ΜΟΝΤΕΛΟΠΟΙΗΣΗ ΠΟΛΥΠΑΡΑΜΕΤΡΙΚΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΠΟΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΘΕΤΙΚΟΥ ΣΗΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΕΤΑΙ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΨΕΚΑΣΜΟ ΣΕ ΤΕΤΡΑΠΟΛΙΚΟ ΑΝΑΛΥΤΗ ΜΑΖΑΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΟΝΤΕΛΟΠΟΙΗΣΗ ΠΟΛΥΠΑΡΑΜΕΤΡΙΚΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΠΟΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΘΕΤΙΚΟΥ ΣΗΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΕΤΑΙ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΨΕΚΑΣΜΟ ΣΕ ΤΕΤΡΑΠΟΛΙΚΟ ΑΝΑΛΥΤΗ ΜΑΖΑΣ ΒΑΡΒΑΡΑ Ι. ΜΑΝΔΡΑ Θεσσαλονίκη, Απρίλιος 2015

AΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΒΑΡΒΑΡΑ Ι. ΜΑΝΔΡΑ ΠΤΥΧΙΟΥΧΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΑΠΘ ΜΟΝΤΕΛΟΠΟΙΗΣΗ ΠΟΛΥΠΑΡΑΜΕΤΡΙΚΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΠΟΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΘΕΤΙΚΟΥ ΣΗΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΕΤΑΙ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΨΕΚΑΣΜΟ ΣΕ ΤΕΤΡΑΠΟΛΙΚΟ ΑΝΑΛΥΤΗ ΜΑΖΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ που εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακευτικής Ανάλυσης, του Τομέα Φαρμακευτικής Τεχνολογίας, του Τμήματος Φαρμακευτικής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης. Ημερομηνία προφορικής εξέτασης: 2-4-2015

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Επίκ. Καθηγήτρια Καθηγητής Επίκ. Καθηγητής Αικατερίνη Μαρκοπούλου - Επιβλέπουσα Γεώργιος Ζαχαριάδης - Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής Δημήτριος Φατούρος - Μέλος Συμβουλευτικής Επιτροπής Η Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή που ορίστηκε για την κρίση της μεταπτυχιακής εργασίας της Βαρβάρας Μανδρά, φαρμακοποιού, συνήλθε σε συνεδρίαση στο Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης την Πέμπτη 2-4-2015, όπου παρακολούθησε την υποστήριξη της μεταπτυχιακής εργασίας με τίτλο «Μοντελοποίηση πολυπαραμετρικών δεδομένων για την αποκωδικοποίηση θετικού σήματος που παράγεται με ηλεκτροψεκασμό σε τετραπολικό αναλυτή μάζας». Η Επιτροπή έκρινε ομόφωνα ότι η εργασία είναι πρωτότυπη και αποτελεί ουσιαστική συμβολή στην πρόοδο της Επιστήμης.

Στην οικογένειά μου

ΜΟΝΤΕΛΟΠΟΙΗΣΗ ΠΟΛΥΠΑΡΑΜΕΤΡΙΚΩΝ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΠΟΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ ΘΕΤΙΚΟΥ ΣΗΜΑΤΟΣ ΠΟΥ ΠΑΡΑΓΕΤΑΙ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΨΕΚΑΣΜΟ ΣΕ ΤΕΤΡΑΠΟΛΙΚΟ ΑΝΑΛΥΤΗ ΜΑΖΑΣ Περίληψη Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων και των δομικών χαρακτηριστικών που επηρεάζουν το σήμα 99 χημικών ουσιών (στην πλειονότητά τους φαρμάκων) κατά την ανάλυσή τους με φασματομετρία μάζας με ηλεκτροψεκασμό, σε θετικό ιονισμό. Το σήμα των πρωτονιωμένων ιόντων των ουσιών ελήφθη μετά από έγχυση μικρού όγκου διαλύματος μιας ουσίας κάθε φορά στη ροή κινητής φάσης: μεθανόλη:νερό (ph10), 50:50 (v/v). Οι φυσικοχημικές ιδιότητες, τα δομικά χαρακτηριστικά και το σήμα των ουσιών αποτέλεσαν τα δεδομένα για την εφαρμογή της μεθόδου πολυπαραμετρικής ανάλυσης PLS (μέθοδος μερικών ελαχίστων τετραγώνων). Ως σημαντικότερη μεταβλητή αναδείχτηκε ο συντελεστής κατανομής οκτανόλης/νερού logd, ο οποίος συνδυάζει τη λιποφιλικότητα και τον βαθμό ιονισμού των ουσιών στο διάλυμα. Επίσης, ισχυρή θετική επίδραση στο σήμα είχαν οι βασικές ομάδες, οι σταθερές pka των βασικών και των όξινων ομάδων, καθώς και ο συντελεστής μερισμού οκτανόλης/νερού logp. Από την άλλη πλευρά, μείωση του σήματος προκαλούσαν: η πολική επιφάνεια, το % ποσοστό ιονισμού των όξινων ομάδων, τα άτομα οξυγόνου, η επιφανειακή τάση, οι όξινες ομάδες, η ικανότητα σχηματισμού δεσμού υδρογόνου και η διαλυτότητα στο νερό. Ως εκ τούτου, το σήμα των προς μελέτη ουσιών θεωρήθηκε ως το αποτέλεσμα της επίδρασης πολλών μεταβλητών. Συνολικά, τα ισχυρότερα σήματα παρατηρήθηκαν στις ουσίες που περιείχαν ισχυρές βασικές ομάδες, ενώ τα σήματα των ουσιών που περιείχαν και βασικές και όξινες ομάδες μειώνονταν παρουσία των όξινων ομάδων. Τέλος, αξιοσημείωτη ήταν η παρατήρηση ότι ουσίες που διέθεταν μόνο όξινες ομάδες στο μόριό τους έδιναν επίσης αξιόλογο σήμα. Το γεγονός αυτό ήταν μη αναμενόμενο και οδήγησε στο συμπέρασμα ότι για την απόδοση σήματος στη φασματομετρία μάζας με ηλεκτροψεκασμό, σε θετικό ιονισμό, λαμβάνουν μέρος και άλλοι μηχανισμοί πρωτονίωσης. Το γεγονός αυτό αποτελεί αντικείμενο περεταίρω διερεύνησης.

MODELING MULTIVARIATE DATA FOR POSITIVE SIGNAL DECODING PRODUCED BY ELECTROSPRAY IN SINGLE QUADRUPOLE MASS ANALYZER Abstract The aim of the present thesis was to investigate the physicochemical properties and structural characteristics that influence the signal of 99 chemicals (mostly drugs) in their analysis by electrospray ionization mass spectrometry, in positive mode. The signal of protonated ion analytes obtained after injection of a small volume of analyte in each case in the mobile phase flow: methanol: water (ph10), 50:50 (v/v). The physicochemical properties, the structural characteristics and the analytes signal resulted the data for the implementation of multivariate statistical analysis using PLS (Partial Least Squares). The most important variable emerged the octanol / water distribution coefficient logd, which combines the lipophilicity and the degree of ionization of the substances in the solution. Furthermore, strong positive effect on the analyte response had the basic groups, pka values of basic and acidic groups, and the octanol / water partition coefficient logp. On the other hand, reduction of responsiveness caused: the polar surface area, % ionization of the acidic groups, the oxygen atoms, the surface tension, the acidic groups, the hydrogen bond forming capacity and water solubility. Therefore, the signal of the substances under study was considered as the result of the effect of several variables. Overall, the strongest signals were observed in the analytes containing strong basic groups, while the signals of substances containing both acidic and basic groups decreased in the presence of acidic groups. Finally, notable was the observation that analytes containing only acidic groups in their molecules also gave valuable signals. It was an unexpected outcome which led to the conclusion that other protonation mechanisms also take part in the signal response when using electrospray ionization mass spectrometry, in positive mode. This could be the subject of further investigation.

Περιεχόμενα Περίληψη Abstract Πρόλογος v vi x ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Κεφάλαιο 1ο Φασματομετρία μάζας με ηλεκτροψεκασμό 1.1 Εισαγωγή 1 1.2 Ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό 3 1.2.1 ESI και πρόδρομες μέθοδοι ιονισμού 4 1.3 ESI-φασματόμετρο μάζας 5 1.3.1 Πηγή ESI 5 1.3.2 Τετραπολικός αναλυτής μάζας 8 1.3.3 Ανιχνευτής ιόντων 12 1.3.4 Σύστημα κενού 13 1.4 Εφαρμογές της τεχνικής ESI-MS 14 1.5 Σύζευξη με χρωματογραφία 16 Κεφάλαιο 2ο Βασικές αρχές του ιονισμού με ηλεκτροψεκασμό 2.1 Εισαγωγή 20 2.2 Στάδια σχηματισμού των ιόντων αέριας φάσης 21 2.3 Παράγοντες που επηρεάζουν την εκλεκτικότητα της τεχνικής ESI-MS 26 2.3.1 Χαρακτηριστικά των προς ανάλυση ουσιών 26 2.3.1.1 Ικανότητα φόρτισης της ουσίας 27 2.3.1.2 Επιφανειακή δραστικότητα της ουσίας 29 2.3.1.3 Η τιμή pka της ουσίας και το ph του διαλύματος 32 2.3.2 Σύσταση της κινητής φάσης 34 2.4 Μοντέλο ισορροπίας κατανομής 36

Κεφάλαιο 3ο Βιβλιογραφική ανασκόπηση 40 Σκοπός της εργασίας 46 Κεφάλαιο 4ο Ανάλυση πολυπαραμετρικών δεδομένων 4.1 Εισαγωγή 48 4.2 Ανάλυση κύριων συνιστωσών 49 4.2.1 Επεξεργασία των δεδομένων 49 4.2.2 Γεωμετρική ερμηνεία της μεθόδου PCA 51 4.3 Μέθοδος μερικών ελαχίστων τετραγώνων 54 4.3.1 Επεξεργασία των δεδομένων 55 4.3.2 Γεωμετρική ερμηνεία της μεθόδου PLS 56 4.4 Βασικά στάδια της ανάλυσης πολυπαραμετρικών δεδομένων 59 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Κεφάλαιο 5ο Όργανα-συσκευές-αντιδραστήρια 5.1 Σύστημα υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας 64 5.1.1 Περιγραφή οργάνου LCMS-2020 65 5.1.2 Παράμετροι λειτουργίας του συστήματος LC-ESI-MS 66 5.2 Συσκευές-Βοηθητικά όργανα 67 5.3 Αντιδραστήρια 67 Κεφάλαιο 6ο Επιλογή κινητής φάσης 82 Κεφάλαιο 7ο Ανάπτυξη μεθοδολογίας ESI-MS για τη μέτρηση και αποκωδικοποίηση του σήματος των υπό μελέτη χημικών ουσιών 7.1.Πειραματική πορεία 84 7.1.1 Παρασκευή μητρικών διαλυμάτων και διαλυμάτων έγχυσης 84 7.1.2 Έγχυση των χημικών ουσιών στο φασματόμετρο μάζας 85 7.1.3 Λήψη και επεξεργασία του σήματος 85

7.1.3.1 Ανίχνευση ιόντων προσθήκης 87 7.1.4. Δημιουργία πίνακα δεδομένων 89 7.1.4.1 Μεταβλητές Χ 101 7.1.4.2 Περιγραφή-επεξήγηση των μεταβλητών 102 7.1.5 Στατιστική ανάλυση των δεδομένων 110 Κεφάλαιο 8ο Εφαρμογή των μεθόδων πολυπαραμετρικής ανάλυσης 8.1 Εφαρμογή της μεθόδου PCA Γενική επισκόπηση 111 8.2 Εφαρμογή της μεθόδου PLS 115 8.2.1 Εφαρμογή της μεθόδου PLS στις ομάδες των ουσιών 118 8.2.2 Βελτίωση του συνολικού μοντέλου PLS 120 8.3 Ερμηνεία του μοντέλου PLS 122 8.3.1 Ραβδόγραμμα VIP 125 8.3.2 Διάγραμμα φορτίων w * c 1/w * c 2 127 8.4 Επικύρωση του μοντέλου PLS 132 8.5 Εφαρμογή της μεθόδου PLS στην ομάδα των ουσιών που έχουν αμιδική ομάδα 134 Κεφάλαιο 9ο Συμπεράσματα 138 Παράρτημα Α 140 Παράρτημα B 149 Βιβλιογραφία 153

Πρόλογος Ο ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό αποτελεί τη μέθοδο ιονισμού που χρησιμοποιείται συνηθέστερα για τη σύζευξη της υγρής χρωματογραφίας με τη φασματομετρία μάζας. Αντικείμενο της παρούσας εργασίας είναι η διερεύνηση των παραγόντων που επηρεάζουν τo σήμα των ουσιών κατά την ανάλυση με φασματομετρία μάζας με ηλεκτροψεκασμό. Πιο συγκεκριμένα, επιχειρείται η δημιουργία ενός μοντέλου, με την εφαρμογή της μεθόδου πολυπαραμετρικής ανάλυσης PLS, για την ερμηνεία της σχέσεως μεταξύ των φυσικοχημικών-δομικών χαρακτηριστικών και του λαμβανόμενου σήματος των πρωτονιωμένων ιόντων των υπό μελέτη ουσιών. Το πειραματικό μέρος της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακευτικής Ανάλυσης του Τομέα Φαρμακευτικής Τεχνολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής του ΑΠΘ, υπό την επίβλεψη της επίκουρης καθηγήτριας Αικατερίνης Μαρκοπούλου. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω την Κα Μαρκοπούλου για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε αλλά κυρίως για την πολύτιμη επιστημονική καθοδήγηση. Οι οδηγίες της και η συνεχής ενθάρρυνση συνέβαλλαν στην ολοκλήρωση αυτής της επίπονης αλλά και τόσο εποικοδομητικής προσπάθειας. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον ομότιμο καθηγητή Ιωάννη Κουντουρέλλη για την αρχική παρότρυνση ενασχόλησης με το αντικείμενο της φαρμακευτικής ανάλυσης αλλά και τα μέλη της τριμελούς επιτροπής, τον καθηγητή Γεώργιο Ζαχαριάδη και τον επίκουρο καθηγητή Δημήτριο Φατούρο για τις υποδείξεις και το ενδιαφέρον τους. Ευχαριστώ θερμά και τους υπόλοιπους διδάσκοντες του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών της Φαρμακευτικής Τεχνολογίας για τις γνώσεις και τις συμβουλές που μου παρείχαν. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τη διδάκτορα Μαρία Κούσκουρα για την πολύτιμη βοήθεια και τις χρήσιμες πληροφορίες κατά τη διάρκεια του πειραματικού μέρους, αλλά και τους συμφοιτητές μου Μαρία Δάρδα και Χρήστο Γιουμουξούζη, συνοδοιπόρους σε αυτή τη δύσκολη προσπάθεια. Ολοκληρώνοντας θα ήθελα να απευθύνω ένα μεγάλο ευχαριστώ στους γονείς και την οικογένειά μου, η υποστήριξη των οποίων ήταν πραγματικά ανεκτίμητη.

Θεωρητικό μέρος

Κεφάλαιο 1o Φασματομετρία μάζας με ηλεκτροψεκασμό (Electrospray Ionization- Mass Spectrometry, ESI-MS) 1.1 Εισαγωγή Οι βασικές αρχές της φασματομετρίας μάζας περιλαμβάνουν τον ιονισμό ανόργανων ή οργανικών ουσιών, τον διαχωρισμό των παραγόμενων ιόντων βάσει του λόγου της μάζας προς το φορτίο τους (m/z) και τον προσδιορισμό τους από τις αντίστοιχες τιμές των λόγων m/z και της αφθονίας τoυς. Στη φασματομετρία μάζας, μέχρι σήμερα, έχει εφαρμοστεί ένας μεγάλος αριθμός τεχνικών για τον ιονισμό, τον διαχωρισμό και την ανίχνευση των ιόντων στην αέρια φάση. Ωστόσο, τα κύρια συστατικά μέρη ενός φασματομέτρου μάζας (σχ.1.1) είναι κοινά και περιλαμβάνουν: την πηγή ιονισμού (Ion Source), τον αναλυτή μάζας (Mass Analyzer) και τον ανιχνευτή (Detector). (1) Σχήμα 1.1 Τα κύρια μέρη ενός φασματομέτρου μάζας 1

Σε ένα φασματόμετρο μάζας, τα ιόντα διαχωρίζονται και ανιχνεύονται βάσει του λόγου της μάζας προς το φορτίο τους m/z (ο λόγος της μοριακής μάζας προς τον αριθμό των στοιχειωδών φορτίων του ιόντος). Το διάγραμμα της έντασης του σήματος (τεταγμένη) ενός ιόντος προς τον λόγο m/z (τετμημένη) αποτελεί το φάσμα μάζας της υπό μελέτη ουσίας (σχ.1.2). Το λαμβανόμενο σήμα καλείται κορυφή και η θέση της κορυφής εκφράζει τον λόγο m/z του ιόντος. Η ένταση της κορυφής ενός ιόντος αντιστοιχεί στην αφθονία αυτού στο χώρο ανίχνευσης. H κορυφή με τη μεγαλύτερη ένταση καλείται βασική κορυφή. Στη βασική κορυφή συνήθως αντιστοιχίζεται το 100% της έντασης, ενώ οι υπόλοιπες κορυφές εκφράζονται ως το % ποσοστό της έντασης της. Συχνά, η κορυφή που βρίσκεται στο μεγαλύτερο m/z προκύπτει από την ανίχνευση του μοριακού ιόντος (το ιόν που προκύπτει από το ακέραιο μόριο της ουσίας με την προσθήκη ή αφαίρεση ενός ή περισσότερων ηλεκτρονίων) και συνήθως ακολουθείται από αρκετές κορυφές σε μικρότερα m/z, οι οποίες αντιστοιχούν σε ιόντα-θραύσματα του μοριακού ιόντος. Επιπρόσθετα, οι κορυφές κάθε φάσματος μάζας φέρουν ισοτοπικές κορυφές, λόγω της ύπαρξης των ισοτόπων (ατόμων με τον ίδιο ατομικό αριθμό αλλά διαφορετικό μαζικό αριθμό). (2,3) Σχήμα 1.2 Φάσμα μάζας ενός υδρογονάνθρακα (με ηλεκτρονιακό ιονισμό) Κατά την εφαρμογή ήπιων μεθόδων ιονισμού, όπως είναι ο ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό, δεν ανιχνεύονται μοριακά ιόντα, αλλά κυρίως ιόντα που προέρχονται από την πρωτονίωση/αποπρωτονίωση των ουσιών, καθώς και από την προσθήκη ιόντων στις υπό μελέτη ουσίες. 2

1.2 Ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό (Electrospray Ionization, ESI) Ο ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό κατέχει κυρίαρχη θέση μεταξύ των μεθόδων ιονισμού υπό συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης (Atmospheric Pressure Ionization, API methods) και αποτελεί τη μέθοδο επιλογής για τη σύζευξη της υγρής χρωματογραφίας με τη φασματομετρία μάζας (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS). Επίσης, έχει συμβάλει στην επέκταση των αναλυτικών εφαρμογών της φασματομετρίας μάζας στους τομείς της βιολογίας και των βιοϊατρικών επιστημών και επί του παρόντος, συγκαταλέγεται ανάμεσα στις πιο συχνά χρησιμοποιούμενες μεθόδους ιονισμού. Ο ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό είναι μία ήπια μέθοδος ιονισμού, με την οποία επιτυγχάνεται η μεταφορά των ουσιών από το διάλυμα στην αέρια φάση ως ιόντα. Χρησιμοποιείται κυρίως για την ανάλυση μεγάλων, μη-πτητικών, ιονίσιμων μορίων, όπως οι πρωτεΐνες. Ωστόσο, εφαρμόζεται εξίσου καλά σε μικρά πολικά μόρια, ιονικά σύμπλοκα μετάλλων και άλλες ανόργανες ουσίες. Το διάλυμα ηλεκτροψεκασμού αποτελείται από τον πτητικό διαλύτη που περιέχει την ουσία σε πολύ χαμηλή συγκέντρωση. Η μεταφορά της ουσίας από το αρχικό διάλυμα στην αέρια φάση ως ιόντα ξεκινάει υπό συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης και καταλήγει σταδιακά στο υψηλό κενό του αναλυτή μάζας. Επιπλέον, ένα άλλο χαρακτηριστικό του ιονισμού με ηλεκτροψεκασμό είναι ο σχηματισμός πολλαπλά φορτισμένων ιόντων στην περίπτωση των μεγαλομοριακών ουσιών. Αυτή η πολλαπλή φόρτιση μειώνει την κλίμακα των λόγων m/z κατά τον αριθμό των φορτίων και ως εκ τούτου μετατοπίζει τα ιόντα σε ένα εύρος τιμών m/z κατάλληλο για τους περισσότερους αναλυτές μάζας (σχ.1.3). (3) Σχήμα 1.3 Φάσμα μάζας πρωτεΐνης υπό συνθήκες ιονισμού με ηλεκτροψεκασμό. Σε κάθε κορυφή αναγράφεται ο λόγος m/z και ο αριθμός των ιονικών φορτίων 3

1.2.1 ESI και πρόδρομες μέθοδοι ιονισμού Ο ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό χρησιμοποιήθηκε στη φασματομετρία μάζας για πρώτη φορά το 1968. (4) Κατά τη διάρκεια της εξέλιξής του χρησιμοποιήθηκαν κι άλλες μέθοδοι ιονισμού, συναφείς με αυτόν. Κάποιες από αυτές γνώρισαν επιτυχία, ενώ άλλες αντικαταστάθηκαν άμεσα από πιο ευαίσθητες και αποτελεσματικές μεθόδους: -Αtmospheric Pressure Ionization: ήταν η πρώτη τεχνική που συνέδεσε απευθείας την παροχή του διαλύματος της ουσίας με τον αναλυτή μάζας. Το διάλυμα της ουσίας εγχέονταν σε θερμό ρεύμα αζώτου, υπό ατμοσφαιρική πίεση, με αποτέλεσμα την άμεση εξάτμιση του διαλύτη. Στη συνέχεια, ο παραγόμενος ατμός βομβαρδίζονταν με ηλεκτρόνια και ξεκινούσαν πολύπλοκες διαδικασίες ιονισμού. (5) -Thermospray, TSP: το διάλυμα της ουσίας, το οποίο συνήθως περιείχε και μικρή ποσότητα άλατος, εξατμίζονταν από ένα θερμαινόμενο τριχοειδές. Καθώς ο διαλύτης εξατμίζονταν, η ουσία σχημάτιζε σύμπλοκα με τα ιόντα του άλατος. Τα παραγόμενα ιόντα μεταφέρονταν σε έναν τετραπολικό αναλυτή μάζας με την εφαρμογή δυναμικού. (6) -Electrohydrodynamic Ionization, EHI: ένα διάλυμα χαμηλής πτητικότητας μεταφέρονταν σε κενό και ψεκάζονταν από ένα λεπτό τριχοειδές υπό την επίδραση ισχυρού ηλεκτροστατικού πεδίου. Έτσι, σχηματίζονταν ένα νέφος μικροσκοπικών φορτισμένων σταγονιδίων, το οποίο διασπώνταν συνεχώς, λόγω της εξάτμισης του διαλύτη, μέχρι τον σχηματισμό ιόντων αέριας φάσης. Η μέθοδος αυτή είχε σημαντικά κοινά χαρακτηριστικά με τον ηλεκτροψεκασμό. (7) -Electrospray Ionization: η βασική αρχή είναι ίδια με του EHI. Κατά τον ηλεκτροψεκασμό παράγεται ένα νέφος μικροσκοπικών φορτισμένων σταγονιδίων, τα οποία συρρικνώνονται και διασπώνται επαναλαμβανόμενα, όπως συμβαίνει και με τον ΕΗΙ. Σε αντίθεση όμως με τον EHI, ο ψεκαστήρας λειτουργεί υπό συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης. Στη συνέχεια, το φορτισμένο νέφος εισάγεται συνεχώς στον αναλυτή μάζας μέσω μιας διάταξης με διαβαθμισμένες συνθήκες πίεσης. Προκειμένου να αποφευχθεί η ψύξη των σταγονιδίων του αερολύματος κατά την αδιάβατη εκτόνωσή του (λόγω της μετάβασης από την ατμόσφαιρα 4

στο κενό), είναι απαραίτητη η παροχή ενέργειας. Η ενέργεια, υπό μορφή θερμότητας, παρέχεται είτε από ένα αντίθετα κινούμενο θερμό ρεύμα αερίου είτε από ένα θερμαινόμενο τριχοειδές (Heated Capillary). Μέχρι σήμερα όλες οι πηγές ESI κάνουν χρήση του ενός ή του άλλου τρόπου θέρμανσης του αερολύματος. 1.3 ESI-φασματόμετρο μάζας Το ESI-φασματόμετρο μάζας παράγει ιόντα με τη μέθοδο του ηλεκτροψεκασμού. Στην παρούσα εργασία θα δοθεί έμφαση στους τύπους του μηχανολογικού εξοπλισμού που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των υπό μελέτη δραστικών ουσιών. Η διάταξη εισαγωγής του δείγματος περιλαμβάνει σύστημα υγρής χρωματογραφίας, χωρίς στήλη. Ακολουθεί η περιγραφή των βασικών τμημάτων του ESI-φασματομέτρου μάζας. 1.3.1 Πηγή ESI (ESI Source) Η πρώτη πηγή ηλεκτροψεκασμού-φασματομετρίας μάζας (σχ.1.4) σχεδιάστηκε από την ομάδα του Fenn, στα μέσα της δεκαετίας του 1980. (8) Το διάλυμα του δείγματος τροφοδοτείται στο τριχοειδές ψεκασμού (Spray Capillary), το οποίο διατηρείται σε δυναμικό 3-4KV σε σχέση με το αντίθετο ηλεκτρόδιο (Counter Electrode). Το σχηματιζόμενο αερόλυμα έρχεται σε επαφή με ένα αντίθετα κινούμενο ρεύμα θερμού αερίου αζώτου, που εξυπηρετεί στην εξάτμιση του διαλύτη. Ένα μικρό μέρος του αερολύματος εισέρχεται στο τριχοειδές μεταφοράς (Transfer Capillary), το οποίο συνδέει τη μονάδα ψεκασμού υπό ατμοσφαιρική πίεση με την πρώτη ζώνη κενού. Ένα, επίσης, μικρό μέρος του παραγόμενου αερίου περνάει μέσω του αποκορυφωτή (Skimmer) στη δεύτερη ζώνη υψηλού κενού (ο αποκορυφωτής είναι ένα κωνικό ηλεκτρόδιο που φέρει ένα μικρό άνοιγμα στην κορυφή του). Σε αυτό το στάδιο έχει ολοκληρωθεί η αποδιαλύτωση των ιόντων, τα οποία συγκεντρώνονται στον αναλυτή μάζας. Με την εφαρμογή κατάλληλων δυναμικών στο τριχοειδές, στον αποκορυφωτή και στους φακούς (Lenses) επιτυγχάνεται η αποτελεσματική μεταφορά των ιόντων μέσω της διασύνδεσης, ενώ το ουδέτερο αέριο δεν επηρεάζεται και εξέρχεται μέσω του συστήματος κενού. 5

Σχήμα 1.4 Αρχική διάταξη πηγής ιονισμού με ηλεκτροψεκασμό Οι σύγχρονες πηγές ιονισμού με ηλεκτροψεκασμό έχουν σχεδιαστεί με πολλές παραλλαγές της παραπάνω βασικής διάταξης και οι οποίες μπορούν να επηρεάσουν το αποτέλεσμα σε σημαντικό βαθμό. O αρχικός σχεδιασμός θέτει περιορισμούς στην ταχύτητα ροής του διαλύματος του δείγματος, γι αυτό και αναπτύχθηκαν διάφορες τροποποιήσεις του σχεδίου του ψεκαστήρα (σχ.1.5). (9) Σχήμα 1.5 Διαφορετικοί ψεκαστήρες ηλεκτροψεκασμού. α) Απλός ηλεκτροψεκασμός, β) Ηλεκτροψεκασμός με περιβάλλον υγρό, γ) Πνευματικά υποβοηθούμενος ηλεκτροψεκασμός και δ) Νεφελοποιητής υπερήχων 6

Η διάταξη του πνευματικά υποβοηθούμενου ηλεκτροψεκασμού (Pneumatically Αssisted ES) διαφέρει από του απλού ηλεκτροψεκασμού στην παροχή ομοαξονικής ροής αερίου (συνήθως αζώτου) και είναι αυτή που χρησιμοποιείται στις περισσότερες μετρήσεις ρουτίνας με ηλεκτροψεκασμό. Το αέριο εκνέφωσης (Nebulizer Gas) επιτρέπει την υψηλότερη ροή του διαλύματος του δείγματος και μειώνει την επίδραση της επιφανειακής τάσης του διαλύτη. (10) Ο νεφελοποιητής υπερήχων (Ultrasonic Nebulizer) παράγει μηχανικά το αερόλυμα και χρησιμοποιείται σε διαλύματα υψηλής αγωγιμότητας και/ή υψηλής επιφανειακής τάσης. (11) Η χρήση περιβάλλουσας ροής υγρού (Sheath Liquid) βρίσκει εφαρμογή κατά τη σύζευξη της φασματομετρίας μάζας με την ηλεκτροφόρηση τριχοειδούς ζώνης (Capillary Zone Electrophoresis). (12) Επιπρόσθετα, αναπτύχθηκαν και διάφορες τροποποιήσεις της γεωμετρίας του ψεκαστήρα, δηλαδή της θέσης του ως προς την είσοδο που οδηγεί στον αναλυτή μάζας (σχ.1.6). Έτσι, σχεδιάστηκαν ψεκαστήρες που ψεκάζουν έκτος άξονα ή σε ορθή γωνία ως προς την είσοδο κενού (ή κοντά σε αυτήν). Αυτές οι τροποποιήσεις έχουν το πλεονέκτημα να ελαττώνουν σε μεγάλο βαθμό την πιθανότητα μόλυνσης και απόφραξης των τριχοειδών και του αποκορυφωτή από την εναπόθεση μη-πτητικών ακαθαρσιών των δειγμάτων. Επιπρόσθετα, ο ψεκασμός σε ορθή γωνία επιτρέπει την επιλεκτική συλλογή των μικρών σταγονιδίων υψηλού φορτίου, τα οποία αποτελούν και την προτιμώμενη πηγή των ιόντων της ουσίας. (13) Σχήμα 1.6 Διαφορετικές θέσεις του ψεκαστήρα εντός της πηγής ηλεκτροψεκασμού 7

1.3.2 Τετραπολικός αναλυτής μάζας (Quadrupole Mass Analyzer) Στις μέρες μας, οι τετραπολικοί αναλυτές μάζας (14,15) αποτελούν τον συνήθη εξοπλισμό για αναλύσεις υγρής χρωματογραφίας- φασματομετρίας μάζας (LC-MS). Καλύπτουν ένα εύρος λόγων m/z έως 2000 ή και περισσότερο και διαθέτουν καλή διακριτική ικανότητα (Resolving Power), υψηλή ταχύτητα σάρωσης και χαμηλό δυναμικό επιτάχυνσης των ιόντων. Στα πλεονεκτήματά τους συγκαταλέγονται, επίσης, η χαμηλή τιμή και το μικρό συγκριτικά βάρος. Ο τετραπολικός αναλυτής μάζας αποτελείται από τέσσερα ηλεκτρόδια (ράβδους κυλινδρικής διατομής ή ιδανικά, διατομής σχήματος υπερβολής) που εκτείνονται στη διεύθυνση z και διευθετούνται σε σχήμα σταυρού (σχ.1.7 και 1.8). Σε κάθε ζεύγος των αντίθετων ηλεκτροδίων εφαρμόζεται το ίδιο δυναμικό, αποτελούμενο από μία συνιστώσα σταθερού (DC) και μία συνιστώσα εναλλασσόμενου ρεύματος (AC). Σχήμα 1.7 Διατομή τετράπολου με ράβδους: α) κυλινδρικού σχήματος και β) προφίλ σχήματος υπερβολής. Το ηλεκτρικό πεδίο είναι μηδέν κατά μήκος των διακεκομμένων γραμμών (r0 η απόσταση του ηλεκτροδίου από το κέντρο). 8

Σχήμα 1.8 Τετραπολικός αναλυτής μάζας Έστω ότι ένα ιόν εισέρχεται στο τετράπολο κατά τη διεύθυνση z. Τότε ασκείται πάνω του μία ελκτική δύναμη από τη ράβδο που έχει φορτίο αντίθετο από το φορτίο του ιόντος. Αν η τάση που εφαρμόζεται στις ράβδους μεταβάλλεται περιοδικά, θα μεταβάλλεται περιοδικά και το πρόσημο της ηλεκτρικής δύναμης, με αποτέλεσμα να εναλλάσσονται με το χρόνο η άπωση με την έλξη του ιόντος και κατά τις δύο διευθύνσεις x και y. Εάν η εφαρμοζόμενη τάση αποτελείται από μία τάση συνεχούς ρεύματος U και μία τάση ραδιοσυχνότητας V με συχνότητα ω, το συνολικό δυναμικό Φ0 θα δίνεται από τη σχέση: Φ 0 = U + V cos ω t (1.1) To ηλεκτρικό πεδίο είναι μηδέν κατά μήκος των διακεκομμένων γραμμών. Ένα ιόν μπορεί να διασχίσει το τετράπολο, χωρίς να χτυπήσει στις ράβδους, με την προϋπόθεση ότι η κίνησή του κατά τον άξονα z είναι σταθερή, με περιορισμένο πλάτος στο επίπεδο xy. Αυτές οι συνθήκες περιγράφονται από τη θεωρία των εξισώσεων του Γάλλου μαθηματικού Ε.L.Mathieu. Οι εξισώσεις κίνησης θα είναι: + (U + V cos ω t) x = 0 (1.2) 9

