PapilloCheck high-risk

hr-hpv DNA-Chip Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ. 505 060 Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Αναθεώρηση: BQ-065-01 Αύγουστος 2011 Greiner Bio-One GmbH

ΓΛΩΣΣΑΡΙΟ ΣΥΜΒΟΛΩΝ! el Αποθηκεύεται στα σκοτεινά το λιγότερο διατηρείται πριν την χρήση διαβάστε τις οδηγίες Αριθμός Καταλόγου Παραγωγός In vitro διαγνωστικά ιατρικά προϊόντα περιoριoμός θερμοκραο ίας Περιεχόμενο αροκετό για <n> τεοτ ερεθιστικό hr-hpv κωδικός DNA-Chip παρτίδας Σημαντική υπόδειξη en Store in the dark Use by Consult Instructions For Use Catalog Number In Vitro Dianostic Medical Device Manufacturer Temperature limitation Contents sufficient for <n> tests Irritant Batch code Important Note de Im Dunkeln lagern Mindestens haltbar bis Vor Gebrauch Anweisung lesen Katalognummer Hersteller In-Vitro- Diagnostika Medizinprodukt Temperaturbegrenzung Inhalt ausreichend für <n> Tests Reizend Chargenbezeichnung Wichtiger Hinweis fr À stocker à l abri de la lumière Date limite de conservation jusqu au Lire les instructions avant utilisation Numéro de référence Fabricant Produit médical de diagnostic in-vitro Limite de température Contenu suffisant pour <n> tests irritant N o de lot Note importante es it pt nl Conservar en un lugar oscuro Nota importante Conservare al buio A utilizar preferiblemente antes de Da utilizzare entro e non oltre Antes de usar, lea las instrucciones Leggere le istruzioni prima dell uso Numero catalogo Número de catálogo Fabricante Produttore Nota importante Conservar A utilizar Antes de Número PapilloCheck Fabricante medicinal Producto high-risk num local preferívelmente as instgo usar, leia de catálo- escuro de antes de ruções Aviso importante Donker Tenminste Gebruik- Catalo- bewaren houdbaar saanwij- gusnum- tot zing lezen mer Fabrikant Producto medicinal de diagnóstica in vitro Dispositivo medicodiagnostico in-vitro diagnóstica in vitro In vitro diagnostisch medisch product Limitação de temperatura Limitación de temperatura Contenido suficiente para <n> ensayos Limitazione temperatura Contenuto sufficiente per test <n> Conteúdo suficiente para <n> ensaios Temperatuurbeperking Voldoende inhoud voor <n> tests irritante Irritante irritante Irriterend Código de lote Codice del lotto Código do lote Lot nummer Belangrijke opmerking da Opbevares mørkt Anvendes senest Læs brugsanvisningen Katalognummer Producent In vitro meskdicin doagnoseapparat Temperaturbegraensær Indeholder nok til <n> test Lokalirriterende Lotnummer Vigtig henvisning sv pl no Förvaras mörkt. Sista förbrukningsdag Viktigt meddelande Przechowywa ć w ciemności Termin zydatności ΑΝΑΦ. 505 060 Läs bruksanvisningen före Przed użyciem przeczytać instrukcję Tillverkare Producent Διαγνωστικό κιτ για användning τύπου 16, 18, 31, 33, 35, apparatur 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 σε τραχηλικά τον προσδιορισμό του nostisk γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) δείγματα Katalognummer In vitromedicinsk doag- Numer katalogowy Diagnostyka in vitro Produkt yw Ograniczenie temperatury Για διαγνωστική χρήση in vitro Oppbeva- holdbar til Les katalog- produsent in vitro-di- μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου res mørkt bruksanvisning før bruk nummer Temperatur-begränsning agnostisk medisinsk utstyr temperaturbegrensning Innehållet räcker till <n> tester Zawartość wystarcza na <n> testów Innhold tilstrekkelig for <n> tester irriterande Lot nummer drażniący Kod partii Ważne irriterende batch nr. Viktig merknad tr Karanlık yerde saklayınız Son kullanma tarihi: Kullanmadan önce talimatı Katalog numarası Üretici firma In vitro diagnostik tıbbi tanı ürünü Sıcaklık sınırlaması Greiner okuyun Bio-One GmbH İçeriği <n> test için yeterlidir Tahriş edici Parti kodu Önemli Not 2

ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ 1. ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΚΙΤ... 5 2. ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ, ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΥΛΙΚΟ... hr-hpv DNA-Chip6 3. ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΦΥΛΑΞΗ... 8 4. ΟΔΗΓΙΕΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ... 8 5. ΑΠΟΡΡΙΨΗ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ... 9 6. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 10 6.1 Ενδεδειγμένη χρήση...10 6.2 Τύποι του HPV που ανιχνεύονται με το...10 6.3 Αρχή της δοκιμής... 11 6.4 Σχεδίαση του τσιπ DNA...13 6.4.1 Διάταξη του τσιπ...13 6.4.2 Μάρτυρες επάνω στο τσιπ...14 7. ΟΔΗΓΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗ ΡΟΗ ΕΡΓΑΣΙΩΝ ΤΟΥ... 15 7.1 Γενικές οδηγίες...15 7.2 Διαχωρισμός αιθουσών...15 7.3 Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις...16 7.3.1 Αποτροπή μόλυνσης...16 7.3.2 Οδηγίες για το χειρισμό των τσιπ DNA...16 7.3.3 Γενικές προφυλάξεις...16 7.3.4 Ασφάλεια κατά την εργασία...17 8. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΤΟΥ... 18 8.1 Συλλογή δειγμάτων και εξαγωγή DNA...18 8.1.1 Συλλογή δειγμάτων...18 8.1.2 Εξαγωγή DNA...20 8.2 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)...21 8.2.1 Προετοιμασία συσκευής θερμικού κύκλου...21 Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων 8.2.2 Κατεργασία (HPV) τύπου Ουρακίλης-N-γλυκοσυλάσης 16, 18, 31, 33, 35, 39, (UNG) 45, 51,...22 52, 56, 58, 59, 66, 68 σε τραχηλικά δείγματα 8.2.3 Προετοιμασία αντίδρασης PCR...23 8.3 Υβριδισμός και πλύση...25 ΑΝΑΦ. 505 060 8.3.1 Παρασκευή και προετοιμασία...25 Για 8.3.2 διαγνωστική Υβριδισμός...27 χρήση in vitro μόνο 8.3.3 από Πλύση εξειδικευμένο και στέγνωμα...29 προσωπικό εργαστηρίου 8.4 Σάρωση και αξιολόγηση του τσιπ...31 Greiner Bio-One GmbH 3

9. ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ... 32 10. ΤΕΧΝΙΚΗ ΥΠΟΣΤΗΡΙΞΗ... 33 11. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ ΤΟΥ... 34 11.1 Αναλυτική απόδοση του...34 hr-hpv DNA-Chip 11.1.1 Αναλυτική ευαισθησία...34 11.1.2 Αναλυτική ειδικότητα τύποι HPV...35 11.1.3 Αναλυτική ειδικότητα Οργανισμοί μη-hpv...35 11.2 Επαναληψιμότητα...36 11.3 Αναπαραγωγιμότητα...37 11.4 Ευρωστία...38 11.5 Κλινική απόδοση του...39 12. ΣΥΝΤΟΜΟ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΟ... 40 12.1 Αίθουσα 2: PCR - Προετοιμασία του μείγματος αντίδρασης...40 12.2 Αίθουσα 2: PCR - Προσθήκη εκχυλισμένου DNA / αντίδραση PCR...41 12.3 Αίθουσα 3: Υβριδισμός - Προετοιμασία / Αντίδραση υβριδισμού...42 12.4 Αίθουσα 3: Πλύση και στέγνωμα / Σάρωση και αξιολόγηση...43 Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ. 505 060 Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Greiner Bio-One GmbH 4

1. ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΚΙΤ Κιτ δοκιμασίας PapilloCheck highrisk 1 Περιεχόμενο Ποσότητα PCR MasterMix Κουτί αντικειμενοφόρων πλακών, 5 x 12 Διατάξεις Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού Συμπ. BUF A Συμπ. BUF Β 5 x PCR MasterMix 2 5 x 300 µl 1 x Κουτί αντικειμενοφόρων πλακών με 5 τσιπ 3 2 x Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού 2 x συμπύκνωμα ρυθμιστικού διαλύματος Α 2 x συμπύκνωμα ρυθμιστικού διαλύματος B hr-hpv DNA-Chip 5 x 12 Διατάξεις 2 x 1.000 µl 2 x 40 ml 1 x 15 ml 1 Ένα κιτ δοκιμασίας επαρκεί για την ανάλυση 60 δειγμάτων. 2 Περιέχει όλα τα στοιχεία που απαιτούνται για την PCR εκτός από Πολυμεράση Taq DNA και Ουρακίλη-Ν-γλυκοσυλάση. Στην ετικέτα κάθε μεμονωμένου φιαλιδίου, αναγράφεται η συντομογραφία της ονομασίας, δηλαδή η ονομασία PapilloCheck hr. 3 Ένα τσιπ περιέχει 12 μικροδιατάξεις. Ένα τσιπ PapilloCheck highrisk περιέχει 12 μικροδιατάξεις. Στην ετικέτα γραμμωτού κώδικα κάθε μεμονωμένου τσιπ, αναγράφεται η συντομογραφία της ονομασίας, δηλαδή η ονομασία PapilloCheck hr. 4 Στην ετικέτα κάθε μεμονωμένου φιαλιδίου, αναγράφεται η συντομογραφία της ονομασίας, δηλαδή η ονομασία PapilloCheck hr. Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ. 505 060 Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Greiner Bio-One GmbH 5

2. ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ, ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΥΛΙΚΟ Το συνιστάται για χρήση σε συνδυασμό με τα αναγραφόμενα αναλώσιμα, τον εξοπλισμό και το υλικό και μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό. Αναλώσιμα Greiner Bio-One Αρ. Κατ. Ποσότητα hr-hpv DNA-Chip Κιτ δοκιμασίας 505 060 Κιτ δοκιμασίας για 60 αντιδράσεις Κιτ συλλογής PapilloCheck 465 070 10 δείγματα Κιτ εξαγωγής DNA / Παρασκευή με μία στήλη ocheck 515 040 Κιτ δοκιμασίας για 50 παρασκευές Κιτ εξαγωγής DNA / Παρασκευή με 8 στήλες ocheck 515 050 12 x 8 παρασκευές Αποστειρωμένα ρύγχη φίλτρου μικροπιπέτας ελεύθερα από DNase 1 Ρύγχη φίλτρου 0,5-10 µl Ρύγχη φίλτρου 0,5-20 µl Ρύγχη φίλτρου 10-100 µl Ρύγχη φίλτρου 10-200 µl Ρύγχη φίλτρου 100-1000 µl 765 288 774 288 772 288 739 288 750 288 96/960 96/960 96/960 96/960 60/600 Σωληνάρια αντίδρασης ελεύθερα από DNase Σωληνάριο αντίδρασης 1,5 ml Σωληνάριο αντίδρασης 0,2 ml 2 8 x 0,2 ml ταινίες PCR Ταινίες καπακιού για 8 x 0,2 ml ταινίες PCR 616 201 683 201 673 210 373 270 500/4000 500/1000 125/1250 125/1250 σωληνάριο πολυπροπυλενίου 50 ml 3 210 261 25/450 Πλαστικές πιπέτες για αυτόματη πιπέτα Πιπέτα 10 ml Πιπέτα 25 ml Πιπέτα 50 ml 760,180 ή 607,160 760,180 ή 760,160 786,180 ή 768,160 1/200 1/200 1/200 1 Ορισμένα από τα αναφερόμενα μεγέθη ρυγχών είναι προαιρετικά ανάλογα με τις διαθέσιμες μικροπιπέτες. 2 Κατ' αρχήν, συνιστάται η χρήση ταινιών PCR 8 σωληναρίων. Τα σωληνάρια μίας αντίδρασης (0,2 ml) είναι προαιρετικά εάν δεν υπάρχουν διαθέσιμες ταινίες. 3 Απαιτείται μόνο εάν δεν υπάρχει διαθέσιμη φυγοκέντριση αντικειμενοφόρων πλακών. Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ. 505 060 Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Greiner Bio-One GmbH 6

Εξοπλισμός Greiner Bio-One Αρ. Κατ. Ποσότητα CheckScanner TM 862 070 1 Βασικό λογισμικό CheckReport TM Software 862 080 / 862 090 4 1 Προσθήκη λογισμικού CheckReport TM 862 088 / 862 098 4 1 Θάλαμος υβριδισμού με θήκη αντικειμενοφόρων πλακών ocheck 447 070 hr-hpv DNA-Chip 1 Λαβή για θήκη αντικειμενοφόρων πλακών 447 001 1 Πλαίσιο πλύσης ocheck 4 447 020 1 ocheck VacSet 6 863 080 1 ocheck VacPump 6 863 070 1 Απαιτούμενα ένζυμα Πολυμεράση Taq: Πολυμεράση DNA HotStarTaq 5 U/µl (Qiagen, 203203, 203205, 203207, 203209) Ουρακίλη-N-γλυκοσυλάση: Ουρακίλη-DNA γλυκοσυλάση 1 U/µl (Fermentas, Αρ. EN0361, Αρ. EN0362) Πρόσθετα απαιτούμενα αναλώσιμα Νερό βαθμού PCR Αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό Γάντια μιας χρήσης Πρόσθετος απαιτούμενος εξοπλισμός Μικροφυγόκεντρος για σωληνάρια αντίδρασης 1,5 και 2 ml Φυγόκεντρος για σωληνάρια πολυπροπυλενίου 50 ml (π.χ. BeckmanCoulter, Φυγόκεντρος Allegra X-22, Ρότορας σταθερής γωνίας C0650) ή φυγόκεντρος αντικειμενοφόρων πλακών (π.χ. Labnet: Slide Spinner, VWR International: Galaxy MiniArray Centrifuge) Μικροφυγόκεντρος για μονά σωληνάρια αντίδρασης 0,2 ml ή ταινίες PCR 8 σωληναρίων (π.χ. Labnet: Spectrafuge Mini Centrifuge) Συσκευή θερμικού κύκλου PCR: Σύστημα PCR GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) ή Συσκευή θερμικού κύκλου 96 βοθρίων Veriti (Applied Biosystems) Υδατόλουτρο (50 C) Μικροπιπέτες (διαφορετικά εύρη από 1-1000 µl) Πολυπιπέτα 8 καναλιών (εύρος: 5-50 µl), π.χ. Brand Transferpette -8 (Brand) Αυτόματη πιπέτα για γυάλινες και πλαστικές πιπέτες Αναδευτήρας τύπου Vortex Στατώ για διάφορα σωληνάρια αντίδρασης Πρόσθετο απαιτούμενο υλικό Υπολογιστής (για τις απαιτήσεις συστήματος ανατρέξτε στις του CheckScanner TM και το λογισμικό CheckReport TM Software) 4 Το λογισμικό CheckReportTMSoftware είναι διαθέσιμο σε δύο εκδόσεις. Το προϊόν με Αρ. Κατ. 862 090 / 862 098 πληροί, επίσης, Διαγνωστικό τις απαιτήσεις του κιτ Κανονισμού για τον προσδιορισμό 21CFR, Τμήμα 11. του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των 5 Για τη θηλωμάτων διαδικασία πλύσης (HPV) του PapilloCheck τύπου 16, 18, high-risk 31, 33, απαιτούνται 35, 39, 45, τρία 51, πλαίσια 52, πλύσης 56, 58, ocheck 59, 66,. 68 σε τραχηλικά 6 Απαιτείται δείγματα μόνο σε συνδυασμό με το είδος με Αρ. Κατ. 515 050. ΑΝΑΦ. 505 060 Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Greiner Bio-One GmbH 7

3. ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΚΑΙ ΦΥΛΑΞΗ Η μεταφορά του κιτ δοκιμασίας λαμβάνει χώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Παρόλα αυτά, το κιτ πρέπει να φυλάσσεται αμέσως μετά την παραλαβή στους 4-8 C και θα πρέπει να προστατεύεται από το φως. Εφόσον φυλάσσεται σωστά, το κιτ δοκιμασίας PapilloCheck highrisk και τα στοιχεία του μπορούν να χρησιμοποιηθούν μέχρι την υποδεικνυόμενη ημερομηνία λήξης. hr-hpv DNA-Chip Επιπλέον, υπό αυτές τις συνθήκες η διάρκεια ζωής του δεν αποκλίνει από την ημερομηνία λήξης όταν ανοιχτεί το κιτ και τα στοιχεία του για πρώτη φορά. 4. ΟΔΗΓΙΕΣ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ Το κιτ δοκιμασίας προορίζεται μόνο για εργαστηριακή χρήση, όχι για φαρμακευτικούς, οικιακούς ή άλλους σκοπούς. Να φοράτε πάντα κατάλληλη εργαστηριακή ρόμπα, αναλώσιμα γάντια και προστατευτικά γυαλιά και να ακολουθείτε τις οδηγίες ασφαλείας που δίνονται σε αυτή την ενότητα. Τα ακόλουθα στοιχεία του κιτ δοκιμασίας περιέχουν επιβλαβή ή επικίνδυνα συστατικά. Στοιχείο Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού Ρυθμιστικό διάλυμα B Σύμβολο Συστατικά Θειοκυανική γουανιδίνη (25-60 %) Σύμβολο κινδύνου <20 % Sodium Dodecylsulfate Φράσεις ασφαλείας Επιβλαβής* Επικίνδυνη* Φράσεις ασφαλείας R 20/21/22 R 32 R 52/53 R 21/22 R 36/37/38 Φράσεις ασφαλείας S13 S61 S36/37 S26 S36/37 * Η επισήμανση των κινδύνων δεν είναι απαραίτητη για μικρότερες συσκευασίες έως 125 g ή ml (σύμφωνα με τις Οδηγίες 67/548//ΕΟΚ Άρθ. 25, 1999/45/EΚ Άρθ. 12, το γερμανικό διάταγμα για τις επικίνδυνες ουσίες GefStoffV 20 (3) καθώς και το γερμανικό κανονισμό TRGS 200 7.1). Για περαιτέρω πληροφορίες ανατρέξτε στο Δελτίο δεδομένων ασφαλείας. Φράσεις κινδύνου R 21/22 Επιβλαβές σε περίπτωση επαφής με το δέρμα και σε περίπτωση κατάποσης R 20/21/22 Επιβλαβές δια της εισπνοής, σε περίπτωση επαφής με το δέρμα και σε περίπτωση κατάποσης R 32 Η επαφή με οξέα απελευθερώνει πολύ τοξικό αέριο R 36/37/38 Ερεθίζει τα μάτια, το αναπνευστικό σύστημα και το δέρμα R 52/53 Επιβλαβές για υδρόβιους οργανισμούς, ενδέχεται να έχει μακροχρόνιες αρνητικές επιπτώσεις στο υδάτινο Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των περιβάλλον θηλωμάτων (HPV) τύπου 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 σε τραχηλικά Φράσεις δείγματα ασφαλείας S13 Μακριά από τρόφιμα, ποτά και ζωοτροφές S26 ΑΝΑΦ. Σε 505 περίπτωση 060 επαφής με τα μάτια πλύνετε αμέσως με άφθονο νερό και ζητήστε ιατρική συμβουλή S36/37 Φοράτε κατάλληλη προστατευτική ενδυμασία και γάντια S61 Για διαγνωστική Αποφεύγετε την χρήση απελευθέρωση in vitro στο περιβάλλον. Ανατρέξτε στις ειδικές οδηγίες/δελτίο Αναθεώρηση: δεδομένων ασφαλείας. BQ-013-06 μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Μπορείτε να λάβετε την τρέχουσα έκδοση του Δελτίου δεδομένων ασφαλείας για αυτό το προϊόν από το δικτυακό τόπο της Greiner Bio-One: www.gbo.com/bioscience/biochips_download Greiner Bio-One GmbH 8

