ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΦΥΤΑ ΒΟΜΒΑΡ ΙΣΜΟΣ-ΧΗΜΙΚΗ ΜΕΘΟ ΟΣ-ΜΙΚΡΟΕΓΧΥΣΗ

ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΑ ΦΥΤΑ ΒΟΜΒΑΡ ΙΣΜΟΣ-ΧΗΜΙΚΗ ΜΕΘΟ ΟΣ-ΜΙΚΡΟΕΓΧΥΣΗ 1

2. ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA ΜΕ ΒΟΜΒΑΡ ΙΣΜΟ ΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ Χρήσηεπιταχυνόµενων µε µεγάλη ταχύτητα σωµατιδίων καλυµµένων µε DNA, ώστε να διαπεράσουν τις εξωτερικές κυτταρικές στοιβάδες ή τα κυτταρικά τοιχώµατα. Τασωµατιδίααποτελούνται από ανενεργό υλικό (βολφράµιοή χρυσός). Το DNAσυνδέεται µε συν-καθίζηση παρουσία CaCl 2 στα σωµατίδια βολφραµίου, και παρουσία αιθανόλης στα σωµατίδια χρυσού. Ηαποτελεσµατικότητα µετασχηµατισµού φυτικών κυττάρων εξαρτάται από τη φάση του κυτταρικού κύκλου στην οποία βρίσκονται. Κύτταρα που βρίσκονται στην G2ή Μ φάση µετασχηµατίζονται 5 φορές περισσότερο από κύτταρα της G1 ή S φάσης. 2

3

2. ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA ΜΕ ΒΟΜΒΑΡ ΙΣΜΟ ΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ Πρωτόκολλο εφαρµογής βοµβαρδισµού: 1. Ταχύτητα βοµβαρδισµού 2. Μέγεθος σωµατιδίων 3. Χηµική σύσταση σωµατιδίων -Είδος του φυτού/ιστού, -Βάθος διείσδυσης 4. Συγκέντρωση DNA (αριθµός σωµατιδίων) 4

2. ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA ΜΕ ΒΟΜΒΑΡ ΙΣΜΟ ΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ Αρχέςβοµβαρδισµού Ηεπιτάχυνση των σωµατιδίων επιτυγχάνεται µε διάφορους τρόπους, όπως παλµούς αερίου, ηλεκτρική εκκένωση υψηλής τάσης ή πυρίτιδα. Στόχοςείναι τα σωµατίδια να αποκτήσουν ταχύτητα περίπου 300 m/s. 5

2. ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA ΜΕ ΒΟΜΒΑΡ ΙΣΜΟ ΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ Αρχέςβοµβαρδισµού Όπλο βοµβαρδισµού 6 Εικ. 6.1

2. ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA ΜΕ ΒΟΜΒΑΡ ΙΣΜΟ ΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ Αρχέςβοµβαρδισµού Όπλο βοµβαρδισµού 7

2. ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA ΜΕ ΒΟΜΒΑΡ ΙΣΜΟ ΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ Αρχέςβοµβαρδισµού Βοµβαρδισµός µε ηλεκτρική εκκένωση 8 Εικ. 6.1

2. ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA ΜΕ ΒΟΜΒΑΡ ΙΣΜΟ ΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ Αρχέςβοµβαρδισµού Σχέσητάσης ηλεκτρικής εκκένωσης και αριθµού κυττάρων σόγιας µε σωµατίδια σε τρία διαφορετικά επίπεδα κυτταρικής στοιβάδας Σχέσητάσης ηλεκτρικής εκκένωσης και αριθµού κυττάρων σόγιας που εκφράζουν το ξένο γονίδιο σε τρία διαφορετικά επίπεδα κυτταρικής στοιβάδας Όσοπερισσότερα σφαιρίδια διαπερνούν προς τις βαθύτερες κυτταρικές στοιβάδες τόσο µεγαλύτερο είναι το ποσοστό των επιφανειακών κυττάρων που νεκρώνονται 9 Εικ. 6.2

2. ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA ΜΕ ΒΟΜΒΑΡ ΙΣΜΟ ΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ Αρχέςβοµβαρδισµού Βοµβαρδισµόςµε απότοµη είσοδο αερίου (ήλιο) Βοµβαρδισµόςµε κύµα ριπής αερίου 10 Εικ. 6.1

2. ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA ΜΕ ΒΟΜΒΑΡ ΙΣΜΟ ΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ ιάµετρος στόχευσης Εξαρτάταιαπό το είδος του φυτικού ιστού «στόχου», και επιλέγεται η κατάλληλη συσκευή βοµβαρδισµού. Όταν επιδιώκεται παραγωγή µετασχηµατισµένων φυτών από εµβρυογενετικούςκάλλους είναι προτιµότερο να µετασχηµατιστεί µεγάλος αριθµός κυττάρων και απαιτείται µεγαλύτερη διάµετρος στόχευσης ( 9cm). Σε ιστούς µε µεγάλη αναγεννησιµότητα (µεριστώµατα, έµβρυα) ο βοµβαρδισµός οδηγείται στα συγκεκριµένα κύτταρα και απαιτείται µικρότερη διάµετρος στόχευσης (<1mm). Μεγαλύτερη διάµετρος στόχευσηςαπό την απαιτούµενη οδηγεί σε µεγάλο ποσοστό νεκρών κυττάρων. ιάµετρος σωµατιδίων Γιαµεγάλα φυτικά κύτταρα η βέλτιστη διάµετρος των σωµατιδίων είναι 1,2 µm.ο µετασχηµατισµός µικρών κυττάρων επιτυγχάνεται µε µικρά σωµατίδιαδιαµέτρου 0,5 µm. Γιανα αποφευχθεί χιµαιρική κατάσταση (φυτά µε κύτταρα µεταµορφωµένα και µη ο βοµβαρδισµός µπορεί να γίνει σε απλοειδή κύτταρα, πχ γυρεόκοκους) 11

2. ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA ΜΕ ΒΟΜΒΑΡ ΙΣΜΟ ΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ ιάµετρος στενώµατος στο όπλο βοµβαρδισµού και διάµετρος υποστρώµατος στο οποίο εµφανίζονται σωµατίδια ιάµετρος στόχου µε σωµατίδια 12 Εικ. 6.4

2. ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA ΜΕ ΒΟΜΒΑΡ ΙΣΜΟ ΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ Επιλογή µετασχηµατισµένων φυτών: Ηεπιλογή µεταµορφωµένων φυτών µπορεί να γίνει µε γονίδιο αντοχήςσε αντιβιοτικό ή ζιζανιοκτόνο στο πλασµίδιο «φορέα». Επειδή όµως εκφράζονται σοβαρές επιφυλάξεις για τις επιπτώσεις στο καταναλωτικό κοινό τελευταία γίνεται στροφή σε άλλες τεχνικές, όπως σάρωση αναγεννηµένων φυτών (µέθοδος Southern), PCR, γονίδιο-µάρτυρας (πχ λουσιφεράση) 13

2. ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA ΜΕ ΒΟΜΒΑΡ ΙΣΜΟ ΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ 14 Πίν. 6.3

2. ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA ΜΕ ΒΟΜΒΑΡ ΙΣΜΟ ΣΩΜΑΤΙ ΙΩΝ Ησόγιαήταν το πρώτο φυτό στο οποίο εφαρµόστηκε ο βοµβαρδισµός. Τα περισσότερα φυτά ήταν χιµαιρικά αλλά το χαρακτηριστικό µεταφέρθηκε σε µερικά φυτά της επόµενης γενιάς. Στο βατόµουρο µεταφέρθηκαν Bt γονίδια (αντοχής σε έντοµα) Στο καλαµπόκι και το κριθάρι προέκυψαν φυτά ανθεκτικά στο ζιζανιοκτόνο Bialaphos Στο ρύζι σε διάφορα ζιζανιοκτόνα ΒΟΜΒΑΡ ΙΣΜΟΣΓΙΑ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ (πχ εισαγωγή γονιδίου το οποίο στον ασθενή είναι µεταλλαγµένο και δεν εκφράζεται, κίνδυνος πρόκλησης µεταλλάξεων). Εφαρµόζεται κυρίως για θεραπεία καρκίνων µε την εισαγωγή γονιδίων «αυτοκτονίας, ή ογκοκατασταλτικών γονιδίων» 15

3. ΧΗΜΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA Πολλέςχηµικές ουσίες είναι γνωστό ότι προστατεύουν το DNAκαι επάγουν την πρόσληψη νουκλεϊκώνοξέων από τους πρωτοπλάστες, παράλληλα όµως ενδέχεται να προκαλούν µείωση της βιωσιµότητας των κυττάρων Κατάλληλα πρωτόκολλα Η συγκέντρωση της χηµικής ουσίας Η συγκέντρωση του DNA Η συγκέντρωση του «συνοδού» DNA Ο αριθµός πρωτοπλαστών Το µέσο επώασης, και το ΡΗ του Ο χρόνος, η θερµοκρασία και ο τρόπος (ανάδευση;) επώασης. 16

3. ΧΗΜΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA Εισαγωγή µε πολυαιθυλενική γλυκόλη (PEG) 15-25% PEG στο διάλυµα επώασης µε 5 µgπλασµιδιακού DNA/ 10 6 πρωτοπλάστες Φαγοκύττωσηκαι τελική συγκέντρωση 1000 πλασµιδιακού DNA/πρωτοπλάστη Συγκέντρωση PEG και αριθµός πλασµιδιακών DNA σε πρωτοπλάστες Petunia Μέγιστησυγκέντρωση DNA: 50-250 µg / 10 6 πρωτοπλάστες, µεγαλύτερη καταστρέφει το κύτταρο 17 Εικ. 7.3

3. ΧΗΜΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA Εισαγωγή µε πολυαιθυλενική γλυκόλη (PEG) 18 Πίν. 7.1

3. ΧΗΜΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA Μειονεκτήµατα: Μπορεί να εισαχθούν πολλά αντίγραφα του «ξένου» DNA στο γονιδίωµα των φυτών.ο µεγαλύτερος αριθµός αντιγράφων έχει σαν συνέπεια τη µεγαλύτερη πιθανότητα ενθέσεων µέσα στα γονίδια του φυτού µε άµεσο αποτέλεσµα τη δηµιουργία µεταλλάξεων. Μπορείνα µεταλλαχθεί η αρχική αλληλουχία βάσεων του «ξένου» DNA. 19

3. ΧΗΜΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA Επιλογή µετασχηµατισµένων φυτών: Στόχοςείναι η επιλογή µετασχηµατισµένων φυτών µε ένα ή λίγα αντίγραφα του «ξένου» DNA. Αν η παρουσία πολλών αντιγράφων προκαλεί µεταλλάξεις που εκφράζονται στο φαινότυπο, η επιλογή γίνεται µε απόρριψη των φυτών µε παρεκκλίνοντες φαινότυπους. Έτσι µε την ολοκλήρωση του βιολογικού κύκλου των φυτών διατηρούνται αυτά που φέρουν όλες ακριβώς τις πατρικές ιδιότητες και επιπλέον αυτή πουέχει προστεθεί. 20

3. ΧΗΜΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA Επιλογή µετασχηµατισµένων φυτών (διασταύρωση µε πατρικό και επιλογή ηµίζυγωνή οµοζύγωτωνµε τις γνωστές µεθόδους Southern, PCR): Απαλοιφήεισαγόµενων αντιγράφων από διαφορετικά χρωµοσώµατα. 21 Εικ. 7.1

3. ΧΗΜΙΚΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ DNA Επιλογή µετασχηµατισµένων φυτών (διασταύρωση µε πατρικό και επιλογή ηµίζυγωνή οµοζύγωτωνµε τις γνωστές µεθόδους Southern, PCR): Απαλοιφήεισαγόµενων αντιγράφων από το ίδιο χρωµόσωµα. 22 Εικ. 7.2

4. ΜΙΚΡΟΕΓΧΥΣΗ DNA Βασίζεταιστη χρήση γυάλινης µικροπιπέταςστην οποία µε θέρµανση και κοπή στο άκρο δηµιουργείται διάµετρος οπής 0,5-1,0µm. Η µικρή διάµετρος του άκρου της πιπέταςεπιτρέπει τη διείσδυσή της µέσω της πλασµατικής µεµβράνης στο κυτταρόπλασµα χωρίς να καταστρέφει το κύτταρο. Το «ξένο» DNAεγχύεταιστο κυτταρόπλασµα ή και απευθείας στον πυρήνα του φυτικού κυττάρου. Α: πολυ-λυσίνη Β: αγαρόζη Γ: στο στόµιο γυάλινης µικροπιπέτας 23 Εικ. 7.8

4. ΜΙΚΡΟΕΓΧΥΣΗ DNA 24

4. ΜΙΚΡΟΕΓΧΥΣΗ DNA Πλεονεκτήµατα: Πολύµεγάλη συχνότητα µετασχηµατισµού φυτικών κυττάρων. Επιτρέπειτην άµεση οπτική επαφή ως προς το διαµέρισµα έγχυσης. Η έγχυση είναι άµεσα ελεγχόµενη ενείναι πάντοτε απαραίτητη η αποµάκρυνση του κυτταρικού τοιχώµατος ενπροκύπτουν µεταµορφωµένα φυτά µε µεγάλο αριθµό αντιγράφων του «ξένου» DNA 25

ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ Ποια τα γενικά χαρακτηριστικά της µεταφοράς DNAστα φυτά µε βοµβαρδισµό σωµατιδίων (σε τι συνίσταται, είδη σωµατιδίων και τρόπος σύνδεσης του DNA, καταλληλότερος κυτταρικός κύκλος) Ποια είναι τα χαρακτηριστικά στα οποία βασίζονται τα πρωτόκολλα εφαρµογής βοµβαρδισµού; Ποιος είναι ο στόχος και µε ποιούςτρόπους (συσκευές) επιτυγχάνεται ο βοµβαρδισµός σωµατιδίων για τη µεταφορά DNA στα φυτά; Ποια η σχέση της τάσης της ηλεκτρικής εκκένωσης κατά το βοµβαρδισµό σωµατιδίων µε τον αριθµό φυτικών κυττάρων στα οποία µεταφέρονται σωµατίδια και µε τον αριθµό κυττάρων που εκφράζουν το «ξένο» DNA; Να σχολιαστεί η διάµετρος στόχευσηςκαι η διάµετρος των σωµατιδίων στη µέθοδο µεταφοράς DNAστα φυτά µε βοµβαρδισµό σωµατιδίων Γιατί υπάρχει ο κίνδυνος χιµαιρικής κατάστασης (;) σε µεταµορφωµένα µε βοµβαρδισµό φυτά, ποιες οι συνέπειες και πως αποφεύγεται αυτή; Επιλογή µεταµορφωµένων φυτών µετά την εφαρµογή της µεθόδου του βοµβαρδισµού Ποια είναι η αρχή της χηµικής µεθόδου µεταφοράς DNAστα φυτά και σε ποια χαρακτηριστικά βασίζονται τα κατάλληλα πρωτόκολλα; Να περιγραφεί η τεχνική της χηµικής µεθόδου µεταφοράς DNA στα φυτά σε πολυαιθυλενική γλυκόλη (PEG) Γιατί υπάρχει η αναγκαιότητα επιλογής µετασχηµατισµένων φυτών µε χηµική µεταφορά DNA, αλλά και άλλες µεθόδους άµεσης µεταφοράς, και πως γίνεται; Να περιγραφεί η µέθοδος της µικροέγχυσης DNA για το µετασχηµατισµό φυτών, πλεονεκτήµατα. 26