+ (U + V cos ω t) y = 0 (1.3) και οι οποίες μπορούν να γραφούν με τη μορφή: + (αx + 2qx cos 2τ) x = 0 (1.4) + (αy + 2qy cos 2τ) y = 0 (1.5) από τις οποίες υπολογίζονται oι παράμετροι α και q: αx = -αy =, qx = -qy =, τ = Για ένα δεδομένο σύνολο τιμών U, V και ω, η συνολική ιοντική κίνηση μπορεί να οδηγήσει σε σταθερή τροχιά επιτρέποντας τη διέλευση από το τετράπολο ιόντων συγκεκριμένης τιμής ή εύρους λόγων m/z. Παριστάνοντας γραφικά τις παραμέτρους α (τεταγμένη) και q (τετμημένη), λαμβάνεται το διάγραμμα σταθερότητας του δισδιάστατου πεδίου του τετράπολου (σχ.1.9). Από το διάγραμμα φαίνονται οι περιοχές όπου: α) και οι x και οι y τροχιές είναι σταθερές, β) είτε οι x είτε οι y τροχιές είναι σταθερές και γ) δε συμβαίνει καμία σταθερή ιοντική κίνηση. Από τις 4 περιοχές (I, II, III και IV) σταθερότητας της κατηγορίας α, η περιοχή I παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τη λειτουργία του τετράπολου ως διαχωριστή μαζών (σχ.1.10). 10

Σχήμα 1.9 Διάγραμμα σταθερότητας τετραπολικού αναλυτή μάζας, το οποίο δείχνει 4 περιοχές σταθερότητας (I-IV) για την κίνηση κατά τους άξονες x και y Σχήμα 1.10 Λεπτομερέστερη απεικόνιση του ανωτέρου μισού της περιοχής Ι του διαγράμματος σταθερότητας για τον τετραπολικό αναλυτή μάζας Εάν τώρα ο λόγος α/q επιλεγεί ώστε 2U/V = 0.237/0.706 = 0.336, η περιοχή σταθερότητας συρρικνώνεται σε ένα σημείο, την κορυφή, του διαγράμματος στο Σχήμα 1.11. Ελαττώνοντας το α με σταθερό το q, ένα διαρκώς ευρύτερο φάσμα λόγων m/z μπορεί να μεταβιβαστεί ταυτόχρονα. Επαρκής διακριτική ικανότητα επιτυγχάνεται, εφόσον ένα μικρό 11

εύρος λόγων m/z παραμένει σταθερό. Επομένως, το πλάτος (Δq) της σταθερής περιοχής καθορίζει τη διακριτική ικανότητα. Μεταβάλλοντας το μέγεθος των U και V κρατώντας σταθερό το λόγο τους U/V, επιτρέπονται ολοένα και μεγαλύτερου λόγου m/z ιόντα να περάσουν το τετράπολο. Άρα, ο τετραπολικός αναλυτής λειτουργεί ως φίλτρο μαζών και γι αυτό ονομάζεται και τετραπολικό φίλτρο μαζών. Μηδενίζοντας την τάση του συνεχούς ρεύματος U, το τετράπολο μετατρέπεται σε ένα πέρασμα ευρείας ζώνης για τα ιόντα. Ο τρόπος αυτός λειτουργίας παριστάνεται με μία γραμμή στο διάγραμμα σταθερότητας, η οποία ισοδυναμεί με τον άξονα των q. Αυτές οι συσκευές είναι κοινώς γνωστές ως RF-μόνο τετράπολα (RF-only Quadrupoles). Ανάλογα χρησιμοποιούνται και τα RF-μόνο εξάπολα και οκτάπολα (RF-only Hexapoles and Octopoles). Οι συσκευές αυτές χρησιμοποιούνται ευρέως ως οδηγοί ιόντων (Ion Guides), δηλαδή αναλαμβάνουν τη μεταφορά ιόντων χαμηλής κινητικής ενέργειας από έναν θάλαμο λειτουργίας σε έναν άλλον και επίσης, στην προσαρμογή των πηγών ιονισμού ατμοσφαιρικής πίεσης στους αναλυτές μάζας. Στην πράξη, λειτουργούν σαν σωλήνες για τα ιόντα, ενώ είναι πλήρως διαπερατοί από τα ουδέτερα μόρια. Έτσι, οι οδηγοί ιόντων οδηγούν τα ιόντα προς τον αναλυτή μάζας, ενώ επιτρέπουν στο αέριο να διαφεύγει διαμέσου του κενού ανάμεσα στις ράβδους προς τις αντλίες κενού. 1.3.3 Ανιχνευτής ιόντων (Ion Detector) Η λήψη φάσματος μάζας προϋποθέτει τη μετατροπή των ιόντων σε σήμα από τον ανιχνευτή. Οι δευτερεύοντες ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστές (Secondary Electron Multipliers, SEM) (15,16) είναι ανιχνευτές που καθιερώθηκαν με τη χρήση των φασματομέτρων μάζας σάρωσης (Scanning Mass Spectrometers). Η λειτουργία τους στηρίζεται στην εκπομπή δευτερευόντων ηλεκτρονίων από την πρόσκρουση των ιόντων σε επιφάνειες. Η διάταξη του ανιχνευτή περιλαμβάνει τη δύνοδο μετατροπής (Conversion Dynode) και τον ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστή. Τα ιόντα που εξέρχονται από τον τετραπολικό αναλυτή μάζας κινούνται αργά και προκειμένου να φτάσουν στον ανιχνευτή, τοποθετείται μετατροπέας δυνόδου μπροστά από τον ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστή. Πρόκειται για ηλεκτρόδια σε υψηλό δυναμικό (5-20 kv), κατάλληλης πολικότητας, ώστε να έλκουν τα ιόντα που εξέρχονται από 12

τον αναλυτή μάζας. Η πρόσκρουση των ιόντων στη δύνοδο μετατροπής δημιουργεί δευτερεύοντα ιόντα ή ηλεκτρόνια, που μπορούν να ανιχνευτούν. Η ευαισθησία του ανιχνευτή είναι σχεδόν ίση για θετικά και για αρνητικά ιόντα. Σχήμα 1.11 Διάταξη ανιχνευτή με δύνοδο μετατροπής 1.3.4 Σύστημα κενού (Vacuum System) Tα συστήματα κενού (17) που χρησιμοποιούνται στην οργανολογία ηλεκτροψεκασμού μπορούν να διαιρεθούν σε συστήματα κενού ενός και πολλαπλών σταδίων (Single-stage and Multiple-stage Vacuum Systems). Tα σύγχρονα φασματόμετρα μάζας με ιονισμό ηλεκτροψεκασμού κάνουν χρήση συστημάτων κενού πολλαπλών σταδίων (σχ.1.12). Οι κατασκευαστές και οι ερευνητές επιλέγουν συστήματα κενού πολλαπλών σταδίων που περιλαμβάνουν σχετικά οικονομικές αντλίες κενού (Vacuum Pumps). 13

Σχήμα 1.12 Σύστημα κενού πολλαπλών σταδίων Τα ιόντα οδηγούνται μέσω ενός μικρού ανοίγματος στον πρώτο θάλαμο, όπου επικρατεί πίεση 1 torr με τη λειτουργία περιστροφικής αντλίας (Rotary Pump). Ένα μέρος του αερίου και ιόντα προχωρούν στον δεύτερο θάλαμο, πιέσεως 10-2 torr ή και λιγότερο. Στο δεύτερο στάδιο απομακρύνεται η μεγαλύτερη ποσότητα αερίου. Στη συνέχεια, τα ιόντα οδηγούνται, από μία κατάλληλη διάταξη οπτικών συστημάτων ιόντων (Ion Optics), στον θάλαμο του αναλυτή μάζας, πιέσεως 10-5 torr. Το οπτικό σύστημα ιόντων μπορεί να αποτελείται από μία σειρά τυπικών φακών ή από οδηγούς ιόντων (RF-μόνο τετράπολο, εξάπολο, οκτάπολο). Τυπικές διαστάσεις για το στόμιο δειγματοληψίας είναι 0.25-0.5 mm και για τον αποκορυφωτή 0.6-4.0 mm. Αυτές οι διαστάσεις εξαρτώνται κυρίως από το μέγεθος και την ταχύτητα λειτουργίας των περιστροφικών και στροβιλομοριακών (Turbomolecular) αντλιών. 1.4 Εφαρμογές της τεχνικής ESI-MS Η τεχνική ESI-MS εφαρμόζεται για την ανάλυση διαφόρων κατηγοριών ουσιών, (3,15,16) ορισμένες από τις οποίες είναι: 14

-ESI-MS πρωτεϊνών Χρησιμοποιείται κυρίως για την ανάλυση πρωτεϊνών και πρωτεϊνικών συμπλόκων, πολύ μεγαλύτερων από 1 ΜDa. Γι αυτές τις περιπτώσεις απαιτούνται ειδικοί αναλυτές μάζας, με μεγάλο εύρος m/z, παρόλο που τα παραγόμενα ιόντα αποκτούν υψηλό φορτίο. -ESI-MS ολιγονουκλεοτιδίων Για την ανάλυση των ολιγονουκλεοτιδίων, DNA και RNA, είναι καταλληλότερη η τεχνική ESI-MS για αρνητικά ιόντα. Tα προβλήματα, κατά την ανάλυση των ολιγονουκλεοτιδίων, προέρχονται συχνά από την πολλαπλή ανταλλαγή πρωτονίων με ιόντα αλκαλίων. Για την απομάκρυνση των αλκαλικών ιόντων προστίθενται αζωτούχες βάσεις (ιμιδαζόλη και πιπεριδίνη) κι έτσι λαμβάνονται καθαρά φάσματα. -ESI-MS ολιγοσακχαριτών Ο ήπιος χαρακτήρας της μεθόδου ιονισμού με ηλεκτροψεκασμό και η χρησιμοποίηση πολικών διαλυτών αποτελούν σημαντικά πλεονεκτήματα για την ανάλυση των ολιγοσακχαριτών, αλλά και για παρόμοιες ουσίες, ιδίως όταν έχουν διακλαδώσεις. Το ESI επιτρέπει τον προσδιορισμό του μοριακού βάρους και της δομής αυτών των ουσιών. -ESI-MS συμπλόκων μετάλλων Βρίσκει καλή εφαρμογή σε ιονικά σύμπλοκα μετάλλων και σχετικές ενώσεις, με την προϋπόθεση ότι είναι διαλυτές σε συγκέντρωση τουλάχιστον 10 6 Μ σε διαλύτες κατάλληλους για τη μέθοδο. -ESI-MS επιφανειοδραστικών ουσιών Οι ανιονικές και κατιονικές επιφανειοδραστικές ουσίες ανιχνεύονται εύκολα με το ESI-MS, όπως επίσης και οι μη-ιονικές επιφανειοδραστικές ουσίες. -ESI-MS μικρών μορίων Xρησιμοποιείται στην ανάλυση μικρών πολικών μορίων (100-1500 m/z) σε φαρμακευτικές εφαρμογές, συμπεριλαμβανομένων και μελετών μεταβολισμού. Τα ιόντα που σχηματίζονται ποικίλλουν, ενώ σπάνια παρατηρούνται πολλαπλά φορτισμένα ιόντα. Οι παράγοντες που 15

επηρεάζουν τον τύπο των ιόντων είναι η πολικότητα, η παρουσία αλάτων, το ph και η συγκέντρωση του διαλύματος. Σχήμα 1.13 Φάσμα ηλεκτροψεκασμού θετικών ιόντων ενός αντί-hiv φαρμάκου 1.5 Σύζευξη με Χρωματογραφία Η ανάλυση πολύπλοκων μιγμάτων επέβαλε τον συνδυασμό διαφόρων τεχνικών διαχωρισμού με τη φασματομετρία μάζας. (13,15) Το πρώτο βήμα προς αυτήν την κατεύθυνση έγινε με τη σύζευξη της αέριας χρωματογραφίας με τη φασματομετρία μάζας (GC-MS). Στη συνέχεια, η προσπάθεια ανάλυσης μη-πτητικών και υψηλής πολικότητας ουσιών οδήγησε στη σύζευξη της υγρής χρωματογραφίας με τη φασματομετρία μάζας (LC-MS) και στην ανάπτυξη μεθόδων ιονισμού υπό συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης (ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό κ.ά.). Από τη σκοπιά της φασματομετρίας μάζας, κάθε χρωματογραφικό σύστημα αποτελεί ένα διαφορετικό σύστημα εισαγωγής του δείγματος, ενώ από χρωματογραφικής απόψεως το φασματόμετρο μάζας αποτελεί τον ανιχνευτή της τεχνικής διαχωρισμού. Η υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας αποτελεί μία σχετικά καινούρια τεχνική, η οποία κατάφερε να επιτύχει τη μέγιστη διεθνή επιστημονική αναγνώριση με την απονομή του βραβείου νόμπελ για χημεία στον John B. Fenn, το 2002. Η τεχνική LC-MS άρχισε να αποκτά ενδιαφέρον από τη στιγμή που κατάφερε να προσδιορίσει με επιτυχία έναν μεγάλο αριθμό οργανικών ενώσεων και πιο συγκεκριμένα, πολικές ενώσεις, θερμικά ασταθείς ενώσεις και ενώσεις υψηλού μοριακού βάρους, οι οποίες ήταν δύσκολο ή αδύνατον να 16

αναλυθούν με την τεχνική GC-MS. Έχει υπολογιστεί ότι περίπου το 80% των γνωστών οργανικών ενώσεων μπορεί να αναλυθεί με την τεχνική LC-MS, ενώ μόνο το 20% μπορεί να αναλυθεί με την τεχνική GC-MS χωρίς προηγούμενη παραγωγοποίηση. Πιο συχνά χρησιμοποιείται η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (High-Pressure Liquid Chromatography, HPLC), ενώ σχετικά πρόσφατα άρχισε να χρησιμοποιείται και η υγρή χρωματογραφία υπερ-υψηλής πίεσης (Ultrahigh-Pressure Liquid Chromatography, UHPLC or Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC). Όσον αφορά τα HPLC-MS συστήματα, στο 80% χρησιμοποιείται χρωματογραφία αντίστροφης φάσης, διότι καλύπτονται οι απαιτήσεις συμβατότητας σχετικά με τη σύσταση του εκλούσματος και τον ρυθμό ροής στο τέλος της στήλης. Η χρωματογραφία διαχωρίζει τα συστατικά ενός μίγματος βάσει του χρόνου συγκράτησης, δηλαδή τη χρονική στιγμή έκλουσης από τη χρωματογραφική στήλη. Οι συνήθεις χρωματογραφικοί ανιχνευτές, όπως ο ανιχνευτής ιονισμού φλόγας (Flame Ionization Detector, FID), παρέχουν ένα χρωματογράφημα που παριστάνει τη ροή μάζας που εκλούεται από τη χρωματογραφική στήλη. Αν χρησιμοποιηθεί ως ανιχνευτής ένα φασματόμετρο μάζας, προσφέρεται μια επιπλέον πηγή πληροφορίας: τα φάσματα μάζας των ουσιών που εκλούονται (σχ.1.14). Σχήμα 1.14 Οι τρεις διαστάσεις της χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας: χρόνος συγκράτησης, ένταση σήματος και λόγος m/z 17

Κάθε ουσία που εκλούεται από τη χρωματογραφική στήλη χαρακτηρίζεται από το δικό της φάσμα μάζας. Το άθροισμα όλων των εντάσεων των κορυφών ενός φάσματος μάζας, σε οποιοδήποτε σημείο του χρόνου συγκράτησης, χρησιμοποιείται για την κατασκευή του χρωματογραφήματος ιόντων. Το συνολικό χρωματογράφημα ιόντων (Total Ion Chromatogram, TIC) λαμβάνεται με άθροιση των εντάσεων των κορυφών κάθε φάσματος μάζας που διαδοχικά λαμβάνεται κατά τη διάρκεια της ανάλυσης και παριστάνεται συναρτήσει του χρόνου συγκράτησης, όπως φαίνεται και στο Σχήμα 1.14. (18) Σχήμα 1.15 Το πλεονέκτημα του SIM τρόπου λειτουργίας έναντι του Scan. Υποθετικό πείραμα για την ανάλυση δείγματος με: α) SIM τρόπο λειτουργίας σε m/z 167, 333, και 403, συγκρινόμενος με β) Scan 500 ms, εύρους m/z 150-450. Στη β περίπτωση θα ξοδεύονταν μόνο 1,5 ms σε καθένα από τα 3 σήματα στη διάρκεια των 500 ms, ενώ 20ms θα ξοδεύονταν στην α περίπτωση, σε κύκλο SIM 75 ms Μία ευρέως εφαρμοζόμενη τεχνική ανάλυσης στη χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας αποτελεί η επαναλαμβανόμενη σάρωση ενός εύρους λόγων m/z (Scan Mode), η οποία χρησιμοποιείται για την αναγνώριση των συστατικών ενός μίγματος. Κατά την εφαρμογή της, λαμβάνονται φάσματα μάζας μεταξύ δύο ακραίων τιμών m/z και για καθορισμένο χρόνο ανάλυσης. Αυτή ακριβώς η διαδικασία δημιουργεί μία σχέση μεταξύ του χρωματογραφήματος και των φασμάτων μάζας των εκλουόμενων συστατικών, ώστε κάθε 18

σημείο του συνολικού χρωματογραφήματος ιόντων να αντιστοιχεί σε ένα πλήρες φάσμα μάζας. Στις περιπτώσεις που ενδιαφέρει ο ποσοτικός προσδιορισμός των συστατικών ενός μίγματος προτιμάται η τεχνική της επιλεκτικής παρακολούθησης ιόντων (Selected Ion Monitoring, SIM). Στη λειτουργία SIM, ο αναλυτής μάζας λειτουργεί με τρόπο ώστε να λαμβάνει εναλλάξ μόνο τις μάζες των ιόντων του ενδιαφέροντος, δηλαδή μεταβαίνει από το ένα m/z στο επόμενο. Έτσι, ο χρόνος που αφιερώνεται στα ιόντα του ενδιαφέροντος αυξάνεται κατά πολύ, με αποτέλεσμα να παρατηρείται και ανάλογη αύξηση στην ευαισθησία. (15) 19

Κεφάλαιο 2o Βασικές αρχές του ιονισμού με ηλεκτροψεκασμό (Basic principles of Electrospray Ionization) 2.1 Εισαγωγή Ο ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό είναι μία μέθοδος ιονισμού κατά την οποία οι ουσίες που βρίσκονται διαλυμένες σε ένα διάλυμα μεταφέρονται στην αέρια φάση ως ιόντα. Τα ιόντα αέριας φάσης ανιχνεύονται στη συνέχεια από το φασματόμετρο μάζας. Τα κύρια στάδια (19) για τον σχηματισμό των ιόντων αέριας φάσης στη διάταξη ηλεκτροψεκασμού είναι: α) η παραγωγή φορτισμένων σταγονιδίων στην έξοδο του τριχοειδούς ψεκασμού β) η συρρίκνωση των φορτισμένων σταγονιδίων σε πολύ μικρά σταγονίδια υψηλού φορτίου, λόγω της εξάτμισης του διαλύτη (αποδιαλύτωση) και των επαναλαμβανόμενων διασπάσεων των σταγονιδίων και γ) ο σχηματισμός των ιόντων αέριας φάσης μέσω του μοντέλου ιοντικής εξάτμισης (Ion Evaporation Model, IEM) ή μέσω του μοντέλου υπολειμματικού φορτίου (Charge Residue Model, CRM). Τα παραπάνω στάδια λαμβάνουν χώρα υπό συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης. Τα ιόντα αέριας φάσης που παράγονται εισέρχονται σε συνθήκες κενού, είτε μέσω ενός μικρού ανοίγματος (Orifice), είτε μέσω ενός τριχοειδούς (Capillary), ανάλογα με τη διάταξη και οδηγούνται προς το φασματόμετρο μάζας. Τα ιόντα εισάγονται συνήθως στην αέρια φάση περιβαλλόμενα από μόρια διαλύτη και άλλα πρόσθετα. Για την απομάκρυνση των προαναφερθέντων, αρχικά, τα ιόντα υποβάλλονται σε θέρμανση στο τριχοειδές και σε δεύτερο στάδιο, σε συγκρουσιογενή 20

ενεργοποίηση (Collisional Activation) με εφαρμογή διαφοράς δυναμικού μεταξύ της εξόδου του τριχοειδούς και του αποκορυφωτή (Skimmer). Σχήμα 2.1 Οι κύριες διαδικασίες του ηλεκτροψεκασμού υπό συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης και θετικού ιονισμού 2.2 Στάδια σχηματισμού των ιόντων αέριας φάσης Πιο αναλυτικά, τα στάδια σχηματισμού (1) των ιόντων αέριας φάσης είναι: α) Παραγωγή φορτισμένων σταγονιδίων στην έξοδο του τριχοειδούς ψεκασμού Καθώς το διάλυμα του δείγματος εξωθείται μέσω του τριχοειδούς ψεκασμού, στο άκρο του οποίου εφαρμόζεται υψηλό δυναμικό, ο διαλύτης υφίσταται ηλεκτροχημική αντίδραση, με αποτέλεσμα τη ροή ηλεκτρονίων προς ή από το μεταλλικό τριχοειδές (ανάλογα με την πολικότητα του εφαρμοζόμενου δυναμικού). Όπως φαίνεται και στον Πίνακα 2.1, η οξείδωση του διαλύτη λαμβάνει χώρα κατά τον θετικό ιονισμό, ενώ η αναγωγή του διαλύτη λαμβάνει 21

χώρα κατά τον αρνητικό ιονισμό. Πίνακας 2.1 Τυπικές οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις των διαλυτών που αναμένεται να συμβούν στο τριχοειδές ηλεκτροψεκασμού και τα αντίστοιχα δυναμικά Αυτές οι οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις παρέχουν στο διάλυμα θετικά ή αρνητικά ιόντα ανάλογα με την πολικότητα του εφαρμοζόμενου δυναμικού στο άκρο του τριχοειδούς ψεκασμού. Γενικά, στη φασματομετρία μάζας με ηλεκτροψεκασμό χρησιμοποιούνται πολικοί διαλύτες, όπως νερό, μεθανόλη, ακετονιτρίλιο κ.ά. και οι οποίοι εύκολα υφίστανται ηλεκτροχημικές αντιδράσεις. Τα συσσωρευμένα φορτία (θετικά ή αρνητικά) που δημιουργούνται, απωθούνται από το ισχυρό δυναμικό που εφαρμόζεται (της ίδιας πολικότητας) και παρασύρονται προς την επιφάνεια του υγρού, στην έξοδο του τριχοειδούς (σχ.2.2). Σχήμα 2.2 Περιγραφή των σταδίων σχηματισμού των ιόντων αέριας φάσης 22

Στην επιφάνεια, τα φορτία αποσταθεροποιούνται και ο μηνίσκος μετασχηματίζεται σε κώνο (κώνος του Taylor) υπό την επίδραση του ισχυρού ηλεκτρικού πεδίου. Άμεσα, ο κώνος αρχίζει να εκτοξεύει μια λεπτή δέσμη υγρού από την κορυφή του προς το αντίθετο ηλεκτρόδιο. Η δέσμη υγρού εύκολα διασπάται σε μικρά φορτισμένα σταγονίδια, τα οποία απωθούνται μεταξύ τους καθώς κινούνται κατά μήκος της κατεύθυνσης του ηλεκτρικού πεδίου. Συνολικά, υπό συνθήκες θετικού ιονισμού σχηματίζεται θετικά φορτισμένο αερόλυμα, ενώ υπό συνθήκες αρνητικού ιονισμού αρνητικά φορτισμένο αερόλυμα. Για τα θετικά φορτία είναι υπεύθυνα κυρίως τα πρωτόνια, ενώ για τα αρνητικά φορτία ορισμένα αρνητικά ιόντα (ΟΗ - κ.ά. βλ. πίν.2.1). β) Συρρίκνωση των φορτισμένων σταγονιδίων σε πολύ μικρά σταγονίδια υψηλού φορτίου λόγω της εξάτμισης του διαλύτη (αποδιαλύτωση) και των επαναλαμβανόμενων διασπάσεων των σταγονιδίων Τα φορτία κατανέμονται στην επιφάνεια των σταγονιδίων σε ίσες αποστάσεις μεταξύ τους. Σε αυτά τα φορτισμένα σταγονίδια δρουν δύο αντίθετες δυνάμεις: η επιφανειακή τάση, η οποία προσπαθεί να διατηρήσει το σφαιρικό σχήμα των σταγονιδίων και η απωστική δύναμη coulomb μεταξύ των ομώνυμων φορτίων της επιφάνειας, η οποία προσπαθεί να διασπάσει το σφαιρικό σχήμα των σταγονιδίων. Καθώς τα σταγονίδια διασχίζουν τον χώρο μεταξύ του τριχοειδούς ψεκασμού και του αντίθετου ηλεκτρόδιου (σχ.2.2), ο διαλύτης εξατμίζεται, με αποτέλεσμα τη μείωση του μεγέθους των σταγονιδίων μέχρι το σημείο (Rayleigh limit), όπου η απωστική δύναμη coulomb ξεπερνά την επιφανειακή τάση. Σε αυτό το σημείο συμβαίνει η σχάση coulomb (Coulomb fission or explosion), δηλαδή τα αρχικά σταγονίδια διασπώνται σε πολύ μικρότερα σταγονίδια-απογόνους, τα οποία έχουν και υψηλότερο λόγο φορτίου προς μάζα σε σχέση με τα αρχικά σταγονίδια. Η παραπάνω διαδικασία επαναλαμβάνεται συνεχώς μέχρι τον σχηματισμό φορτισμένων νανοσταγονιδίων, απ όπου τελικά θα προκύψουν τα ιόντα της ουσίας στην αέρια φάση. 23

Σχήμα 2.3 Εξέλιξη των αρχικών σταγονιδίων μεθανόλης στα σταγονίδια που είναι πρόδρομοι των ιόντων αέριας φάσης (όπου R: η ακτίνα του σταγονιδίου, Ν: ο αριθμός στοιχειωδών φορτίων του σταγονιδίου, Δt: ο χρόνος που απαιτείται για τη συρρίκνωση του σταγονιδίου στο μέγεθος που συμβαίνει η σχάση coulomb) Η διάρκεια ζωής ενός σταγονιδίου ηλεκτροψεκασμού εξαρτάται από διάφορες παραμέτρους, όπως το εφαρμοζόμενο δυναμικό, η φύση των χρησιμοποιούμενων διαλυτών, η ταχύτητα ροής του αερίου εκνέφωσης, η απόσταση μεταξύ του άκρου του τριχοειδούς ψεκασμού και του αντίθετου ηλεκτροδίου κ.ά. Η μέση διάρκεια ζωής ενός φορτισμένου σταγονιδίου που παράγεται κατά τη διαδικασία ηλεκτροψεκασμού είναι από 1 έως μερικά χιλιοστά του δευτερολέπτου. γ) Σχηματισμός των ιόντων της ουσίας στην αέρια φάση Έχουν προταθεί δύο βασικά μοντέλα (20) για τον σχηματισμό των ιόντων της ουσίας στην αέρια φάση: το μοντέλο ιοντικής εξάτμισης (Ion Evaporation Model, IEM) και το μοντέλο υπολειμματικού φορτίου (Charge Residue Model, CRM). 24

-Μοντέλο ιοντικής εξάτμισης Αναπτύχθηκε αρχικά από τους Iribarne και Thomson, το 1976. Το μοντέλο αυτό προτείνει πως όταν η ακτίνα των φορτισμένων σταγονιδίων μειωθεί στην τάξη μεγέθους μερικών δεκάδων νανομέτρων, λόγω της εξάτμισης του διαλύτη και των επαναλαμβανόμενων διασπάσεων (σχάσεων), είναι πιθανή η απευθείας εκπομπή ιόντων στην αέρια φάση. -Μοντέλο υπολειμματικού φορτίου Αναπτύχθηκε από τους Dole και συνεργάτες, το 1968. Το μοντέλο αυτό προτείνει ότι η διαδικασία ηλεκτροψεκασμού, μετά τις επαναλαμβανόμενες διασπάσεις των σταγονιδίων και την εξάτμιση του διαλύτη, παράγει μικροσκοπικά σταγονίδια (της τάξης μερικών νανομέτρων) που περιέχουν μόνο ένα ιόν, και το οποίο απελευθερώνεται με την εξάτμιση του διαλύτη. Σχήμα 2.4 Παραγωγή ιόντων αέριας φάσης με τα μοντέλα ιοντικής εξάτμισης και υπολειμματικού φορτίου 25

2.3. Παράγοντες που επηρεάζουν την εκλεκτικότητα της τεχνικής ESI-MS Τα ιόντα αέριας φάσης που προκύπτουν με τη μέθοδο του ηλεκτροψεκασμού, ανεξαρτήτως του μοντέλου με το οποίο παράγονται, μπορούν να ανιχνευτούν από το φασματόμετρο μάζας βάσει του λόγου της μάζας προς το φορτίο τους. Είναι προφανές πως οι ουσίες που δεν μπορούν να μετατραπούν σε ιόντα αέριας φάσης με τον ηλεκτροψεκασμό, δεν ανιχνεύονται από το φασματόμετρο μάζας. Ο ηλεκτροψεκασμός είναι ήπια τεχνική ιονισμού, δηλαδή επιτυγχάνει τον ιονισμό μιας ουσίας με ελάχιστη θραυσμάτωση. Αυτό είναι πλεονέκτημα, διότι επιτρέπει την ανίχνευση και την ανάλυση ακέραιου του μορίου της ουσίας του ενδιαφέροντος. Ωστόσο, ο ήπιος χαρακτήρας της μεθόδου του ηλεκτροψεκασμού μπορεί να ερμηνευτεί ότι ενισχύει την εκλεκτικότητα της μεθόδου, από την άποψη ότι το σήμα που ανιχνεύεται εξαρτάται από το αν φορτίζεται και πόσο αποτελεσματικά φορτίζεται η ουσία. Εν συνεχεία, θα περιγραφούν λεπτομερέστερα οι διαφορετικοί μηχανισμοί με τους οποίους οι ουσίες αποκτούν το φορτίο τους κατά τη διαδικασία του ηλεκτροψεκασμού. (21) Ένα πολύ σημαντικό πεδίο έρευνας στο κεφάλαιο του ηλεκτροψεκασμού αποτελεί η διευκρίνιση των παραγόντων που συμβάλλουν στην εκλεκτικότητα, με άλλα λόγια των παραγόντων που επηρεάζουν το λαμβανόμενο σήμα των ουσιών που αναλύονται με ESI-MS. Στην πράξη, ο προσδιορισμός αυτών των παραγόντων διευκολύνει την πρόβλεψη των ουσιών που μπορούν να αναλυθούν με ESI-MS και την επιλογή των κατάλληλων αναλυτικών συνθηκών π.χ. επιλογή κινητής φάσης, διαλυτών, προσθήκη άλλων ουσιών κ.α. 2.3.1 Χαρακτηριστικά των προς ανάλυση ουσιών Η τεχνική ESI-MS εφαρμόζεται για την ανάλυση πολλών διαφορετικών κατηγοριών ουσιών (βλ.1.4). Παρόλα αυτά, όπως αναφέρθηκε, είναι εκλεκτική τεχνική, κατάλληλη για ορισμένες ουσίες, ενώ υπάρχουν και αρκετές κατηγορίες ουσιών που δεν αποκρίνονται. Παρακάτω, θα περιγραφούν τα χαρακτηριστικά-ιδιότητες των ουσιών που θεωρείται ότι επηρεάζουν την απόκριση στο ESI-MS. 26