5. ΑΠΟΡΡΙΨΗ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ Μετά την πλύση και το στέγνωμα του τσιπ του, μπορείτε να απορρίψετε τα διαλύματα πλύσης I, II και III χωρίς ειδικές προφυλάξεις. Απορρίπτετε το χρησιμοποιημένο τσιπ, τα μη χρησιμοποιημένα στοιχεία του κιτ, καθώς και το μη χρησιμοποιημένο μείγμα υβριδισμού με τα χημικά εργαστηριακά απόβλητα. Τηρείτε όλους τους εθνικούς, hr-hpv DNA-Chip κρατικούς και τοπικούς κανονισμούς σχετικά με την απόρριψη. Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ. 505 060 Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Greiner Bio-One GmbH 9

6. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η επίμονη λοίμωξη από τον καρκινογόνο ανθρώπινο ιό των θηλωμάτων (HPV) βρίσκεται σε όλες σχεδόν τις περιπτώσεις στον καρκίνο του τραχήλου τη δεύτερη συνηθέστερη μορφή καρκίνου σε γυναίκες σε όλο τον κόσμο. 1 Μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί περισσότεροι από 100 τύποι του HPV, εκ των οποίων 40 τύποι περίπου είναι σεξουαλικά μεταδιδόμενοι και μολύνουν τη γεννητική hr-hpv DNA-Chip βλεννογόνο. Οι τραχηλικοί τύποι του HPV ταξινομούνται τόσο στην ομάδα υψηλού κινδύνου (HPV υψηλού κινδύνου, hrhpv) όσο και χαμηλού κινδύνου (HPV χαμηλού κινδύνου, lrhpv). Ενώ οι τύποι HPV υψηλού κινδύνου συσχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του τραχήλου, οι τύποι HPV χαμηλού κινδύνου προκαλούν κυρίως καλοήθεις γεννητικούς σπίλους. 2 Ωστόσο, ακόμα και μέσα στην ομάδα υψηλού κινδύνου, ο σχετικός κίνδυνος για την ανάπτυξη καρκίνου ή τραχηλικών ενδοεπιθηλιακών βλαβών (CIN) εξαρτάται από τον τύπο. 3 Περίπου 70 % του συνόλου των περιστατικών καρκίνου του τραχήλου συνδέονται με επίμονη λοίμωξη από τον HPV 16 ή 18. Οι πιο κυρίαρχοι τύποι χαμηλού κινδύνου είναι οι HPV 6 και 11. Με βάση την σχεδόν απόλυτη αιτιολογική σύνδεση μεταξύ του καρκινογόνου HPV και του καρκίνου του τραχήλου, η εξέταση για hrhpv μελετάται πλέον για πρωτογενή προσυμπτωματικό έλεγχο για τον καρκίνο του τραχήλου. 4 6.1 Ενδεδειγμένη χρήση Το είναι ένα διαγνωστικό κιτ και προορίζεται για χρήση στην ποιοτική ανίχνευση και τον προσδιορισμό του γονότυπου 14 τύπων του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων υψηλού κινδύνου του γεννητικού συστήματος (hrhpv) σε παρασκευές DNA από ανθρώπινα τραχηλικά επιχρίσματα. Το κιτ προορίζεται για χρήση μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό Το κιτ προορίζεται για χρήση μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό. Το πληροί τις προϋποθέσεις της Οδηγίας για τα ιατροτεχνολογικά βοηθήματα που χρησιμοποιούνται στη διάγνωση (98/79/ΕΚ) κι επομένως, φέρει το σύμβολο συμβατότητας "CE". Οποιοδήποτε διαγνωστικό αποτέλεσμα παράγεται με τη χρήση του θα πρέπει να ερμηνεύεται σε συνδυασμό με άλλα κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα. 6.2 Τύποι του HPV που ανιχνεύονται με το Το επιτρέπει την ταυτοποίηση 14 καρκινογόνων τύπων του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων υψηλού κινδύνου (hrhpv) (Πίνακας 1). Πίνακας 1: Τύποι του HPV που ανιχνεύονται με το HPV 16 HPV 51 HPV 18 HPV 52 HPV 31 HPV 56 HPV Διαγνωστικό 33 κιτ HPV για 58τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 σε τραχηλικά HPV δείγματα 35 HPV 59 HPV 39 HPV 66 ΑΝΑΦ. 505 060 HPV 45 HPV 68 Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου 1 Walboomers, J. et al (1999). Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol. 189(1):12-9. 2 Burd EM. Human papillomavirus and cervical cancer. Clin Microbiol Rev. 2003;16:1 17. 3 Bosch F.X. et al. (2008). Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type-specificimplications in cervical neoplasia. Vaccine. 26 Suppl 10:K1-16. 4 Meijer, C.J. et al. (2009). Guidelines for human papillomavirus DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older. Int J Cancer. 124(3):516-20. Greiner Bio-One GmbH 10

6.3 Αρχή της δοκιμής Το είναι ένα κιτ δοκιμασίας που βασίζεται σε μικροδιάταξη για την ανίχνευση και τον προσδιορισμό του γονότυπου ενός κλάσματος του γονιδίου E1 του γονιδιώματος του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV). Η διαδικασία δοκιμής συνοψίζεται στην Εικόνα 1. hr-hpv DNA-Chip Πριν από την ανάλυση, πρέπει να εκτελεστεί εξαγωγή DNA από ένα δείγμα τραχηλικού επιχρίσματος. Η συλλογή δειγμάτων και η εξαγωγή DNA δεν αποτελούν μέρος του κιτ δοκιμασίας. Διατίθενται επίσης ειδικά προϊόντα για τη συλλογή δείγματος (Κιτ Συλλογής PapilloCheck ) και εξαγωγή DNA (ocheck Κιτ εξαγωγής DNA) από την Greiner Bio- One και μπορείτε να τα προμηθευτείτε ξεχωριστά (ανατρέξτε στις πληροφορίες παραγγελίας στο Κεφάλαιο 2). Μετά από την εξαγωγή του ιικού και ανθρώπινου γονιδιωματικού DNA από ένα τραχηλικό δείγμα, ένα κλάσμα 350 bp του ιικού γονιδίου E1 ενισχύεται με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) παρουσία ενός σετ HPV-ειδικών υγρών πλήρωσης. Στην ίδια αντίδραση, ένα κλάσμα του ανθρώπινου γονιδίου μονού αντιγράφου ADAT1 (ανθρώπινη trna-ειδική αδενοσίνη δεαμινάση1) ενισχύεται για την παρακολούθηση της παρουσίας ανθρώπινου υλικού δείγματος στο τραχηλικό δείγμα (μάρτυρας δείγματος) και ένας εσωτερικός εκχυλισμένος μάρτυρας που βρίσκεται στο PapilloCheck highrisk PCR MasterMix ενισχύεται για την παρακολούθηση της απόδοσης του PCR (μάρτυρας PCR). Επιπλέον, το PCR MasterMix περιέχει dutp. Συνεπώς, μπορεί να εξαλειφθεί η πιθανότητα επιμόλυνσης μεταφοράς από προηγούμενες αντιδράσεις PCR μέσω της χρήσης κατεργασίας Ουρακίλης-Ν-γλυκοσυλάσης (UNG) (βλ. κεφάλαιο 8.2.2). Στη συνέχεια, τα προϊόντα PCR υβριδοποιούνται σε ειδικούς ανιχνευτές DNA και σε μάρτυρες σε τσιπ που είναι συνδεδεμένα στην επιφάνεια του τσιπ του. Κάθε τσιπ περιέχει 12 DNA-μικροδιατάξεις, που επιτρέπουν ταυτόχρονη ανάλυση 12 τραχηλικών δειγμάτων. Κατά τον υβριδισμό, το δεσμευμένο DNA επισημαίνεται με φθορισμό και το αδέσμευτο DNA αφαιρείται στα επόμενα βήματα πλύσης. Η αποτελεσματικότητα του υβριδισμού παρακολουθείται (μάρτυρας υβριδισμού). Τέλος, το τσιπ PapilloCheck high-risk σαρώνεται, αναλύεται και αξιολογείται αυτόματα χρησιμοποιώντας το CheckScanner TM και το λογισμικό CheckReport TM Software, αντίστοιχα (ανατρέξτε στις πληροφορίες παραγγελίας στο Κεφάλαιο 2). Το CheckScanner TM είναι ένας δίχρωμος σαρωτής λέιζερ (μήκη κύματος διέγερσης 532 nm και 635 nm), που επιτρέπει την ανίχνευση του σήματος φθορισμού που παράγεται από την παρουσία των HPV-ειδικών προϊόντων ενίσχυσης καθώς και των μαρτύρων (βλ. κεφάλαιο 6.4.2). Το λογισμικό CheckReport TM Software επιτρέπει την οπτικοποίηση, ανάλυση και αξιολόγηση των αποτελεσμάτων και εμφανίζει αυτόματα τις αντίστοιχες τιμές τόσο των ανιχνευμένων τύπων HPV όσο και των μαρτύρων σε μια λεπτομερή αναφορά. Η αναφορά Διαγνωστικό υποδεικνύει κιτ για με τον σαφήνεια προσδιορισμό την παρουσία του γονότυπου ή απουσία ενός του ανθρώπινου ή περισσότερων ιού από των τους 14 τύπους θηλωμάτων HPV υψηλού (HPV) κινδύνου τύπου που 16, είναι 18, 31, ανιχνεύσιμοι 33, 35, 39, και 45, οι 51, περιεκτικοί 52, 56, 58, μάρτυρες 59, 66, 68 επάνω σε τραχηλικά στο τσιπ καθιστούν δείγματα την ανάλυση εξαιρετικά αξιόπιστη. ΑΝΑΦ. 505 060 Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Greiner Bio-One GmbH 11

