Κεφάλαιο 10 ΤΟ ΟΠΕΡΟΝΙΟ (σελ. 387-417)
Ένα ρυθμιστικό γονίδιο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που δρα σε μια θέση-στόχο πάνω στο DNA και ρυθμίζει την έκφραση ενός άλλου γονιδίου.
Στον αρνητικό έλεγχο, μία trans-δραστική πρωτεΐνηκαταστολέας προσδένεται στην cisδραστική αλληλουχίακαταστολέα (χειριστής) και σταματά τη μεταγραφή.
Στο θετικό έλεγχο, οι transδραστικοί παράγοντες πρέπει να προσδεθούν στις cisρυθμιστικές αλληλουχίες προκειμένου η RNA πολυμεράση να αρχίσει τη μεταγραφή από τον υποκινητή.
Το οπερόνιο lac καταλαμβάνει ~6.000 bp DNA. Το γονίδιο laci (αριστερά) έχει το δικό του υποκινητή (P) και τερματιστή. Το άκρο του laci βρίσκεται ακριβώς πριν τον υποκινητή των δομικών γονιδίων. Ο χειριστής(o) καταλαμβάνει τα πρώτα 26 bp της μεταγραφικής μονάδας. Το γονίδιο lacz ξεκινάαπότηβάση+39. Μετά από αυτό ακολουθούν τα γονίδια lacυ και laca.
Ο καταστολέας και η RNA πολυμεράση προσδένονται σε αλληλοεπικαλυπτόμενες θέσεις, γύρω από το σημείο έναρξης της μεταγραφής του οπερονίου lac.
Η προσθήκη επαγωγέα προκαλεί τη γρήγορη επαγωγή του mrna του οπερονίου lac και ακολουθείται από τη σύνθεση των ενζύμων, μετά από μια σύντομη φάση υστέρησης. Η απομάκρυνση του επαγωγέα ακολουθείται από γρήγορη παύση της σύνθεσης.
???
Καταστολή και ενεργοποίηση μεταγραφής Ο καταστολέας(τετραμερής πρωτεΐνη) διατηρεί το οπερόνιο lac στην ανενεργή κατάσταση μέσω της πρόσδεσής του στο χειριστή. Η προσθήκη του επαγωγέα μετατρέπει τον καταστολέα στην ανενεργή μορφή του, που δεν μπορεί να προσδεθεί στο χειριστή. Αυτό επιτρέπει στην RNA πολυμεράση να προσδεθείκαινααρχίσειτημεταγραφή.
Καταστολή και ενεργοποίηση μεταγραφής Οι μεταλλάξεις του χειριστή είναι ιδιοστατικές, επειδή ο χειριστής καθίσταται ανίκανος να προσδέσει την πρωτεΐνη-καταστολέα. Αυτό επιτρέπει στην RNA πολυμεράση να έχει απεριόριστη πρόσβαση στον υποκινητή. Οι μεταλλάξεις Oc είναι cis-δραστικές, επειδή επηρεάζουν μόνο τα συνδεδεμένα (δομικά) γονίδια. Οι μεταλλάξεις που απενεργοποιούν το γονίδιο laci προκαλούν την ιδιοστατική έκφραση του οπερονίου, επειδή η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη του καταστολέα δεν μπορεί να προσδεθεί στο χειριστή.
Καταστολή και ενεργοποίηση μεταγραφής Ένα μεταλλαγμένο γονίδιο laci -d παράγει ένα μονομερές που έχει ελαττωματική θέση πρόσδεσης στο DNA. Όταν βρίσκεται στο ίδιο κύτταρο με ένα γονίδιο άγριου τύπου, δημιουργούνται τυχαίοι συνδυασμοί πολυμερών καταστολέων και από τα δύο είδη υπομονάδων. Αν τουλάχιστον μία μονάδα του πολυμερούς είναι του τύπου laci -d τότε παρεμποδίζεται η λειτουργία του καταστολέα. Έτσι εξηγείται η επικρατής αρνητική συμπεριφορά της μετάλλαξης lac -d.
Ο χειριστής lac έχει συμμετρική αλληλουχία. Η αλληλουχία αριθμείται σε σχέση με το σημείο έναρξης της μεταγραφής στο +1. Τα ροζ βέλη αριστερά και δεξιά δείχνουν τις δύο ανεστραμμένες επαναλήψεις. Με πράσινο φόντο εμφανίζονται οι ταυτόσημες θέσεις των δύο ανεστραμμένων επαναλήψεων.
Οι βάσεις που έρχονται σε επαφή με τον καταστολέα μπορεί να ταυτοποιηθούν πειραματικά. Έτσι, αναγνωρίστηκαν θέσεις του χειριστή, που έρχονται σε επαφή με τον καταστολέα.
1. Ηπρωτεΐνη-επαγωγέας προσδένεται στον ελεύθερο καταστολέα, ώστε να διαταράξει μια ισορροπία. 2. Ηπρωτεΐνη-επαγωγέας προσδένεται άμεσα στον καταστολέα που βρίσκεται προσδεδεμένος στο χειριστή.
???
Ηδομήενός μονομερούς του καταστολέα Lac αποκαλύπτει αρκετές ανεξάρτητες επικράτειες.
Ηκρυσταλλικήδομήτου πυρήνα του καταστολέα Lac δείχνει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μονομερών μέσα στο τετραμερές.
Το τετραμερές του καταστολέα αποτελείται από δύο διμερή.
Ο επαγωγέας αλλάζει τη δομή του πυρήνα, έτσι ώστε οι κεφαλές του διμερούς καταστολέα να μην έχουν πια τον προσανατολισμό που επιτρέπει την πρόσδεσή τους στο DNA.
Οι υπολειπόμενες μεταλλάξεις laci -, που αδυνατούν να καταστείλουν τη μεταγραφή, μπορεί να εντοπίζονται οπουδήποτε στην πρωτεΐνη. Οι επικρατείς αρνητικές μεταλλάξεις laci -d, που επίσης αδυνατούν να καταστείλουν τη μεταγραφή, εντοπίζονται στην θέση πρόσδεσης DNA. Οι επικρατείς μεταλλάξεις lacis, που δεν μπορούν να επάγουν τη μεταγραφή επειδή δεν μπορούν να δεσμεύσουν τον επαγωγέα, εντοπίζονται στην κεντρική επικράτεια.
Αν και τα δύο διμερή σε ένα τετραμερές καταστολέα προσδεθούν στο DNA, τότε το DNA ανάμεσα στις δύο θέσεις πρόσδεσης σχηματίζει ένα βρόχο.
Όταν ένας τετραμερής καταστολέας προσδένεται σε δύο χειριστές, η έκταση του DNA ανάμεσά τους εξωθείται στη δημιουργία ενός σφιχτού βρόχου. Η μπλε δομή στο κέντρο του βρόχου του DNA αντιπροσωπεύει την πρωτεΐνη CAP, άλλη μια ρυθμιστική πρωτεΐνη που προσδένεται στην περιοχή.
??
Σχεδόν όλη η ποσότητα του καταστολέα ενός κυττάρου βρίσκεται δεσμευμένη στο DNA.
Ο καταστολέας Trp αναγνωρίζει χειριστές σε τρεις γενετικούς τόπους. Οι συντηρημένες βάσεις φαίνονται με κόκκινο. Η θέση έναρξης της μεταγραφής των αντίστοιχων mrna διαφέρει, όπως δείχνουν τα κίτρινα βέλη.
Οι χειριστές μπορεί να απαντούν σε διάφορες θέσεις σχετικά με τον υποκινητή.