2.3.1.1 Ικανότητα φόρτισης της ουσίας -ιονισμός μέσω διαχωρισμού των φορτίων (Ionization through charge separation) Οι ουσίες που προϋπάρχουν ως ιόντα στο διάλυμα μπορούν να αποτελέσουν μέρος της περίσσειας φορτίου στo σχηματιζόμενo μηνίσκο και κατόπιν στα σταγονίδια που δημιουργούνται στο τριχοειδές ψεκασμού. Η πολικότητα του εφαρμοζόμενου δυναμικού στο τριχοειδές διαχωρίζει τα φορτία και απωθεί τα ομώνυμα ιόντα, προωθώντας τα στην επιφάνεια του υγρού και κατόπιν στα σχηματιζόμενα σταγονίδια. Ο διαχωρισμός φορτίων αποτελεί την κύρια μέθοδο ιονισμού για ανόργανα είδη, όπως νάτριο, χλώριο κ.α., για βιολογικά και οργανικά μόρια με όξινες ή βασικές λειτουργικές ομάδες και για ουσίες που περιέχουν χαρακτηριστικές ομάδες αμμωνίου, φωσφονίου ή οξονίου. Τα θετικά φορτισμένα ιόντα, όπως τα ανόργανα κατιόντα και οι πρωτονιωμένες οργανικές βάσεις, ανιχνεύονται με ανάλυση σε θετικό ιονισμό, ενώ τα αρνητικά φορτισμένα ιόντα, όπως τα ανόργανα ανιόντα και τα αποπρωτονιωμένα οργανικά οξέα, ανιχνεύονται με ανάλυση σε αρνητικό ιονισμό. Στις παραπάνω περιπτώσεις τα ιόντα δεν παράγονται με τον ηλεκτροψεκασμό, αλλά θεωρείται ότι ο ηλεκτροψεκασμός εξυπηρετεί στο διαχωρισμό των ήδη υπαρχόντων ιόντων από τα αντισταθμιστικά τους ιόντα (Counterions) και στη μεταφορά τους από το διάλυμα στην αέρια φάση. -σχηματισμός ιόντων προσθήκης (Adduct formation) Οι πολικές ουσίες που δεν διαθέτουν όξινες ή βασικές ομάδες μπορούν να φορτιστούν κατά τον ηλεκτροψεκασμό με συμπλοκοποίηση με διάφορα ιόντα του διαλύματος. Κατά τον αρνητικό ιονισμό ανιχνεύονται συνήθως ιόντα προσθήκης με χλώριο. Κατά τον θετικό ιονισμό παρατηρούνται συνήθως ιόντα προσθήκης με νάτριο, αμμώνιο και κάλιo. Η προσθήκη αλάτων στα δείγματα διευκολύνει το σχηματισμό θετικών ιόντων, ωστόσο πρέπει να είναι μικρής συγκέντρωσης, διότι διαφορετικά παρεμβαίνει στην ανίχνευση της ουσίας. Στις περισσότερες περιπτώσεις, στα δείγματα του ηλεκτροψεκασμού υπάρχουν άλατα, συνήθως νατρίου, τα οποία σε χαμηλές συγκεντρώσεις προέρχονται από τα γυάλινα σκεύη και τα φιαλίδια αποθήκευσης ή είναι παρόντα ως προσμείξεις ακόμη και σε διαλύτες 27

αναλυτικού βαθμού. Υψηλότερες συγκεντρώσεις διαφόρων αλάτων εμφανίζονται σε δείγματα βιολογικής προέλευσης ή όταν προστίθενται ως ρυθμιστικά στην υγρή χρωματογραφία για την διευκόλυνση των διαχωρισμών. -ιονισμός μέσω αντιδράσεων αέριας φάσης (Ionization through gas-phase reactions) Οι αντιδράσεις αέριας φάσης λαμβάνουν χώρα μετά την είσοδο της ουσίας στην αέρια φάση. Εκεί η ουσία μπορεί να φορτιστεί με μεταφορά πρωτονίου. Για παράδειγμα, μόρια που ήταν πρωτονιωμένα στο διάλυμα αποδίδουν τα πρωτόνια τους στους διαλύτες ή στις ουσίες με υψηλότερη βασικότητα αέριας φάσης (Gas-phase basicity). Με αυτόν τον μηχανισμό, ουσίες που απελευθερώνονται από τα σταγονίδια χωρίς φορτίο μπορούν να αποκτήσουν φορτίο στην αέρια φάση. Οι αντιδράσεις μεταφοράς πρωτονίου στην αέρια φάση συμβαίνουν όταν αντιστρέφεται η σειρά βασικότητας των μορίων που μεταβαίνουν από το διάλυμα στην αέρια φάση. Σημειωτέον ότι η αντιστροφή στη σειρά βασικότητας συμβαίνει διότι η βασικότητα του διαλύματος δεν σχετίζεται απαραίτητα με τη συγγένεια πρωτονίου στην αέρια φάση (Gasphase proton affinity). Επομένως, χημικές οντότητες με υψηλή συγγένεια πρωτονίου στην αέρια φάση μπορεί να μην είναι ιδιαίτερα βασικές στο διάλυμα. Η βασικότητα αέριας φάσης εκφράζεται με τη συγγένεια πρωτονίου αέριας φάσης και η οποία ορίζεται ως η αρνητική μεταβολή της ενθαλπίας για την υποθετική πρωτονίωση στους 298 Κ. Σημειωτέον ότι η συγγένεια πρωτονίου δεν σχετίζεται απαραίτητα με την pka, η οποία είναι μέτρο της βασικότητας του διαλύματος. Στην αέρια φάση, ένα μόριο με υψηλή συγγένεια πρωτονίου θα αποσπάσει ένα πρωτόνιο από ένα πρωτονιωμένο μόριο με χαμηλότερη συγγένεια πρωτονίου. Στις περιπτώσεις που ο διαλύτης ηλεκτροψεκασμού έχει υψηλότερη συγγένεια πρωτονίου αέριας φάσης από την ουσία, το σήμα της ουσίας μπορεί να κατασταλεί πλήρως. Επομένως, στις αναλύσεις με ηλεκτροψεκασμό είναι σημαντικό ο διαλύτης να έχει χαμηλότερη συγγένεια πρωτονίου από την ουσία του ενδιαφέροντος. Οι περισσότερες ουσίες που αναλύονται με ESI-MS σε θετικό ιονισμό, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών και των περισσότερων μικρών βασικών οργανικών μορίων, έχουν σημαντικά υψηλότερη συγγένεια πρωτονίου απ ότι οι συνήθεις διαλύτες ηλεκτροψεκασμού (νερό, μεθανόλη, ακετονιτρίλιο). Έτσι, τουλάχιστον για το ESI-MS σε 28

θετικό ιονισμό δεν παρουσιάζεται καταστολή ιόντων λόγω μεταφοράς πρωτονίου, παρά μόνο κάτω από ακραίες συνθήκες. -ιονισμός μέσω ηλεκτροχημικής οξείδωσης ή αναγωγής (Ionization through electrochemical oxidation or reduction) Οι οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις αποτελούν έναν ακόμη μηχανισμό με τον οποίο οι ουσίες αποκτούν φορτίο κατά τον ηλεκτροψεκασμό. Στην επαφή μεταξύ τριχοειδούς ψεκασμού και του διαλύματος λαμβάνει χώρα οξείδωση (για την ανάλυση σε θετικό ιονισμό) ή αναγωγή (για την ανάλυση σε αρνητικό ιονισμό), προκειμένου να κυκλοφορεί ρεύμα στο εξωτερικό κύκλωμα του ηλεκτροψεκασμού (έτσι δημιουργείται μία συγκέντρωση οξειδωμένων ή αναχθέντων ειδών ισοδύναμη με τη συγκέντρωση της περίσσειας φορτίου που δημιουργείται κατά τον διαχωρισμό φορτίων). Ανάλογα και με τις ιδιαίτερες συνθήκες της ανάλυσης, τα είδη που μπορούν να οξειδωθούν ή να αναχθούν είναι η ουσία, ο διαλύτης, διάφορες πρόσθετες ουσίες στο διάλυμα ή το ίδιο το μεταλλικό τριχοειδές. Η φόρτιση της ουσίας με οξείδωση ή αναγωγή μπορεί να διευκολύνει την ανίχνευσή της. Ωστόσο, οι αντιδράσεις οξείδωσης ή αναγωγής, που είναι εγγενείς στη διαδικασία ηλεκτροψεκασμού, μπορούν να έχουν και αρνητικές επιπτώσεις, εάν σχηματίζουν προϊόντα ιονισμού του διαλύτη ή των πρόσθετων ουσιών. Αυτά τα προϊόντα περιπλέκουν τα φάσματα μάζας και μπορούν να ανταγωνιστούν την προς ανίχνευση ουσία για την περίσσεια φορτίου, όπως θα δούμε παρακάτω. 2.3.1.2 Επιφανειακή δραστικότητα της ουσίας Στην τεχνική της φασματομετρίας μάζας με ηλεκτροψεκασμό, συνήθως, χρησιμοποιούνται πολικοί διαλύτες, όπως το νερό, η μεθανόλη, το ακετονιτρίλιο ή συνδυασμοί αυτών. Επομένως, οι ουσίες με σημαντικό μη πολικό χαρακτήρα θα «προτιμούν» και θα εγκαθίστανται στην επιφάνεια των σταγονιδίων, στη διεπιφάνεια αέρα-διαλύτη. Οι συγκεκριμένες ουσίες ορίζονται ως επιφανειοδραστικές (Surface-active). Η επιφανειοδραστικότητα φαίνεται ότι σχετίζεται με την απόκριση στο ESI-MS. (22) Στο Σχήμα 2.5 απεικονίζεται το φάσμα μάζας ενός ισομοριακού μίγματος 6 τριπεπτιδίων, των οποίων η δομή διαφέρει μόνο στον αριθμό των ανθράκων της πλευρικής αλυσίδας (σχ.2.6). Το σήμα του τριπεπτιδίου με την υψηλότερη απόκριση (GGF) είναι διπλάσιο από το σήμα 29

του τριπεπτιδίου με τη χαμηλότερη απόκριση (GGG). Η διαφορά στο λαμβανόμενο σήμα των τριπεπτιδίων αποδίδεται στον διαφορετικό μη πολικό χαρακτήρα τους. Σχήμα 2.5 Φάσμα μάζας των 6 τριπεπτιδίων, των οποίων οι δομές φαίνονται στο επόμενο σχήμα. Το λαμβανόμενο σήμα αυξάνει με την αύξηση της μη πολικής επιφάνειας Σχήμα 2.6 Δομές των τριπεπτιδίων που χρησιμοποιήθηκαν στη σύγκριση των σημάτων του Σχήματος 2.5 Ανάλογα, και ο λογάριθμος του συντελεστή μερισμού οκτανόλης/νερού (log P), o οποίος χρησιμοποιείται ως μέτρο της πολικότητας μιας ουσίας, φαίνεται ότι σχετίζεται με την απόκριση στο ESI-MS. (23) Υψηλές τιμές log P υποδεικνύουν μεγαλύτερη προτίμηση για την οκτανόλη (μη πολικός διαλύτης) και επομένως για την επιφάνεια των σταγονιδίων. 30

Επομένως, ουσίες που έχουν υψηλή τιμή log P αναμένεται να έχουν μεγαλύτερο σήμα στο ESI-MS συγκριτικά με ουσίες με μικρότερη τιμή logp. Στο Σχήμα.2.7 παριστάνονται γραφικά τα σήματα διαφόρων όξινων ουσιών (φαινόλες, βενζοϊκά οξέα, φαινόξυ-αλκανοϊκά οξέα, τριαζίνες), που αναλύθηκαν σε αρνητικό ιονισμό και διαλύτη μεθανόλη, συναρτήσει των τιμών logp. Από το διάγραμμα παρατηρείται θετική συσχέτιση της απόκρισης και των τιμών logp των ουσιών με τιμές logp > 1.5. Προφανώς. οι πολικές ουσίες, με τιμές logp < 1.5, σταθεροποιούνται καλύτερα στην πολική μεθανόλη απ ότι στη διεπιφάνεια αέρα-διαλύτη στην επιφάνεια των σταγονιδίων. Επομένως, δεν γίνονται κομμάτι της περίσσειας φορτίου στην επιφάνεια των σταγονιδίων και παρουσιάζουν χαμηλή απόκριση. Επίσης, παρατηρούνται 4 ουσίες που παρουσιάζουν ιδιαίτερα υψηλό σήμα συγκριτικά με το σήμα των ουσιών που έχουν παραπλήσιες τιμές logp. To σήμα των 4 αυτών ουσιών αυξάνει περίπου με την ίδια κλίση και προφανώς υπάρχει και κάποιος άλλος αδιευκρίνιστος ακόμη παράγοντας που εξηγεί την ανώμαλα υψηλή απόκριση αυτών των ουσιών. Σχήμα 2.7 Θετική συσχέτιση μεταξύ των τιμών logp και των σημάτων των ουσιών με τιμές logp > 1.5 31

2.3.1.3 Η τιμή pkα της ουσίας και το ph του διαλύματος Προκειμένου για ουσίες που μπορούν να προϋπάρχουν στο διάλυμα ως πρωτονιωμένα ή αποπρωτονιωμένα ιόντα, θα ήταν αναμενόμενο η τιμή pka των λειτουργικών ομάδων των ουσιών να παίζει καθοριστικό ρόλο στο λαμβανόμενο σήμα. Από την άλλη, για να πρωτονιωθεί μια ουσία κατά τον ηλεκτροψεκασμό, πρέπει να είναι βασική είτε στο διάλυμα είτε στην αέρια φάση. Το ίδιο ισχύει αντίστοιχα και για τις όξινες ουσίες και την αποπρωτονίωσή τους. Γενικότερα, η ανάλυση βασικών ουσιών με ηλεκτροψεκασμό δείχνει να λειτουργεί καλύτερα σε όξινο περιβάλλον, ενώ η ανάλυση των όξινων ουσιών σε βασικό περιβάλλον. Παρόλα αυτά, έχουν ανιχνευτεί πρωτονιωμένα ιόντα βασικών ουσιών σε βασικό ph και αποπρωτονιωμένα ιόντα όξινων ουσιών σε όξινο ph. Για παράδειγμα, στο Σχήμα 2.8 απεικονίζεται το φάσμα μάζας ενός πολυπεπτιδίου σε βασικό διάλυμα (ph=10) και ενώ δεν αναμενόταν η πρωτονίωση των βασικών αμινοξέων σε τόσο υψηλό ph, ωστόσο, ανιχνεύτηκαν τόσο θετικά (σχ.2.8 α) όσο και αρνητικά ιόντα (σχ.2.8 b). (21) Σχήμα 2.8 ESI φάσματα μάζας πολυπεπτιδίου σε 50:50 μεθανόλη:νερό και σε ph 10. Tο φάσμα α ελήφθη σε θετικό ιονισμό, ενώ το φάσμα b σε αρνητικό ιονισμό. Παρά το γεγονός ότι το ph του διαλύματος ήταν αρκετά πάνω από το pka των βασικών αμινοξέων, παρατηρήθηκαν πρωτονιωμένα ιόντα του πολυπεπτιδίου 32

Στον ηλεκτροψεκασμό, η σχέση μεταξύ ph και λαμβανόμενου σήματος δεν είναι απλή. Έχουν αναφερθεί ελάχιστες διάφορες στο σήμα πρωτονιωμένων και αποπρωτονιωμένων ιόντων (που αναλύθηκαν σε θετικό και αρνητικό ιονισμό αντίστοιχα) σε ph με εύρος τιμών από 3 εώς 11 (σχ.2.9). (24) Σχήμα 2.9 Απεικόνιση της μικρής μεταβολής στο σήμα ηλεκτροψεκασμού της ιστιδίνης καθώς το ph μεταβάλλεται από 3 εώς 11 Το γεγονός ότι σε πολλές περιπτώσεις όξινες ή βασικές ουσίες ιονίζονται σε ένα μεγάλο εύρος τιμών ph εξυπηρετεί τη σύζευξη του ESI-MS με τις χρωματογραφικές τεχνικές. Έτσι, γίνεται εφικτή η ανάλυση σε τιμή ph που δίνει τον βέλτιστο διαχωρισμό των ουσιών ή η εναλλαγή μεταξύ θετικού και αρνητικού ιονισμού, χωρίς να χρειάζεται αλλαγή του συστήματος των διαλυτών. 33

2.3.2 Σύσταση της κινητής φάσης Η συνολική διαδικασία του ηλεκτροψεκασμού είναι ιδιαίτερα πολύπλοκη και πολλές ιδιότητες των χρησιμοποιούμενων διαλυτών και των πρόσθετων ουσιών, όπως πτητικότητα, επιφανειακή τάση, ιξώδες, αγωγιμότητα, ιονική ισχύς, διηλεκτρική σταθερά, συγκέντρωση ηλεκτρολύτη, επηρεάζουν τη διαδικασία ιονισμού και επομένως το λαμβανόμενο σήμα. Η επιλογή, λοιπόν, της σύστασης της κινητής φάσης απαιτεί προσοχή, καθώς πρέπει να ληφθούν υπόψη πολλές παράμετροι. Η αγωγιμότητα του διαλύτη επηρεάζει τη διαδικασία του διαχωρισμού των φορτίων (κατιόντα από ανιόντα), η οποία λαμβάνει χώρα στο τριχοειδές ψεκασμού κατά την εφαρμογή του ηλεκτρικού πεδίου. Οι διαλύτες που είναι κατάλληλοι για τον ηλεκτροψεκασμό ποικίλλουν από πολικούς έως μέτρια πολικούς. Οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενοι, όπως αναφέρθηκε, είναι το νερό, η μεθανόλη και το ακετονιτρίλιο. Το νερό από μόνο του, συγκριτικά με τη μεθανόλη και το ακετονιτρίλιο, θεωρείται φτωχός διαλύτης για τον ηλεκτροψεκασμό, εξαιτίας κυρίως του υψηλότερου ιξώδους του, που δυσχεραίνει την κινητικότητα των ιόντων, οδηγώντας σε ανεπαρκή διαχωρισμό των φορτίων και παραγωγή ασταθούς αερολύματος. Από τη στιγμή που σχηματίζονται τα φορτισμένα σταγονίδια, η ικανότητά τους να εκπέμπουν ιόντα αέριας φάσης εξαρτάται από την επιφανειακή τάση και την πτητικότητα του διαλύτη. Το νερό, συγκριτικά με το ακετονιτρίλιο και τη μεθανόλη, παρουσιάζει υψηλή επιφανειακή τάση και χαμηλή πτητικότητά. Έτσι, σχηματίζει μεγαλύτερα αρχικά σταγονίδια, από τα οποία εξατμίζεται πιο αργά από τον οργανικό διαλύτη. Γι αυτούς τους λόγους, η διάσπαση των σταγονιδίων είναι λιγότερο αποδοτική με νερό και ο αριθμός των σταγονιδίων που μπορούν να εκπέμπουν ιόντα στην αέρια φάση μειώνεται. Συνεπώς, το σήμα των ουσιών σε νερό ή σε μίγματα διαλυτών με υψηλό ποσοστό νερού είναι χαμηλό. Παρόλο που δεν μπορούν να προκύψουν σαφή συμπεράσματα κατά τη σύγκριση της αποτελεσματικότητας της μεθανόλης και του ακετονιτριλίου κατά τον ηλεκτροψεκασμό, η μεθανόλη προτιμάται στις περισσότερες εφαρμογές, καθώς δείχνει να προσφέρει ελάχιστα καλύτερα αποτελέσματα από το ακετονιτρίλιο, καθώς και καλύτερο σχήμα κορυφής για τις βασικές ενώσεις, στις οποίες περιλαμβάνονται και οι περισσότερες φαρμακευτικά δραστικές ουσίες. 34

Οι πρόσθετες και οι ρυθμιστικές ουσίες, που προστίθενται στην κινητή φάση της υγρής χρωματογραφίας για τη βελτίωση των διαχωρισμών, έχουν σημαντική επίδραση στο λαμβανόμενο σήμα κατά τον ηλεκτροψεκασμό. Τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα πρόσθετα στο LC-ESI/MS, τα οποία είναι πτητικά, είναι το φορμικό οξύ, το οξικό οξύ, το υδροξείδιο του αμμωνίου, το οξικό αμμώνιο και το φορμικό αμμώνιο. Η συγκέντρωση των πρόσθετων, στο διάλυμα ηλεκτροψεκασμού, δεν πρέπει να ξεπερνά τα 10 mm, προκειμένου να αποφεύγεται η καταστολή του ιονισμού της υπό ανάλυση ουσίας και η μείωση του λαμβανόμενου σήματος. Η διερεύνηση της επίδρασης διαφόρων πρόσθετων και των συγκεντρώσεών τους στη λαμβανόμενη απόκριση όξινων και βασικών φαρμάκων κατά τον ηλεκτροψεκασμό, έδειξε σαφή μείωση του σήματος των ουσιών κατά την αύξηση της συγκέντρωσης του πρόσθετου (φορμικό οξύ, οξικό οξύ, τριφθοροξικό οξύ, φορμικό αμμώνιο, διφωσφονικό αμμώνιο και όξινο ανθρακικό αμμώνιο) από 0.05% σε 1%. Επιπλέον, το φορμικό αμμώνιο, το διφωσφονικό αμμώνιο και το όξινο ανθρακικό αμμώνιο είχαν ισχυρότερη κατασταλτική επίδραση από τα όξινα (φορμικό οξύ και οξικό οξύ) και βασικά (υδροξείδιο του αμμωνίου) πρόσθετα στο σήμα ηλεκτροψεκασμού των συγκεκριμένων φαρμάκων. Συμπεραίνεται, λοιπόν, ότι πολύ υψηλές συγκεντρώσεις πρόσθετων οδηγούν σε μειωμένη απόκριση κατά τον ηλεκτροψεκασμό. Ωστόσο, σε κάποιες περιπτώσεις, η προσθήκη κατάλληλης ποσότητας πρόσθετου μπορεί να αυξήσει το σήμα, όπως συνέβη στην περίπτωση μιας σειράς τετρακυκλινών και νουκλεοσιδίων, κατά την προσθήκη 1% οξικού οξέος σε θετικό ιονισμό και 50mM υδροξειδίου του αμμωνίου σε αρνητικό ιονισμό. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η παρουσία στο διάλυμα ηλεκτροψεκασμού διαφόρων ιόντων μπορεί να διευκολύνει τον ιονισμό πολικών, ουδέτερων ουσιών (αμίδια, εστέρες, αιθέρες, υδρογονάνθρακες, λιπίδια) με σχηματισμό ιόντων προσθήκης. Ο σχηματισμός ιόντων προσθήκης με αμμώνιο διευκολύνεται από την παρουσία στο διάλυμα πρόσθετων με βάση την αμμωνία, όπως φορμικό αμμώνιο, οξικό αμμώνιο και υδροξείδιο του αμμωνίου. Τα ιόντα προσθήκης με νάτριο [Μ+Na] + σχηματίζονται πολύ συχνά ταυτόχρονα με τα πρωτονιωμένα ιόντα [M+H] +, καθώς το νάτριο είναι σχεδόν πάντα παρόν στην κινητή φάση. Η συγκέντρωση του νατρίου εξαρτάται από τις πειραματικές συνθήκες και την προέλευση του δείγματος, με αποτέλεσμα η σχετική αφθονία του [M+Na] + να ποικίλλει μειώνοντας την επαναληψιμότητα της ανάλυσης. Στον αρνητικό ιονισμό, χλωριωμένοι διαλύτες και χλωριούχα άλατα έχουν χρησιμοποιηθεί ως πηγές ιόντων χλωρίου, για να προάγουν το σχηματισμό ιόντων προσθήκης με χλώριο [M+Cl] -. (25) 35

2.4. Μοντέλο ισορροπίας κατανομής (Equilibrium Partitioning Model) Κατά τον ηλεκτροψεκασμό, τα σχηματιζόμενα φορτισμένα σταγονίδια περιέχουν διάφορα ιόντα: τα ιόντα της προς ανάλυση ουσίας, ιόντα από την αυτοπρωτόλυση του νερού (οξώνια και υδροξυλιόντα), ιόντα που περιέχονται σε διαλύτες αποθηκευμένους σε γυάλινους περιέκτες (ιόντα νατρίου), ιόντα που περιέχονται ως ακαθαρσίες ακόμη και σε καθαρούς διαλύτες (ιόντα αμμωνίου, ασβεστίου, χλωρίου), ιόντα πρόσθετων ουσιών για τη βελτίωση της διαδικασίας του ηλεκτροψεκασμού ή για τη ρύθμιση του ph (ηλεκτρολύτες υπό τη μορφή ασθενών οξέων, ασθενών βάσεων ή αλάτων), ιόντα που προκύπτουν κατά την αναπόφευκτη ηλεκτρολυτική αντίδραση που συμβαίνει μεταξύ της παροχής τάσης και του διαλύματος ηλεκτροψεκασμού. Το φορτίο αυτών των σταγονιδίων προκύπτει από την περίσσεια των ανιόντων ή των κατιόντων, ανάλογα με την πολικότητα του εφαρμοζόμενου δυναμικού (θετικά φορτισμένα σταγονίδια, όταν εφαρμόζεται θετικό δυναμικό στο τριχοειδές και αρνητικά φορτισμένα σταγονίδια όταν εφαρμόζεται αρνητικό δυναμικό). Τα ιόντα της περίσσειας φορτίου εγκαθίστανται στην επιφάνεια του σταγονιδίου, όσο πιο μακριά το ένα από το άλλο, εξαιτίας των απωστικών δυνάμεων μεταξύ τους, λόγω του ομώνυμου φορτίου τους. Καθώς ο διαλύτης εξατμίζεται από το σταγονίδιο, η συγκέντρωση της περίσσειας φορτίου αυξάνει, η πυκνότητα φορτίου κοντά στην επιφάνεια του σταγονιδίου αυξάνει και οι απωστικές δυνάμεις αυξάνουν. Τα δύο μοντέλα: ιοντικής εξάτμισης και υπολειμματικού φορτίου, που περιγράφηκαν παραπάνω, έχουν προταθεί ακριβώς για να εξηγήσουν τον μηχανισμό με τον οποίο το σταγονίδιο απαλλάσσεται από την περίσσεια φορτίου του. Ωστόσο, κανένα από αυτά τα μοντέλα δεν επιχειρεί να προβλέψει ποια από τα υπάρχοντα ιόντα θα εμφανιστούν στο λαμβανόμενο φάσμα μαζών, σε αντίθεση με το μοντέλο ισορροπίας κατανομής, το οποίο θα περιγραφεί στη συνέχεια. Το μοντέλο ισορροπίας κατανομής (26) προτείνει ότι στα σταγονίδια ηλεκτροψεκασμού υπάρχουν δύο ξεχωριστές φάσεις. Η επιφάνεια του σταγονιδίου, όπου τοποθετείται η παραγόμενη περίσσεια φορτίου κατά τη διαδικασία του ηλεκτροψεκασμού και το εσωτερικό 36

του, που παραμένει ηλεκτρικά ουδέτερο και αποτελείται από μόρια διαλύτη, ηλεκτρολυτών και φορτισμένα μόρια ουσίας μαζί με ίσο αριθμό αντισταθμιστικών ιόντων. H περίσσεια φορτίου περιγράφεται με το μέγεθος Q σύμφωνα με την εξίσωση: [Q]=i / ΓF (2.1) όπου [Q] η συγκέντρωση της περίσσειας φορτίου, i η ένταση του ρεύματος στο κύκλωμα του ηλεκτροψεκασμού, F η σταθερά του Faraday και Γ η ταχύτητα ροής του διαλύματος. H συγκέντρωση της περίσσειας φορτίου αποτελεί ένα μικρό ποσοστό του συνόλου των ιόντων του διαλύματος, γεγονός που συνεπάγεται ότι μερικά ιόντα θα αποτελούν την περίσσεια φορτίου, ενώ τα υπόλοιπα θα σχηματίζουν ζεύγη με ισοδύναμο αριθμό αντισταθμιστικών ιόντων. Δηλαδή, το μέγεθος Q δηλώνει τη μέγιστη συγκέντρωση ιόντων στο διάλυμα που μπορεί να μετατραπεί σε ιόντα στην αέρια φάση. Τα μη συζευγμένα, επιφανειακά, ιόντα είναι ελεύθερα να ανταλλάσσουν θέσεις με τα ιόντα στο εσωτερικό του σταγονιδίου. Από τη στιγμή όμως που συμβαίνει κατανομή ιόντων μεταξύ δύο διαφορετικών φάσεων (επιφάνεια και εσωτερικό σταγονιδίου) χρησιμοποιούνται εξισώσεις ισορροπίας κατανομής για να περιγράψουν αυτή τη διαδικασία. Για παράδειγμα, μία φορτισμένη πρόσθετη ουσία E + μπορεί να κατανέμεται μεταξύ της μη συζευγμένης κατάστασης (στην επιφάνεια του σταγονιδίου, surface (s)) και της συζευγμένης κατάστασης με αντισταθμιστικό ιόν Χ - (στο εσωτερικό του σταγονιδίου, interior (i)), όπως φαίνεται στην παρακάτω εξίσωση: Στην εξίσωση το Ε + παριστάνει κάποιο κατιόν ηλεκτρολύτη (όπως Νa + ή ΝΗ4 + ) ή πρωτονιωμένο διαλύτη (όπως CH3OH2 + ή Η3Ο + ). Ας υποτεθεί ότι ταυτόχρονα με το Ε + υπάρχουν στο διάλυμα και οι ουσίες Α + και Β + (ουσίες με ένα θετικό φορτίο, όπως πρωτονιωμένες αμίνες ή ιόντα τεταρτοτάγους αμμωνίου), οι οποίες κατανέμονται επίσης μεταξύ της επιφάνειας και του εσωτερικού, όπως φαίνεται στο σχ.2.10. Οι εξισώσεις που περιγράφουν την ισορροπία κατανομής είναι: 37

Σχήμα 2.10 Σχηματική απεικόνιση του σταγονιδίου με τις δύο ξεχωριστές φάσεις, την επιφανειακή με την περίσσεια φορτίου και την εσωτερική, ηλεκτρικά ουδέτερη. Οι ουσίες (Α και Β) ανταγωνίζονται με τον ηλεκτρολύτη (Ε) για την επιφάνεια του σταγονιδίου. Αποτελεί αρχή του μοντέλου ισορροπίας κατανομής ότι οι ουσίες που βρίσκονται στην επιφάνεια είναι πιο πιθανό να γίνουν ιόντα αέριας φάσης και επομένως να ανιχνευτούν. Τα ιόντα που βρίσκονται στο εσωτερικό του σταγονιδίου σχηματίζουν ζεύγη με αντισταθμιστικά ιόντα και συνεπώς δεν ανιχνεύονται από το φασματόμετρο μάζας Η σταθερά ισορροπίας Κ έχει υψηλή τιμή για τα ιόντα που προτιμούν την επιφάνεια του σταγονιδίου. Για ένα συγκεκριμένο ιόν, οι παράγοντες που καθορίζουν το μέγεθος του Κ είναι η πολικότητα, η πυκνότητα φορτίου και η βασικότητα. Ουσίες με πολύ υψηλές τιμές Κ θα βρίσκονται κυρίως στην επιφάνεια των σταγονιδίων, ενώ ουσίες με χαμηλές τιμές Κ θα βρίσκονται στο εσωτερικό, ανά ζεύγη με αντισταθμιστικά ιόντα. Η κατανομή μεταξύ των δύο φάσεων των σταγονιδίων συμβαίνει αρχικά, κι όσο εξατμίζεται ο διαλύτης τόσο αυξάνουν οι παράγοντες που ευνοούν την κατανομή της ουσίας στην επιφάνεια του σταγονιδίου. 38

Ας θεωρήσουμε την απλούστερη περίπτωση, όπου υπάρχουν στο διάλυμα η ουσία Α + και ο ηλεκτρολύτης Ε +. Από τις εξισώσεις ισορροπίας κατανομής προκύπτουν οι αναλυτικές συγκεντρώσεις του Α και του Ε στο σύστημα του σταγονιδίου: CA = [A + ]s + [A + X - ]i (2.5) CE = [E + ]s + [E + X - ]i (2.6) Η ολική συγκέντρωση των φορτισμένων ειδών στην επιφάνεια του σταγονιδίου ισούται με Q, τη συγκέντρωση της περίσσειας φορτίου: [Q] = [E + ]s + [A + ]s (2.7) Επειδή όπως ειπώθηκε παραπάνω, είναι πιθανόν τα ιόντα της περίσσειας φορτίου, στην επιφάνεια του σταγονιδίου, να μετατρέπονται σε ιόντα αέριας φάσης, είναι προτιμότερο να υπολογιστεί η συγκέντρωση επιφάνειας της ουσίας. Συνδυάζοντας τις παραπάνω εξισώσεις προκύπτει για τη συγκέντρωση επιφάνειας της ουσίας Α: Είναι προφανές ότι το κλάσμα της ουσίας στην επιφάνεια εξαρτάται από το λόγο των σταθερών κατανομής της ουσίας προς του ηλεκτρολύτη και η επιφανειακή συγκέντρωση της ουσίας μειώνεται με τη μείωση του λόγου K A /K E. Επίσης, η επιφανειακή συγκέντρωση της ουσίας μειώνεται όταν αυξάνει η συγκέντρωση του ηλεκτρολύτη. Αυτό υποδηλώνει πως η ουσία είναι πάντοτε σε ανταγωνισμό με τον ηλεκτρολύτη για το επιφανειακό φορτίο. Μερικές ουσίες, όπως μικρά κατιόντα και μη μετουσιωμένες πρωτεΐνες, μπορεί να μην είναι επιφανειακά ενεργές και ωστόσο να ανιχνεύονται στο φάσμα μάζας με ηλεκτροψεκασμό. Αυτά τα ιόντα δεν ακολουθούν το μοντέλο της ισορροπίας κατανομής και μεταβαίνουν στην αέρια φάση με άλλο μηχανισμό. (17) 39