1. Αντίδραση PCR hr-hpv DNA-Chip 2. Υβριδοποίηση 3. Πλύση και στέγνωμα ή 4. Σάρωση και ανάλυση Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ. 505 060 Για διαγνωστική χρήση in vitro Εικόνα μόνο 1:Διαδικασία από εξειδικευμένο δοκιμής PapilloCheck προσωπικό εργαστηρίου high-risk 1. Αντίδραση PCR: Μετά από την εξαγωγή DNA, ένα κλάσμα 350 bp του ιικού γονιδίου E1 και κλάσματα δύο στόχων μαρτύρων ενισχύονται με PCR. Στη συνέχεια, τα προϊόντα ενίσχυσης υβριδοποιούνται σε συμπληρωματικούς ανιχνευτές DNA στο τσιπ. 2. Υβριδοποίηση: Κάθε τύπος HPV ανιχνεύεται από έναν ειδικό ανιχνευτή DNA που υπάρχει σε πέντε αντίγραφα. Κατά τον υβριδισμό εισάγεται η σήμανση φθορισμού. 3. Πλύση και στέγνωμα: Το αδέσμευτο DNA αφαιρείται στα επόμενα βήματα πλύσης. 4. Σάρωση και ανάλυση: Greiner Το Bio-One τσιπ PapilloCheck GmbH high-risk σαρώνεται, αναλύεται και αξιολογείται χρησιμοποιώντας το CheckScanner TM και Maybachstr. το λογισμικό 2 CheckReport 72636 Frickenhausen TM Software. Δημιουργείται Germany μια αναφορά που υποδεικνύει σαφώς την παρουσία ή απουσία Τηλέφωνο: ενός ή περισσότερων +49 (0) 7022 από 948-0 τους 14 Fax τύπους +49 (0) HPV 7022 που 948-514 μπορούν να ανιχνευτούν. 12

6.4 Σχεδίαση του τσιπ DNA 6.4.1 Διάταξη του τσιπ Κάθε τσιπ περιέχει 12 μικροδιατάξεις που καθορίζονται ως βοθρίο A1 - B6. Κάθε μικροδιάταξη αποτελείται από 28 διαφορετικούς ανιχνευτές hr-hpv DNA-Chip και πλαισιώνεται από υπερυψωμένο χείλος. Κάθε ανιχνευτής εναποτίθεται σε κηλίδες σε πέντε αντίγραφα. Η διάταξη της μικροδιάταξης απεικονίζεται στην Εικόνα 2 και οι μάρτυρες επάνω στο τσιπ επεξηγούνται περαιτέρω στο Κεφάλαιο 6.4.2. α) μάρτυρας προσανατολισμού Μάρτυρας υβριδισμού κόκκινο κανάλι (635 nm) HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 45 HPV 51 HPV 52 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 β) γ) πράσινο κανάλι (532 nm) μάρτυρας δείγματος μάρτυρας προσανατολισμού HPV 16 HPV 18 HPV 31 HPV 33 HPV 35 HPV 39 HPV 45 μάρτυρας δείγματος μάρτυρας PCR Μάρτυρας υβριδισμού HPV 51 HPV 52 HPV 56 HPV 58 HPV 59 HPV 66 HPV 68 μάρτυρας PCR Εικόνα 2: Σχεδίαση του τσιπ α) Σχηματική αναπαράσταση του τσιπ. β) και γ) Εικόνες που εμφανίζονται από το λογισμικό CheckReport TM Software για τα δύο διαφορετικά μήκη κύματος διέγερσης που χρησιμοποιούνται για σάρωση (β) κόκκινο Διαγνωστικό κανάλι: 635 nm, κιτ γ) πράσινο για τον κανάλι: προσδιορισμό 532 nm) και σχηματικές του γονότυπου αναπαραστάσεις του ανθρώπινου της διάταξης ιού μικροδιατάξεων των του PapilloCheck θηλωμάτων high-risk. (HPV) Οι ειδικοί τύπου ανιχνευτές 16, 18, τύπου 31, HPV 33, και 35, οι 39, μάρτυρες 45, 51, επάνω 52, στο 56, τσιπ 58, υποδεικνύονται. 59, 66, 68 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ. 505 060 Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Greiner Bio-One GmbH 13

6.4.2 Μάρτυρες επάνω στο τσιπ Η σχεδίαση του τσιπ DNA του ενσωματώνουν περιεκτικούς μάρτυρες επάνω στο τσιπ. Πολλά συστήματα ελέγχου παρακολουθούν όλα τα κρίσιμα βήματα τόσο της δοκιμής όσο και της επεξεργασίας του τσιπ, συμπεριλαμβανομένης της ποιότητας δείγματος και της εξαγωγής DNA (μάρτυρας δείγματος), της ποιότητας της αντίδρασης PCR (μάρτυρας PCR), της αποτελεσματικότητας του υβριδισμού (μάρτυρας υβριδισμού), καθώς και της ομοιογένειας κηλίδων και της ποιότητας hr-hpv εκτύπωσης DNA-Chip (μάρτυρας προσανατολισμού και μάρτυρας εκτύπωσης). Εκτός από την παρουσία ή απουσία των τύπων HPV, το λογισμικό CheckReport Software εμφανίζει αυτόματα τις αντίστοιχες τιμές των μαρτύρων και τους ανιχνευμένους τύπους HPV σε μια λεπτομερή αναφορά. Για τη μέτρηση των διαφόρων μαρτύρων χρησιμοποιούνται και τα δύο μήκη κύματος διέγερσης του CheckScanner. Για το μάρτυρα της απόδοσης της δοκιμής (μάρτυρας δείγματος και PCR), χρησιμοποιείται το κόκκινο κανάλι (μήκος κύματος διέγερσης 635 nm), ενώ η ποιότητα του υβριδισμού και του τσιπ (μάρτυρας υβριδισμού, προσανατολισμού και εκτύπωσης) αποτιμάται στο πράσινο κανάλι (μήκος κύματος διέγερσης 532 nm). Μάρτυρας δείγματος Το παρακολουθεί την ποιότητα του δείγματος ή/και την εξαγωγή DNA ενισχύοντας ένα κλάσμα του ανθρώπινου γονιδίου ADAT1 (ανθρώπινη trna-ειδική αδενοσίνη δεαμινάση1) μονού αντιγράφου. Εάν υπάρχει ανθρώπινο DNA σε επαρκή ποσότητα στο DNA που έχει εξαχθεί από τραχηλικό δείγμα, παράγεται ένα σήμα φθορισμού στις κηλίδες του μάρτυρα δείγματος. Εάν δεν προκύψει καμία ή ανεπαρκής ενίσχυση ADAT1, το λογισμικό CheckReport Software θα υποδείξει ότι ο μάρτυρας δείγματος "απέτυχε" και πρέπει να επαναληφθεί η ανάλυση ως συνέπεια της ύπαρξης ανεπαρκούς ποσότητας κυττάρων στο τραχηλικό δείγμα ή/και ανεπαρκούς απόδοσης εξαγωγής (βλ. Κεφάλαιο 9). Μάρτυρας PCR Το παρακολουθεί επίσης την ποιότητα της αντίδρασης PCR. Η ενίσχυση ενός εσωτερικού εκχυλισμένου μάρτυρα που PapilloCheck υπάρχει στο PapilloCheck high-risk high-risk PCR MasterMix παράγει ένα σήμα στις κηλίδες μάρτυρα PCR που βρίσκονται στο τσιπ. Η ποιότητα της αντίδρασης ενίσχυσης αποτιμάται επίσης αυτόματα από το λογισμικό CheckReport Software. Εάν η απόδοση PCR είναι χαμηλότερη από ένα προκαθορισμένο κατώφλι, το λογισμικό CheckReport Software υποδεικνύει ότι ο μάρτυρας PCR "απέτυχε" και πρέπει να επαναληφθεί η ανάλυση (βλ. Κεφάλαιο 9). Εάν η ποσότητα DNA του HPV στο δείγμα είναι πολύ υψηλή, το σήμα φθορισμού των κηλίδων μάρτυρα PCR μπορεί να είναι χαμηλό ή ακόμα και να απουσιάζει λόγω ανταγωνισμού κατά την αντίδραση PCR. Σε αυτή την περίπτωση, το σήμα φθορισμού για έναν τουλάχιστον HPV-ειδικό ανιχνευτή πρέπει να υπερβαίνει ένα προκαθορισμένο κατώφλι, προκειμένου θα θεωρηθεί έγκυρη η δοκιμασία. Μάρτυρας υβριδισμού Το PapilloCheck Διαγνωστικό high-risk παρακολουθεί την αποτελεσματικότητα του υβριδισμού μέσω της χρήσης κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των ενός ανιχνευτή θηλωμάτων με σήμανση (HPV) τύπου φθορισμού 16, 18, που 31, 33, βρίσκεται 35, 39, μέσα 45, 51, στο 52, Ρυθμιστικό 56, 58, 59, διάλυμα 66, 68 υβριδισμού σε τραχηλικά του PapilloCheck δείγματα high-risk, το οποίο υβριδοποιεί τις ειδικές αλληλουχίες DNA στο τσιπ του PapilloCheck high-risk. Μια επαρκής αποτελεσματικότητα υβριδισμού οδηγεί σε σήματα φθορισμού σε κάθε κηλίδα διάταξης. ΑΝΑΦ. Τα αποτελέσματα 505 060 πέντε κηλίδων μάρτυρα υβριδισμού στο τσιπ του αποτιμούνται επίσης από το λογισμικό CheckReport TM Software. Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Μάρτυρας προσανατολισμού και εκτύπωσης Οι κηλίδες μάρτυρα προσανατολισμού του τσιπ παράγουν σήματα φθορισμού ανεξάρτητα από την αποτελεσματικότητα της διεργασίας υβριδισμού. Αυτές οι κηλίδες χρησιμοποιούνται από το λογισμικό CheckReport TM Software ως σημεία καθοδήγησης για σωστό εντοπισμό των κηλίδων, που αποτελεί προαπαιτούμενο για τη σωστή ανάλυση των σημάτων. Επιπλέον, η ποιότητα της διεργασίας Greiner Bio-One GmbH εκτύπωσης παρακολουθείται από την παρουσία ενός πράσινου σήματος φθορισμού σε κάθε κηλίδα του τσιπ (μάρτυρας εκτύπωσης). 14