6. ΒΟΜΒΑΡΔΙΣΜΟΣ ΧΗΜΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ - ΜΙΚΡΟΕΓΧΥΣΗ 2 Η μεταφορά «ξένου» DNA με βομβαρδισμό με σωματίδια συνίσταται στη χρήση σωματιδίων καλυμμένων με το «ξένο» DNA τα οποία κινούνται επιταχυνόμενα και με μεγάλη ταχύτητα, ώστε να διαπεράσουν τις εξωτερικές κυτταρικές στοιβάδες ή τα κυτταρικά τοιχώματα των φυτικών κυττάρων. Τα σωματιδία αποτελούνται από ανενεργό υλικό όπως είναι το βολφράμιο και ο χρυσός. Το DNA συνδέεται με συν-καθίζηση παρουσία CaCl2 στα σωματίδια βολφραμίου, και παρουσία αιθανόλης στα σωματίδια χρυσού. Η αποτελεσματικότητα μετασχηματισμού των φυτικών κυττάρων εξαρτάται από τη φάση του κυτταρικού κύκλου στην οποία βρίσκονται. Κύτταρα που βρίσκονται στην G2 ή Μ φάση μετασχηματίζονται 5 φορές περισσότερο από κύτταρα της G1 ή S φάσης. (βλ. επόμενη διαφάνεια). 3 G1: αμέσως μετά τη μίτωση, S: σύνθεση DNA, G2 (2σμός οργανιδίων), Μ: μίτωση (βλ. βιβλίο Γενετικής) 4 Για το πρωτόκολλο εφαρμογής του βομβαρδισμού, πλην τους είδους του φυτού λαμβάνεται υπόψη το είδος του ιστού και το απαιτούμενο βάθος διείσδυσης. Το πρωτόκολλο περιλαμβάνει: 1.Την ταχύτητα κίνησης των σωματιδίων κατά τον βομβαρδισμό 2. Το μέγεθος των σωματιδίων 3.Τη χημική σύσταση των σωματιδίων 4.Τη συγκέντρωση του DNA, δηλαδή τον αριθμός των σωματιδίων 5 Αρχές βομβαρδισμού Η επιτάχυνση των σωματιδίων επιτυγχάνεται με διάφορους τρόπους, όπως παλμούς αερίου, ηλεκτρική εκκένωση υψηλής τάσης ή πυρίτιδα. Στόχος είναι τα σωματίδια να αποκτήσουν ταχύτητα περίπου 300 m/s. 6 Στο σχήμα δίνονται τα μέρη από τυπικό όπλο βομβαρδισμού (άλλες ονομασίες: επιταχυντής σωματιδίων, γονιδιακό όπλο ή όπλο σωματιδίων). Στοχεύοντας στον ιστό του φύλλου το όπλο εκπυρσοκροτεί με αποτέλεσμα τα μικροσωματίδια να εισχωρούν στο εσωτερικό του ιστού και το DNA από τα σωματίδια να περνά στον πρωτοπλάστη, στη συνέχεια στον πυρήνα και ένα ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του φυτού. Σήμερα έχουν σχεδιαστεί φορητές συσκευές με παλμούς αερίων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μεταφορά DNA σε φυτικά κύτταρα ακόμη και στον αγρό.