Κεφάλαιο 3o Βιβλιογραφική ανασκόπηση Η μέθοδος φασματομετρία μάζας με ηλεκτροψεκασμό (ESI-MS) εξελίχθηκε κατά τη διάρκεια των χρόνων και βρήκε ευρεία εφαρμογή στη χημική ανάλυση, κυρίως για τον ποιοτικό χαρακτηρισμό των ουσιών. Από την άλλη πλευρά, η ποσοτική ανάλυση με ESI-MS αποδείχθηκε δύσκολη, επειδή δεν μπορεί να προβλεφθεί με ακρίβεια ο ιονισμός των διαφόρων ουσιών. Από αναλυτικής πλευράς, η δυσκολία αυξάνει, όταν το ESI-MS συνδυάζεται με τεχνικές διαχωρισμού, όπως την υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC). Σε αυτές τις συνθήκες προστίθενται επιπλέον οι επιδράσεις της ταχύτητας ροής και της σύστασης του διαλύματος στο λαμβανόμενο σήμα. Η διευκρίνιση, λοιπόν, των παραμέτρων που επηρεάζουν την απόκριση (Response) μιας ουσίας κρίνεται σημαντική και γι αυτούς τους λόγους. Οι περισσότερες έρευνες προς αυτήν την κατεύθυνση έχουν στραφεί στη μελέτη των φυσικοχημικών ιδιοτήτων των προς ανάλυση ουσιών, γιατί οι παράμετροι του οργάνου, που επίσης επηρεάζουν το λαμβανόμενο σήμα, μπορούν να ελεγχθούν και να παραμείνουν σχετικά σταθερές. Οι Tang L. και Kebarle P. (27) βασίστηκαν στη θεωρία του μοντέλου ιοντικής εξάτμισης του Iribarne και μελέτησαν την εξάρτηση της έντασης του λαμβανόμενου σήματος των ουσιών από τη συγκέντρωσή τους στο διάλυμα ηλεκτροψεκασμού και από την παρουσία άλλων ηλεκτρολυτών. Οι ουσίες που χρησιμοποίησαν (δύο σε κάθε μέτρηση) ήταν μεταλλικά κατιόντα και πρωτονιωμένα αλκαλοειδή, 16 σε σύνολο. Έτσι, δημιούργησαν εξισώσεις για τον υπολογισμό της εντάσεως του λαμβανόμενου σήματος συναρτήσει συντελεστών που περιέγραφαν τη σχετική ικανότητα των διαφόρων ιόντων να μετατρέπονται από ιόντα διαλύματος σε ιόντα αέριας φάσης. Διαπίστωσαν ότι οι διαφορές στους ρυθμούς εξάτμισης, από μόνοι τους, δεν μπορούσαν να εξηγήσουν τις διαφορές στην απόκριση που παρατηρούνταν με μόρια που είχαν υψηλή συγγένεια για τη διεπιφάνεια αέρα-υγρού των σταγονιδίων ηλεκτροψεκασμού. Κατά την ανάλυση αυτών των επιφανειοδραστικών ουσιών, 40

απέδωσαν τις διαφορές στην απόκριση σε διαφορές στη συγγένεια για την επιφάνεια, όταν οι συγκεντρώσεις ήταν χαμηλές (10-6 -10-8 ) και σε διαφορές στη συγγένεια για την επιφάνεια μαζί με διαφορές στην ικανότητα εξάτμισης, όταν οι συγκεντρώσεις ήταν υψηλές (10-2 -10-5 Μ). Η συγγένεια για την επιφάνεια των σταγονιδίων θεωρήθηκε ότι συνέβαλε στις διαφορές στην απόκριση με σταθερό τρόπο σε όλες τις συγκεντρώσεις, ενώ η καταστολή στην απόκριση αποδόθηκε σε διαφορές στους ρυθμούς εξάτμισης σε χαμηλές και υψηλές συγκεντρώσεις των ουσιών. Οι μετρήσεις έγιναν με φασματόμετρο μάζας τριπλού τετράπολου SCIEX TAGA 6000E, σε θετικό ιονισμό και διαλύτη μεθανόλη. Οι Cech N. και Enke C. (22), όπως αναφέρθηκε (βλ.2.3.1.2), μελέτησαν τον ρόλο που έχουν τα μη πολικά τμήματα των βιολογικών μορίων (πεπτιδίων) στο λαμβανόμενο σήμα τους με ESI-MS. Τα μόρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 6 τριπεπτίδια που διέφεραν μεταξύ τους στον αριθμό των ατόμων άνθρακα της πλευρικής αλυσίδας, στο τρίτο αμινοξύ. Συνεπώς διέθεταν διαφορετικό μη πολικό τμήμα, αλλά ο σκελετός (πολικό τμήμα) παρέμενε ο ίδιος. Στη μελέτη τους, παρατηρήθηκε αύξηση της απόκρισης για τα πεπτίδια με πιο εκτεταμένες μη πολικές περιοχές. Η αιτία για τη συγκεκριμένη αύξηση διερευνήθηκε με σύγκριση των τιμών της μη πολικής επιφάνειας (Non polar Surface Area) και των τιμών της ελεύθερης ενέργειας μεταφοράς του Gibbs (Gibbs Free Energy of Transfer). Οι παρατηρήσεις επεξηγήθηκαν με βάση το μοντέλο ισορροπίας κατανομής, το οποίο θεωρεί ότι επειδή η περίσσεια φορτίου βρίσκεται στην επιφάνεια των σταγονιδίων, η σχετική συγγένεια (Affinity) μίας ουσίας για την επιφάνεια του σταγονιδίου καθορίζει και την απόκρισή της κατά τον ηλεκτροψεκασμό. Αύξηση του μη πολικού χαρακτήρα, η οποία οδηγεί σε αυξημένη συγγένεια για την επιφάνεια, έχει ως αποτέλεσμα περισσότερο ανταγωνισμό για την περίσσεια φορτίου και υψηλότερη απόκριση. Οι ερευνητές πρότειναν ότι οι ουσίες που αναλύονται επιτυχώς με ESI- MS έχουν και πολικές και μη πολικές περιοχές. Τα πολικά τμήματα είναι απαραίτητα για τον ιονισμό της ουσίας, είτε μέσω πρωτονίωσης είτε μέσω προσθήκης κατιόντων, ενώ οι μη πολικές περιοχές είναι υπεύθυνες για την αύξηση του ποσοστού της ουσίας που εγκαθίσταται στην επιφάνεια των σταγονιδίων. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν με φασματόμετρο μάζας Finnigan MAT TSQ 7000, σε θετικό ιονισμό και διαλύτη 50:50 μεθανόλη:νερό, οξικό οξύ 0,5%. Οι McNair H. και Schug K. (28,29) σχεδίασαν πειράματα για να εξακριβώσουν τις βασικές αρχές που καθορίζουν τον σχηματισμό των ιόντων (αποπρωτονιωμένων και ιόντων προσθήκης) κατά τον ιονισμό με ηλεκτροψεκασμό. Μελέτησαν, λοιπόν, αρωματικά οξέα με 41

ανάλυση έγχυσης ροής (Flow Injection Analysis), σε αρνητικό ιονισμό και με φασματόμετρο μάζας Shimadzu LCMS-2010 API. Κατά την ανάλυση έγχυσης ροής δεν χρησιμοποιείται στήλη και το σύστημα της υγρής χρωματογραφίας εξυπηρετεί για την εισαγωγή του προς ανάλυση δείγματος. Η κινητή φάση αποτελούνταν από 50:50 ακετονιτρίλιο:νερό. Στο πρώτο μέρος των πειραμάτων μελέτησαν 6 αντιφλεγμονώδη φάρμακα (ιμπουπροφαίνη, καρπροφαίνη, ναπροξένη, κετοπροφαίνη, φλουρβιπροφαίνη και φαινοπροφαίνη). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αν και πέντε από τα έξι φάρμακα σχημάτιζαν αποπρωτονιωμένα ιόντα υψηλής έντασης, το εύρος της αφθονίας των αποπρωτονιωμένων ιόντων διέφερε σημαντικά για τα έξι φάρμακα. Ακριβώς, εξαιτίας της πολυπλοκότητας των μορίων των φαρμάκων, ήταν δύσκολη η εξαγωγή συγκεκριμένων συμπερασμάτων παρά μόνο γενικών τάσεων. Στο δεύτερο τμήμα των πειραμάτων μελέτησαν πιο απλά μόρια (βενζοϊκό οξύ και υποκατεστημένα παράγωγά του). Τα αλογονωμένα παράγωγα του βενζοϊκού οξέος χρησιμοποιήθηκαν για να εξαχθούν συμπεράσματα για την επίδραση των ηλεκτραρνητικότερων υποκαταστατών (βρωμο-, χλωρο- και φθορο-) και της θέσης τους στον δακτύλιο (ορθο-, μετα- και παρα-) στην απόκριση του αποπρωτονιωμένου ιόντος ([Μ-Η] - ) και του διμερούς ιόντος με νάτριο ([2Μ-2Η+Να] - ). Επίσης, μελετήθηκαν αμινουποκατεστημένα βενζοϊκά οξέα προκειμένου να ερευνηθεί η επίδραση μιας επιπρόσθετης ιονίσιμης ομάδας στο μόριο, και παρα-τριτ-βουτυλ-βενζοϊκό οξύ προκειμένου να ερευνηθεί η επίδραση της αυξανόμενης υδροφοβικότητας. Η έρευνα έδειξε ότι οι ιδιότητες των ουσιών που σχετίζονται με το διάλυμα (logp και pka) καθόριζαν τη σχετική ικανότητα σχηματισμού των ιόντων. Επίσης, καθώς η πολυπλοκότητα της δομής των μορίων αυξανόταν, παράλληλα, γινόταν ισχυρότερη και η εξάρτηση μεταξύ των τιμών logp των ουσιών και της ικανότητας ιονισμού τους. Πράγματι, αυτό υποστηρίχτηκε και από τη σχεδόν δεκαπλάσια αύξηση του σήματος του τριτ-βουτυλ-βενζοϊκού οξέος σε σχέση με το βενζοϊκό οξύ, εξαιτίας της υψηλότερης υδροφοβικότητας του πρώτου και κατά συνέπεια της μεγαλύτερης επιφανειακής δραστικότητας στα σταγονίδια ηλεκτροψεκασμού. Οι Henriksen T. και συνεργάτες (23), όπως αναφέρθηκε (βλ.2.3.1.2), μελέτησαν την επίδραση της σύστασης του διαλύματος και των χαρακτηριστικών των προς ανάλυση ουσιών στο λαμβανόμενο σήμα με ESI-MS, σε αρνητικό ιονισμό. Πιο συγκεκριμένα, μελέτησαν την επίδραση της οξύτητας και της πολικότητας (ως μέτρο της πολικότητας ελήφθη η τιμή logp και ως μέτρο της οξύτητας η τιμή pka της ουσίας) στο λαμβανόμενο σήμα 31 μικρών, όξινων ουσιών, με στόχο τον προσδιορισμό του παράγοντα (οξύτητα ή πολικότητα) που είναι πιο 42

καθοριστικός για την πρόβλεψη της απόκρισης. Η απόκριση των ουσιών εκφράστηκε ως το εμβαδόν των κορυφών των αντίστοιχων ιόντων και μελετήθηκε σε διαφορετικούς διαλύτες (μεθανόλη, ακετονιτρίλιο, 50:50 μεθανόλη:νερό, 50:50 ακετονιτρίλιο:νερό). Τα δείγματα προς ανάλυση περιείχαν μία ουσία κάθε φορά, σε συγκέντρωση 10-6 -10-7 M και η ανάλυση πραγματοποιήθηκε με φασματόμετρο μάζας τριπλού τετράπολου Quattro Ultima Micromass. Γενικότερα, τα λαμβανόμενα σήματα ήταν υψηλότερα στις μετρήσεις με μεθανόλη απ ότι με ακετονιτρίλιο, ενώ με προσθήκη νερού στον οργανικό διαλύτη (μεθανόλη ή ακετονιτρίλιο) η απόκριση γινόταν μικρότερη για όλες τις ουσίες. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε θετική συσχέτιση μεταξύ της απόκρισης και των τιμών logp των ουσιών, και στους δύο οργανικούς διαλύτες, κάτι που αναμενόταν άλλωστε για ουσίες με σημαντικό μη πολικό χαρακτήρα, εξαιτίας της συγγένειάς τους για την επιφάνεια των σταγονιδίων. Από την άλλη πλευρά, ενώ αναμενόταν οι ουσίες με σημαντικό όξινο χαρακτήρα να δίνουν υψηλό σήμα, λόγω της τάσης τους να σχηματίζουν αρνητικά ιόντα, ωστόσο για τις ουσίες που μελετήθηκαν, η οξύτητα δεν βρέθηκε να έχει σταθερή επίδραση στο λαμβανόμενο σήμα. Σημειωτέον ότι πολλές από τις ουσίες υψηλής οξύτητας ήταν αρκετά πολικές και επομένως ελάχιστα αποκρίσιμες. Μία ακόμη σημαντική παρατήρηση ήταν ότι ανιχνεύτηκαν αποπρωτονιωμένα ιόντα για έναν αριθμό ουσιών που είχαν πολύ υψηλές τιμές pka και γι αυτόν τον λόγο δεν αναμενόταν να σχηματίζουν αρνητικά ιόντα στο διάλυμα. Συνεπώς, φάνηκε ότι η σχέση μεταξύ του λαμβανόμενου σήματος κατά τον ηλεκτροψεκασμό και της οξύτητας δεν είναι τόσο απλή, όπως θα περίμενε κανείς βάσει της ισορροπίας οξέος/βάσεως στο διάλυμα. Προφανώς, λόγω της πολυπλοκότητας της διαδικασίας του ηλεκτροψεκασμού, είναι δύσκολο να συσχετίσει κανείς μόνο μία παράμετρο με το λαμβανόμενο σήμα. Οι Bökman και συνεργάτες (30) μελέτησαν την επίδραση της επιφανειακής δραστικότητας και της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας στην κατανομή των ιόντων της ουσίας στην επιφάνεια των σταγονιδίων ηλεκτροψεκασμού. Η έρευνα αυτή σχετίζεται με το θέμα της προσπάθειας αποκωδικοποίησης του σήματος στο ESI-MS λόγω της κοινής προσέγγισης ότι τα ιόντα που κυρίως παρατηρούνται σε ένα φάσμα μάζας είναι αυτά που βρίσκονται κοντά ή στην επιφάνεια των σταγονιδίων και επομένως οι παράγοντες που επηρεάζουν την κατανομή των ιόντων στην επιφάνεια του σταγονιδίου θα επηρεάζουν και το λαμβανόμενο σήμα. Οι ουσίες που μελετήθηκαν ήταν βρωμιούχα άλατα του τετραμεθυλαμμωνίου, του τετρααιθυλαμμωνίου, του τετραπροπυλαμμωνίου, του τετραβουτυλαμμωνίου και του τετραπεντυλαμμωνίου. Ως μέτρο της επιφανειακής δραστικότητας των ουσιών ελήφθη η 43

συγκράτηση τους στο χρωματογραφικό σύστημα αντίστροφης φάσης και η οποία διαπιστώθηκε ότι είχε μεγάλη επίδραση στην κατανομή των ιόντων στα σταγονίδια ηλεκτροψεκασμού. Οι μετρήσεις έγιναν με σύστημα υγρής χρωματογραφίας και φασματόμετρο μάζας τριπλού τετράπολου PE SCIEX API-III, σε θετικό ιονισμό και κινητή φάση μεθανόλη:νερό, σε διαφορετικές αναλογίες, παρουσία 10mM HCl. Διαπιστώθηκε, επίσης, ότι η επίδραση της κινητικότητας των ιόντων στην κατανομή τους στην επιφάνεια των σταγονιδίων μειωνόταν με την αύξηση του ποσοστού της μεθανόλης. Αυτό αποδόθηκε στη μείωση της επιφανειακής τάσης με την αύξηση του ποσοστού του οργανικού διαλύτη. Στην ίδια παρατήρηση κατέληξαν και με την αύξηση της ιονικής ισχύος του διαλύτη. Οι μετρήσεις της κινητικότητας των ιόντων έγιναν με σύστημα τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης (Capillary Electrophoresis, CE) και φασματόμετρο μάζας μονού τετράπολου PE SCIEX API- I, σε θετικό ιονισμό και σε διαφορετικές αναλογίες μεθανόλης:νερού, παρουσία 10mM HCl και 10mM NaCl. Οι Ehrmann Β. και συνεργάτες (31) μελέτησαν τον ρόλο της βασικότητας του διαλύματος και της βασικότητας στην αέρια φάση στο λαμβανόμενο σήμα των ουσιών με ESI-MS. Τα πειράματα περιλάμβαναν 19 μικρά μόρια, των οποίων η συγκέντρωση στα τελικά δείγματα ήταν 1.0 x 10-4 M. Η ανάλυση έγινε με ανάλυση έγχυσης ροής και φασματόμετρο μάζας παγίδας ιόντων ThermoFinnigan LCQ Advantage, σε θετικό ιονισμό. Η έρευνα περιλάμβανε σύγκριση των σημάτων (εμβαδά των κορυφών των πρωτονιωμένων ιόντων των ουσιών) που ελήφθησαν με κινητή φάση μεθανόλη 100% και μεθανόλη με 0.5% οξικό οξύ. Τα αποτελέσματα έδειξαν συσχέτιση μεταξύ των τιμών pkb των ουσιών και των λαμβανόμενων σημάτων. Ωστόσο, η απόκριση για τις ουσίες με πολύ υψηλές τιμές pkb ( χαμηλές τιμές Kb, δηλαδή ουσίες που προτιμούν να παραμένουν περισσότερο με την ουδέτερη μορφή τους στη μεθανόλη) ήταν σημαντικά υψηλότερη απ ότι αναμενόταν βάσει της συγκέντρωσης της πρωτονιωμένης μορφής της ουσίας στο διάλυμα. Επιπρόσθετα, η υψηλότερη αυτή απόκριση δεν ήταν αποτέλεσμα αντιδράσεων μεταφοράς ιόντων στην αέρια φάση. Συνεπώς, κάποιος παράγοντας που εμπεριέχεται στη διαδικασία ηλεκτροψεκασμού ευνοεί την πρωτονίωση αυτών των ουσιών σε πολύ μεγαλύτερο βαθμό απ ότι προβλέπεται από την ισορροπία μεταφοράς πρωτονίου στο διάλυμα. Αυτή ακριβώς η ενίσχυση της πρωτονίωσης είναι πολύ σημαντική, διότι καθιστά την τεχνική ESI-MS κατάλληλη για την ανάλυση οργανικών μορίων με μεγάλο εύρος τιμών pkb. Επίσης, η απόκριση ήταν μεγαλύτερη κατά την ανάλυση των ουσιών σε μεθανόλη με 0.5% οξικό οξύ συγκριτικά με μεθανόλη 100%. Αυτή η αύξηση 44

της απόκρισης ήταν πιο έντονη για τις ασθενώς βασικές ουσίες και πολύ μικρότερη για τις ισχυρά βασικές ουσίες Επομένως, βάσει αυτών των αποτελεσμάτων δικαιολογείται η συνήθης πρακτική της προσθήκης οξικού οξέος στον διαλύτη ηλεκτροψεκασμού, κατά την ανάλυση σε θετικό ιονισμό. Από την άλλη πλευρά, για την ανάλυση ουσιών που είναι πολύ βασικές στο διάλυμα, δεν είναι απαραίτητη η προσθήκη οξικού οξέος. Οι Leito Ι. και συνεργάτες (32) έκαναν μία διαφορετική προσέγγιση στο θέμα της αποκωδικοποίησης του σήματος στο ESI-MS. Δημιούργησαν μία κλίμακα, την κλίμακα της ικανότητας ιονισμού (Ionization Efficiency Scale) ουσιών, με βάση τις μετρήσεις της σχετικής ικανότητας ιονισμού τους (Relative Ionization Efficiency, RIE), στην οποία περιλαμβάνονταν 10 ουσίες (7 εστέρες και 3 αρωματικές αμίνες). Με τον όρο ικανότητα ιονισμού (Ionization Efficiency, IE) εννοείται η ικανότητα παραγωγής ιόντων αέριας φάσης από τα μόρια ή τα ιόντα των ουσιών στο διάλυμα ηλεκτροψεκασμού. Η προσέγγιση στηρίχτηκε στο μοντέλο της ισορροπίας κατανομής του Enke. Η σχετική ικανότητα ιονισμού μιας ουσίας πλεονεκτεί στο ότι είναι ανεξάρτητη από έναν αριθμό παραμέτρων που επηρεάζουν τη διαδικασία ESI-MS και επιπλέον υπολογίζεται σχετικά εύκολα. Ο υπολογισμός των τιμών RIE έγινε με μέτρηση των εντάσεων των πρωτονιωμένων ιόντων των ουσιών μετά τον ηλεκτροψεκασμό διαλυμάτων που περιείχαν δύο από τις 10 ουσίες κάθε φορά, γνωστής συγκέντρωσης (10-3 -10-6 Μ). Στη συνέχεια, συνδυάζοντας ανά ζεύγη τις τιμές RIE των ουσιών δημιουργήθηκε η κλίμακα της ικανότητας ιονισμού τους (εκφρασμένη σε τιμές logrie). Η κλίμακα περιείχε έναν πολύ περιορισμένο αριθμό ουσιών και επομένως δεν επέτρεπε οποιαδήποτε γενίκευση ή πρόβλεψη. Ωστόσο, τα αποτελέσματα ήταν σε πλήρη συμφωνία με τα αποτελέσματα των Cech και Enke. Η ικανότητα ιονισμού αυξανόταν με την αύξηση της υδροφοβικότητας των εστέρων και ήταν υψηλότερη για τους διεστέρες που μπορούσαν να δεσμεύουν πρωτόνια με χηλίωση. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν με φασματόμετρο μάζας παγίδας ιόντων Agilent XCT, σε θετικό ιονισμό και διαλύτη 80:20 ακετονιτρίλιο:υδατικό διάλυμα φορμικού οξέος 0,1%. Οι Leito I. και συνεργάτες, δύο χρόνια αργότερα (33), διεύρυναν την έρευνα τους και εφάρμοσαν τη μεθοδολογία τους, αυτή τη φορά, σε 62 ουσίες, διαφορετικής χημικής φύσης (εστέρες, πυριδίνες, αμιδίνες, γουανιδίνες, φωσφαζένια, αρωματικές, αλειφατικές και ετεροκυκλικές αμίνες, άλατα τετραλκυλαμμωνίου, αμίδια και μερικές άλλες). Έτσι, δημιούργησαν μία κλίμακα τιμών logie που κυμαινόταν 6 τάξεις μεγέθους και περιλάμβανε 62 ουσίες. Οι τιμές logie υπολογίστηκαν από τις τιμές logrie με τη μέθοδο των ελαχίστων 45

τετραγώνων και με τη χρήση του βενζοϊκού μεθυλεστέρα ως ένωση αναφοράς για την κλίμακα. Προκειμένου να διευκρινιστούν ποιες ιδιότητες (βασικότητα, πολικότητα, μοριακό μέγεθος, συντελεστής κατανομής της πρωτονιωμένης μορφής μεταξύ ενός πολικού και ενός μη πολικού μέσου) συμβάλλουν περισσότερο στην ικανότητα ιονισμού των ουσιών, εφαρμόστηκε ανάλυση γραμμικής παλινδρόμησης. Οι ιδιότητες που βρέθηκε να συμβάλλουν περισσότερο στην πρόβλεψη της ικανότητας ιονισμού ήταν η βασικότητα εκφρασμένη με την τιμή pka (στο νερό) και το μοριακό μέγεθος εκφρασμένο με τον λογάριθμο του μοριακού όγκου του κατιόντος (logmv). Ωστόσο, κατά την εφαρμογή της ανάλυσης παλινδρόμησης μόνο στην ομάδα των αμινών (21 σε αριθμό), η οποία ήταν και η πολυπληθέστερη, βρέθηκε ότι στατιστικά σημαντικές ήταν η βασικότητα αέριας φάσης και ο συντελεστής κατανομής της πρωτονιωμένης μορφής στον διαλύτη και στο εξάνιο logp solvent/hexane, ενώ η pka βρέθηκε στατιστικά μη σημαντική γι αυτήν την ομάδα. Εάν υπήρχαν αρκετές ουσίες για την εφαρμογή της ανάλυσης και σε άλλες χημικές ομάδες, είναι πιθανό να βρισκόντουσαν και διαφορετικά μοντέλα. Επίσης, ενώ οι τιμές logie των περισσότερων ομάδων ουσιών είχαν σχετικά ευρεία κατανομή και επομένως δεν ήταν δυνατή η σύγκριση μεταξύ τους με βάση τις τιμές logie, ωστόσο σε όλες τις ομάδες υπήρχε η τάση της αύξησης της αποτελεσματικότητας ιονισμού με την αύξηση του αριθμού ή του μεγέθους των αλκυλομάδων. Η αύξηση του αριθμού ή του μεγέθους των αλκυλομάδων οδηγεί σε αύξηση του μοριακού μεγέθους (και της λιποφιλικότητας) και σε μικρή αύξηση της βασικότητας. Σκοπός της παρούσας εργασίας Από τη βιβλιογραφική ανασκόπηση γίνεται αντιληπτό ότι η διευκρίνιση των παραγόντων που καθορίζουν το σήμα στο ESI-MS αποτελεί δύσκολο εγχείρημα. Από τη μία πλευρά η πολυπλοκότητα της διαδικασίας του ηλεκτροψεκασμού και από την άλλη πλευρά οι διαφορετικές συνθήκες διεξαγωγής των ερευνών, δεν διευκολύνουν τη σύγκριση και την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων. Παρόλα αυτά, η πλειονότητα των ερευνών αναδεικνύει την επιφανειοδραστικότητα των ουσιών ως σημαντικό παράγοντα για το λαμβανόμενο σήμα. Παράλληλα, ενώ είναι αναμενόμενο ότι η τιμή pka των λειτουργικών ομάδων των ουσιών (που μπορούν να προϋπάρχουν στο διάλυμα ως πρωτονιωμένα ή αποπρωτονιωμένα ιόντα) να παίζει καθοριστικό ρόλο στο σήμα, ωστόσο η επίδραση της pka στο σήμα δεν είναι σταθερή, 46

αλλά ακόμη και στις περιπτώσεις που βρίσκεται θετική συσχέτιση του σήματος με την pka, δεν μπορεί να αιτιολογηθεί πλήρως το μέγεθος του λαμβανόμενου σήματος στο συγκεκριμένο ph. Επιπρόσθετα, διατυπώθηκε και η υπόθεση ότι πιθανότατα κάποιος άλλος παράγοντας που εμπεριέχεται στη διαδικασία ηλεκτροψεκασμού να ευνοεί την από/πρωτονίωση σε μεγαλύτερο βαθμό από ό,τι προβλέπεται από την ισορροπία μεταφοράς του πρωτονίου στο διάλυμα. Η παρούσα μεταπτυχιακή εργασία αποσκοπεί να συμβάλει στην αποκωδικοποίηση του σήματος που λαμβάνεται σε θετικό ιονισμό με ESI-MS (σε βασικό περιβάλλον) και πιο συγκεκριμένα στη διερεύνηση των παραγόντων που επηρεάζουν τον ιονισμό των ουσιών με πρωτονίωση (μονοπρωτονίωση). Σκοπός της συγκεκριμένης έρευνας είναι η δημιουργία ενός μοντέλου για την ερμηνεία της σχέσης μεταξύ των φυσικοχημικών δομικών χαρακτηριστικών και του λαμβανόμενου σήματος των πρωτονιωμένων ιόντων των προς ανάλυση ουσιών. Οι προς ανάλυση ουσίες είναι μικρά μόρια (ΜΒ < 700), πολύπλοκης δομής, στην πλειονότητά τους φαρμακευτικές δραστικές ουσίες, με βασικές και/ή όξινες ιονίσιμες ομάδες, με ευρύ φάσμα τιμών logp και pka. Η δομική ποικιλία των προς ανάλυση μορίων αναμένεται να αναδείξει επιπλέον παράγοντες και να διευκολύνει στον εντοπισμό των δομικών στοιχείων των ενώσεων που πιθανόν να έχουν επίδραση στην πρωτονίωση. Γενικότερα, από το σύνολο των ερευνών συμπεραίνεται ότι μία φυσικοχημική ιδιότητα δεν μπορεί να επεξηγήσει από μόνη της και να αιτιολογήσει πλήρως τις διαφορές στο σήμα των ουσιών στο ESI-MS, γι αυτό και η επιλογή-εφαρμογή των μεθόδων πολυπαραμετρικής ανάλυσης στην παρούσα εργασία δικαιολογείται απόλυτα. 47

Κεφάλαιο 4o Ανάλυση πολυπαραμετρικών δεδομένων (Multivariate Data Analysis) 4.1 Εισαγωγή Στα πλαίσια της έρευνας διεξάγονται πολλές μετρήσεις και υπολογίζονται διάφορες μεταβλητές και ιδιότητες των υπό μελέτη συστημάτων. Έτσι, στην επιστήμη και την τεχνολογία σήμερα συλλέγονται δεδομένα που είναι πολυπαραμετρικά, περιέχουν δηλαδή πολλαπλές μεταβλητές διαφορετικών δειγμάτων ή διαφορετικών χρονικών στιγμών. Στην κατανόηση αυτών των πολυπαραμετρικών δεδομένων συμβάλλουν η έκφραση των πληροφοριών με διαγράμματα ή με κάποιες άλλες παραμέτρους, περισσότερο κατανοητές και στη συνέχεια, η ερμηνεία των αποτελεσμάτων, δηλαδή η σύνδεσή τους με το αντικείμενο της έρευνας. Μία απλή προσέγγιση της πολυπαραμετρικής ανάλυσης (34 36) αποτελούν οι λεγόμενες μέθοδοι προβολής (Projection Methods), οι οποίες θα περιγραφούν στη συνέχεια. Με αυτές τις μεθόδους οι παρατηρήσεις παριστάνονται ως ένα νέφος σημείων σε έναν χώρο Κ διαστάσεων (όπου Κ ο αριθμός των μεταβλητών) και έπειτα, τα σημεία προβάλλονται σε ένα επίπεδο λιγότερων διαστάσεων. Οι συντεταγμένες των σημείων σε αυτό το επίπεδο παρέχουν μια «συμπυκνωμένη» απεικόνιση των παρατηρήσεων, ενώ τα ανύσματα διεύθυνσης του επιπέδου παρέχουν αντίστοιχα μια απεικόνιση των μεταβλητών. H ευελιξία των μεθόδων προβολής τις έχει καταστήσει χρήσιμες για την ανάλυση και τη μοντελοποίηση πολύπλοκων δεδομένων και έτσι χρησιμοποιούνται σε ένα πλήθος βιομηχανικών εφαρμογών, όπως στον ποιοτικό έλεγχο (Quality Control), στoν έλεγχο διεργασιών (Process Monitoring), στις σχέσεις μεταξύ δομής-δραστικότητας (Structure-Activity Relationships) ουσιών, κ.ά. 48

H έννοια του μοντέλου είναι στενά συνυφασμένη με τον σχεδιασμό και την ανάλυση δεδομένων και είναι αποτέλεσμα των θεωρητικών επιτευγμάτων στη χημεία και τη φυσική, καθώς και στα μαθηματικά. Τα μοντέλα αποτελούν απλοποιημένες μαθηματικές προσεγγίσεις της πραγματικότητας. Σύμφωνα με τα μοντέλα τα δεδομένα διαχωρίζονται σε δύο μέρη: το συστηματικό μέρος που «επεξηγείται» από το μοντέλο και τον «θόρυβο» που αποτελεί το εναπομείναν, μη μοντελοποιημένο μέρος των δεδομένων. Από το συστηματικό μέρος του μοντέλου μπορεί να γίνει η πρόβλεψη της συμπεριφοράς του συστήματος για νέες παρατηρήσεις και παράλληλα ο έλεγχος του συστήματος και η βελτιστοποίησή του. 4.2 Ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis, PCA) Η ανάλυση κύριων συνιστωσών διατυπώθηκε αρχικά στη στατιστική, από τον Pearson. Αποτελεί συνήθως το πρώτο στάδιο στην ανάλυση πολυπαραμετρικών δεδομένων. Στόχος της PCA είναι να παραστήσει τον πίνακα δεδομένων ως ένα επίπεδο ελάχιστων διαστάσεων, συνήθως 2 έως 5, ώστε να ληφθεί μία γενική επισκόπηση των δεδομένων. Η επισκόπηση αυτή μπορεί να αποκαλύψει ομάδες, διάφορες τάσεις και ακραίες τιμές (Outliers) των παρατηρήσεων. Επίσης, η επισκόπηση μπορεί να φανερώσει τις σχέσεις μεταξύ των παρατηρήσεων και των μεταβλητών και τις σχέσεις ανάμεσα στις μεταβλητές. 4.2.1 Επεξεργασία των δεδομένων Πριν την εφαρμογή της PCA, τα δεδομένα συνήθως επεξεργάζονται, ώστε να αποκτήσουν μορφή κατάλληλη για ανάλυση. Στις περιπτώσεις που οι μεταβλητές εκφράζουν διαφορετικά μεγέθη εφαρμόζεται η διακύμανση μονάδας (Unit Variance, UV), η οποία είναι η πιο συνήθης τεχνική κανονικοποίησης ή κλιμάκωσης (Standardization or Scaling) των μεταβλητών. Οι μεταβλητές διαιρούνται με την τυπική τους απόκλιση (Standard Deviation) κι έτσι τους αποδίδεται η ίδια βαρύτητα στην εξαγωγή των παραμέτρων του μοντέλου. Επιπρόσθετα, εφαρμόζεται η τεχνική του κεντραρίσματος (Mean-centering), δηλαδή αφαιρείται από τις μεταβλητές ο μέσος όρος, ο οποίος μπορεί να θεωρηθεί ότι εκφράζει την 49