7. ΟΔΗΓΙΕΣ ΓΙΑ ΤΗ ΡΟΗ ΕΡΓΑΣΙΩΝ ΤΟΥ PapilloCheck high-risk 7.1 Γενικές οδηγίες Εάν στο εργαστήριο υλοποιούνται οι τρέχουσες χρησιμοποιούμενες τεχνικές αιχμής hr-hpv στη DNA-Chip μοριακή βιολογία, θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη οι παρακάτω οδηγίες ώστε να διασφαλίζεται τόσο η μέγιστη ασφάλεια για το εργαστηριακό προσωπικό όσο και αποτελέσματα υψηλής ποιότητας. Η εκτέλεση τεχνικών μοριακής βιολογίας όπως η εξαγωγή DNA, η ενίσχυση και η ανίχνευση των προϊόντων ενίσχυσης απαιτούν κατάλληλα εξειδικευμένο προσωπικό. Επιπλέον, απαιτείται σαφής και καλά δομημένη ροή εργασιών ώστε να αποτρέπονται εσφαλμένα αποτελέσματα, όπως αυτά που προκύπτουν λόγω εξασθένισης ή μόλυνσης του DNA από τα προϊόντα ενίσχυσης. Για να διασφαλιστεί αυτό, απαιτείται ο διαχωρισμός των χώρων εξαγωγής, ενίσχυσης και ανίχνευσης, όπως περιγράφεται στο Κεφάλαιο 7.2. Κάθε χώρος πρέπει να είναι εξοπλισμένος με ξεχωριστό εξοπλισμό, αναλώσιμα, εργαστηριακές ρόμπες και γάντια. Μην μεταφέρετε ποτέ εργαστηριακές ρόμπες, γάντια ή εξοπλισμό από τον ένα ξεχωριστό χώρο στον άλλο. 7.2 Διαχωρισμός αιθουσών Η Εικόνα 3 απεικονίζει ένα παράδειγμα του τρόπου με τον οποίο μπορεί να διαχωριστεί το εργαστήριο σε τρεις ευδιάκριτες περιοχές. Η μια περιοχή χρησιμοποιείται μόνο για την εξαγωγή DNA, η άλλη για την προετοιμασία και την εκτέλεση αντιδράσεων PCR και η τελευταία για τον υβριδισμό και την ανάλυση. Κάθε αίθουσα χρησιμοποιείται αποκλειστικά για την εφαρμογή ή την τεχνική που υποδεικνύεται, προκειμένου να αποτρέπεται η μόλυνση των δειγμάτων. Η χρήση χρωματικού κώδικα θα μπορούσε να είναι ωφέλιμη στην αποφυγή τυχαίας μεταφοράς εξοπλισμού και αναλωσίμων από τη μία περιοχή στην άλλη. Αίθουσα 1 Αίθουσα 2 Αίθουσα 3 Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 σε τραχηλικά Εικόνα δείγματα 3: Διαχωρισμός αιθουσών Αίθουσα 1: Ολόκληρη η διαδικασία εξαγωγής DNA πρέπει να εκτελείται σε αυτή την αίθουσα. Αίθουσα ΑΝΑΦ. 2: Μέσα 505 σε αυτή 060την αίθουσα, προετοιμάζεται και διαιρείται σε κλάσματα το μείγμα αντίδρασης για την αντίδραση PCR (ιδανικά κάτω από απαγωγό PCR). Η προσθήκη των δειγμάτων DNA που έχουν εξαχθεί στην αίθουσα 1 πρέπει να διενεργηθεί Για διαγνωστική σε ξεχωριστό χώρο χρήση μέσα στην in vitro αίθουσα 2. Αίθουσα μόνο 3: Στην από τρίτη εξειδικευμένο αίθουσα του εργαστηρίου προσωπικό πραγματοποιούνται εργαστηρίου η αντίδραση υβριδισμού, τα βήματα πλύσης Απρίλιος και το 2011 στέγνωμα του τσιπ. Επιπλέον, το CheckScanner TM σε συνδυασμό με το λογισμικό CheckReport TM Software χρησιμοποιείται για την τελική ανάλυση της δοκιμής.! Δεν πρέπει να γίνεται ανταλλαγή εξοπλισμού ή αναλωσίμων μεταξύ των αιθουσών και των χώρων του εργαστηρίου. Συνεπώς, η ύπαρξη πολλαπλού εξοπλισμού και αναλωσίμων είναι απαραίτητη και θα πρέπει να λαμβάνεται Greiner υπόψη Bio-One κατά τον GmbH εξοπλισμό του εργαστηρίου. 15

7.3 Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις 7.3.1 Αποτροπή μόλυνσης Σε όλη τη διάρκεια της διαδικασίας το προσωπικό πρέπει να φορά εργαστηριακές ρόμπες, ενώ για κάθε αίθουσα του εργαστηρίου απαιτούνται διαφορετικές εργαστηριακές ρόμπες. hr-hpv DNA-Chip Το προσωπικό πρέπει να φορά γάντια σε κάθε βήμα της ανάλυσης και να τα αλλάζει συχνά, ιδιαίτερα κατά την εξαγωγή DNA. Το περιβάλλον εργασίας πρέπει να απολυμαίνεται με κατάλληλο διάλυμα καθαρισμού. Μην αγγίζετε ποτέ το εσωτερικό του καπακιού του σωληναρίου αντίδρασης. Για να αποφύγετε τη διασταυρούμενη επιμόλυνση, πρέπει να ανοίγετε μόνο ένα σωληνάριο κάθε φορά. Πρέπει να χρησιμοποιούνται κατάλληλα ρύγχη φίλτρου μικροπιπέτας με συγκράτηση αερολυμάτων (ελεύθερα από DNase, RNase και ανθρώπινο DNA). Τα ρύγχη πιπέτας πρέπει να αντικαθίστανται πάντα μεταξύ των μεταφορών υγρού. 7.3.2 Οδηγίες για το χειρισμό των τσιπ DNA Τα τσιπ DNA θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σε ένα περιβάλλον χωρίς σκόνη. Πρέπει να αποτρέπεται η εναπόθεση σκόνης και άλλων σωματιδίων στην επιφάνεια του τσιπ. Μην αγγίζετε τη ζώνη υβριδισμού στην επιφάνεια του τσιπ. Μόνο η επισημασμένη πλευρά του τσιπ προορίζεται για υβριδισμό. Μη χρησιμοποιείτε οποιουσδήποτε μαρκαδόρους για την ταυτοποίηση των τσιπ DNA, επειδή προκαλούν μη ειδικό φθορισμό στο τσιπ. Οι διατάξεις DNA προορίζονται για μία μόνο χρήση. Τα υβριδοποιημένα τσιπ δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν ξανά. Φυλάσσετε τα μη χρησιμοποιημένα τσιπ στην αρχική συσκευασία μέσα στον ασκό αποστολής με φερμουάρ που περιέχει αφυγραντικό υλικό. 7.3.3 Γενικές προφυλάξεις Αυτό το κιτ προορίζεται αποκλειστικά και μόνο για in vitro διαγνωστική χρήση και θα πρέπει να χρησιμοποιείται από προσωπικό που έχει καταρτιστεί στην in vitro διαγνωστική εργαστηριακή πρακτική. Κατά την άφιξή του, ελέγξτε τα στοιχεία του κιτ για βλάβη. Εάν ένα από τα περιεχόμενα είναι κατεστραμμένο (π.χ. οι φιάλες ρυθμιστικού διαλύματος), επικοινωνήστε με τον διανομέα της Greiner Bio-One της περιοχής σας. Μην χρησιμοποιείτε κατεστραμμένα περιεχόμενα του κιτ, καθώς η χρήση τους ενδέχεται να οδηγήσει σε κακή απόδοση του κιτ. Μη χρησιμοποιείτε το κιτ δοκιμασίας PapilloCheck Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου high-risk μετά από την ημερομηνία λήξης. του ανθρώπινου ιού των Μην θηλωμάτων χρησιμοποιείτε (HPV) αντιδραστήρια τύπου 16, 18, που 31, έχουν 33, 35, λήξει. 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 σε τραχηλικά Μην δείγματα αναμειγνύετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες. Χρησιμοποιείτε μόνο τα αντιδραστήρια/τον εξοπλισμό που παρέχονται και συνιστώνται από τον ΑΝΑΦ. 505 060 κατασκευαστή. Θα Για πρέπει διαγνωστική να εκτελείτε χρήση τακτικά in vitro βαθμονόμηση/συντήρηση για τις μικροπιπέτες, Αναθεώρηση: το υδατόλουτρο BQ-013-06 και μόνο το θερμικό από εξειδικευμένο μπλοκ. προσωπικό εργαστηρίου Η αναρρόφηση με πιπέτα μικρής ποσότητας υγρού της κλίμακας μικρολίτρων αποτελεί πρόκληση. Συνεπώς, απαιτείται προσοχή ώστε η αναρρόφηση με την πιπέτα να γίνεται όσο το δυνατόν με μεγαλύτερη ακρίβεια. Για την αποφυγή μικροβιακής μόλυνσης των αντιδραστηρίων, απαιτείται προσοχή κατά την αφαίρεση κλασμάτων Greiner από Bio-One τα σωληνάρια GmbH αντιδραστηρίων. Όλα τα βήματα Maybachstr. φυγοκέντρισης 2 72636 θα πρέπει Frickenhausen να διεξάγονται Germany σε θερμοκρασία δωματίου (18-25 C). 16

