιοτικό είναι απαραίτητο για την ταυτοποίηση στη συνέχεια των μεταμορφωμένων βακτηρίων (που θα φέρουν το ανασυνδυασμένο Ti πλασμιδίου), ενώ το γονίδιο αντοχής στο ζιζανιοκτόνο για την ταυτοποίηση των φυτικών κυττάρων που θα έχουν τροποποιηθεί (στο γένωμα τους έχει ενσωματωθεί το ανασυνδυασμένο Τ-DNA). 12 Στο τρίτο στάδιο βακτήρια Agrobacterium που στερούνται πλασμιδίου μεταμορφώνονται με εισαγωγή στα κύτταρά τους του ανασυνδυαμένου Ti πλασμίδιυ. Μετά από πολλαπλασιασμό τους σε θρεπτικό υπόστρωμα μεταχειρίζονται με το αντιβιοτικό για το οποίο είχε ενσωματωθεί γονίδιο αντοχής, οπότε επιβιώνουν μόνο τα μεταμορφωμένα. 13 Στο τέταρτο στάδιο τα μεταμορφωμένα βακτήρια μολύνουν φυτικά κύτταρα. Στα φυτικά κύτταρα μεταναστεύει το ανασυνδυασμένο Τ-DNA φέροντας το «ξένο» γονίδιο και ενσωματώνεται στο γένωμα του κυττάρου. Τα φυτικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται σε θρεπτικό υπόστρωμα που έχει και το ζιζανιοκτόνο για το οποίο είχε ενσωματωθεί γονίδιο αντοχής οπότε επιβιώνουν μόνο κύτταρα που έχουν μεταμορφωθεί. 14 Ένα μεταμορφωμένο κύτταρο με μικροπολλαπλασιασμό τελικά δίνει ένα γενετικά τροποποιημένα φυτό που στο σύνολο των κυττάρων του φέρει το «ξένο» γονίδιο. 15 Ένα γενετικά τροποποιημένο φυτό αρχικά φέρει το «ξένο» γονίδιο σε ημίζυγη κατάσταση (μόνο στο ένα ομόλογο χρωμόσωμα). Με συνεχείς αυτογονιμοποιήσεις κρατιούνται μόνο τα φυτά που κληρονομούν σταθερά το «ξένο» γονίδιο, δηλαδή έχουν μετατραπεί σε ομοζύγωτα για το «ξένο» γονίδιο. 16 Ο υβριδισμός κατά Southern μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση γενετικά τροποποιημένων φυτών χρησιμοποιώντας μοριακό δείκτη (ιχνηλάτη) που είναι ομόλογος του «ξένου» γονιδίου.
17 Μετά από υβριδισμό κατά Southern σε διαφορετικά φυτά που έχουν τροποποιηθεί γενετικά, μπορεί να προκύψουν διαφορετικές ζώνες γιατί αφορούν διαφορετικές ενθέσεις άρα διαφορετικού μεγέθους τμήματα DNA μετά την επίδραση των ενζύμων περιορισμού. 19 H PCR βοηθάει στην παραγωγή πολλών αντιγράφων από τα εξεταζόμενα φυτά, χρησιμοποιώντας μεταξύ των άλλων και εκκινητές με ομολογία με το γονίδιο «στόχος». Στη συνέχεια αυτά θα ηλεκτροφορηθούν και αν ένα φυτό είναι μεταμορφωμένο θα εμφανίζει επιπλέον ζώνη από τα μη μεταμορφωμένα, που θα αντιστοιχεί στο γονίδιο στόχος. Αν μάλιστα οι επιπλέον ζώνες είναι περισσότερες αυτό σημαίνει περισσότερα αντίγραφα του γονιδίου στόχος. 21 Η μέθοδος έχει εφαρμοστεί επιτυχώς στη γενετική τροποποίηση καλαμποκιού για αντοχή σε έντομα και ζιζανιοκτόνα 22 Επίσης σε καπνό και γκαζόν για την τροποποίηση τους με το γονίδιο της λουσιφεράσης από την πυγολαμπίδα, με αποτέλεσμα το φυτό να εκπέμπει συνεχώς φως. 22. Από New Scientist: Βακτήρια γενικά κινούνται ευκολότερα σε συνθήκες μειωμένης βαρύτητας. Αυτό οδήγησε τον Veirling (Purdue Un.) να αναρωτηθεί μήπως η εφαρμογή της μεθόδου σε συνθήκες μειωμένης βαρύτητας αυξάνει το ποσοστό των γενετικά τροποποιημένων φυτών στη σόγια. Έτσι έστειλε φυτάρια σόγιας στο διάστημα, όπου ο αστροναύτης Clenn τα επίπασε με βακτήρια Agrobacterium στα οποία είχε προστεθεί ένα γονίδιο του οποίου η πρωτεϊνη βάφει τα φυτικά κύτταρα κόκκινα. Όταν τα φυτά επέστρεψαν στη γη, στο μικροσκόπιο βρέθηκε ότι σ αυτά το γονίδιο της κόκκινης πρωτείνης είχε μεταφερθεί 10 φορές συχνότερα απ ότι σε φυτά μάρτυρες όπου η ίδια τεχνική εφαρμόστηκε στη γη. Αυτό θεωρείται σημαντικό κυρίως για φυτά στα οποία η τεχνική δεν είναι τόσο αποτελεσματική, όπως το σιτάρι.