εγγενή κοινή μεταβλητότητα των δεδομένων στο σύστημα που μελετάται. Με αυτόν τον τρόπο, επιτυγχάνεται καλύτερη ερμηνεία του μοντέλου. Σχήμα 4.1 Συνήθης επεξεργασία των δεδομένων. Μετά την κλιμάκωση UV και το κεντράρισμα, όλες οι μεταβλητές θα έχουν ισοδύναμο «μήκος» και μηδενική μέση τιμή Προκειμένου να διευκολυνθεί η ανάλυση των δεδομένων, έχουν αναπτυχθεί κι άλλες τεχνικές επεξεργασίας τους. Επειδή η PCA είναι γραμμική μέθοδος, κατά την εφαρμογή της σε μη γραμμικές διεργασίες, εφαρμόζονται κατάλληλοι μαθηματικοί μετασχηματισμοί (Transformations), ώστε να απομακρυνθεί μέρος της μη γραμμικής φύσης των δεδομένων. Έτσι, χρησιμοποιούνται λογαριθμικές συναρτήσεις, εκθετικές συναρτήσεις, η τετραγωνική ρίζα, η τέταρτη ρίζα, ο αντίστροφος κ.α. Επίσης, τα δεδομένα ελέγχονται για την ανίχνευση μεταβλητών με μηδενική μεταβλητότητα. Οι μεταβλητές αυτές πρέπει να παραλειφθούν, καθώς η μεταβλητότητα των μεταβλητών που συμμετέχουν στην ανάλυση πρέπει να είναι διαφορετική του μηδενός. Επιπλέον, ο θόρυβος στα δεδομένα πρέπει να είναι όσο το δυνατό περιορισμένος, διότι μπορεί να επικαλύψει μια διεργασία. Η μείωση του αριθμού των διαστάσεων του μοντέλου κατά την εφαρμογή της μεθόδου PCA, βοηθάει προς αυτήν την κατεύθυνση. Ορισμένες φορές είναι πιθανόν να μην έχουν καταγραφεί κάποιες μετρήσεις μεταβλητών, με αποτέλεσμα την ύπαρξη κενών στον πίνακα δεδομένων. Σε αντίθεση με τις κλασικές στατιστικές μεθόδους, η μέθοδος PCA μπορεί να δώσει ακριβείς εκτιμήσεις των παραμέτρων του μοντέλου, ακόμη κι όταν υπάρχουν ελλιπή δεδομένα (Missing Data). Αυτό γίνεται, εφόσον δεν ξεπερνούν το 10-20% του συνόλου των δεδομένων και επίσης με την προϋπόθεση ότι έχουν τυχαία κατανομή. Τέλος, είναι πιθανόν να υπάρχουν ακραίες παρατηρήσεις (Outliers), δηλαδή παρατηρήσεις 50

που δεν συμφωνούν με τα υπόλοιπα δεδομένα. Ο εντοπισμός των ακραίων παρατηρήσεων πραγματοποιείται με τη βοήθεια ορισμένων στατιστικών μέτρων, όπως το στατιστικό κριτήριο του Hotelling και γίνονται εμφανείς, διότι απέχουν από το νέφος που σχηματίζουν τα υπόλοιπα δεδομένα. Η απομάκρυνση των ακραίων τιμών μπορεί να αυξήσει την ομοιογένεια των δεδομένων και να βελτιώσει το μοντέλο. Ωστόσο, μία ακραία παρατήρηση δεν αντιπροσωπεύει απαραίτητα μία εσφαλμένη λειτουργία, αλλά μπορεί να είναι απλά η μοναδική παρατήρηση που περιγράφει ένα συγκεκριμένο φαινόμενο. 4.2.2 Γεωμετρική ερμηνεία της μεθόδου PCA Ας θεωρήσουμε έναν πίνακα Χ, με Ν γραμμές (παρατηρήσεις) και Κ στήλες (μεταβλητές). Κατασκευάζουμε έναν χώρο Κ διαστάσεων, όπου κάθε μεταβλητή του πίνακα Χ παριστάνει έναν άξονα συντεταγμένων. Το μήκος κάθε μεταβλητής έχει κανονικοποιηθεί σύμφωνα με κάποιο κριτήριο, συνήθως με διακύμανση μονάδας. Στο επόμενο στάδιο, κάθε παρατήρηση, δηλαδή κάθε γραμμή του πίνακα Χ, τοποθετείται στο χώρο των Κ διαστάσεων. Έτσι, σε αυτόν το χώρο οι γραμμές του πίνακα δεδομένων σχηματίζουν ένα σμήνος από σημεία (σχ.4.2). Σχήμα 4.2 Οι παρατηρήσεις του πίνακα δεδομένων σχηματίζουν ένα σμήνος σημείων στο χώρο των Κ-διαστάσεων (εδώ 3 διαστάσεις) Η διαδικασία του κεντραρίσματος αντιστοιχεί στη μετακίνηση του συστήματος συντεταγμένων, ώστε το σημείο των μέσων τιμών να αποτελεί τώρα την αρχή των αξόνων (σχ.4.3). 51

Σχήμα 4.3 Η διαδικασία του κεντραρίσματος. (κόκκινο σημείο: σημείο των μέσων τιμών) Η πρώτη κύρια συνιστώσα (First Principal Component, PC1) είναι η ευθεία γραμμή που υπολογίζεται με τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων και η οποία προσεγγίζει καλύτερα τα δεδομένα. Παριστάνει την κατεύθυνση της μέγιστης διακύμανσης των δεδομένων και περνάει από την αρχή των αξόνων. Κάθε παρατήρηση μπορεί να προβληθεί πάνω σε αυτή τη γραμμή, προκειμένου να ληφθεί μια συντεταγμένη τιμή κατά μήκος της γραμμής της κύριας συνιστώσας. Αυτή η τιμή ονομάζεται score (σχ. 4.4). Σχήμα 4.4 Η πρώτη κύρια συνιστώσα PC1 Τις περισσότερες φορές, υπολογίζεται και η δεύτερη κύρια συνιστώσα (Second Principal Component, PC2), η οποία βελτιώνει ακόμη περισσότερο την προσέγγιση των δεδομένων. H PC2 παριστάνεται κι αυτή με μία ευθεία γραμμή στο χώρο των Κ διαστάσεων, σχηματίζει ορθή γωνία με την πρώτη κύρια συνιστώσα και περνάει από την αρχή των αξόνων. Οι δύο κύριες συνιστώσες ορίζουν μαζί ένα επίπεδο, ένα παράθυρο στον χώρο των Κ διαστάσεων 52

(σχ.4.5). Με την προβολή όλων των παρατηρήσεων σε αυτό το επίπεδο και τη γραφική παράσταση των αποτελεσμάτων, είναι δυνατό να δούμε τη δομή του υπό έρευνα συνόλου δεδομένων. Οι τιμές των συντεταγμένων των παρατηρήσεων σε αυτό το επίπεδο ονομάζονται scores (συμβολίζονται με t και δείκτη τον αριθμό της αντίστοιχης συνιστώσας) και η αντίστοιχη γραφική παράσταση ονομάζεται διάγραμμα των scores, για παράδειγμα διάγραμμα των scores t1/t2, των δύο πρώτων κύριων συνιστωσών. Σχήμα 4.5 Οι PC1 και PC2 σχηματίζουν ένα επίπεδο Η ερμηνεία του διαγράμματος των scores πραγματοποιείται με τα φορτία (Loadings) των κύριων συνιστωσών και τα οποία εκφράζουν τον προσανατολισμό του επιπέδου του μοντέλου στο χώρο των Κ διαστάσεων (σχ.4.6). Η κατεύθυνση της PC1 σε σχέση με τις αρχικές μεταβλητές δίνεται από το συνημίτονο των γωνιών α1, α2 και α3. Αυτές οι τιμές δείχνουν πώς οι αρχικές μεταβλητές x1, x2 και x3 συνεισφέρουν ( Load ) στην PC1. Επιπλέον, ένα δεύτερο σύνολο από συντελεστές φορτίων εκφράζει την κατεύθυνση της PC2 σε σχέση με τις αρχικές μεταβλητές. Το διάγραμμα των φορτίων (p1 vs p2) μπορεί να αποκαλύψει τις σχέσεις μεταξύ των μεταβλητών και σε συνδυασμό με το διάγραμμα των scores να ερμηνεύσει τις σχέσεις μεταξύ των παρατηρήσεων. 53

Σχήμα 4.6 Τα φορτία (Loadings) αποκαλύπτουν πώς το επίπεδο του PCA μοντέλου εισάγεται στον χώρο Συνήθως, μία ή δύο κύριες συνιστώσες δεν είναι αρκετές για να συνοψίσουν ικανοποιητικά τις πληροφορίες του συνόλου των δεδομένων. Σε αυτές τις περιπτώσεις η περιγραφική ικανότητα του μοντέλου PCA βελτιώνεται με τον υπολογισμό περισσότερων κύριων συνιστωσών. Έτσι, υπολογίζεται η τρίτη κύρια συνιστώσα (PC3), η οποία προσανατολίζεται στην κατεύθυνση της τρίτης μεγαλύτερης διακύμανσης των δεδομένων, σχηματίζει ορθή γωνία με τις άλλες δύο συνιστώσες και περνάει από την αρχή των αξόνων κ.ο.κ. 4.3 Μέθοδος μερικών ελαχίστων τετραγώνων (Partial Least Squares, PLS) Η PLS είναι μέθοδος παλινδρόμησης και υπό αυτήν την έννοια αποτελεί επέκταση της PCA. Είναι μέθοδος που εφαρμόζεται για να συνδέσει δύο πίνακες δεδομένων, Χ και Y, με ένα γραμμικό πολυπαραμετρικό μοντέλο και επιπλέον, για να αναλύσει δεδομένα με πολλές, συγγραμμικές, ακόμη και ελλιπείς μεταβλητές. Οι μεταβλητές Χ ονομάζονται παράγοντες (Factors) ή προβλέπουσες (Predictors), ενώ οι μεταβλητές Y ονομάζονται αποκρίσεις (Responses) (σχ.4.7). 54

Σχήμα 4.7 Συνήθης ορολογία που χρησιμοποιείται στις μεθόδους παλινδρόμησης και PLS Η μέθοδος PLS εισήχθη από τον Herman Wold, το 1975, για την ανάπτυξη μοντέλων πολύπλοκων συνόλων δεδομένων. Ανέπτυξε, λοιπόν, μία αποτελεσματική τεχνική για τον υπολογισμό των παραμέτρων στα μοντέλα, η οποία αρχικά ονομάστηκε NIPALS (Nonlinear Iterative Partial Least Squares) και στη συνέχεια μετονομάστηκε σε PLS (Partial Least Squares). Γύρω στο 1980 οι Svante Wold και Harald Martens τροποποίησαν ελαφρά την PLS. Aργότερα, οι ερευνητές για να της προσδώσουν μία πιο περιγραφική έννοια, άρχισαν να την ερμηνεύουν ως προβολές σε λανθάνουσες δομές (Projections to Latent Structures). Η μέθοδος PLS έχει εφαρμοστεί με μεγάλη επιτυχία κυρίως σε τρεις τομείς: α) στη μοντελοποίηση ποσοτικών σχέσεων δομής-δραστικότητας (Quantitative Structure-Activity Relationships modelling, QSAR modelling) β) στην πολυπαραμετρική βαθμονόμηση (Multivariate Calibration) και γ) στον έλεγχο και στη βελτιστοποίηση διεργασιών (Process Monitoring and Optimization). 4.3.1 Επεξεργασία των δεδομένων Η μέθοδος PLS, όπως και η PCA, περιλαμβάνει ένα στάδιο αρχικής επεξεργασίας των δεδομένων, για να αποκτήσουν μορφή κατάλληλη για ανάλυση (βλ. 4.2.1). Η PLS λειτουργεί καλύτερα, όταν τα δεδομένα έχουν σχετικά συμμετρική κατανομή και γι αυτόν τον λόγο, οι μεταβλητές συνήθως υφίστανται μαθηματικούς μετασχηματισμούς, για παράδειγμα λογαριθμικό μετασχηματισμό. Επιπλέον, αν υπάρχει σε μια μεταβλητή η τιμή μηδέν, αντί του λογαριθμικού μετασχηματισμού, εναλλακτικά, μπορεί να εφαρμοστεί η τέταρτη ρίζα. 55

4.3.2 Γεωμετρική ερμηνεία της μεθόδου PLS Η γεωμετρία της μεθόδου PLS έχει μελετηθεί σε βάθος από τους Phatak and DeJong, το 1997. Ας θεωρήσουμε δύο πίνακες Χ και Υ με Ν παρατηρήσεις, και Κ=3 μεταβλητές Χ και Μ=3 μεταβλητές Y. Για κάθε πίνακα, Χ και Y, κατασκευάζεται ένας χώρος με Κ και Μ διαστάσεις αντίστοιχα (σχ.4.8). Σε αυτούς τους δύο χώρους, κάθε Χ και Y μεταβλητή παριστάνει έναν άξονα συντεταγμένων. Σχήμα 4.8 Ένα παράδειγμα παλινδρόμησης με Κ=3 μεταβλητές Χ και Μ=3 μεταβλητές Y. Το μήκος κάθε άξονα συντεταγμένων έχει κανονικοποιηθεί με διακύμανση μονάδας Όπως και στη μέθοδο PCA, κάθε παρατήρηση μπορεί να παρασταθεί γραφικά. Ωστόσο, η διαφορά με τη μέθοδο PLS είναι ότι κάθε παρατήρηση τώρα αντιστοιχεί σε δύο σημεία, ένα στον Χ-χώρο και ένα στον Y-χώρο. Συνεπώς, το σύνολο των παρατηρήσεων σχηματίζει δύο σμήνη σημείων, όπως φαίνεται στο σχ.4.9. Σκοπός της ανάλυσης PLS είναι να περιγράψει τη σχέση μεταξύ των θέσεων των παρατηρήσεων στον Χ-χώρο και των θέσεων των παρατηρήσεων στον Y-χώρο. 56

Σχήμα 4.9 Κάθε παρατήρηση παριστάνεται με ένα σημείο στον Χ-χώρο και ένα άλλο σημείο στον Y-χώρο. Τα δεδομένα και στους δύο χώρους έχουν υποστεί τη διαδικασία του κεντραρίσματος Η πρώτη PLS συνιστώσα είναι μία ευθεία γραμμή στον Χ-χώρο και άλλη μία γραμμή στον Y-χώρο (σχ.4.10). Οι δύο αυτές γραμμές υπολογίζονται έτσι, ώστε να περιγράφουν ικανοποιητικά τα σμήνη των σημείων και να παρέχουν μία καλή συσχέτιση μεταξύ των θέσεων των σημείων κατά μήκος αυτών των γραμμών και στους δύο χώρους. Προβάλλοντας τις παρατηρήσεις πάνω στις γραμμές λαμβάνονται τα scores t1 και u1 για το Χ και το Y αντίστοιχα. Σχήμα 4.10 Η πρώτη συνιστώσα ενός PLS μοντέλου Το διάγραμμα t1/u1 παρουσιάζει τη δομική συσχέτιση μεταξύ Χ και Y (σχ.4.11). Η κλίση της διαγωνίου στο διάγραμμα έχει τιμή 1.0. Όταν υπάρχει απόλυτη ταύτιση μεταξύ των δεδομένων Χ και Y, όλα τα σημεία βρίσκονται πάνω στη διαγώνιο. Αντίστροφα, όταν υπάρχει ασθενής δομική συσχέτιση μεταξύ Χ και Y, τα σημεία εμφανίζουν σημαντική 57

διασπορά γύρω από τη διαγώνιο. Τέλος, η απουσία γραμμικότητας μεταξύ των Χ και Y μπορεί να ανιχνευτεί από την κλίση της σχέσης μεταξύ t1 και u1 (σχ.4.13). Σχήμα 4.11 Διαγράμματα t1/u1, όπου αριστερά η ευθεία με κλίση 1 υποδηλώνει γραμμική σχέση, ενώ δεξιά η καμπύλη υποδηλώνει την απουσία γραμμικότητας στη σχέση μεταξύ Χ και Y Η δεύτερη PLS συνιστώσα παριστάνεται επίσης με δύο γραμμές, μία σε κάθε χώρο, οι οποίες περνούν από την αρχή των αξόνων. Αυτές οι γραμμές βελτιώνουν την περιγραφή και τη συσχέτιση μεταξύ των θέσεων των επιπέδων Χ και Y. Γεωμετρικά, το μοντέλο PLS δύο συνιστωσών περιγράφεται με επίπεδα στον Χ και Y χώρο. Προβάλλοντας τις παρατηρήσεις σε αυτά τα επίπεδα, λαμβάνονται τα scores t1 και t2 στον Χ και τα scores u1 και u2 στον Y χώρο (σχ.4.12). Σχήμα 4.12 Οι δύο PLS συνιστώσες αντιστοιχούν στην εισαγωγή επιπέδων στον Χ και Y χώρο 58

Συχνά, υπολογίζονται περισσότερες από δύο συνιστώσες σε ένα μοντέλο PLS. Σε αυτές τις περιπτώσεις, δεν προσαρμόζονται επίπεδα δύο διαστάσεων στους Χ και Y χώρους, αλλά προσαρμόζονται υπέρ-επίπεδα τριών, τεσσάρων κ.τ.λ. διαστάσεων. Οι αρχές της προβολής των παρατηρήσεων, καθώς και ο προσδιορισμός των scores ισχύουν και σε αυτά τα υπέρεπίπεδα. Τα φορτία (Weights) είναι παράμετροι που χρησιμοποιούνται στη μέθοδο PLS, σχετίζονται με τις μεταβλητές και μπορούν να βοηθήσουν στην ερμηνεία ενός μοντέλου PLS. Τα φορτία συμβολίζονται με w* και c, για τις Χ και Y μεταβλητές αντίστοιχα και μπορούν να απεικονιστούν μαζί στο ίδιο διάγραμμα. Τα φορτία (Weights) ερμηνεύονται περίπου με τον ίδιο τρόπο που ερμηνεύονται και τα φορτία (Loadings) στη μέθοδο PCA και δείχνουν ποιες μεταβλητές συνεισφέρουν στο μοντέλο PLS. 4.4 Βασικά στάδια της ανάλυσης πολυπαραμετρικών δεδομένων Τα κύρια στάδια της ανάλυσης των πολυπαραμετρικών δεδομένων είναι: α) η εκτίμηση και η επεξεργασία των δεδομένων β) η δημιουργία του μοντέλου και η ερμηνεία του και γ) η επικύρωση του μοντέλου και η χρήση του. Το στάδιο της εκτίμησης και επεξεργασίας των δεδομένων αποσκοπεί στην προετοιμασία των δεδομένων για την επακόλουθη εφαρμογή του μοντέλου. Κατά το στάδιο αυτό γίνεται μία γενική εκτίμηση και ανιχνεύονται τυχόν ιδιομορφίες των δεδομένων. Τις περισσότερες φορές, τα δεδομένα δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν όπως ακριβώς είναι και γι αυτό επεξεργάζονται με κατάλληλες τεχνικές. Για παράδειγμα οι μεταβλητές με μη-κανονική κατανομή μπορεί να υποστούν μετασχηματισμό. Επίσης τα δεδομένα μπορεί να υποστούν κανονικοποίηση και κεντράρισμα. Επιπλέον, είναι σημαντική η γνώση του ποσοστού των δεδομένων που λείπουν, διότι τα πολλά κενά επηρεάζουν την ανάπτυξη ενός καλού μοντέλου. Ένα πολύ πληροφοριακό διάγραμμα, όσον αφορά τις ιδιότητες κατανομής των μεταβλητών, είναι το ιστόγραμμα (σχ.4.13). 59

Σχήμα 4.13 Το ιστόγραμμα της μεταβλητής Var 1 χωρίς μετασχηματισμό (αριστερά) και το ιστόγραμμα μετά τον λογαριθμικό μετασχηματισμό της (δεξιά) Στο επόμενο στάδιο, συστήνεται η εφαρμογή PCA σε ολόκληρο το σύνολο των δεδομένων, ανεξαρτήτως αν ο τελικός στόχος είναι η εφαρμογή PLS μοντέλου. Ο λόγος γι αυτό είναι ότι η PCA δίνει μία γενική εικόνα των δεδομένων, η οποία είναι χρήσιμη για να κατευθύνει περαιτέρω προσπάθειες μοντελοποίησης. Όπως αναφέρθηκε, η PCA διαθέτει διαγνωστικά εργαλεία για την ανίχνευση ομάδων, τάσεων, ακραίων παρατηρήσεων, για την εκτίμηση των σχέσεων ανάμεσα στις μεταβλητές και μεταξύ των παρατηρήσεων και των μεταβλητών (διάγραμμα scores και διάγραμμα φορτίων). Από την άλλη, η PLS προσπαθεί να συνδέσει τις προβλέπουσες μεταβλητές (Χ) με τις αποκρίσεις (Y), με στόχο την πρόβλεψη των τελευταίων από τις πρώτες. Πάντως, η ερμηνεία του μοντέλου παίζει πολύ σημαντικό ρόλο και στις δύο μεθόδους. Για την ερμηνεία του PLS μοντέλου τα scores t και u παρέχουν πληροφορίες για τις παρατηρήσεις και τις ομοιότητες/ανομοιότητες τους. Τα φορτία w* και c είναι σημαντικά για την ερμηνεία των scores και την κατανόηση του ρόλου των Χ-μεταβλητών. Τέλος, η παράμετρος VIP (Variable Influence on Projection) παρέχει την πιο «συμπυκνωμένη» πληροφορία, διότι συνοψίζει όλες τις συνιστώσες και τις μεταβλητές Y. Στο ραβδόγραμμα VIP απεικονίζονται οι μεταβλητές X με βάση τη σπουδαιότητά τους για το μοντέλο. Αναμφισβήτητα, πριν τη χρήση ενός μοντέλου είναι πολύ σημαντική η επαλήθευση της αξιοπιστίας του μοντέλου και της προβλεπτικής του ικανότητας. Η επαλήθευση της ικανότητας πρόβλεψης του μοντέλου είναι ο μόνος αξιόπιστος τρόπος για να καθοριστεί η καταλληλότητα του μοντέλου για την εφαρμογή του σε νέες παρατηρήσεις. Στο τρίτο, λοιπόν, στάδιο της πολυπαραμετρικής ανάλυσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορα εργαλεία και παράμετροι. Η παράμετρος R 2 (ο συντελεστής συσχέτισης) εκφράζει ποσοτικά το βαθμό προσαρμογής του μοντέλου, δηλαδή το πόσο καλά μπορούν να αναπαραχθούν 60

μαθηματικά τα δεδομένα του υπό εξέταση συνόλου. Η παράμετρος Q 2 (η ικανότητα πρόβλεψης) εκφράζει την ακρίβεια με την οποία μπορούν να προβλεφθούν τα δεδομένα νέων παρατηρήσεων, που δεν περιλαμβάνονται στο αρχικό μοντέλο. Το θέμα είναι ότι το R 2 μπορεί να προσεγγίσει την βέλτιστη τιμή του, την τιμή 1, καθώς αυξάνεται η πολυπλοκότητα του μοντέλου, πράγμα που δεν μπορεί ευτυχώς να συμβεί με την παράμετρο Q 2. Επιπλέον, είναι αδύνατον να υφίσταται υψηλό Q 2 χωρίς υψηλό R 2 και επίσης, η διαφορά μεταξύ τους δεν πρέπει να ξεπερνάει το 0.2-0.3. Γενικότερα, τιμή Q 2 > 0.5 θεωρείται καλή, ενώ τιμή Q 2 > 0.9 θεωρείται εξαιρετική. Πάντοτε όμως εξαρτάται από την εφαρμογή. Η επαλήθευση της αξιοπιστίας (ικανότητα πρόβλεψης) ενός μοντέλου μπορεί να εκτιμηθεί είτε εσωτερικά (Internal Validation), μέσω των υπαρχόντων δεδομένων, είτε εξωτερικά (External Validation), μέσω της χρήσης ενός ανεξάρτητου συνόλου παρατηρήσεων. Η διασταυρούμενη επικύρωση (Cross-Validation, CV) αποτελεί έναν πρακτικό και αξιόπιστο τρόπο για την αξιολόγηση ενός PCA ή ενός PLS μοντέλου. Η βασική ιδέα της CV είναι να μένει ένα μέρος των δεδομένων (ή και μία μόνο παρατήρηση) έξω από το μοντέλο, να αναπτύσσεται το μοντέλο από τα εναπομείναντα δεδομένα και μετά να γίνεται πρόβλεψη από το μοντέλο των δεδομένων που έμειναν εκτός. Στο τέλος, γίνεται σύγκριση των τιμών που ελήφθησαν με πρόβλεψη, με τις πραγματικές. Επίσης, η τεχνική CV χρησιμοποιείται από τα διάφορα λογισμικά για να προσδιορίσει τον κατάλληλο αριθμό συνιστωσών σε ένα PLS ή ένα PCA μοντέλο. Σχήμα 4.14 Ένα παράδειγμα διαγράμματος της μεθόδου μετάθεσης των αποκρίσεων 61

Μία άλλη προσέγγιση για την επαλήθευση της αξιοπιστίας ενός PLS μοντέλου αποτελεί η εφαρμογή της CV σε συνδυασμό με τη μέθοδο μετάθεσης των αποκρίσεων (Response Permutation). Κατά τη μέθοδο αυτή, τα δεδομένα Y δεν αλλάζουν σε αριθμό, αλλά μετατοπίζονται οι θέσεις τους με τυχαίο ανακάτεμα. Στη συνέχεια, προσαρμόζεται PLS μοντέλο στα τροποποιημένα δεδομένα Y και χρησιμοποιώντας CV υπολογίζονται οι τιμές R 2 Y και Q 2 Y για το παραγόμενο μοντέλο. Αυτές οι τιμές συγκρίνονται με τις αντίστοιχες τιμές του αρχικού μοντέλου και λαμβάνεται μια πρώτη ένδειξη της σημαντικότητάς των τελευταίων. Η συγκεκριμένη διαδικασία επαναλαμβάνεται αρκετές φορές (για παράδειγμα από 20-100) και έτσι εκτιμάται η στατιστική σημαντικότητα των παραμέτρων R 2 Y και Q 2 Y του αρχικού μοντέλου. Το διάγραμμα της μεθόδου (σχ.4.14) παριστάνει στον Y-άξονα τις τιμές R 2 Y/Q 2 Y όλων των μοντέλων και στον Χ-άξονα τους συντελεστές συσχέτισης μεταξύ των τροποποιημένων και των αρχικών αποκρίσεων. Προκειμένου να συνοψιστούν τα αποτελέσματα της μεθόδου, εφαρμόζεται ανάλυση παλινδρόμησης στα δύο σύνολα των R 2 Y και Q 2 Y σημείων κι έτσι προκύπτουν οι δύο καμπύλες παλινδρόμησης (Regression Lines). Για το χαρακτηρισμό ενός μοντέλου ως αξιόπιστου, η τεταγμένη της ευθείας R 2 Y δεν πρέπει να ξεπερνάει την τιμή 0.3-0.4, ενώ η τεταγμένη της ευθείας Q 2 Y την τιμή 0.05. 62

Πειραματικό μέρος

Κεφάλαιο 5o Όργανα-συσκευές-αντιδραστήρια 5.1 Σύστημα Υγρής Χρωματογραφίας - Φασματομετρίας Μάζας Στα πλαίσια της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας, το σύστημα υγρής χρωματογραφίας - φασματομετρίας μάζας κατείχε τον κυρίαρχο ρόλο. Το σύστημα αυτό (σχ.5.1) αποτελoύνταν από: ζεύγος αντλιών για την παροχή διαλυτών (LC-20AD, Shimadzu) αυτόματο δειγματολήπτη (SIL-20AC HT, Shimadzu) θερμοστατούμενο θάλαμο (CTO-20AC, Shimadzu) φασματόμετρο μάζας με τετραπολικό αναλυτή μάζας και πηγή ιονισμού με ηλεκτροψεκασμό (LCMS-2020, Shimadzu) ηλεκτρονικό υπολογιστή με λογισμικό ελέγχου και επεξεργασίας των δεδομένων (LabSolutions LCMS, Shimadzu) Σχήμα 5.1 Σύστημα υγρής χρωματογραφίας φασματομετρίας μάζας 64

5.1.1 Περιγραφή οργάνου LCMS-2020 Πρόκειται για ένα φασματόμετρο μάζας με τετραπολικό αναλυτή μάζας. (37) Επιτυγχάνει μεγάλη ταχύτητα σάρωσης και αλλαγής πολικότητας, σε συνδυασμό με υψηλή ευαισθησία. Στο Σχήμα 5.2 απεικονίζονται τα κύρια τμήματα του οργάνου. Ο μηχανισμός της ανάλυσης περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια: το δείγμα, που εισάγεται από το σύστημα της υγρής χρωματογραφίας, ψεκάζεται και ιονίζεται υπό συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης από τον ψεκαστήρα ηλεκτροψεκασμού (Ionization Probe) το ιονισμένο δείγμα εισάγεται μέσω της γραμμής αποδιαλύτωσης (Desolvation Line, DL) στον πρώτο θάλαμο κενού. Εκεί, εστιάζεται στην κορυφή του αποκορυφωτή (Skimmer) από ένα σύστημα οδηγών ιόντων πολλαπλών σταδίων και υψηλής συχνότητας (Qarray) ο επόμενος θάλαμος κενού περιλαμβάνει το οκτάπολο (Octapole), το οποίο επίσης αποτελείται από οδηγούς ιόντων υψηλής συχνότητας στη συνέχεια, τα ιόντα διαχωρίζονται σύμφωνα με το λόγο της μάζας προς το φορτίο τους (m/z) από τον τετραπολικό αναλυτή μάζας (Quadrupole Mass Analyzer) και ανιχνεύονται από τον ανιχνευτή (Detector) τα σήματα των ιόντων πρώτα ενισχύονται και κατόπιν επεξεργάζονται με το λογισμικό LabSolutions LCMS Σχήμα 5.2 Διάταξη του LCMS-2020 65

5.1.2 Παράμετροι λειτουργίας του συστήματος LC-MS Όσον αφορά το σύστημα της υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας, οι συνθήκες που επιλέχθηκαν ήταν: κινητή φάση: μεθανόλη:νερό (ph 10) με ΝΗ4ΟΗ, 50:50 (v/v) δεν χρησιμοποιήθηκε αναλυτική στήλη, αλλά τοποθετήθηκε κατάλληλος σύνδεσμος μεταξύ του χρωματογραφικού συστήματος και του φασματομέτρου μάζας πίεση: 180-200 psi ταχύτητα ροής: 0,5 ml/min όγκος έγχυσης: 5 μl δυναμικό διασύνδεσης: 4,5 KV δυναμικό Qarray RF: 60 V θερμοκρασία γραμμής αποδιαλύτωσης: 250 o C ροή αερίου νεφελοποίησης: 1,5 L/min ροή αερίου ξήρανσης: 15 L/min Το σύστημα ήταν συνδεδεμένο με γεννήτρια παραγωγής αερίου αζώτου (N2LCMS Nitrogen Generator, Claind). 66

5.2 Συσκευές Βοηθητικά όργανα Για την παρασκευή των διαλυμάτων χρησιμοποιήθηκαν τα κάτωθι: αυτόματη πιπέτα (Pipetman P1000, Gilson) για την αραίωση των πυκνών διαλυμάτων των ουσιών αναλυτικός ζυγός (ADA 180, Adam Equipment) για τη ζύγιση των ουσιών πεχάμετρο ακριβείας (C931, Consort) για τη ρύθμιση του ph της κινητής φάσης λουτρό υπερήχων (Bransonic 220) για τη διευκόλυνση της διάλυσης των ουσιών γυάλινα όργανα και σκεύη: ογκομετρικές φιάλες και κύλινδροι, σιφώνια πληρώσεως 5.3 Αντιδραστήρια Οι διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν ως κινητή φάση (νερό, μεθανόλη και ακετονιτρίλιο) ήταν καθαρότητας LC-MS, της εταιρείας Panreac (Spain). Οι αντίστοιχοι διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή των πυκνών διαλυμάτων των ουσιών, αλλά και για τη μετέπειτα αραίωσή τους ήταν καθαρότητας HPLC, της εταιρείας Carlo Erba Reagents (Italy). Για τη ρύθμιση του ph της υδατικής φάσης χρησιμοποιήθηκαν φορμικό οξύ 98-100% και αμμωνία 25%, της εταιρείας Merck (Germany). Οι χημικές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν των παρακάτω εταιρειών: Sigma-Aldrich (Life Science Chemilab) Carlo Erbra (Milano, Italy) Riedel-de-Haën (Life Science Chemilab) Fluka (Life Science Chemilab, authorized distributor in Greece) Applichem (Bioline Scientific, Athens, Greece) Boehringer Ingelheim Acros-Organics (Life Science Chemilab) Στον πίνακα που ακολουθεί παρουσιάζονται οι 99 υπό μελέτη ουσίες, οι οποίες είναι στην πλειονότητά τους φαρμακευτικές δραστικές ουσίες, οι χημικές τους δομές (38) και η κατηγορία (39) στην οποία ανήκουν. 67