7.3.4 Ασφάλεια κατά την εργασία Να είστε προσεκτικοί κατά το χειρισμό βιολογικών δειγμάτων που περιέχουν δυνητικά μολυσματικά ανθρώπινα υλικά. Για την ελαχιστοποίηση του κινδύνου μόλυνσης από δυνητικά μολυσματικό υλικό, συνιστάται να εργάζεστε υπό συνθήκες θαλάμου νηματικής ροής, μέχρι την ολοκλήρωση της λύσης των δειγμάτων. Να χειρίζεστε και να απορρίπτετε όλα τα βιολογικά δείγματα, όπως εάν υπήρχε πιθανότητα μετάδοσης μολυσματικών παραγόντων. hr-hpv DNA-Chip Ποτέ μην αναρροφάτε με πιπέτα τα διαλύματα με το στόμα. Μην τρώτε, μην πίνετε, μην καπνίζετε και μην χρησιμοποιείτε καλλυντικά στους χώρους εργασίας. Αποφεύγετε την άμεση επαφή με τα βιολογικά δείγματα καθώς και την εκτόξευση ή τον ψεκασμό των δειγμάτων. Να φοράτε πάντα εργαστηριακή ρόμπα, γάντια και γυαλιά ασφαλείας κατά την εργασία με ανθρώπινα δείγματα. Πλένετε τα χέρια σας προσεκτικά μετά από το χειρισμό των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων. Διαγνωστικό κιτ για τον προσδιορισμό του γονότυπου του ανθρώπινου ιού των θηλωμάτων (HPV) τύπου 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 σε τραχηλικά δείγματα ΑΝΑΦ. 505 060 Για διαγνωστική χρήση in vitro μόνο από εξειδικευμένο προσωπικό εργαστηρίου Greiner Bio-One GmbH 17

8. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΤΟΥ Το παρακάτω κεφάλαιο περιγράφει λεπτομερώς τα διαφορετικά βήματα εργασίας που οδηγούν τελικά στη δημιουργία μιας λεπτομερούς αναφοράς, η οποία υποδεικνύει σαφώς την παρουσία ή απουσία ενός ή περισσότερων από τους 14 τύπους HPV υψηλού κινδύνου που μπορούν να ανιχνευτούν σε κάθε τραχηλικό δείγμα που αναλύεται. Η Εικόνα 4 εμφανίζει μια επισκόπηση των διαφόρων απαραίτητων βημάτων εργασίας. Επίσης, υποδεικνύει το αντίστοιχο υπο-κεφάλαιο που περιγράφει το συγκεκριμένο βήμα δοκιμής. Τα βήματα εργασίας πρέπει να εκτελούνται με τη σειρά που περιγράφεται σε αυτό το κεφάλαιο. Κάθε συγκεκριμένο πρακτικό βήμα υποδεικνύεται με ένα μπλε βέλος.! Η συλλογή δειγμάτων, η εξαγωγή DNA και η ανάλυση με το λογισμικό CheckReport TM Software δεν αποτελούν μέρος του κιτ δοκιμασίας Συνεπώς, η περιγραφή αυτών των βημάτων εργασίας συνοψίζεται σε αυτό το κεφάλαιο. Για πιο λεπτομερείς πληροφορίες, ανατρέξτε στις αντίστοιχες, π.χ. από το Κιτ συλλογής PapilloCheck το Κιτ εξαγωγής DNA ocheck και το λογισμικό CheckReport TM Software. 8.1 Συλλογή δειγμάτων και εξαγωγή DNA 8.1.1 Συλλογή δειγμάτων Η συλλογή δειγμάτων δεν αποτελεί μέρος του κιτ δοκιμασίας. Διατίθεται επίσης ειδικό κιτ συλλογής για τραχηλικά δείγματα (Κιτ συλλογής PapilloCheck ) από την Greiner Bio-One (ανατρέξτε στις πληροφορίες παραγγελίας στο Κεφάλαιο 2). Το έχει επικυρωθεί με χρήση DNA που παρασκευάστηκε με το Κιτ εξαγωγής DNA ocheck από ανθρώπινα τραχηλικά επιχρίσματα που συλλέχθηκαν με ένα από τα παρακάτω συστήματα ή μέσα συλλογής: Κιτ συλλογής PapilloCheck (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany) PreservCyt (Hologic, Bedford, MA, USA) Surepath (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) STM TM (Qiagen, Hilden, Germany). Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τα κατάλληλα μέσα μεταφοράς ή τα συστήματα εξαγωγής DNA, επικοινωνήστε με τον τοπικό διανομέα της Greiner Bio-One ή συμβουλευτείτε το δικτυακό τόπο της Greiner Bio-One: www.gbo.com/bioscience/biochips_download Αναθεώρηση: BQ-013-07 / Αύγουστος 2011 18

Κεφάλαιο 8.1.2 Εξαγωγή DNA Κεφάλαιο 8.2 PCR Κεφάλαιο 8.3.2 Υβριδισμός Κεφάλαιο 8.3.3 Πλύση και στέγνωμα ή Κεφάλαιο 8.4. Σάρωση και αξιολόγηση Εικόνα 4: Επισκόπηση των διαφόρων βημάτων εργασίας του Αναθεώρηση: BQ-013-07 / Αύγουστος 2011 19

8.1.2 Εξαγωγή DNA Η εξαγωγή DNA δεν αποτελεί μέρος του κιτ δοκιμασίας. Η εξαγωγή DNA πριν από την ανάλυση του πρέπει να εκτελείται χρησιμοποιώντας το Κιτ εξαγωγής DNA ocheck, το οποίο διατίθεται επίσης από την Greiner Bio-One (ανατρέξτε στις πληροφορίες παραγγελίας στο Κεφάλαιο 2). Ακολουθήστε προσεκτικά τις όταν χρησιμοποιείτε το Κιτ εξαγωγής DNA ocheck. Για εξαγωγή DNA με το Κιτ εξαγωγής DNA ocheck, πρέπει να χρησιμοποιηθεί διάλυμα δείγματος 250 µl. Δείγματα ανθρώπινου τραχηλικού επιχρίσματος τα οποία συλλέγονται με το Κιτ συλλογής PapilloCheck (Greiner Bio-One, Αρ. Κατ. 465 070) σε μέσο συλλογής PreservCyt (Hologic, Bedford, MA, USA) μπορούν να υποβληθούν απευθείας σε επεξεργασία. Τα τραχηλικά δείγματα τα οποία συλλέγονται σε μέσο συλλογής Surepath TM (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) πρέπει να υποβάλλονται σε πλύση πριν από τη χρήση: φυγοκεντρίστε 250 µl του δείγματος για 5 λεπτά στα 11.000 g και επανεναιωρήστε το ίζημα σε 250 µl αποσταγμένο νερό. Στη συνέχεια, η ποσότητα 250 µl μπορεί να υποβληθεί σε επεξεργασία με το Κιτ εξαγωγής DNA ocheck. Τα τραχηλικά δείγματα τα οποία συλλέγονται σε μέσο συλλογής STM TM (Qiagen, Hilden, Germany) πρέπει να αραιωθούν: χρησιμοποιήστε 100 µl του δείγματος και προσθέστε 150 µl αποσταγμένο νερό. Η ποσότητα 250 µl του αραιωμένου δείγματος μπορεί να υποβληθεί σε επεξεργασία με το Κιτ εξαγωγής DNA ocheck. Γενικά, εάν το δείγμα του κολπικού επιχρίσματος φαίνεται να είναι υπερβολικά συμπυκνωμένο και ήδη συσσωματωμένο, το δείγμα πρέπει να αραιωθεί και να ομογενοποιηθεί πριν από την έναρξη της εξαγωγής DNA! Τα δείγματα κολπικού επιχρίσματος που είναι υπερβολικά αραιά και στα οποία δεν υπάρχουν ορατά κύτταρα πρέπει να συμπυκνώνονται, προκειμένου να επιτευχθεί υψηλότερος αριθμός κυττάρων για εξαγωγή DNA: φυγοκεντρίστε μέχρι 1000 µl του δείγματος για 5 λεπτά στα 11.000 g και επανεναιωρήστε το ίζημα σε 250 µl αποσταγμένο νερό. Στη συνέχεια, η ποσότητα 250 µl μπορεί να υποβληθεί σε επεξεργασία με το Κιτ εξαγωγής DNA ocheck.! Αυτό το βήμα συγκέντρωσης είναι κατάλληλο μόνο για δείγματα τραχηλικού επιχρίσματος τα οποία συλλέχθηκαν με το Κιτ συλλογής PapilloCheck σε μέσο συλλογής PreservCyt ή σε μέσο συλλογής SurepathTM. Εάν χρησιμοποιήθηκε το μέσο συλλογής STM TM δεν είναι δυνατή η συγκέντρωση με φυγοκέντριση. Αναθεώρηση: BQ-013-07 / Αύγουστος 2011 20