9 Κύκλοι η 1η, τρίγωνα η 2η και ρόμβοι η 3η στοιβάδα υποκοτύλης σόγιας. Σωματίδια χρυσού 1-3μm καλύφθηκαν με DNA (γονίδιο β-γλουκορονιδάση GUS) σε αναλογία 0,1μg/mg σωματιδίων. Μετά τον βομβαρδισμό έγιναν τομές στα υποκοτύλια και μετρήθηκαν τα κύτταρα με σωματίδια χρυσού στον πυρήνα (1η εικόνα) και διερευνήθηκε η έκφραση του γονιδίου (2η εικόνα). Οι εικόνες δείχνουν ότι όσο μεγαλύτερη είναι η τάση της ηλεκτρικής εκκένωσης τόσο μεγαλύτερο είναι το ποσοστό των κυττάρων στα οποία παρατηρούνται σωματίδια (1 η εικόνα) και τόσο εντονότερη είναι η έκφραση του «ξένου» γονιδίου που σημαίνει σε μεγαλύτερο ποσοστό των κυττάρων ενσωματώθηκε το «ξένο» γονίδιο (2 η εικόνα). Εύλογα τόσο το ποσοστό των κυττάρων με σωματίδια όσο και αυτών που εκφράζουν το «ξένο» γονίδιο είναι μεγαλύτερα στις επιφανειακές στοιβάδες 11 Επειδή ο βομβαρδισμός γίνεται σε ιστούς και όχι σε μεμονωμένα κύτταρα, υπάρχει μεγάλη πιθανότητα να προκύψουν χιμαιρικά φυτά. Ο κίνδυνος από χιμαιρικό φυτό είναι αφενός η πλημμελής έκφρασή του, αλλά κυρίως η αδυναμία κληρονόμησης αν τα γαμετικά κύτταρα προκύψουν από μη μεταμορφωμένα σωματικά!!! 12 Με διάμετρο στενώματος στο όπλο βομβαρδισμού 300nm το 80% των σωματιδίων παρατηρείται σε διάμετρο 0.8mm του φυτικού υποστρώματος (γκρι περιοχή), ενώ με διάμετρο στενώματος στο όπλο βομβαρδισμού 140nm το 80% των σωματιδίων παρατηρείται σε διάμετρο 0.15mm του φυτικού υποστρώματος 13 Η επιλογή μεταμορφωμένων φυτών μπορεί να γίνει με γονίδιο αντοχής σε αντιβιοτικό ή ζιζανιοκτόνο στο πλασμίδιο «φορέα». Επειδή όμως εκφράζονται σοβαρές επιφυλάξεις για τις επιπτώσεις στο καταναλωτικό κοινό τελευταία γίνεται στροφή σε άλλες τεχνικές, όπως σάρωση αναγεννημένων φυτών (μέθοδος Southern), PCR, γονίδιο-μάρτυρας (πχ λουσιφεράση) Γονίδιο αντοχής σε αντιβιοτικό: πχ καναμυκίνη για δικότυλα ή υγρομυκίνη στα αγροστώδη που αντέχουν στο προηγούμενο. Επίσης το ζιζανιοκτόνο φωσφινοθρισίνη ή το χλωροσουλφορόν για αγροστώδη. Τα βομβαρδισμένα κύτταρα αφήνονται να ανακτήσουν τη φυσιολογική τους λειτουργία και στη συνέχεια επιλέγονται σε θρεπτικά μέσα. Το γονίδιο του ενζύμου λουσιφεράση προέρχεται από έντομα ή βακτήρια, και καταλύει αντιδράσεις εκπομπής φωτός (βιοφθορισμός). Βλ. σελ. 161. 14 O πίνακας δείχνει διαγονιδιακά φυτά που προέκυψαν με την τεχνική του βομβαρδισμού. 15 Βλέπε διαφάνεια