Πίνακας 5.1 Οι χημικές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση Ουσία Δομή (38) Κατηγορία (39) 1 Ακεταμινοφαίνη Αναλγητικό-αντιπυρετικό (Acetaminophen) 2 Ακετυλοσαλικυλικό οξύ (Acetylsalicylic acid) Μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες, αντιαιμοπεταλιακό 3 Αλλοπουρινόλη (Allopurinol) Φάρμακο κατά της ουρικής αρθρίτιδας και της υπερουριχαιμίας 4 Αλοπεριδόλη Αντιψυχωσικό (Haloperidol) 5 Αμβροξόλη Αποχρεμπτικό-βλεννολυτικό (Ambroxol) 6 Αμινοφυλλίνη (Aminophylline) Βρογχοδιασταλτικό (παράγωγο ξανθίνης) 7 Αμιτριπτυλίνη (Amitriptyline) Αντικαταθλιπτικό (τρικυκλικό) 68

8 Αμιωδαρόνη Αντιαρρυθμικό (Amiodarone) 9 Αμοβαρβιτάλη (Amobarbital) Κατασταλτικό-ηρεμιστικό (38) 10 Αμοξυκιλλίνη (Amoxycillin) Αντιμικροβιακό (πενικιλλίνη) 11 Ανταζολίνη (Antazoline) Αντιαλλεργικό (φάρμακο οφθαλμολογικών παθήσεων) 12 Απομορφίνη (Apomorphine) 13 Ατενολόλη (Atenolol) Ντοπαμινεργικό (φάρμακο χορηγούμενο σε παρκινσονισμό και συναφείς παθήσεις) Β-αδρενεργικός αποκλειστής 14 Ατροπίνη (Atropine) Αντιχολινεργικό, αντιαρρυθμικό 15 Βαρφαρίνη Αντιπηκτικό (Warfarin) 69

16 Βενζοϊκό οξύ (Benzoic acid) Αντιμικροβιακός παράγοντας (38) 17 Βιπεριδένη (Biperiden) 18 Βρωμοφαινυραμίνη Αντιχολινεργικό (φάρμακο χορηγούμενο σε παρκινσονισμό και συναφείς παθήσεις) Αντιισταμινικό (Brompheniramine) 19 Γκαμπαπεντίνη Αντιεπιληπτικό (Gabapentin) 20 Γλιπιζίδη (Glipizide) Αντιδιαβητικό (σουλφονυλουρία) 21 Δεσιπραμίνη Αντικαταθλιπτικό (Desipramine) 22 Διαζεπάμη (Diazepam) Αγχολυτικό (βενζοδιαζεπίνη), μυοχαλαρωτικό 23 Διαίθυλοστιλβεστρόλη (Diethylstilbestrol) Αντισυλληπτικό (οιστρογόνο) (38) 70

24 Διαίθυλοστιλβεστρόλη διπροπιονική Οιστρογόνο (38) (Diethylstilbestrol dipropionate) 25 Διβουκαΐνη Τοπικό αναισθητικό (Dibucaine) 26 Δικλοφενάκη (Diclofenac) Μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες (παράγωγο του οξικού οξέος) 27 Διλτιαζέμη (Diltiazem) Αντιστηθαγχικό (αποκλειστής διαύλων ασβεστίου) 28 Διπυριδαμόλη Αντιαιμοπεταλιακό (Dipyridamole) 29 Διφαινυδραμίνη (Diphenhydramine) Αντιισταμινικό (αιθανολαμίνη), μη ναρκωτικό αντιβηχικό 71

30 Επινεφρίνη (Epinephrine) Συμπαθητικομιμητικό (αδρενεργικός διεγέρτης) 31 Εφεδρίνη (Ephedrine) Συμπαθητικομιμητικό (αδρενεργικός διεγέρτης) 32 Ζιπεπρόλη Αντιβηχικό (38) (Zipeprol) 33 Θειοκολχικοσίδη Μυοχαλαρωτικό (Thiocolchicoside) 34 Θεοφυλλίνη (Theophylline) Βρογχοδιασταλτικό (παράγωγο ξανθίνης) 35 Ιμιπραμίνη (Imipramine) Αντικαταθλιπτικό (τρικυκλικό) 36 Ινδομεθακίνη (Indomethacin) Μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες (παράγωγο του οξικού οξέος) 72

37 Ισοπρεναλίνη (Isoprenaline) Συμπαθητικομιμητικό (αδρενεργικός διεγέρτης) 38 Καπτοπρίλη (Captopril) Αντιυπερτασικό (αναστολέας του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτασίνης) 39 Καρβαμαζεπίνη (Carbamazepine) Αντιεπιληπτικό, φάρμακο κατά της διπολικής διαταραχής 40 Καρβιντόπα Αντιπαρκινσονικό (Carbidopa) 41 Καρισοπροδόλη Μυοχαλαρωτικό (Carisoprodol) 42 Καφεΐνη (Caffeine) Διεγερτικό του κεντρικού νευρικού συστήματος 43 Κετοκοναζόλη (Ketoconazole) Αντιμυκητιασικό (αζόλη) 44 Κετοπροφαίνη (Ketoprofen) Μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες (παράγωγο του προπιονικού οξέος) 73

45 Κεφουροξίμη (Cefuroxime) Αντιμικροβιακό (κεφαλοσπορίνη β γενεάς) 46 Κλοβαζάμη (Clobazam) Αγχολυτικό (βενζοδιαζεπίνη) 47 Κλομιφαίνη Αντιοιστρογόνο (Clomiphene) 48 Κλονιδίνη (Clonidine) Αντιυπερτασικό με κεντρική δράση 49 Κλοτριμαζόλη (Clotrimazole) Αντιμυκητιασικό (αζόλη) 50 Κολχικίνη (Colchicine) Φάρμακο κατά της ουρικής αρθρίτιδας και της υπερουριχαιμίας 51 Λιδοκαΐνη Τοπικό αναισθητικό (Lidocaine) 74

52 Λισινοπρίλη (Lisinopril) Αντιυπερτασικό (αναστολέας του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτασίνης) 53 Λοραζεπάμη (Lorazepam) Αγχολυτικό (βενζοδιαζεπίνη) 54 Μελοξικάμη (Meloxicam) Μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες (οξικάμη) 55 Μετοκλοπραμίδη (Metoclopramide) Φάρμακο που προάγει την κινητικότητα του πεπτικού συστήματος (παράγωγο της βενζαμίδης) 56 Μετρονιδαζόλη (Metronidazole) Αντιμικροβιακό (ιμιδαζόλιο) 57 Μεφαιναμικό οξύ (Mefenamic acid) 58 Ναπροξένη (Naproxen) Μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες (παράγωγο του ανθρανιλικού οξέος) Μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες (παράγωγο του προπιονικού οξέος) 75

59 Ναφαζολίνη (Naphazoline) Αποσυμφορητικό (συμπαθητικομιμητικό) 60 Νεοστιγμίνη (Neostigmine) Αντιμυασθενικό (αντιχολινεστερασικό) 61 Νικοτινικό οξύ Υδροδιαλυτή βιταμίνη (Nicotinic acid) 62 Νιφεδιπίνη (Nifedipine) Αντιστηθαγχικό (αποκλειστής διαύλων ασβεστίου) 63 Νορτριπτυλίνη (Nortriptyline) Αντικαταθλιπτικό (τρικυκλικό) 64 Νορφλοξασίνη (Norfloxacin) Αντιμικροβιακό (κινολόνη) 65 Νοσκαπίνη Αντιβηχικό (38) (Noscapine) 66 Πιροξικάμη (Piroxicam) Μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες (οξικάμη) 76

67 Πραζεπάμη (Prazepam) Αγχολυτικό (βενζοδιαζεπίνη) 68 Προμεθαζίνη (Promethazine) Αντιισταμινικό (φαινοθειαζίνη) 69 Προπρανολόλη (Propranolol) Β-αδρενεργικός αποκλειστής 70 Ραμιπρίλη (Ramipril) Αντιυπερτασικό (αναστολέας του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτασίνης) 71 Ρανιτιδίνη (Ranitidine) 72 Ρεσερπίνη (Reserpine) Ανασταλτικό της γαστρικής έκκρισης (Η 2-ανταγωνιστής) Αντιυπερτασικό (αλκαλοειδές) 73 Ριβοφλαβίνη Υδροδιαλυτή βιταμίνη (Riboflavin) 77

74 Σαλβουταμόλη (Salbutamol) Βρογχοδιασταλτικό (β 2 αδρενεργικός διεγέρτης βραχείας δράσης) 75 Σιμετιδίνη (Cimetidine) Ανασταλτικό της γαστρικής έκκρισης (Η 2-ανταγωνιστής) 76 Σπιρονολακτόνη (Spironolactone) Διουρητικό (ανταγωνιστής της αλδοστερόνης) 77 Σουλφαμεθοξαζόλη (Sulfamethoxazole) Αντιμικροβιακό (σουλφοναμίδη) 78 Σουλφασαλαζίνη (Sulfasalazine) Φάρμακο κατά των ιδιοπαθών φλεγμονωδών νόσων του εντέρου (αμινοσαλικυλικό) 79 Σουλφισοξαζόλη (Sulfisoxazole) Αντιμικροβιακό (σουλφοναμίδη) 80 Τερβουταλίνη (Terbutaline) Βρογχοδιασταλτικό (β 2 αδρενεργικός διεγέρτης βραχείας δράσης) 81 Τετρακαΐνη Τοπικό αναισθητικό (Tetracaine) 78

82 Τικλοπιδίνη Αντιαιμοπεταλιακό (Τiclopidine) 83 Τολβουταμίδη (Tolbutamide) Αντιδιαβητικό (σουλφονυλουρία) 84 Τριαμτερένη (Triamterene) Διουρητικό (προστατευτικό της απώλειας καλίου) 85 Τριμεθοπρίμη (Trimethoprim) Αντιμικροβιακό (ανταγωνιστής του φυλλικού οξέος) 86 Τριμιπραμίνη (Trimipramine) Αντικαταθλιπτικό (τρικυκλικό) 87 Τριπρολιδίνη Αντιισταμινικό (38) (Triprolidine) 88 Τριφλουπρομαζίνη Αντιψυχωσικό (38) (Triflupromazine) 89 Υδροξυζίνη (Hydroxyzine) Αντιισταμινικό (πιπεραζίνη) 79

90 Υδροχλωροθειαζίδη (Hydrochlorothiazide) Διουρητικό (θειαζίδη) 91 Φαινοβαρβιτάλη Αντιεπιληπτικό (Phenobarbital) 92 Φαινυλεφρίνη (Phenylephrine) Συμπαθητικομιμητικό (αδρενεργικός διεγέρτης) 93 Φλουοξετίνη (Fluoxetine) Αντικαταθλιπτικό (εκλεκτικός αναστολέας της επαναπρόσληψης σεροτονίνης) 94 Φλουρβιπροφαίνη (Flurbiprofen) Μη στεροειδές αντιφλεγμονώδες (παράγωγο του προπιονικού οξέος) 95 Χλωραμφαινικόλη (Chloramphenicol) Αντιμικροβιακό (αμφενικόλη) 96 Χλωροθαλιδόνη (Chlorthalidone) Διουρητικό (παρόμοιας δράσης με θειαζίδες) 80

97 Χλωρφαινυραμίνη (Chlorpheniramine) Αντιισταμινικό (αλκυλαμίνη) 98 Benzethonium Chloride Αντιμικροβιακό (38) 99 Cinchonidine Αντιπρωτοζωικό (ανθελονοσιακό) (38) 81

Κεφάλαιο 6o Επιλογή κινητής φάσης Η επιλογή της κατάλληλης κινητής φάσης έγινε κατόπιν πειραματικής διερεύνησης αποβλέποντας στην ανεύρεση της φάσης εκείνης η οποία αποδίδει το μέγιστο σήμα απόκρισης για τις περισσότερες από τις ουσίες που μελετήθηκαν. Για τη διεξαγωγή του πειράματος αυτού επελέγησαν 10 από τις 99 συνολικά ουσίες, με κριτήριο τα δομικά χαρακτηριστικά τους να τις κατατάσσουν σε διαφορετικές κατηγορίες χημικών ενώσεων (π.χ. βάσεις, οξέα) Το σήμα απόκρισης των ουσιών αυτών (με τριπλή επανάληψη κάθε μέτρησης) διερευνήθηκε στις 5 ακόλουθες διαφορετικές κινητές φάσεις: 1) αραίωση του μητρικού διαλύματος με νερό και κινητή φάση νερό (w/w), 2) αραίωση του μητρικού διαλύματος με νερό (ph 2.6, προσθήκη φορμικού οξέος) και ίδια κινητή φάση (f/f), 3) αραίωση του μητρικού διαλύματος με νερό (ph 10, προσθήκη αμμωνίας) και ίδια κινητή φάση (n/n), 4) αραίωση του μητρικού διαλύματος με ακετονιτρίλιο και κινητή φάση ακετονιτρίλιο (a/a) 5) αραίωση του μητρικού διαλύματος με μεθανόλη και κινητή φάση μεθανόλη (m/m). Οι 10 αυτές ουσίες αναλύθηκαν με την τεχνική της επιλεκτικής παρακολούθησης (SIM) των πρωτονιωμένων τους ιόντων. Στις περισσότερες περιπτώσεις διαπιστώθηκε η υπεροχή του σήματος με τις συνθήκες 3 και 5, οπότε και συνδυάστηκαν για να αποτελέσουν την ιδανική κινητή φάση η οποία ήταν η μεθανόλη:νερό (ph 10), 50:50 (v/v). Η ίδια κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε και σαν τελική αραίωση των προς ανάλυση δειγμάτων. 82

Πίνακας 6.1 Ανάλυση 10 ουσιών σε διαφορετικές συνθήκες 1 2 3 4 5 w/w f/f n/n a/a m/m Βαρφαρίνη 1349817 879147 9701961 977747 2667638 1346149 901898 9503773 979436 2750630 1339326 900411 9320463 962772 3005620 Θειοκολχικοσίδη 404878 591960 1452927 57137 200851 403972 586074 1445418 45792 200627 395055 586878 1406649 39505 196275 Καφεΐνη 254608 524074 427892 3796 328011 262821 545731 437870 2622 330677 241639 531483 406778 2247 326710 Κλοβαζάμη 389473 501653 1276439 106890 1982451 390456 489140 1312891 97729 2058195 389356 499917 1310832 92175 1991331 Νεοστιγμίνη 12913149 6958828 8966262 13752497 20232404 13522570 7040423 9005690 13562721 20755145 13855198 7026906 8373022 13332888 21208694 Νικοτινικό οξύ 105225 567738 933090 16766 71613 278244 510495 980309 19638 84143 296241 477994 968375 21077 91068 Νιφεδιπίνη 858205 1049527 3884288 1179708 1901299 855980 1045552 3936964 1144920 1919995 873729 1048142 3865643 1033680 2016530 Ραμιπρίλη 7608661 4745262 8487275 3563758 10346450 8031737 4792649 8214081 3055851 10012718 8173401 4727969 8190443 3275057 9537687 Σιμετιδίνη 10578082 4809083 6517484 2748568 6569968 10605979 4944975 6742368 2300047 6685320 10598773 4940078 6298770 2349166 6713465 Benzethonium 1317938 5212491 1650589 12989869 17397605 1304269 4852355 1631995 12813769 17453774 1852837 4035545 1834550 12865998 17394947 83

Κεφάλαιο 7o Ανάπτυξη μεθοδολογίας ESI-MS για τη μέτρηση και αποκωδικοποίηση του σήματος των υπό μελέτη χημικών ουσιών 7.1 Πειραματική πορεία Στη συνέχεια περιγράφεται η πειραματική πορεία που ακολουθήθηκε και αφορά την ανάπτυξη μεθοδολογίας ESI-MS για τη μέτρηση και αποκωδικοποίηση του σήματος των υπό μελέτη ουσιών. 7.1.1 Παρασκευή μητρικών διαλυμάτων και διαλυμάτων έγχυσης Αρχικά, παρασκευάστηκαν τα πυκνά μητρικά διαλύματα όλων των υπό μελέτη ουσιών. Για το σκοπό αυτό ζυγίστηκαν και διαλυτοποιήθηκαν 10,0 mg από κάθε ουσία σε ογκομετρική φιάλη των 25 ml με διαλύτη μεθανόλη. Η διαλυτοποίηση διευκολύνθηκε με χρήση λουτρού υπερήχων. Στη συνέχεια, τα διαλύματα αυτά τοποθετήθηκαν σε σκουρόχρωμες γυάλινες φιάλες για διατήρηση στο ψυγείο (2-8 ο C). Η επιλογή της μεθανόλης έγινε για λόγους σταθερότητας και διαλυτότητας. Από τα μητρικά αυτά διαλύματα παρασκευάστηκαν τα διαλύματα έγχυσης. Για το σκοπό αυτό ελήφθησαν με αυτόματη πιπέτα 500 μl μητρικού διαλύματος και τοποθετήθηκαν σε κωνική φιάλη. Κατόπιν, προστέθηκαν με σιφώνιο πληρώσεως 10 ml διαλύματος μεθανόλης:νερού (ph 10), 50:50 (v/v). Η συγκέντρωση των διαλυμάτων έγχυσης ήταν περίπου 19 μg/ml. Η αλκαλοποίηση του νερού έγινε με προσθήκη διαλύματος αμμωνίας 25% και έλεγχο του ph του διαλύματος με πεχάμετρο, μέχρι την επίτευξη της τιμής ph 10. 84

7.1.2 Έγχυση των χημικών ουσιών στο φασματόμετρο μάζας (Flow Injection Analysis) Μικρή ποσότητα του διαλύματος έγχυσης κάθε ουσίας τοποθετήθηκε κάθε φορά σε φιαλίδιο στον αυτόματο δειγματολήπτη για την ανίχνευση των πρωτονιωμένων ιόντων [M+H] +. Για κάθε ουσία, όγκος 5 μl (Injection Volume) διαλύματος συγκεντρώσεως 19 μg/ml (δηλαδή 0,095 μg της ουσίας) μεταφέρθηκε στο φασματόμετρο μάζας με ροή κινητής φάσης 0,5 ml/min. Οι συνθήκες φασματομετρικής ανάλυσης κατά την έγχυση των ουσιών αναφέρονται στην υποενότητα 5.1.2. 7.1.3 Λήψη και επεξεργασία του σήματος Η λήψη των φασμάτων μάζας έλαβε χώρα σε θετικό ιονισμό. Αρχικά, για κάθε ουσία διερευνήθηκε το εύρος 100-700 m/z με την τεχνική της πλήρους σάρωσης (Scan Mode). Το εύρος αυτό επελέγη βάσει του εύρους των μοριακών βαρών των υπό μελέτη ουσιών. Ο χρόνος Event Time διαμορφώθηκε στα 0,04 sec, ώστε να επιτυγχάνεται η μέγιστη ταχύτητα σάρωσης (Scan Speed) 15.000 u/sec. Στη συνέχεια, εφαρμόστηκε η τεχνική της επιλεκτικής παρακολούθησης ιόντων (SIM), ώστε να ενισχυθούν τα ιόντα του ενδιαφέροντος (πρωτονιωμένα ιόντα). Η τεχνική SIM επαναλήφθηκε δύο φορές για κάθε ουσία. Ακολούθησε ολοκλήρωση των κορυφών που αντιστοιχούσαν στα πρωτονιωμένα ιόντα των ουσιών και υπολογισμός του μέσου όρου των δύο μετρήσεων για κάθε ουσία. Ο μέσος όρος των δύο μετρήσεων (των επιφανειών κάτω από την καμπύλη των κορυφών των πρωτονιωμένων ιόντων) αποτέλεσε το σήμα των ουσιών, τη μεταβλητή Υ (πίν.7.1). 85

Πίνακας 7.1 Οι υπό μελέτη χημικές ουσίες και τα ληφθέντα σήματα (κατά σειρά φθίνοντος σήματος) Ουσία Σήμα Ουσία Σήμα Ουσία Σήμα Τριφλουπρομαζίνη 53995053.5 Προμεθαζίνη 13861257 Γλιπιζίδη 1202511.5 Ζιπεπρόλη 52238859.5 Διφαινυδραμίνη 13716505 Κλοτριμαζόλη 1197914.5 Βιπεριδένη 45971617 Κλομιφαίνη 13259372 Λοραζεπάμη 1193336 Ναφαζολίνη 40895297.5 Απομορφίνη 13137992.5 Μετρονιδαζόλη 854828 Χλωρφαινυραμίνη 39080533.5 Μελοξικάμη 11580741.5 Κετοπροφαίνη 744597.5 Σιμετιδίνη 36671848.5 Διπυριδαμόλη 10982283.5 Δικλοφενάκη 685412 Τριμιπραμίνη 36238379.5 Νορφλοξασίνη 10363714 Θεοφυλλίνη 684747.5 Τριαμτερένη 34510486 Κολχικίνη 9825899.5 Νικοτινικό οξύ 646475 Τριμεθοπρίμη 33845364 Φλουοξετίνη 8917794 Λισινοπρίλη 542251 Μετοκλοπραμίδη 31871894 Γκαμπαπεντίνη 8314263 Πραζεπάμη 351955 Νεοστιγμίνη 30791639.5 Βρωμοφαινυραμίνη 6629330.5 Καρβιντόπα 342504.5 Benzethonium 29684023 Φαινυλεφρίνη 6227902 Σπιρονολακτόνη 177782 Αλοπεριδόλη 28448660 Κλοβαζάμη 6124889 Ινδομεθακίνη 176416.5 Τικλοπιδίνη 26942643 Εφεδρίνη 6011356 Αμινοφυλλίνη 168686.5 Αμιτριπτυλίνη 25248192.5 Καρισοπροδόλη 6006958.5 Ριβοφλαβίνη 167097 Κλονιδίνη 25000884.5 Αμιωδαρόνη 5737965 Θειοκολχικοσίδη 126953 Cinchonidine 24708967 Νιφεδιπίνη 5271907 Αλλοπουρινόλη 104092 Κετοκοναζόλη 23611211 Σουλφαμεθοξαζόλη 5257055 Διλτιαζέμη 79167 Ατροπίνη 22740506 Καπτοπρίλη 5133964.5 Ναπροξένη 67513 Ατενολόλη 21982036 Ρανιτιδίνη 4258098.5 Νοσκαπίνη 37441 86

Προπρανολόλη 21979216 Ρεσερπίνη 4124089.5 Χλωροθαλιδόνη 22566.5 Δεσιπραμίνη 21390257.5 Τολβουταμίδη 3954992.5 Χλωραμφαινικόλη 21579 Ανταζολίνη 20822423 Ισοπρεναλίνη 3322122 Πιροξικάμη 12829.5 Τριπρολιδίνη 19993243 Ακεταμινοφαίνη 2989240.5 Αμοβαρβιτάλη 4509 Ραμιπρίλη 19400770.5 Βαρφαρίνη 2549113.5 Αμοξυκιλλίνη 1373.5 Υδροξυζίνη 18747316 Σουλφασαλαζίνη 2131878 Κεφουροξίμη 776.5 Λιδοκαΐνη 18234027 Επινεφρίνη 2029253.5 Ακετυλοσαλικυλικό 0 οξύ Διαζεπάμη 17550660 Σουλφισοξαζόλη 1865557 Βενζοϊκό οξύ 0 Καρβαμαζεπίνη 16899621.5 Νορτριπτυλίνη 1815911.5 Διαίθυλοστιλβεστρόλη 0 Ιμιπραμίνη 16558203.5 Μεφεναμικό οξύ 1805648.5 Διαίθυλοστιλβεστρόλη 0 διπροπιονική Τετρακαΐνη 15220310.5 Αμβροξόλη 1750493 Φλουρβιπροφαίνη 0 Τερβουταλίνη 15155603 Καφεΐνη 1513558 Υδροχλωροθειαζίδη 0 Σαλβουταμόλη 13890111 Διβουκαΐνη 1327158.5 Φαινοβαρβιτάλη 0 7.1.3.1 Ανίχνευση ιόντων προσθήκης Κατά την εφαρμογή της τεχνικής πλήρους σάρωσης ανιχνεύτηκαν εκτός των πρωτονιωμένων ιόντων των ουσιών και διάφορα ιόντα προσθήκης. Ενδεικτικά, στο Σχήμα Π.Α.1 απεικονίζονται τα φάσματα μάζας ορισμένων υπό μελέτη ουσιών, όπου υποδεικνύονται τα ιόντα που αναγνωρίστηκαν. Στον πίνακα που ακολουθεί αναγράφονται τα είδη των ιόντων προσθήκης που ανιχνεύτηκαν και οι επιφάνειες κάτω από την καμπύλη των κορυφών των αντίστοιχων ιόντων. 87

Πίνακας 7.2 Διάφορα ιόντα προσθήκης που ανιχνεύτηκαν κατά την τεχνική της πλήρους σάρωσης Ουσία [M+K] + [M+CH3OH+H] + [M+2Na-H] + [M+NH4] + [M+Na] + Ουσία [M+K] + [M+CH3OH+H] + [M+2Na-H] + [M+NH4] + [M+Na] + Ακεταμινοφαίνη 1221403.5 Λιδοκαΐνη 380146 Ακετυλοσαλικυλικό οξύ 434482.5 Λισινοπρίλη 90134 Αλλοπουρινόλη 49622.5 Λοραζεπάμη 873662.5 Αλοπεριδόλη 94603 Μελοξικάμη 7072025.5 Αμβροξόλη Μετοκλοπραμίδη 351121 Αμινοφυλλίνη 6836 Μετρονιδαζόλη Αμιτριπτυλίνη 7421.5 Μεφαιναμικό οξύ 236595.5 Αμιωδαρόνη Ναπροξένη Αμοβαρβιτάλη 6376.5 Ναφαζολίνη Αμοξυκιλλίνη 44131 Νεοστιγμίνη Ανταζολίνη 17012 Νικοτινικό οξύ Απομορφίνη Νιφεδιπίνη 20200989 Ατενολόλη 1278169.5 Νορτριπτυλίνη 3388 Ατροπίνη 132149.5 Νορφλοξασίνη 2549074.5 Βαρφαρίνη 956640 Νοσκαπίνη 466.5 Βενζοϊκό οξύ Πιροξικάμη 772.5 Βιπεριδένη 52997.5 Πραζεπάμη 686 Βρωμοφαινυραμίνη 27683.5 Προμεθαζίνη 19178.5 Γκαμπαπεντίνη 1482423.5 Προπρανολόλη 125031.5 Γλιπιζίδη 1576600.5 Ραμιπρίλη 1144212.5 Δεσιπραμίνη 152399 Ρανιτιδίνη 119883.5 Διαζεπάμη 166141.5 Ρεσερπίνη 921772 Διαίθυλοστιλβεστρόλη Ριβοφλαβίνη 171895 Διαίθυλοστιλβεστρόλη 2272563.5 711667.5 Σαλβουταμόλη 117977 διπροπιονική Διβουκαΐνη 1462 Σιμετιδίνη 1247674 Δικλοφενάκη 669717 Σπιρονολακτόνη 3262943 Διλτιαζέμη Σουλφαμεθοξαζόλη 4260342.5 Διπυριδαμόλη 173452 Σουλφασαλαζίνη 1328493 Διφαινυδραμίνη 48681 Σουλφισοξαζόλη 5995946 Επινεφρίνη 13257 Τερβουταλίνη Εφεδρίνη Τετρακαΐνη 631725.5 Ζιπεπρόλη 434056 Τικλοπιδίνη 25797.5 Θειοκολχικοσίδη 349965.5 Τολβουταμίδη 11091338.5 Θεοφυλλίνη 2190428.5 Τριαμτερένη 191863 Ιμιπραμίνη 32958 Τριμεθοπρίμη 892444.5 Ινδομεθακίνη 241796 Τριμιπραμίνη 71434 Ισοπρεναλίνη 5686 Τριπρολιδίνη 159802.5 Καπτοπρίλη 4907762 Τριφλουπρομαζίνη Καρβαμαζεπίνη 2086891.5 Υδροξυζίνη 246501.5 Καρβιντόπα Υδροχλωροθειαζίδη 598397 207947 Καρισοπροδόλη 6988878.5 Φαινοβαρβιτάλη Καφεΐνη 12674 Φαινυλεφρίνη 88

Κετοκοναζόλη 1217685.5 Φλουοξετίνη 157515 Κετοπροφαίνη 1477544 Φλουρβιπροφαίνη 115433 Κεφουροξίμη 601 Χλωραμφαινικόλη 69864 Κλοβαζάμη 6283906.5 Χλωροθαλιδόνη 88520.5 Κλομιφαίνη Χλωρφαινυραμίνη 88251 Κλονιδίνη 613486.5 Benzethonium Chloride Κλοτριμαζόλη Cinchonidine 180696 Κολχικίνη 9090348.5 Ο Πίνακας 7.2 περιλαμβάνει τα ιόντα προσθήκης: [M+K] +, [M+CH3OH+H] +, [M+2Na-H] +, [M+NH4] + και [M+Na] +. Η πλειονότητα των ουσιών σχημάτισε ιόντα προσθήκης με κάλιο και μάλιστα σε κάποιες περιπτώσεις το σήμα τους είχε ισχυρότερη ένταση από το αντίστοιχο των πρωτονιωμένων ιόντων των ουσιών (αμοβαρβιτάλη, γλιπιζίδη, θειοκολχικοσίδη, θεοφυλλίνη, ινδομεθακίνη, καρισοπροδόλη, κετοπροφαίνη, νιφεδιπίνη, σουλφισοξαζόλη, σπιρονολακτόνη, τολβουταμίδη, χλωραμφαινικόλη, χλωροθαλιδόνη,). Επιπλέον, το ακετυλοσαλικυλικό οξύ, η διπροπιονική διαίθυλοστιλβεστρόλη, η φλουρβιπροφαίνη και η υδροχλωροθειαζίδη σχημάτισαν ιόντα προσθήκης με κάλιο, ενώ δεν έδωσαν πρωτονιωμένα ιόντα. Eπίσης, τα ιόντα [M+CH3OH+H] + και [M+NH4] + ήταν περιορισμένα, γεγονός που δεν αναμενόταν λόγω της σύστασης της κινητής φάσης (μεθανόλη και αμμωνία). Τέλος, ενώ ο σχηματισμός ιόντων προσθήκης με νάτριο είναι από τους πιο συνήθεις κατά τον ηλεκτροψεκασμό σε θετικό ιονισμό, ωστόσο δεν κυριάρχησε στις συγκεκριμένες συνθήκες. Έχει διαπιστωθεί εξάλλου ότι η προσθήκη μικρής ποσότητας αμμωνίας σε μεθανολικά διαλύματα περιορίζει σημαντικά τον σχηματισμό ιόντων προσθήκης με νάτριο κατά τον ηλεκτροψεκασμό. (40) 7.1.4 Δημιουργία του πίνακα δεδομένων Ο πίνακας δεδομένων που κατασκευάστηκε (πίν.π.β.1), αποτελείται από 58 μεταβλητές (στήλες) και 99 παρατηρήσεις (γραμμές), οι οποίες περιλαμβάνουν τις υπό μελέτη χημικές ενώσεις. Οι μεταβλητές αφορούν φυσικοχημικές ιδιότητες και δομικά χαρακτηριστικά των μελετούμενων ουσιών. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες συλλέχθηκαν από τρεις διαφορετικές πηγές (Πίνακας 7.3). Η επιλογή τους έγινε ώστε να σχετίζονται όσο το δυνατόν περισσότερο με τη διαδικασία ηλεκτροψεκασμού αλλά και με βάση προηγούμενες έρευνες. Ωστόσο, 89

σημαντικό ρόλο έπαιξε και η διαθεσιμότητά τους για το σύνολο των παρατηρήσεων. Τα δομικά χαρακτηριστικά ουσιαστικά αποτυπώνουν τη χημική δομή των ουσιών που μελετήθηκαν. Η τελευταία στήλη περιλαμβάνει τα σήματα των ουσιών, μετά την ολοκλήρωση των κορυφών των πρωτονιωμένων ιόντων τους. Πίνακας 7.3 Απεικόνιση τμήματος του πίνακα δεδομένων. Ενδεικτικά, είναι διαφορετικά χρωματισμένες οι φυσικοχημικές ιδιότητες (γαλάζιο), τα δομικά χαρακτηριστικά (κίτρινο) και το σήμα (πράσινο) των μελετούμενων ουσιών (Οι αριθμοί 1,2,3, μπροστά από τις φυσικοχημικές ιδιότητες, αναφέρονται στην προέλευσή τους: 1-EPI Suite, 2-DrugBank, 3- ACD/Labs) 1LogP 1Vapor Pressure 2MW 2W.Solubility 3LogP 3PSA benzene O atoms Response Acetaminophen Acetylsalicylic acid Ambroxol Aminophylline Amiodarone Οι φυσικοχημικές ιδιότητες των υπό μελέτη ουσιών προέρχονται από τις εξής πηγές: 1) EPI Suite, 2) DrugBank και 3) ACD/Labs (πίν.7.4). H επεξήγηση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων ακολουθεί παρακάτω (βλ.7.1.4.2). Το EPI (Estimation Programs Interface) Suite αποτελεί ένα σύνολο προγραμμάτων υπολογισμού φυσικοχημικών ιδιοτήτων και περιβαλλοντικής κατάληξης των χημικών ουσιών. Αναπτύχθηκε από την Αμερικανική Υπηρεσία EPA (Environmental Protection Agency), για τον έλεγχο των νέων χημικών ουσιών που δεν διαθέτουν πειραματικά δεδομένα. Το DrugBank είναι μία λεπτομερής βάση δεδομένων για μικρομοριακά (ΜΒ < 1.000) και βιοτεχνολογικά φάρμακα (πεπτίδια, πρωτεΐνες, νουκλεϊκά 90