8.2 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Η PCR είναι μια πολύ ευαίσθητη μέθοδος, η οποία μπορεί να ανιχνεύσει εξαιρετικά μικρές ποσότητες DNA. Πρέπει να τηρούνται ειδικές προφυλάξεις προκειμένου να αποφεύγεται μόλυνση της αντίδρασης (βλ. Κεφάλαιο 7). Απαιτείται Πολυμεράση HotStarTaq και Ουρακίλη-Ν-γλυκοσυλάση, αλλά δεν παρέχονται με το κιτ δοκιμασίας και πρέπει να τα προμηθευτείτε χωριστά (βλ. Κεφάλαιο 2).! Το Κιτ δοκιμασίας έχει επικυρωθεί χρησιμοποιώντας Πολυμεράση HotStarTaq από την Qiagen και Ουρακίλη-N-γλυκοσυλάση από την Fermentas (βλ. πληροφορίες παραγγελίας στο Κεφάλαιο 2). Η χρήση αυτών των ενζύμων είναι υποχρεωτική προκειμένου να επιτευχθεί η καθιερωμένη απόδοση. 8.2.1 Προετοιμασία συσκευής θερμικού κύκλου Το κιτ δοκιμασίας έχει επικυρωθεί με τις ακόλουθες συσκευές θερμικού κύκλου: Σύστημα PCR GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) Συσκευή θερμικού κύκλου 96 βοθρίων Veriti (Applied Biosystems).! Η χρήση μιας από τις συσκευές θερμικού κύκλου που αναφέρονται παραπάνω είναι απολύτως απαραίτητη για την επίτευξη της καθιερωμένης απόδοσης. Το πρόγραμμα της συσκευής θερμικού κύκλου για την PCR του συνοψίζεται στον Πίνακα 2. Πίνακας 2: Πρόγραμμα θερμικού κύκλου της PCR του Χρόνος Θερμ. C Αρ. κύκλων 20 λεπτά 37 C 1 15 λεπτά 95 C 1 30 δευτερόλεπτα 25 δευτερόλεπτα 45 δευτερόλεπτα 30 δευτερόλεπτα 45 δευτερόλεπτα 95 C 55 C 72 C 95 C 72 C 40 15 Κράτηση 10 C Επιπλέον, πρέπει να ρυθμιστούν οι ακόλουθες παράμετροι εκτέλεσης για κάθε συσκευή θερμικού κύκλου. Για μια περιγραφή του τρόπου ρύθμισης αυτών των παραμέτρων, ανατρέξτε στις Οδηγίες χρήσης της αντίστοιχης συσκευής θερμικού κύκλου. Σύστημα PCR GeneAmp 9700 (Applied Biosystems) Ρυθμίστε τον όγκο αντίδρασης σε 26 µl, την ταχύτητα ράμπας σε "9600" και χρησιμοποιήστε θερμοκρασία καλύμματος 103 C. Συσκευή θερμικού κύκλου 96 βοθρίων Veriti (Applied Biosystems) Χρησιμοποιήστε το εργαλείο Μετατροπής μεθόδου της Συσκευής θερμικού κύκλου 96 βοθρίων Veriti για εισαγωγή στο πρόγραμμα PCR του και επιλέξτε τη λειτουργία "9600 Emulation Mode" (Λειτουργία προσομοίωσης 9600). Ρυθμίστε τον όγκο αντίδρασης σε 26 µl και τη θερμοκρασία του καλύμματος στους 103 C. Αναθεώρηση: BQ-013-07 / Αύγουστος 2011 21

8.2.2 Κατεργασία Ουρακίλης-N-γλυκοσυλάσης (UNG) 5 Το PCR MasterMix περιέχει dutp που ενσωματώνεται στα προϊόντα ενίσχυσης κατά τη διάρκεια της PCR του, καθιστώντας τα προϊόντα PCR ευαίσθητα σε εξασθένιση από την UNG. Η UNG διασπά το προϊόν της PCR σε σημεία που έχει ενσωματωθεί υπόλειμμα deoxyuridylate. Τα διασπασμένα προϊόντα PCR δεν θα ενισχυθούν σε επόμενη αντίδραση. Συνεπώς, μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια κατεργασία UNG για την εξάλειψη της επιμόλυνσης μεταφοράς από προηγούμενες αντιδράσεις PCR. 6 Αραιώστε την Ουρακίλη-N-γλυκοσυλάση 1:200 σε νερό βαθμού PCR. Χρησιμοποιήστε μια νέα αραίωση UNG για κάθε προετοιμασία αντίδρασης PCR του (βλ. Κεφάλαιο 8.2.3). Μην επαναχρησιμοποιείτε το αραιωμένο UNG. Αναμίξτε προσεκτικά την αραίωση UNG με ανάδευση για 2 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια με περιδίνηση ή με αναρρόφηση και ελευθέρωση αρκετές φορές. Η αρχική συγκέντρωση της Ουρακίλης-N-γλυκοσυλάσης είναι 1 U/µl. Κατά συνέπεια, η συγκέντρωση της αραίωσης είναι 0,005 U/µl.! Το Κιτ δοκιμασίας έχει επικυρωθεί χρησιμοποιώντας την Ουρακίλη-N-γλυκοσυλάση από την Fermentas (βλ. Κεφάλαιο 2). Η χρήση αυτού του ενζύμου είναι υποχρεωτική προκειμένου να επιτευχθεί η καθιερωμένη απόδοση. Προσθέστε 1 µl από αυτή την αραίωση σε κάθε αντίδραση PCR (βλ. Κεφάλαιο 8.2.3, Πίνακας 3). Αυτή η ποσότητα είναι επαρκής για να εξαλειφθεί η επιμόλυνση μεταφοράς της PCR. Φροντίστε να μην χρησιμοποιήσετε διάλυμα UNG με υψηλότερη συγκέντρωση, καθώς αυτό μπορεί να έχει αρνητικό αποτέλεσμα στην απόδοση της PCR και να οδηγήσει σε μειωμένη ευαισθησία του PapilloCheck high-risk. Γενικά, για κατεργασία UNG, το μείγμα αντίδρασης PCR επωάζεται για 20 λεπτά στους 37 C. Συνεπώς, το UNG αδρανοποιείται με ένα πρόσθετο βήμα επώασης διάρκειας 15 λεπτών στους 95 C. Αυτά τα δύο βήματα ενσωματώνονται ήδη στην PCR του και αντιστοιχούν στα πρώτα δύο βήματα του προγράμματος της συσκευής θερμικού κύκλου (βλ. Πίνακα 2). Στο δεύτερο βήμα (15 λεπτά στους 95 C) προκύπτει τόσο η αδρανοποίηση της Ουρακίλης-N-γλυκοσυλάσης όσο και η ενεργοποίηση της Πολυμεράσης HotStarTaq.! Το ενσωματωμένο σύστημα UNG του PCR του εξαλείφει μόνο τη μόλυνση μεταφοράς με προϊόντα PCR από προηγούμενες αντιδράσεις PCR. Δεν μπορούν να εξαλειφθούν άλλες μολύνσεις, που προκύπτουν για παράδειγμα κατά τη διάρκεια της παρασκευής δειγμάτων, εξαγωγής DNA ή προσθήκης εκχυλίσματος PCR. Συνεπώς, είναι απαραίτητο να τηρούνται οι οδηγίες και οι ειδικές προφυλάξεις για την πρόληψη μόλυνσης που περιγράφονται στο Κεφάλαιο 7. 5 Η προμήθεια του συνοδεύεται από περιορισμένη άδεια χρήσης σύμφωνα με τους Αριθμούς Διπλωμάτων Ευρεσιτεχνίας Η.Π.Α. 5,035,996, 5,683,896, 5,945,313, 6,287,823 και 6,518,026 και τα αντίστοιχα ξένα διπλώματα ευρεσιτεχνίας. 6 Longo, M.C., et al., Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions, Gene, 93, 125-128, 1990. Αναθεώρηση: BQ-013-07 / Αύγουστος 2011 22