16 Πολλές χημικές ουσίες είναι γνωστό ότι προστατεύουν το DNA και επάγουν την πρόσληψη νουκλεϊκών οξέων από τους πρωτοπλάστες, παράλληλα όμως ενδέχεται να προκαλούν μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων. Έτσι κατάλληλα πρωτοκόλλα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μεταφορά DNA στα φυτά. Στα πρωτόκολλα λαμβάνονται υπόψη: Η συγκέντρωση της χημικής ουσίας Η συγκέντρωση του DNA Η συγκέντρωση του «συνοδού» DNA Ο αριθμός πρωτοπλαστών Το μέσο επώασης, και το ΡΗ του Ο χρόνος, η θερμοκρασία και ο τρόπος (ανάδευση;) επώασης 17 Μια από τις χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται για τη χημική μεταφορά DNA είναι η πολυαιθυλενική γλυκόλη (PEG). Διάλυμα 15-25% PEG στο διάλυμα επώασης με 5 μg πλασμιδιακού DNA/ 106 πρωτοπλάστες οδηγεί φαγοκύττωση των κυττάρων και τελική συγκέντρωση 1000 πλασμιδιακού DNA ανά πρωτοπλάστη. Στο σχήμα δίνεται η σχέση της συγκέντρωσης του διαλύματος PEG και του αριθμού πλασμιδιακών DNA σε πρωτοπλάστες Petunia. Η προσέγγιση του αριθμού έγινε με υβριδισμό με ραδιενεργά πλασμίδια (δηλαδή x 100 σημαίνει ότι στη μεταχείριση αυτή εντοπίστηκαν 100 πλασμιδιακά DNA καθώς υβριδίστηκαν με 100 ραδιενεργά πλασμίδια που είχαν τοποθετηθεί στη νιτροκυτταρίνη) 18 πίνακας δείχνει διαγονιδιακά φυτά που προέκυψαν με την τεχνική της χημικής μεταφοράς DNA (PEG). 19 Τα μειονεκτήματα της χημικής μεταφοράς DNA : Μπορεί να εισαχθούν πολλά αντίγραφα του «ξένου» DNA στο γονιδίωμα των φυτών. Ο μεγαλύτερος αριθμός αντιγράφων έχει σαν συνέπεια τη μεγαλύτερη πιθανότητα ενθέσεων μέσα στα γονίδια του φυτού με άμεσο αποτέλεσμα τη δημιουργία μεταλλάξεων. Μπορεί να μεταλλαχθεί η αρχική αλληλουχία βάσεων του «ξένου» DNA 20 Επιλογή μετασχηματισμένων φυτών: Στόχος είναι η επιλογή μετασχηματισμένων φυτών με ένα ή λίγα αντίγραφα του «ξένου» DNA. Αν η παρουσία πολλών αντιγράφων προκαλεί μεταλλάξεις που εκφράζονται στο φαινότυπο, η επιλογή γίνεται με απόρριψη των φυτών με παρεκκλίνοντες φαινότυπους. Έτσι με την ολοκλήρωση του βιολογικού κύκλου των φυτών διατηρούνται αυτά που φέρουν όλες ακριβώς τις πατρικές ιδιότητες και επιπλέον αυτή που έχει προστεθεί.

21 Επαναδιασταύρωση μετασχηματισμένου που έχει δύο αντίγραφα του «ξένου» σε διαφορετικά χρωμοσώματα (ασύνδετες θέσεις), με το πατρικό φυτό: Η διασταύρωση μετασχηματισμένου με το πατρικό και οι συνεχείς αυτογονιμοποιήσεις μπορεί να οδηγήσει στην αναγνώριση φυτών που έχουν μονο το ένα αντίγραφο (τα φυτά 1,2,3,4,5,6) 22 Επαναδιασταύρωση μετασχηματισμένου που έχει δύο αντίγραφα του «ξένου» στο ίδιο χρωμόσωμα (συνδεδεμένες θέσεις), με το πατρικό φυτό: Η διασταύρωση μετασχηματισμένου με το πατρικό και οι συνεχείς αυτογονιμοποιήσεις μπορεί να οδηγήσει σε χίασμα ανταλλαγή και τελικά στην απομόνωση φυτών που έχουν μονο το ένα αντίγραφο (τα φυτά 1,2) 23. Οι πρωτοπλάστες έχουν ακινητοποιηθεί σε διαφορετικά υποστρώματα Α: πολυλυσίνης, Β: αγαρόζης, Γ: στο στόμιο γυάλινης μικροπιπέτας. 25 Βλέπε διαφάνεια για πλεονεκτήματα μικροέγχυσης