οξέα). Κάθε καρτέλα φαρμάκου (DrugCard) παρέχει εκτενείς πληροφορίες σχετικά με τις ιδιότητες, τη δομή και τη δράση του φαρμάκου στον οργανισμό. Η ACD/Labs (Advanced Chemistry Development, Inc.) είναι μία εταιρεία λογισμικών χημείας, η οποία είναι αναγνωρισμένη παγκοσμίως για την πρόβλεψη φυσικοχημικών ιδιοτήτων και για την ανάπτυξη λογισμικών φασματοσκοπίας NMR. Πίνακας 7.4 Αναλυτική απεικόνιση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων ανά πηγή προέλευσης (οι ιδιότητες που εμφανίζονται περισσότερες από μία φορές υπολογίζονται με διαφορετική μέθοδο) EPI Suite 1logP 1BP 1MP 1VP 1.1WS 1.2WS 1logKoa 1HLC DrugBank 2MW 2WS 2.1logP 2.2logP 2logS 2PSA 2Refractivity 2Polarizability ACD/Labs 3logP 3logD (ph 0.1-14) 3pKa basic (strongest) 3pKa acidic (strongest) 3HBA 3HBD 3Refractive index 3MV 3Surface Tension 3BP 3PSA 3Refractivity 3Polarizability 3Enthalpy of vaporization 91

Τα % ποσοστά ιονισμού των βασικών και όξινων ομάδων υπολογίστηκαν (σύμφωνα με τις εξισώσεις 7.6 και 7.7) από τις τιμές pka των ισχυρότερων βασικών και όξινων ομάδων αντίστοιχα και για ph 10. Τα αποτελέσματα παρατίθενται στον Πίνακα Π.Β.2. Τα δομικά χαρακτηριστικά που συμπεριλήφθηκαν στον πίνακα δεδομένων ως μεταβλητές έλαβαν τιμές 0,1,2 κ.τ.λ. ανάλογα με την παρουσία του κάθε χαρακτηριστικού στο μόριο της χημικής ένωσης και περιλάμβαναν: διάφορες βασικές και όξινες χαρακτηριστικές ομάδες (όπως τις υπέδειξε για κάθε ουσία ξεχωριστά η ACD/Labs), δακτύλιους (βενζολικoύς, συμπυκνωμένους, συνολικούς), άτομα στοιχείων (αλογόνων, αζώτου, οξυγόνου), αριθμό πλευρικών αλυσίδων και αριθμό ατόμων άνθρακα των πλευρικών αλυσίδων, τα οποία αναφέρονται αναλυτικά στο παράδειγμα του πίνακα που ακολουθεί (πίν.7.5). Σχήμα 7.1 Δομή της αμιτριπτυλίνης Σχήμα 7.2 Δομή της αμιτριπτυλίνης και η βασική ομάδα όπως την υπέδειξε η ACD/Labs 92

Πίνακας 7.5 Δομικά χαρακτηριστικά της αμιτριπτυλίνης Βανζόλιο 2 Άτομα αζώτου 1 (Benzene) (N atoms) Συμπυκνωμένοι δακτύλιοι 3 Άτομα οξυγόνου 0 (Condensed rings) (O atoms) Σύνολο δακτυλίων 3 Αλογόνα 0 (All rings) (Halogens) Όξινες ομάδες (ACD/Labs) (Acidic groups) 0 Άτομα άνθρακα των πλευρικών αλυσίδων (C atoms on side chains) 5 Βασικές ομάδες (ACD/Labs) 1 Αριθμός πλευρικών αλυσίδων 1 (Basic groups) (No of side chains) Επαμφοτερίζουσες ομάδες (ACD/Labs) 0 (Amphoteric groups) Στους πίνακες που ακολουθούν οι υπό μελέτη ουσίες διαχωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες: 1) ουσίες που διαθέτουν μόνο βασικές ομάδες 2) ουσίες που διαθέτουν μόνο όξινες ομάδες 3) ουσίες που δεν έχουν ούτε βασικές ούτε όξινες ομάδες και 4) ουσίες που διαθέτουν και όξινες και βασικές ομάδες (συμπεριλαμβανόμενων και των επαμφοτεριζουσών ομάδων). Η διάκριση αυτή έγινε βάσει των ομάδων που ανιχνεύτηκαν από την ACD/Labs (με μπλε χρώμα οι βασικές ομάδες, με κόκκινο οι όξινες και με μοβ οι επαμφοτερίζουσες). 93

Πίνακας 7.6 Ουσίες με βασικές ομάδες Αμιτριπτυλίνη Αμιωδαρόνη Ανταζολίνη Βρωμοφαινυραμίνη Δεσιπραμίνη Διαζεπάμη Διλτιαζέμη Διφαινυδραμίνη Ιμιπραμίνη Κετοκοναζόλη Κλομιφαίνη Κλονιδίνη Κλοτριμαζόλη Ναφαζολίνη Νεοστιγμίνη Νιφεδιπίνη Νορτριπτυλίνη Νοσκαπίνη Πραζεπάμη Προμεθαζίνη 94

Ρανιτιδίνη Τετρακαίνη Τικλοπιδίνη Τριαμτερένη Τριμεθοπρίμη Τριμιπραμίνη Τριπρολιδίνη Τριφλουπρομαζίνη Φλουοξετίνη Χλωρφαινυραμίνη Benzethonium 95

Πίνακας 7.7 Ουσίες με όξινες ομάδες Ακετυλοσαλικυλικό οξύ Αλλοπουρινόλη Αμινοφυλλίνη Αμοβαρβιτάλη Βαρφαρίνη Βενζοϊκό οξύ Διαίθυλοστιλβεστρόλη Δικλοφενάκη Θεοφυλλίνη Ινδομεθακίνη Καπτοπρίλη Καρισοπροδόλη Κετοπροφαίνη Κεφουροξίμη Μελοξικάμη Ναπροξένη Ριβοφλαβίνη Τολβουταμίδη Υδροχλωροθειαζίδη Φαινοβαρβιτάλη 96

Φλουρβιπροφαίνη Χλωραμφαινικόλη Πίνακας 7.8 Ουσίες χωρίς βασικές και όξινες ομάδες Διαίθυλοστιλβεστρόλη διπροπιονική Καφεΐνη Κλοβαζάμη Σπιρονολακτόνη 97

Πίνακας 7.9 Ουσίες με βασικές και όξινες ομάδες (συμπεριλαμβανόμενων και των επαμφοτεριζουσών ομάδων) Ακεταμινοφαίνη Αλοπεριδόλη Αμβροξόλη Αμοξυκιλλίνη Απομορφίνη Ατενολόλη Ατροπίνη Βιπεριδένη Γκαμπαπεντίνη Γλιπιζίδη Διβουκαΐνη Διπυριδαμόλη Επινεφρίνη Εφεδρίνη Ζιπεπρόλη Θεικολχικοσίδη Ισοπρεναλίνη Καρβαμαζεπίνη Καρβιντόπα Κολχικίνη 98

Λιδοκαΐνη Λισινοπρίλη Λοραζεπάμη Μετοκλοπραμίδη Μετρονιδαζόλη Μεφεναμικό οξύ Νικοτινικό οξύ Νορφλοξασίνη Πιροξικάμη Προπρανολόλη Ραμιπρίλη Ρεσερπίνη Σαλβουταμόλη Σιμετιδίνη Σουλφαμεθοξαζόλη Σουλφασαλαζίνη Σουλφισοξαζόλη Τερβουταλίνη Υδροξυζίνη Φαινυλεφρίνη Χλωροθαλιδόνη Cinchonidine 99

Η ομαδοποίηση των ουσιών με βάση τον όξινο ή βασικό χαρακτήρα των λειτουργικών ομάδων των μορίων έγινε για να διευκολυνθεί η διερεύνηση του ρόλου της βασικότητας (στο διάλυμα) στην πρωτονίωση των ουσιών. Παράλληλα δίνονταν η δυνατότητα να μελετηθεί γενικότερα η σχέση των διαφόρων ομάδων (όξινων και βασικών) με τις υπόλοιπες μεταβλητές αλλά και η επίδρασή τους στην πρωτονίωση των ουσιών. Στα παρακάτω σχήματα απεικονίζονται μερικά παραδείγματα βασικών και όξινων λειτουργικών ομάδων που απαντώνται συχνά στα οργανικά μόρια καθώς και οι ιονισμένες τους μορφές. (41) Σχήμα 7.3 Συνήθεις όξινες οργανικές λειτουργικές ομάδες και οι ιονισμένες μορφές τους (συζυγείς βάσεις) 100

Σχήμα 7.4 Συνήθεις βασικές οργανικές λειτουργικές ομάδες και οι ιονισμένες μορφές τους (συζυγή οξέα) Σχήμα 7.5 Συνήθεις οργανικές λειτουργικές ομάδες που θεωρούνται ουδέτερες (υπό φυσιολογικές συνθήκες) 7.1.4.1. Μεταβλητές Χ-molecular descriptors Τόσο οι φυσικοχημικές ιδιότητες όσο και τα δομικά χαρακτηριστικά των χημικών ενώσεων, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως μεταβλητές Χ στον πίνακα δεδομένων, συμπεριλαμβάνονται στον γενικότερο όρο molecular descriptors (μοριακοί περιγραφείς). (42,43) Πρόκειται για 101

αριθμητικά μεγέθη τα οποία περιέχουν κωδικοποιημένες πληροφορίες που σχετίζονται με τη μοριακή δομή. Οι μοριακοί περιγραφείς μπορεί να είναι πειραματικές φυσικοχημικές ιδιότητες των μορίων ή θεωρητικά μεγέθη υπολογισμένα με μαθηματικούς τύπους ή αλγορίθμους. Τα τελευταία χρόνια επεξεργάζονται με μεθόδους στατιστικής, χημειομετρίας και χημειοπληροφορικής και χρησιμοποιούνται στη μοντελοποίηση διαφόρων ιδιοτήτων των χημικών ενώσεων, σε επιστημονικά πεδία όπως: η αναλυτική χημεία, η τοξικολογία, η φυσική χημεία, η φαρμακευτική χημεία και η περιβαλλοντική χημεία. Πιο συγκεκριμένα, οι μοριακοί περιγραφείς διακρίνονται σε δύο κύριες κατηγορίες: στους πειραματικούς, οι οποίοι γενικότερα αποτελούνται από τις φυσικοχημικές ιδιότητες (logp, μοριακή διαθλασιμότητα, πολωσιμότητα κ.α.) και στους θεωρητικούς, οι οποίοι προκύπτουν από τη διαφορετική συμβολική απεικόνιση του μορίου και μπορούν περαιτέρω να ταξινομηθούν σύμφωνα με τους τύπους της μοριακής απεικόνισης. Οι κύριες κατηγορίες των θεωρητικών μοριακών περιγραφέων είναι: α) 0-D περιγραφείς, όπως ο αριθμός ατόμων, το μοριακό βάρος κ.ά. β) 1D-περιγραφείς, όπως διάφορες λειτουργικές ομάδες γ) 2-D ή τοπολογικοί περιγραφείς, όπως οι δεσμοί με δυνατότητα ελεύθερης περιστροφής (Freely Rotatable Bonds, FRB) δ) 3-D ή γεωμετρικοί περιγραφείς, όπως η πολική επιφάνεια (PSA) και ε) 4-D περιγραφείς. 7.1.4.2. Περιγραφή-επεξήγηση των μεταβλητών το μοριακό βάρος (Molecular Weight, MW) Το μοριακό βάρος (44) είναι ο αριθμός που δείχνει πόσες φορές είναι μεγαλύτερη η μάζα του μορίου από το 1/12 της μάζας του ατόμου 12 C. Περιγράφει με τον πιο απλό τρόπο το μέγεθος των μορίων. Το μέσο μοριακό βάρος (Average Molecular Weight, MW) ορίζεται ως το μοριακό βάρος σε g/mol. ο μοριακός όγκος (Molecular or Molar Volume, MV) Ο μοριακός όγκος (45) ορίζεται ως ο όγκος που καταλαμβάνει ένα γραμμομόριο της χημικής ουσίας σε δεδομένη θερμοκρασία και πίεση. 102

ο λογάριθμος του συντελεστή μερισμού (logp) και κατανομής (logd) οκτανόλης/νερού Οι συντελεστές logp και logd (46) αποτελούν εκφράσεις της λιποφιλικότητας και χρησιμοποιούνται ευρέως για την εκτίμηση διαφόρων ιδιοτήτων των φαρμάκων όπως: η διείσδυση μεμβρανών και η διαπερατότητα, συμπεριλαμβανομένων της γαστρεντερικής απορρόφησης, της διέλευσης του αιματοεγκεφαλικού φραγμού και συσχετίσεων με φαρμακοκινητικές ιδιότητες. Οι δύο κύριες συνιστώσες της λιποφιλικότητας είναι το μοριακό μέγεθος και η ικανότητα δημιουργίας δεσμών υδρογόνου (H-bonding). Η λιποφιλικότητα (Lipophilicity) αντιπροσωπεύει τη συγγένεια ενός μορίου ή γενικότερα μιας χημικής οντότητας για ένα λιπόφιλο περιβάλλον. Συνήθως εκτιμάται από τη συμπεριφορά κατανομής του σε ένα διφασικό σύστημα, είτε υγρού-υγρού (π.χ. 1- οκτανόλη-νερό), είτε στερεού-υγρού (π.χ. κατακράτηση σε σύστημα HPLC αντίστροφης φάσης). Η υδροφοβικότητα (Hydrophobicity) είναι η ένωση των μη πολικών ομάδων ή μορίων σε ένα υδατικό περιβάλλον, η οποία προκύπτει από την τάση του νερού να αποκλείει μη πολικά μόρια. Η εγγενής λιποφιλικότητα (Intrinsic Lipophilicity, P) μίας ουσίας αναφέρεται στην ισορροπία μόνο της μη ιονισμένης (ουδέτερης) ουσίας μεταξύ της υδατικής και της οργανικής φάσης. Το εναπομείναν κομμάτι της συνολικής ισορροπίας, δηλαδή η συγκέντρωση της ιονισμένης ουσίας στην υδατική φάση, εξαρτάται από το ph της υδατικής φάσης και την οξύτητα ή βασικότητα (pka) της ουσίας. Το συνολικό ποσοστό της ουσίας, ιονισμένης και μη ιονισμένης, μεταξύ των φάσεων αποδίδεται από τον συντελεστή κατανομής (D), ο οποίος περιγράφει τη λιποφιλικότητα μίας ουσίας σε δεδομένο ph λαμβάνοντας υπόψη και την εγγενή της λιποφιλικότητα αλλά και τον βαθμό ιονισμού της. Για ένα μονοπρωτικό οξύ (ΗΑ) ο συντελεστής κατανομής (D) ορίζεται ως εξής: D = [HA]organic/([HA]aqueous + [A - ]aqueous) (7.1) όπου [ΗΑ] και [A - ] παριστάνουν τις συγκεντρώσεις του οξέος στη μη ιονισμένη και ιονισμένη μορφή, αντίστοιχα. Ο ιονισμός της ουσίας στο νερό ορίζεται από τη σταθερά διαστάσεώς (Κa) της ως εξής: Ka = [H + ] [A - ] / [HA] (7.2) και η οποία είναι γνωστή ως η εξίσωση Henderson-Hasselbach. Ο συνδυασμός των εξισώσεων 7.1 και 7.2 δίνει την εξίσωση logd για μονοπρωτικά οργανικά οξέα (HA): 103

logd = logp log(1 + 10 ph-pka ) (7.3) ενώ για μονοπρωτικές οργανικές βάσεις (ΒΗ + ) η αντίστοιχη εξίσωση είναι: logd = logp log(1+10 pka-ph ) (7.4) Για ουσίες με πολλαπλές ιονίσιμες ομάδες η σχέση μεταξύ logp και logd, καθώς και του logd ως συνάρτηση του ph, γίνεται πιο πολύπλοκη. Ουσίες για τις οποίες Ρ > 1 ή logp > 0 είναι λιπόφιλες (Lipophilic), ενώ ουσίες για τις οποίες P < 1 ή logp < 0 είναι υδρόφιλες (Hydrophilic). Πιο ευρέως χρησιμοποιούμενος είναι ο συντελεστής μερισμού οκτανόλης/νερού (συμβολίζεται με logkow ή και logp, όταν δεν δίνεται άλλη διευκρίνιση). ο λογάριθμος του συντελεστή μερισμού οκτανόλης/αέρα (logkoa) Ο συντελεστής μερισμού οκτανόλης/αέρα (47) είναι ο λόγος της συγκέντρωσης της ουσίας στην οκτανόλη προς τη συγκέντρωση της ουσίας στον αέρα. Χρησιμοποιείται κυρίως η λογαριθμική του μορφή (logkoa). Μαζί με τη σταθερά HLC και το logp αποτελούν σημαντικές φυσικοχημικές παραμέτρους που βρίσκουν εφαρμογή στη φαρμακευτική χημεία και την περιβαλλοντική έρευνα. η σταθερά HLC (Henry Law Constant) Η σταθερά HLC (47) είναι ο λόγος της συγκέντρωσης της χημικής ουσίας στην αέρια φάση προς τη συγκέντρωση της ουσίας στην υδατική φάση σε ισορροπία. Υποδεικνύει την πτητικότητα της ουσίας από το νερό, καθώς και την πιθανή περιβαλλοντική κατανομή της. Οι τιμές HLC που ακολουθούν παρέχουν πληροφορίες για την πτητικότητα των ουσιών από το νερό. HLC > 10-1 πολύ πτητική ουσία HLC > 10-1 - 10-3 πτητική HLC > 10-3 -10-5 μέτρια πτητική HLC > 10-5 - 10-7 ελάχιστα πτητική HLC < 10-7 μη πτητική ο λογάριθμος της σταθεράς διαστάσεως του οξέος (pka) και το επί τοις εκατό (%) ποσοστό ιονισμού Η σταθερά διαστάσεως του οξέος Ka (48) εκφράζει την τάση του μορίου ή ιόντος να 104

κρατήσει ένα πρωτόνιο (Η + ) στο κέντρο ή στα κέντρα ιονισμού του. Σχετίζεται με την ικανότητα ιονισμού μίας χημικής ομάδας-οντότητας και είναι βασική ιδιότητα που καθορίζει την χημική και βιολογική συμπεριφορά. Oι περισσότερες χημικές ουσίες περιέχουν λειτουργικές ομάδες που ενδέχεται να χάνουν ή να κερδίζουν ένα πρωτόνιο ή πρωτόνια κάτω από καθορισμένες συνθήκες. Εάν ένα μόριο ιονίζεται εύκολα, αυτό μεταφέρεται στο υδατικό διάλυμα, γιατί το νερό είναι ένας πολύ πολικός διαλύτης. Εάν το μόριο δεν ιονίζεται εύκολα, τότε θα παραμείνει στον μη πολικό διαλύτη π.χ. οκτανόλη ή κυκλοεξάνιο. Επομένως, από βιολογικής απόψεως η pka είναι σημαντική, γιατί καθορίζει εάν ένα μόριο θα παραληφθεί από τα υδατικά συστατικά των ιστών ή από τις λιπιδικές μεμβράνες. Επίσης, συνδέεται στενά με τις έννοιες του ph και του logd. Η επίδραση της θερμοκρασίας στην pka δεν μπορεί να προβλεφθεί με βεβαιότητα. Για πολλές αζωτούχες βάσεις, η pka μειώνεται κατά 0,1-0,3 με κάθε 10 ο C αύξηση της θερμοκρασίας, ενώ για μερικά καρβοξυλικά οξέα η pka παραμένει αμετάβλητη σε μικρές μεταβολές της θερμοκρασίας. Σύμφωνα με τον ορισμό των Bronsted-Lowry για τα οξέα και τις βάσεις (η βάση ορίζεται ως δέκτης και το οξύ ως δότης πρωτονίου) η σταθερά Ka εκφράζει το λόγο των συγκεντρώσεων για την αντίδραση: acid + base conj. acid + conj. base Για μια αντίδραση οξέος-βάσεως, όπου το νερό θεωρείται η βάση, η Κa είναι: όπου η συγκέντρωση του νερού θεωρείται σταθερή και ενσωματώνεται στον ορισμό της Ka. Επειδή η Ka έχει μεγάλο εύρος τιμών, χρησιμοποιείται η λογαριθμική της μορφή pka (pka= - log(ka)). Ωστόσο, είναι σημαντικό να διευκρινιστεί ότι η pka για μία βάση είναι στην πραγματικότητα η pka του συζυγούς οξέος (Conjugate Acid, BH + ) της βάσης και πρέπει να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή κατά την ερμηνεία των τιμών pka. Με κατάλληλη προσαρμογή του ph και χρησιμοποιώντας την τιμή pka μιας ουσίας, μπορεί να επιτευχθεί μέγιστη διαλυτότητα στο νερό (ιονισμένη μορφή της ουσίας) ή μέγιστη διαλυτότητα σε μη πολικό μέσο (μη ιονισμένη μορφή). 105

Βάσει της ιονικής τους ισχύς, τα οξέα διαιρούνται σε δύο τύπους: ΗΑ και ΒΗ +. Σύμφωνα με τις παρακάτω εξισώσεις, τα ΗΑ οξέα μεταβαίνουν από μη ιονισμένα οξέα σε ιονισμένες συζυγείς βάσεις, ενώ αντίθετα, τα ΒΗ + οξέα μεταβαίνουν από ιονισμένα (πολικά) οξέα σε μη ιονισμένες (μη πολικές) συζυγείς βάσεις: Γενικότερα, τα σημαντικότερα ΗΑ οξέα στη φαρμακευτική περιλαμβάνουν: τα ανόργανα οξέα (π.χ. HCl, H2SO4), ενόλες (βαρβιτουρικά, υδαντοίνες), καρβοξυλικά οξέα (σαλικυλικά οξέα), αμίδια (σουλφοναμίδια) και ιμίδια (σακχαρίνη). Τα πράγματα είναι πιο απλά για τα σημαντικότερα στη φαρμακευτική ΒΗ + οξέα, αφού είναι όλα πρωτονιωμένες αμίνες (π.χ. υδροχλωρική εφεδρίνη). Το επί τοις εκατό ποσοστό ιονισμού ενός ΗΑ οξέος υπολογίζεται από την εξίσωση: ενώ ενός BH + οξέος από την εξίσωση: Όταν ph = pka η ουσία είναι 50% ιονισμένη. Αύξηση κατά 1 μονάδα ph από την τιμή της pka (αύξηση της βασικότητας) προκαλεί αύξηση του ιονισμού ενός ΗΑ οξέος, σε ποσοστό 90,9%, στη μορφή της ιονισμένης συζυγούς βάσης, αλλά προκαλεί τη μείωση του ιονισμού ενός ΒΗ + οξέος, σε ποσοστό μόνο 9,1%. Αύξηση κατά 2 μονάδες ph προκαλεί σχεδόν πλήρη ιονισμό (99%) του ΗΑ οξέος, ενώ προκαλεί μετατροπή του ΒΗ + οξέος στη μορφή της μη ιονικής βάσης (0,99%). Ακριβώς το αντίθετο συμβαίνει όταν αυξάνεται η οξύτητα του διαλύματος σχετικά με την pka της ουσίας. Τα αποτελέσματα αυτά συνοψίζονται στον παρακάτω πίνακα. 106

Πίνακας 7.10 Ποσοστό ιονισμού (%) σε σχέση με την pka Ιονισμός (%) ΗΑ οξέα ΒΗ + οξέα pka 2 ph μονάδες 0,99 99,0 pka -1 ph μονάδα 9,1 90,9 pka = ph 50,0 50,0 pka +1 ph μονάδα 90,9 9,1 pka + 2 ph μονάδες 99,0 0,99 Για τον χαρακτηρισμό μίας χημικής ουσίας ως ασθενές ή ισχυρό οξύ/βάση χρησιμοποιείται ο παρακάτω γενικός κανόνας: pka < 2: ισχυρό οξύ, η συζυγής βάση δεν έχει σημαντικές βασικές ιδιότητες στο νερό pka 4-6: ασθενές οξύ, ασθενής συζυγής βάση pka 8-10: πολύ ασθενές οξύ, η συζυγής βάση γίνεται ισχυρότερη pka >12: ουσιαστικά δεν έχει όξινες ιδιότητες στο νερό, ισχυρή συζυγής βάση ο αριθμός των δοτών ή δεκτών δεσμού υδρογόνου (Number of HBD, HBA) Ο δεσμός υδρογόνου είναι ο δεσμός που προκύπτει από την αλληλεπίδραση μεταξύ του υδρογόνου και ενός ατόμου δότη ηλεκτρονίων, όπως το οξυγόνο και το άζωτο. Οι διάφορες λειτουργικές ομάδες σε ένα μόριο διακρίνονται σε δότες δεσμού υδρογόνου (Hydrogen Bond Donors) και δέκτες δεσμού υδρογόνου (Hydrogen Bond Acceptors). (46) Οι δότες έχουν ισχυρούς ηλεκτρονιόφιλους υποκαταστάτες, όπως -OH, -NH, -SΗ και -CH, ενώ οι δέκτες έχουν διάφορες ομάδες όπως -PO, -SO, -CO, -N, -O, -S και -F. Ακόμη και ένα σύστημα πλούσιο σε π ηλεκτρόνια μπορεί να θεωρηθεί ως δέκτης δεσμού υδρογόνου. 107

Κάποιες ομάδες παρουσιάζουν ταυτόχρονα και συμπεριφορά δότη και δέκτη, όπως οι -ΟΗ και -ΝΗ. Ένα μέτρο της ικανότητας δημιουργίας δεσμού υδρογόνου ενός μορίου αποτελεί ο αριθμός των πιθανών δοτών και δεκτών δεσμού υδρογόνου. Πιο συγκεκριμένα, οι δότες υπολογίζονται ως ο αριθμός των ατόμων υδρογόνου που συνδέονται με άτομα οξυγόνου και αζώτου και οι δέκτες ως ο αριθμός των ατόμων οξυγόνου και αζώτου στο μόριο. η διαλυτότητα στο νερό (Water Solubility, WS) Eίναι η ποσότητα της ουσίας που διαλύεται σε ορισμένη ποσότητα νερού, σε συγκεκριμένη θερμοκρασία και πίεση. (47) Υποδεικνύει την κατανομή της χημικής ουσίας στα διάφορα διαμερίσματα, καθώς και τη συμπεριφορά των φαρμάκων (απορρόφηση, κατανομή και συγκέντρωση στο σημείο της φαρμακολογικής δράσης). Ορισμένες φορές χρησιμοποιείται και η λογαριθμική της μορφή logs. Ακολουθεί μία γενική κατάταξη των ουσιών βάσει των τιμών διαλυτότητας WS (mg/l). WS > 10.000 πολύ διαλυτή ουσία WS > 1.000-10.000 διαλυτή WS >100-1.000 μέτρια διαλυτή WS > 0.1-100 ελάχιστα διαλυτή WS < 0.1 αμελητέα διαλυτή η πολική επιφάνεια (Polar Surface Area, PSA) Η πολική επιφάνεια (46) χαρακτηρίζει το πολικό τμήμα της επιφάνειας του μορίου και ορίζεται απλά ως το τμήμα της επιφάνειας που αντιστοιχεί στα άτομα οξυγόνου και αζώτου, καθώς και στα άτομα υδρογόνου που είναι συνδεδεμένα με τα παραπάνω άτομα. Η πολική επιφάνεια μαζί με το συντελεστή μερισμού οκτανόλης-νερού αποτελούν τις πιο σημαντικές παραμέτρους για το χαρακτηρισμό των ιδιοτήτων μεταφοράς των φαρμάκων. Επίσης, έχει αποδειχθεί ότι παρέχει πολύ καλές συσχετίσεις με την εντερική απορρόφηση, την διαπέραση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού και με πολλά άλλα χαρακτηριστικά των φαρμάκων. Η πολική επιφάνεια φαίνεται ότι εμπεριέχει έναν βέλτιστο συνδυασμό ιδιοτήτων: την ικανότητα σχηματισμού δεσμού υδρογόνου, την πολικότητα και τη διαλυτότητα, χαρακτηριστικά που παίζουν σημαντικό ρόλο στη διαπέραση μεμβρανών. 108

η μοριακή διαθλασιμότητα (Molar refractivity, MR) Η μοριακή διαθλασιμότητα (43) περιέχει πληροφορίες και για τον μοριακό όγκο και για την πολωσιμότητα. Ορίζεται από την εξίσωση Lorenz-Lorentz: MR = (7.8) όπου MW είναι το μοριακό βάρος, ρ η πυκνότητα του υγρού (ο λόγος MW/ρ αντιστοιχεί στο μοριακό όγκο) και n ο δείκτης διάθλασης του υγρού. Είναι ένα μέτρο της ολικής πολωσιμότητας του μορίου της ουσίας και συνδέεται στενά με τον μοριακό όγκο και με τις δυνάμεις διασποράς London, οι οποίες παίζουν σημαντικό ρόλο στις αλληλεπιδράσεις φαρμάκου-υποδοχέα. ο δείκτης διάθλασης (Refractive index) Ο δείκτης διάθλασης (45) ορίζεται ως ο λόγος της ταχύτητας του φωτός στο κενό προς την ταχύτητα του φωτός στην ουσία του ενδιαφέροντος. Χρησιμοποιείται ως δείκτης της καθαρότητας των οργανικών ουσιών και σχετίζεται με πολλές ηλεκτρικές και μαγνητικές ιδιότητες, όπως η πολωσιμότητα, η επιφανειακή τάση, η πυκνότητα και το σημείο ζέσεως. η πολωσιμότητα (Polarizability) Η πολωσιμότητα (45) είναι η ηλεκτρική διπολική ροπή που επάγεται σε ένα σύστημα, όπως ένα άτομο ή ένα μόριο, από ένα ηλεκτρικό πεδίο μοναδιαίας ισχύος. Εμπεριέχει πληροφορίες για την κατανομή του φορτίου στο μόριο. το σημείο ζέσεως (Boiling Point, BP) Το σημείο ζέσεως ενός υγρού (45) είναι η θερμοκρασία στην οποία το υγρό και ο ατμός βρίσκονται σε ισορροπία μεταξύ τους σε μία καθορισμένη πίεση. Ως εκ τούτου, το σημείο ζέσεως είναι η θερμοκρασία στην οποία η τάση ατμών του υγρού είναι ίση με την πίεση που εφαρμόζεται στο υγρό. το σημείο τήξεως (Melting Point, MP) Το σημείο τήξεως ενός στερεού (47) είναι η θερμοκρασία στην οποία αλλάζει κατάσταση και από στερεό γίνεται υγρό, υπό ατμοσφαιρική πίεση. Στο σημείο τήξεως η στερεή και η υγρή φάση υπάρχουν σε ισορροπία. Το σημείο τήξεως μιας ουσίας εξαρτάται από την 109

πίεση. η τάση ατμών (Vapor Pressure, VP) Η τάση ατμών (45) είναι η πίεση κορεσμού που ασκείται από τους ατμούς που βρίσκονται σε ισορροπία με την αντίστοιχη υγρή ή στερεή μορφή τους. Αποτελεί μία από τις πιο σημαντικές φυσικές ιδιότητες ενός υγρού και υπεισέρχεται σε πολλούς θερμοδυναμικούς υπολογισμούς. η επιφανειακή τάση (Surface Tension) Η επιφανειακή τάση (45) είναι ιδιότητα των υγρών που απορρέει από τις ασύμμετρες μοριακές συνεκτικές δυνάμεις που δρουν στην επιφάνεια ή κοντά σε αυτήν. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα η επιφάνεια να συστέλλεται και να αποκτά ιδιότητες που μοιάζουν με εκείνες μίας τεντωμένης ελαστικής μεμβράνης. η ενθαλπία ατμοποίησης (Enthalpy of Vaporization, ΔΗvap) Η ενθαλπία ατμοποίησης (49) είναι η μεταβολή της ενθαλπίας που απαιτείται, για να μετατραπεί μία ορισμένη ποσότητα ουσίας από την υγρή στην αέρια κατάσταση, σε ορισμένη πίεση, συνήθως ατμοσφαιρική (η ενθαλπία εκφράζει το ολικό ποσό θερμότητας που περιέχει ένα θερμοδυναμικό σύστημα). Η ενθαλπία ατμοποίησης εξαρτάται από τη θερμοκρασία. 7.1.5 Στατιστική ανάλυση των δεδομένων (με το πολυπαραμετρικό πρόγραμμα SIMCA-P 9.0, Umetrics) Το SIMCA-P είναι λογισμικό που αναπτύχθηκε από την εταιρεία Umetrics (Sweden) και χρησιμοποιείται κυρίως για την εφαρμογή των μεθόδων PCA και PLS. Χαρακτηρίζεται ως ένα φιλικό προς τον χρήστη λογισμικό, βασισμένο στα Windows. (50) Οι λειτουργίες των μοντέλων θεωρούνται σχετικά εύκολες στον χειρισμό και τα αποτελέσματα μπορούν να απεικονιστούν με διαγράμματα και πίνακες, τα οποία ουσιαστικά είναι επεξηγήσεις αυτών των μοντέλων. Επί του παρόντος, αποτελεί βασικό εργαλείο για τους ερευνητές τόσο στην ανάλυση PLS, όσο και σε πολλά πεδία της επιστήμης και της τεχνολογίας. 110