8.2.3 Προετοιμασία αντίδρασης PCR Με εξαίρεση την Πολυμεράση HotStarTaq και την Ουρακίλη-N-γλυκοσυλάση, το PapilloCheck highrisk PCR MasterMix περιέχει ήδη όλα τα στοιχεία για την εκτέλεση της αντίδρασης PCR (ρυθμιστικό διάλυμα PCR, MgCl 2, dntp, υγρά πλήρωσης, εκχυλισμένο μάρτυρα PCR).! Το κιτ δοκιμασίας έχει επικυρωθεί χρησιμοποιώντας Πολυμεράση HotStarTaq από την Qiagen (βλ. Κεφάλαιο 2). Η χρήση αυτού του ενζύμου είναι υποχρεωτική προκειμένου να επιτευχθεί η καθιερωμένη απόδοση. Η προετοιμασία του μείγματος αντίδρασης εκτελείται ιδανικά σε προστατευόμενο περιβάλλον, π.χ. απαγωγός PCR, για την αποφυγή αντίδρασης μόλυνσης. Προετοιμάστε το μείγμα αντίδρασης (που αποτελείται από PCR MasterMix, Πολυμεράση HotStarTaq και Ουρακίλη-N-γλυκοσυλάση) για την απαιτούμενη ποσότητα των αντιδράσεων PCR όπως περιγράφεται στον Πίνακα 3. Για να αναλύσετε πολλαπλά δείγματα, το μείγμα αντίδρασης θα πρέπει να παρασκευαστεί σε μια πατρίδα (στην ποσότητα που απαιτείται για όλες τις αναλύσεις). Για να ρυθμίσετε τις διακυμάνσεις όγκου κατά την αναρρόφηση με πιπέτα, συνιστάται να αυξήσετε τον αριθμό αντιδράσεων (n) κατά 1 για κάθε τσιπ (=n+1), π.χ. παρασκευάστε έναν όγκο μείγματος αντίδρασης για 13 αντιδράσεις ενίσχυσης εάν πρόκειται να δοκιμαστούν 12 δείγματα (βλ. Πίνακα 3). Χρησιμοποιείτε πάντα ένα φιαλίδιο MasterMix για τις αντιδράσεις ενός τσιπ.! Συνιστάται να συμπεριλαμβάνεται ένας αρνητικός μάρτυρας για κάθε παρτίδα PCR MasterMix που παρασκευάζεται. Ως αρνητικός μάρτυρας μπορεί να χρησιμοποιηθεί το ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης DNA του κατάλληλου κιτ εξαγωγής DNA ή νερό βαθμού PCR. Αναμίξτε καλά το μείγμα αντίδρασης με ανάδευση για 2 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια με περιδίνηση ή με αναρρόφηση και ελευθέρωση αρκετές φορές. Διαιρέστε το μείγμα αντίδρασης σε κλάσματα αναρροφώντας με πιπέτα 21 µl του μείγματος αντίδρασης για κάθε αντίδραση PCR σε ένα σωληνάριο αντίδρασης PCR 0,2 ml λεπτού τοιχώματος. Διενεργήστε προσθήκη του εκχυλισμένου DNA σε ξεχωριστό χώρο εργασίας, στη συνέχεια προετοιμάστε το μείγμα αντίδρασης (βλ. Κεφάλαιο 7.2). Προσθέστε 5 µl DNA εξαγωγής σε κάθε αντίδραση PCR και αναμίξτε με ανάδευση για 2 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια με περιδίνηση ή με αναρρόφηση και ελευθέρωσης αρκετές φορές. Ο συνολικός όγκος μίας αντίδρασης PCR είναι 26 µl. Τοποθετήστε τα σωληνάρια αντίδρασης στη συσκευή θερμικού κύκλου και ξεκινήστε την αντίδραση PCR χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα της συσκευής θερμικού κύκλου που περιγράφεται στο Κεφάλαιο 8.2.1 (Πίνακας 2).! Μετά από την ολοκλήρωση της PCR, τα προϊόντα ενίσχυσης θα πρέπει να χρησιμοποιούνται αμέσως για υβριδισμό ή να φυλάσσονται σε σκοτεινό μέρος στους -20 C για μία εβδομάδα. Αναθεώρηση: BQ-013-07 / Αύγουστος 2011 23

Πίνακας 3: Προετοιμασία της αντίδρασης PCR 1 αντίδραση 13 αντιδράσεις (1 τσιπ) 26 αντιδράσεις (2 τσιπ) 39 αντιδράσεις (3 τσιπ) 52 αντιδράσεις (4 τσιπ) PCR MasterMix 19,8 µl 257,4 µl 514,8 µl 772,2 µl 1029,6 µl Πολυμεράση HotStarTaq (5 U/µl) 0,2 µl 2,6 µl 5,2 µl 7,8 µl 10,4 µl Ουρακίλη-N-γλυκοσυλάση (Αραίωση 1:200, 0,005 U/µl) Συνολικός όγκος πριν από την προσθήκη του δείγματος DNA DNA εξαγωγής από το τραχηλικό δείγμα (εκχυλισμένο DNA) 1 µl 13µl 26 µl 39 µl 52 µl 21 µl 273 µl 546 µl 819 µl 1092 µl 5 µl Συνολικός όγκος ανά αντίδραση 26 µl Αναθεώρηση: BQ-013-07 / Αύγουστος 2011 24

8.3 Υβριδισμός και πλύση 8.3.1 Παρασκευή και προετοιμασία Ο υβριδισμός πρέπει να εκτελείται σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C). Αρχίστε με τις απαραίτητες παρασκευές για τον υβριδισμό και τα βήματα πλύσης 30 λεπτά τουλάχιστον πριν από την έναρξη της διαδικασίας υβριδισμού. Για να διαλύσετε δυνητικά ιζήματα στα ρυθμιστικά διαλύματα υβριδισμού και πλύσης, εκθέστε τα σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C) για 30 λεπτά και αναμίξτε καλά πριν από τη χρήση. Η φύλαξη του κιτ δοκιμασίας στους 4-8 C ενδέχεται να οδηγήσει σε ίζημα του SDS στο Ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού και το Ρυθμιστικό διάλυμα Β. Αφήστε τα διαλύματα να εξισορροπήσουν σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια περιδινήστε το σωληνάριο ή αναδεύστε τη φιάλη μέχρι να διαλυθούν τυχόν ιζήματα. Προετοιμάστε το Θάλαμο υβριδισμού ocheck : Τοποθετήστε μια νέα υγρή χάρτινη πετσέτα μέσα στο Θάλαμο υβριδισμού και κλείστε το κάλυμμα για να δημιουργηθεί μια ατμόσφαιρα κορεσμένη από υγρασία. Για αποφυγή εξάτμισης του μικρού όγκου χρησιμοποιημένου μείγματος υβριδισμού επάνω στο τσιπ, η εκτέλεση του υβριδισμού πρέπει να διενεργηθεί σε ατμόσφαιρα με κορεσμό υγρασίας. Διατίθεται ειδικός Θάλαμος υβριδισμού για την ανάλυση από την Greiner Bio-One (βλ. Κεφάλαιο 2). Επωάστε την απαιτούμενη ποσότητα τσιπ στον προετοιμασμένο Θάλαμο υβριδισμού σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C) για 10 λεπτά τουλάχιστον.! Η μαγνητική θήκη αντικειμενοφόρων πλακών του Θαλάμου υβριδισμού περιέχει μόνον ένα μαγνήτη στο ένα από τα δύο άκρα. Εάν πρόκειται να υβριδοποιηθούν παράλληλα λιγότερα από τέσσερα τσιπ PapilloCheck high-risk, φροντίστε να πληρώσετε τη θήκη αντικειμενοφόρων πλακών με τσιπ από την αντίθετη πλευρά του μαγνήτη. Διαφορετικά, τα τσιπ δεν θα καλυφτούν με υγρό κατά τη διαδικασία πλύσης. Παρασκευάστε τα διαλύματα πλύσης I, II και III σύμφωνα με τις παρακάτω οδηγίες. Προετοιμασία των διαλυμάτων πλύσης I, II και III: Προετοιμάστε το μείγμα διαλύματος πλύσης για τα διαλύματα πλύσης I, II και III που είναι κατάλληλα για τον αριθμό τσιπ του που θα αναλυθούν, όπως φαίνεται στον Πίνακα 4. Διαιρέστε τρεις ίσες ποσότητες του μείγματος διαλύματος πλύσης σε τρία ξεχωριστά Πλαίσια πλύσης ocheck και επισημάνετέ τα ως διάλυμα πλύσης I, II και III. Ελέγξτε ότι το πλαίσιο πλύσης ocheck περιέχει μια χαραγμένη κλίμακα, που υποδεικνύει τη σωστή ποσότητα διαλύματος πλύσης που απαιτείται για μέχρι 4 τσιπ. Χρησιμοποιήστε αυτή την κλίμακα για να ελέγξετε την ποιότητα του ρυθμιστικού διαλύματος. Προθερμάνετε το διάλυμα πλύσης II στους 50 C σε ένα υδατόλουτρο με ελεγχόμενη θερμοκρασία για 20 λεπτά τουλάχιστον πριν από τη χρήση. Βεβαιωθείτε ότι το επίπεδο πλήρωσης του υδατόλουτρου ισούται με το επίπεδο πλήρωσης του διαλύματος πλύσης II. Αναθεώρηση: BQ-013-07 / Αύγουστος 2011 25