Κεφάλαιο 8o Εφαρμογή των μεθόδων πολυπαραμετρικής ανάλυσης 8.1 Εφαρμογή της μεθόδου PCA - Γενική επισκόπηση Αρχικά, οι μεταβλητές επεξεργάστηκαν με κεντράρισμα και κλιμάκωση UV, οι οποίες αποτελούν και προεπιλεγμένες επεξεργασίες στο SIMCA-P 9. Η απευθείας εφαρμογή της μεθόδου PCA στο σύνολο των δεδομένων (μεταβλητές Χ και Υ), έδωσε ένα μοντέλο 5 συνιστωσών με τιμές στατιστικών συντελεστών: R 2 X= 0,774 και Q 2 X= 0,657 (σχ.8.1). Protonation.M1 (PCA-X), PCA for overview R2X(cum) Q2(cum) 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 Comp[1] Comp[2] Comp[3] Comp[4] Comp[5] Comp No. Σχήμα 8.1 Διάγραμμα σύνοψης της εφαρμογής του PCA μοντέλου (Summary of Fit of PCA model) Το διάγραμμα t1/t2 των scores δείχνει διασπορά των ουσιών, χωρίς ευδιάκριτη ομαδοποίηση, ενώ μερικές ουσίες (αμιωδαρόνη, αμοξυκιλλίνη, διπυριδαμόλη, θειοκολχικοσίδη, κεφουροξίμη, ρεσερπίνη) αποκλίνουν ελαφρά από τις υπόλοιπες (σχ.8.2). 111

Protonation.M1 (PCA-X), PCA for overview t[1]/t[2] 12 thiocolchi 10 dipyridamo reserpine t[2] 8 6 4 2 0-2 -4 carbidopa cefuroxime glipizide amoxycilli riboflavin lisinopril ramipril sulfasalaz ketoconazo colchicine chlorthali piroxicam meloxicam noscapine diltiazem benzethoni chloramphe spironolac norfloxaci triamteren zipeprol indomethac hydrochlor hydroxyzin nifedipine dibucaine atenolol cimetidine ranitidine trimethopr lorazepamhaloperido sulfametho sulfisoxaz w arfarin phenobarbi metoclopra ambroxol cinchonidiclobazam prazepam clotrimazo amobarbita apomorphin salbutamol aminophyll atropine diclofenac biperiden captopril antazoline carbamazep diazepam diethylsti isoprenali terbutalinneostigmin ketoprofen propranolo tolbutamid mefenamic trifluprom epinephrin theophylli carisoprod naproxen tetracaine promethazi caffeine flurbiprof bromphenir triprolidi trimiprami desipramin nortriptyl imipramine amitriptyl metronidaz chlorpheni allopurinogabapentin lidocaine fluoxetine acetylsali acetaminop naphazolin phenylephr clonidine diphenhydrticlopidin amiodarone clomiphene diethylsti -6 nicotinic ephedrine benzoic ac -8-12 -11-10 -9-8 -7-6 -5-4 -3-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 t[1] Σχήμα 8.2 Διάγραμμα t1/t2 των scores του PCA μοντέλου Τα διαγράμματα συνεισφοράς (Contribution Plot) της θειοκολχικοσίδης και της ρεσερπίνης απεικονίζουν τις διαφορές που παρουσιάζουν οι συγκεκριμένες ουσίες με το μέσο όρο για όλες τις μεταβλητές (σχ.8.3 και 8.4). Ωστόσο, οι ουσίες που αποκλίνουν δεν θα εξαιρεθούν από το σύνολο των δεδομένων, διότι η απόκλιση είναι μικρή και επιπλέον δεν γνωρίζουμε τη συμπεριφορά τους κατά την εφαρμογή του μοντέλου PLS. Protonation.M1 (PCA-X), PCA for overview Score Contrib(Obs thiocolchicoside - Average), Weight=p1p2 10 Score Contrib(Obs thiocolchicoside - Average), Weight=p1p2 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0-1 -2 1logP 1BP 1MP 1VP 1.1WS 1.2WS 1logKoa 1HLC 2MW 2WS 2.1logP 2.2logP 2logS 2PSA 2Refractiv 2Polarizab 3logP 3logD(pH0. 3logD(pH1) 3logD(pH2) 3logD(pH3) 3logD(pH4) 3logD(pH5) 3logD(pH6) 3logD(pH7) 3logD(pH8) 3logD(pH9) 3logD(pH10 3logD(pH11 3logD(pH12 3logD(pH13 3logD(pH14 3pKa bas(s 3pKa acid( 3bas %Ioni 3acid %ion 3HBA 3HBD 3Refr.inde 3MV 3Surf.Tens 3BP 3PSA 3Refractiv 3Polarizab 3Enthalpy benzene all rings condens ri 3acidic gr 3basic gro 3amphoteri N atoms O atoms halogens C atoms on No of side Response Var ID (Primary) Σχήμα 8.3 Διάγραμμα συνεισφοράς της θειοκολχικοσίδης 112

Protonation.M1 (PCA-X), PCA for overview Score Contrib(Obs reserpine - Average), Weight=p1p2 Score Contrib(Obs reserpine - Average), Weight=p1p2 5 4 3 2 1 0-1 -2 1logP 1BP 1MP 1VP 1.1WS 1.2WS 1logKoa 1HLC 2MW 2WS 2.1logP 2.2logP 2logS 2PSA 2Refractiv 2Polarizab 3logP 3logD(pH0. 3logD(pH1) 3logD(pH2) 3logD(pH3) 3logD(pH4) 3logD(pH5) 3logD(pH6) 3logD(pH7) 3logD(pH8) 3logD(pH9) 3logD(pH10 3logD(pH11 3logD(pH12 3logD(pH13 3logD(pH14 3pKa bas(s 3pKa acid( 3bas %Ioni 3acid %ion 3HBA 3HBD 3Refr.inde 3MV 3Surf.Tens 3BP 3PSA 3Refractiv 3Polarizab 3Enthalpy benzene all rings condens ri 3acidic gr 3basic gro 3amphoteri N atoms O atoms halogens C atoms on No of side Response Var ID (Primary) Σχήμα 8.4 Διάγραμμα συνεισφοράς της ρεσερπίνης Το διάγραμμα t1/t2 των scores αποτελεί τον «χάρτη» των ουσιών (σχ.8.2). Οι ουσίες που βρίσκονται κοντά η μία στην άλλη έχουν παρόμοιες ιδιότητες, ενώ αυτές που βρίσκονται μακριά είναι ανόμοιες, όσον αφορά τα φυσικοχημικά-δομικά χαρακτηριστικά και το σήμα τους. Παρόλα αυτά, όπως φαίνεται και από το διάγραμμα t1/t2 (σχ.8.5), μετά τον χρωματισμό των ουσιών βάσει του διαχωρισμού τους (βλ.7.1.4) σε ουσίες που διαθέτουν μόνο βασικές ομάδες (μπλε χρώμα, class 1), σε ουσίες που διαθέτουν μόνο όξινες ομάδες (κόκκινο χρώμα, class 2), σε ουσίες που δεν έχουν ούτε βασικές ούτε όξινες ομάδες (μαύρο χρώμα, class 3) και σε ουσίες που διαθέτουν και όξινες και βασικές ομάδες (γαλάζιο χρώμα, class 4), δεν επιτυγχάνεται ομαδοποίηση. Σε συνδυασμό, όμως, με το διάγραμμα των φορτίων p1/p2 (σχ.8.6) μπορεί να δοθεί μία ερμηνεία των τάσεων που παρατηρούνται στο διάγραμμα των scores. 113

Protonation.M9 (PCA-X), PCA classes t[1]/t[2] Colored according to classes in M9 No Class Class 1 Class 2 Class 3 Class 4 thiocolchi 12 10 dipyridamo reserpine 8 6 amoxycilli cefuroxime riboflavin lisinopril glipizide sulfasalaz ramipril ketoconazo t[2] 4 2 0-2 -4 carbidopa colchicine chlorthali piroxicam meloxicam noscapine diltiazem spironolac benzethoni norfloxaci chloramphe triamteren zipeprol indomethac nifedipine dibucaine hydrochlor hydroxyzin atenolol ranitidine trimethopr lorazepam haloperido cimetidine sulfisoxaz w arfarin sulfamethophenobarbimetoclopra ambroxol cinchonidi clobazam prazepam clotrimazo amobarbita apomorphin salbutamol diclofenac biperiden neostigmin aminophyll atropine diazepam diethylsti ketoprofentolbutamid trifluprom isoprenali terbutalin propranolo carbamazepmefenamic antazoline captopril theophylli carisoprod naproxen promethazi trimiprami epinephrin tetracainetriprolidi bromphenir desipramin nortriptyl imipramine flurbiprof amitriptyl metronidaz caffeine lidocaine naphazolin chlorpheni fluoxetine allopurino gabapentin acetaminop clonidine diphenhydr ticlopidin phenylephr acetylsali amiodarone clomiphene diethylsti -6 nicotinic ephedrine benzoic ac -8-12 -11-10 -9-8 -7-6 -5-4 -3-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 t[1] Σχήμα 8.5 Διάγραμμα t1/t2 των scores του PCA μοντέλου μετά τον διαχωρισμό των ουσιών βάσει των βασικών-όξινων ομάδων τους Protonation.M1 (PCA-X), PCA for overview p[1]/p[2] X 0,30 0,20 2PSA 3PSA 3HBA O atoms 1logKoa 1MP 3Enthalpy 3BP 1BP 2MW 2Refractiv 2Polarizab 3Refractiv 3Polarizab 3MV all rings p[2] 0,10 3HBD 3Surf.Tens 3acidic gr N atoms 3amphoteri 1VP No of side condens ri 0,00 1.2WS 2WS 1.1WS 3acid %ion 3Refr.inde 3bas %Ioni 3basic C atoms groon 3pKa halogens acid( Response 1HLC 3logD(pH5) 3logD(pH6) benzene 3logD(pH4) 3logD(pH7) 3logD(pH0. 3logD(pH1) 3logD(pH2) 3logD(pH3) 3logD(pH8) 1logP 2.1logP 3logP 3logD(pH9) 3logD(pH10 3logD(pH11 3logD(pH12 3logD(pH13 3logD(pH14 2.2logP -0,10 2logS 3pKa bas(s -0,20-0,10 0,00 0,10 0,20 p[1] Σχήμα 8.6 Διάγραμμα p1/p2 των φορτίων του PCA μοντέλου 114

Το διάγραμμα p1/p2 (σχ.8.6) δείχνει τη συσχέτιση των μεταβλητών, καθώς και τις μεταβλητές που κυριαρχούν και επηρεάζουν περισσότερο το μοντέλο. Έτσι, οι μεταβλητές που δίνουν παραπλήσιες πληροφορίες ομαδοποιούνται μαζί και συσχετίζονται θετικά. Ενδεικτικά αναφέρονται η ομάδα των μεταβλητών που περιγράφει τη λιποφιλικότητα των ουσιών (logp και logd) και η ομάδα των μεταβλητών που περιγράφει την υδατοδιαλυτότητα (WS και logs). Από την άλλη πλευρά, μεταβλητές που έχουν αρνητική συσχέτιση βρίσκονται σε διαγωνίως αντίθετα τεταρτημόρια. Επιπλέον, η απόσταση της μεταβλητής από το κέντρο του διαγράμματος (Origin) υποδηλώνει την ισχύ της επίδρασης που έχει η μεταβλητή στο μοντέλο. Παρατηρείται λοιπόν ότι, για την πρώτη συνιστώσα, οι μεταβλητές που κυριαρχούν και συσχετίζονται θετικά είναι οι logp, logd, MV, polarizability, refractivity, benzene, και οι οποίες συσχετίζονται αρνητικά με τις μεταβλητές WS, logs και HBD. Ακριβώς, λόγω της τοποθέτησης των ομάδων των μεταβλητών της λιποφιλικότητας και υδροφιλικότητας στις δύο άκρες του διαγράμματος p1/p2, οι ουσίες στο διάγραμμα t1/t2 διατάσσονται ξεκινώντας από τις πιο πολικές (αριστερή πλευρά του διαγράμματος) και προχωρώντας προς τη δεξιά πλευρά του διαγράμματος καταλήγουν στις πιο λιπόφιλες. 8.2 Εφαρμογή της μεθόδου PLS Η εφαρμογή της μεθόδου PLS στα δεδομένα έδωσε ένα μοντέλο 2 συνιστωσών με τιμές στατιστικών συντελεστών: R 2 Y=0,402 και Q 2 Y=0,323 (σχ.8.7). Τα αποτελέσματα αυτά δεν είναι ικανοποιητικά. Με έναν πιο λεπτομερή έλεγχο παρατηρούμε ότι υπάρχουν προβλήματα στο μοντέλο. Τα διαγράμματα που ακολουθούν απεικονίζουν ακριβώς αυτά τα προβλήματα. Protonation.M2 (PLS), PLS without response 4th root transformation R2Y(cum) Q2(cum) 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 Comp[1] Comp[2] Comp No. Σχήμα 8.7 Διάγραμμα σύνοψης της εφαρμογής του PLS μοντέλου 115

-1 Protonation.M2 (PLS), PLS without response 4th root transformation YPred[2](M+H area)/yvar(m+h area) 5,00+07 trifluprom zipeprol biperiden YVar(M+H area) 4,00+07 3,00+07 2,00+07 1,00+07 0,00+00 naphazolin chlorpheni cimetidine trimiprami triamteren trimethopr metoclopra neostigmin benzethoni haloperido ticlopidin amitriptyl clonidinecinchonidi atenolol atropine ketoconazo propranolo desipramin antazoline ramipril triprolidi carbamazep diazepam lidocaine hydroxyzin imipramine terbutalin tetracaine apomorphin salbutamol diphenhydr clomiphene promethazi meloxicam colchicine norfloxaci dipyridamo gabapentin fluoxetine amiodarone bromphenir captoprilsulfametho nifedipine carisoprodclobazam phenylephr ephedrine tolbutamid reserpine acetaminop isoprenali ranitidine sulfasalaz wmefenamic arfarin caffeine epinephrin dibucaine ambroxol cefuroxime acetylsali chloramphe diclofenac glipizide sulfisoxaz chlorthali amobarbita benzoic amoxycilli aminophyll ac carbidopa clotrimazo indomethac ketoprofen hydrochlor flurbiprof diethylsti allopurino lisinopril lorazepam naproxen nicotinic metronidaz nortriptyl thiocolchi riboflavin piroxicam phenobarbi theophylli spironolac noscapine prazepam diltiazem 0,00+00 1,00+07 2,00+07 3,00+07 4,00+07 5,00+07 YPred[2](M+H area) RMSEE = 1,04059e+007 Σχήμα 8.8 Διάγραμμα των παρατηρούμενων/υπολογισμένων σημάτων των ουσιών Protonation.M2 (PLS), PLS without response 4th root transformation Normal Probability for M2.YVarRes[2](M+H area)st 0,999 0,995 trifluprom Probability 0,99 0,98 0,95 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,05 0,02 0,01 0,005 triamteren naphazolin ranitidine ephedrine diltiazem prazepam noscapine epinephrin metronidaz isoprenali phenylephr amiodarone fluoxetine lorazepam spironolac caffeine clomiphene lisinopril promethazi allopurino diphenhydr carbidopa imipramine nicotinic reserpine acetaminop tetracaine theophylli diethylsti triprolidi aminophyll amoxycilli clobazam tolbutamid diethylsti dipyridamo antazoline norfloxaci hydroxyzin phenobarbi desipramin benzoic flurbiprof amobarbita piroxicam sulfisoxaz gabapentin lidocaine hydrochlor chlorthali naproxen chloramphe carisoprod acetylsali glipizide riboflavin ketoprofen diclofenac salbutamol nifedipine indomethac thiocolchi apomorphin terbutalin colchicine mefenamic cinchonidi sulfametho propranolo ketoconazo atenolol diazepam watropine arfarin sulfasalaz clonidine amitriptyl captopril carbamazep cefuroxime haloperido ticlopidin metoclopra meloxicam ramipril trimiprami chlorpheni benzethoni neostigmin cimetidine trimethopr ac bromphenir dibucaine ambroxol nortriptyl clotrimazo biperiden zipeprol -2-1 0 1 2 3 Σχήμα 8.9 Διάγραμμα κανονικής πιθανότητας των υπολοίπων Protonation.M2 (PLS), PLS without response 4th root transformation Histogram of M2.YVar(M+H area) 40 30 20 10 0 5e+006 1e+007 1,5e+007 2e+007 2,5e+007 3e+007 3,5e+007 4e+007 4,5e+007 5e+007 5,5e+007 Count Bins Σχήμα 8.10 Ιστόγραμμα του σήματος (μεταβλητή Υ) Στο διάγραμμα του Σχήματος 8.8, οι παρατηρούμενες και οι υπολογισμένες από το μοντέλο τιμές των σημάτων των ουσιών παριστάνονται η μια έναντι της άλλης (Observed vs Predicted Plot). Η μεγάλη καμπυλότητα που παρατηρείται φανερώνει ότι η σχέση μεταξύ των φυσικοχημικών-δομικών χαρακτηριστικών και του σήματος δεν είναι γραμμική. Στο Σχήμα 8.9, το διάγραμμα της κανονικής πιθανότητας των υπολοίπων (Normal Probability Plot of 116

Residuals) δείχνει καμπυλότητα, καθώς μερικές ουσίες ξεφεύγουν από την ευθεία γραμμή (ευθεία που περνάει από το σημείο 0, 50%) και στην οποία είναι επιθυμητό να στοιχίζονται όλες οι παρατηρήσεις. Η απεικόνιση αυτή φανερώνει τη μη συμμετρική κατανομή του σήματος, της μεταβλητής Υ, γεγονός που επιβεβαιώνεται και από το ιστόγραμμα της μεταβλητής, στο Σχήμα 8.10. Προκειμένου στη συνέχεια να βελτιωθεί η συσχέτιση των Χ με τη μεταβλητή Υ στο μοντέλο, το εμβαδόν του σήματος απόκρισης των προς μελέτη ουσιών αποδόθηκε στην τέταρτη ρίζα του. Τα βελτιωμένα αποτελέσματα απεικονίζονται στα σχήματα που ακολουθούν. Το R 2 Y έγινε 0,527 και το Q 2 Y 0,431 (σχ.8.11). Επιπρόσθετα, ο μετασχηματισμός του σήματος μετέτρεψε τη σχέση φυσικοχημικών-δομικών χαρακτηριστικών και σήματος σε γραμμική (σχ.8.12), έκανε την κατανομή των υπολοίπων πιο κανονική (σχ.8.13) και επίσης βελτίωσε τη συμμετρικότητα της κατανομής του σήματος (σχ.8.14). Παρόλα αυτά το μοντέλο χρειαζόταν περαιτέρω βελτίωση. Protonation.M3 (PLS), PLS response 4th root transformation R2Y(cum) Q2(cum) 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 Comp[1] Comp[2] Comp No. Σχήμα 8.11 Διάγραμμα σύνοψης της εφαρμογής του PLS μοντέλου μετά τον μετασχηματισμό Protonation.M3 (PLS), PLS response 4th root transformation YPred[2](Response)/YVar(Response) YVar(Response) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 cefuroxime trifluprom zipeprol biperiden naphazolin chlorpheni triamteren trimethopr cimetidinetrimiprami benzethoni neostigmin metoclopra ticlopidin haloperido amitriptyl clonidine cinchonidi propranolo atropine atenolol ketoconazo desipramin ramipril antazoline carbamazep diazepam lidocaine hydroxyzin triprolidi terbutalin imipramine apomorphin salbutamol clomiphene promethazi tetracaine diphenhydr meloxicam colchicine norfloxaci dipyridamo gabapentin fluoxetine carisoprod clobazam bromphenir captopril amiodarone phenylephr ephedrine sulfametho nifedipine tolbutamid reserpine ranitidine acetaminop isoprenali w arfarin sulfasalaz mefenamic sulfisoxaz epinephrin nortriptyl caffeine ambroxol glipizide lorazepam clotrimazo dibucaine diclofenac ketoprofen metronidaz theophylli nicotinic lisinopril carbidopa prazepam indomethac riboflavin aminophyll spironolac thiocolchi allopurino naproxen diltiazem noscapine chlorthali chloramphe piroxicam amobarbita amoxycilli acetylsali hydrochlor flurbiprof phenobarbi benzoic diethylsti ac 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 YPred[2](Response) RMSEE = 16,9212 Σχήμα 8.12 Διάγραμμα των παρατηρούμενων/υπολογισμένων σημάτων των ουσιών μετά τον μετασχηματισμό 117

-1 Protonation.M3 (PLS), PLS response 4th root transformation Normal Probability for M3.YVarRes[2](Response)ST 0,999 0,995 meloxicam Probability 0,99 0,98 0,95 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,05 0,02 0,01 0,005 noscapine diltiazem ramipril benzethoni captopril triamteren ambroxol diethylsti nortriptyl benzoic phenobarbi prazepam flurbiprof amoxycilli acetylsali hydrochlor ranitidine bromphenir metronidaz ephedrine allopurino amobarbita spironolac epinephrin lisinopril piroxicam carbidopa isoprenali chloramphe chlorthali phenylephr aminophyll nicotinic naproxen caffeine lorazepam amiodarone triprolidi fluoxetine imipramine theophylli tetracaine diphenhydr antazoline promethazi desipramin cefuroxime riboflavin thiocolchi clomiphene hydroxyzin cinchonidi indomethac acetaminop lidocaine reserpine tolbutamid dipyridamo chlorpheni ketoconazo atenolol ketoprofen propranolo atropine diclofenac clonidine norfloxaci clobazam sulfisoxaz salbutamol glipizide gabapentin trimiprami amitriptyl metoclopra terbutalin haloperido carisoprod naphazolin diazepam apomorphin cimetidine nifedipine mefenamic ticlopidin colchicine zipeprol biperiden sulfametho trimethopr wcarbamazep neostigmin sulfasalaz trifluprom arfarin ac diethylsti dibucaine clotrimazo -2-1 0 1 2 Σχήμα 8.13 Διάγραμμα κανονικής πιθανότητας των υπολοίπων μετά τον μετασχηματισμό Protonation.M3 (PLS), PLS response 4th root transformation Histogram of M3.YVar(Response) 14 12 10 Count 8 6 4 2 0 7,5 16 24,5 33 41,5 50 58,5 67 75,5 84 92,5 Bins Σχήμα 8.14 Ιστόγραμμα του σήματος (μεταβλητή Υ) μετά τον μετασχηματισμό 8.2.1 Εφαρμογή της μεθόδου PLS στις ομάδες των ουσιών Κατά την εφαρμογή της μεθόδου PLS στις ομάδες των ουσιών: ουσίες που διαθέτουν μόνο βασικές ομάδες (class 1), ουσίες που διαθέτουν μόνο όξινες ομάδες (class 2) και ουσίες που διαθέτουν και όξινες και βασικές ομάδες (class 4) (δεν εφαρμόστηκε στην ομάδα 3 λόγω του μικρού αριθμού παρατηρήσεων), τα μοντέλα που προέκυψαν ήταν πολύ φτωχά, ιδιαίτερα για τις ομάδες 1 και 2 (σχ.8.15, 8.16 και 8.17). Επομένως, επελέγη η εφαρμογή της μεθόδου PLS στο σύνολο των ουσιών. 118

Protonation.M5 (PLS-Class(1)), PLS class 1 (only basic groups) R2Y(cum) Q2(cum) 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00-0,10-0,20 Comp[1] Comp[2] Comp No. Σχήμα 8.15 Διάγραμμα σύνοψης της εφαρμογής του PLS μοντέλου στην ομάδα των ουσιών που διαθέτει μόνο βασικές ομάδες (R 2 Y=0,299, Q 2 Y=-0,21) Protonation.M6 (PLS-Class(2)), PLS class 2 (only acidic groups) R2Y(cum) Q2(cum) 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00-0,10-0,20 Comp[1] Comp[2] Comp No. Σχήμα 8.16 Διάγραμμα σύνοψης της εφαρμογής του PLS μοντέλου στην ομάδα των ουσιών που διαθέτει μόνο όξινες ομάδες (R 2 Y=0,4, Q 2 Y=-0,21) Protonation.M7 (PLS-Class(4)), PLS class 4 (basic + acidic groups) R2Y(cum) Q2(cum) 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 Comp[1] Comp[2] Comp No. Σχήμα 8.17 Διάγραμμα σύνοψης της εφαρμογής του PLS μοντέλου στην ομάδα των ουσιών που διαθέτει και βασικές και όξινες ομάδες (R 2 Y=0,575, Q 2 Y=0,345) Το γεγονός αυτό ήταν απρόβλεπτο δεδομένου ότι ιδιαίτερα οι βασικές ουσίες αναμένονταν να δώσουν καλύτερες συσχετίσεις με τα εμβαδά απόκρισης αφού στο πλείστον των περιπτώσεων είναι και αυτές που καθορίζουν το σήμα. Προφανώς, ομαδοποιώντας όλες τις βασικές ουσίες σε ένα μοντέλο αποδυναμώνεται η δυναμική της συγκεκριμένης παραμέτρου. 119

8.2.2 Βελτίωση του συνολικού μοντέλου PLS Τα στατιστικά στοιχεία του συνολικού μοντέλου PLS βελτιώθηκαν μετά την μετατροπή του σήματος απόκρισης στην τέταρτη ρίζα, αλλά παρέμειναν μη ικανοποιητικά (R 2 Y=0,527, Q 2 Y=0,431). Το διάγραμμα t1/u1 απεικονίζει τη σχέση μεταξύ των φυσικοχημικών-δομικών χαρακτηριστικών των ουσιών και του σήματός τους (σχ. 8.18). Παρατηρείται, λοιπόν, μια σχετική διασπορά των ουσιών και κάποιες ουσίες να αποκλίνουν περισσότερο. Αυτές οι ουσίες δεν δείχνουν καλή προσαρμογή συγκριτικά με τις υπόλοιπες και αυξάνουν την ανομοιογένεια των δεδομένων. Protonation.M3 (PLS), PLS response 4th root transformation t[1]/u[1] u[1] 10 8 6 4 2 0-2 -4-6 -8-10 cefuroxime zipeprol trifluprom biperiden naphazolin chlorpheni triamteren cimetidine trimethopr trimiprami neostigmin metoclopra benzethoni clonidine ticlopidin haloperido cinchonidi amitriptyl atenolol atropine propranolo ketoconazo antazoline desipramin ramipril carbamazep diazepam hydroxyzin triprolidi lidocaine terbutalin tetracaine imipramine salbutamol apomorphin diphenhydr promethazi clomiphen meloxicam norfloxaci dipyridamo colchicine gabapentin fluoxetine phenylephr carisoprod clobazam ephedrine bromphenir amiodarone captopril sulfametho nifedipine tolbutamid ranitidine reserpine acetaminop isoprenali w arfarin sulfasalaz sulfisoxaz epinephrinmefenamic caffeine ambroxol nortriptyl glipizide lorazepam dibucaine clotrimazo ketoprofen metronidaz nicotinic theophylli diclofenac lisinopril carbidopa prazepam riboflavin aminophyll indomethac spironolac thiocolchi allopurino naproxen diltiazem noscapine chlorthali chloramphe piroxicam amobarbita amoxycilli hydrochlor acetylsalibenzoic phenobarbi ac flurbiprof diethylsti diethylsti -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 0 1 2 3 4 5 6 7 t[1] Σχήμα 8.18 Διάγραμμα t1/u1 για την πρώτη συνιστώσα του μοντέλου PLS Λαμβάνοντας το διάγραμμα συνεισφοράς των ουσιών που διαταράσσουν την ομοιογένεια, είναι δυνατή η κατανόηση της διαφοράς τους από τις υπόλοιπες. Για παράδειγμα, το διάγραμμα συνεισφοράς της νεοστιγμίνης απεικονίζει ότι η ουσία διαφέρει σημαντικά από τον μέσο όρο για τις μεταβλητές: 1logP, 2.1logP, 2.2logP, 2PSA, 3logP, 3logD(pH1-3), 3logD(pH8-14), 3PSA, 3acidic groups, 3basic groups (σχ.8.16). Το διάγραμμα συνεισφοράς της διπροπιονικής διαιθυλοστιλβεστρόλης δείχνει ότι η ουσία παρουσιάζει μειωμένη τιμή για τις μεταβλητές: 2WS, 3surface tension, 3acidic groups, 3basic groups, και αυξημένη τιμή για τις μεταβλητές: 1logP, 1HLC, 2.1logP, 2.2logP, 3logP, 3logD(pH0.1-5), 3logD(pH7-14), 3MV, O atoms και No of side chains. 120

Protonation.M3 (PLS), PLS response 4th root transformation Score Contrib(Obs neostigmine - Average), Weight=w*1 3 Score Contrib(Obs neostigmine - Average), Weight=w*1 2 1 0-1 -2 1logP 1BP 1MP 1VP 1.1WS 1.2WS 1logKoa 1HLC 2MW 2WS 2.1logP 2.2logP 2logS 2PSA 2Refractiv 2Polarizab 3logP 3logD(pH0. 3logD(pH1) 3logD(pH2) 3logD(pH3) 3logD(pH4) 3logD(pH5) 3logD(pH6) 3logD(pH7) 3logD(pH8) 3logD(pH9) 3logD(pH10 3logD(pH11 3logD(pH12 3logD(pH13 3logD(pH14 3pKa bas(s 3pKa acid( 3bas %Ioni 3acid %ion 3HBA 3HBD 3Refr.inde 3MV 3Surf.Tens 3BP 3PSA 3Refractiv 3Polarizab 3Enthalpy benzene all rings condens ri 3acidic gr 3basic gro 3amphoteri N atoms O atoms halogens C atoms on No of side Var ID (Primary) Σχήμα 8.16 Διάγραμμα συνεισφοράς της νεοστιγμίνης Protonation.M3 (PLS), PLS response 4th root transformation Score Contrib(Obs diethylstilbestrol dipropionate - Average), Weight=w*1 Score Contrib(Obs diethylstilbestrol dipropionate - Average), Weight=w*1 3 2 1 0-1 -2 1logP 1BP 1MP 1VP 1.1WS 1.2WS 1logKoa 1HLC 2MW 2WS 2.1logP 2.2logP 2logS 2PSA 2Refractiv 2Polarizab 3logP 3logD(pH0. 3logD(pH1) 3logD(pH2) 3logD(pH3) 3logD(pH4) 3logD(pH5) 3logD(pH6) 3logD(pH7) 3logD(pH8) 3logD(pH9) 3logD(pH10 3logD(pH11 3logD(pH12 3logD(pH13 3logD(pH14 3pKa bas(s 3pKa acid( 3bas %Ioni 3acid %ion 3HBA 3HBD 3Refr.inde 3MV 3Surf.Tens 3BP 3PSA 3Refractiv 3Polarizab 3Enthalpy benzene all rings condens ri 3acidic gr 3basic gro 3amphoteri N atoms O atoms halogens C atoms on No of side Var ID (Primary) Σχήμα 8.17 Διάγραμμα συνεισφοράς της διπροπιονικής διαιθυλοστιλβεστρόλης Μετά την απομάκρυνση των ουσιών που διατάρασσαν την ομοιογένεια (αμιωδαρόνη, διαιθυλοστιλβεστρόλη, διαιθυλοστιλβεστρόλη διπροπιονική, διβουκαΐνη, διλτιαζέμη, κλομιφαίνη, κλοτριμαζόλη, μελοξικάμη, νεοστιγμίνη, νορτριπτυλίνη, νοσκαπίνη, πραζεπάμη, ραμιπρίλη, σιμετιδίνη, σπιρονολακτόνη, τερβουταλίνη, τριαμτερένη, τριμεθοπρίμη, φλουρβιπροφαίνη), η εφαρμογή της μεθόδου PLS έδωσε ένα μοντέλο 2 συνιστωσών με R 2 Y= 0,731 και Q 2 Y= 0,673 (σχ.8.18). Το διάγραμμα t1/u1 του νέου μοντέλου είναι σαφώς βελτιωμένο, όπως φαίνεται και στο σχήμα 8.19. 121

Protonation.M8 (PLS), PLS reduced data set R2Y(cum) Q2(cum) 1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00 Comp[1] Comp[2] Comp No. Σχήμα 8.18 Διάγραμμα σύνοψης της εφαρμογής του μοντέλου PLS μετά την απομάκρυνση των ουσιών που διατάρασσαν την ομοιογένεια Protonation.M8 (PLS), PLS reduced data set t[1]/u[1] u[1] 10 8 6 4 2 0-2 -4-6 -8-10 carbidopa cefuroxime amoxycilli riboflavin zipeprol trifluprom biperiden naphazolin chlorpheni trimiprami metoclopra haloperidobenzethoni clonidine ticlopidin cinchonidi amitriptyl atenolol atropine propranolo ketoconazo antazoline desipramin carbamazep diazepam hydroxyzin triprolidi lidocaine imipramine salbutamol tetracaine apomorphin diphenhydr promethazi norfloxaci dipyridamo colchicine gabapentin fluoxetine phenylephr ephedrine carisoprod clobazam bromphenir captopril sulfametho nifedipine ranitidine tolbutamid reserpine isoprenali acetaminop w arfarin epinephrin sulfisoxaz sulfasalaz mefenamic caffeine ambroxol glipizide lorazepam metronidaz nicotinic theophylli ketoprofen diclofenac lisinopril aminophyll indomethac allopurino thiocolchi naproxen chlorthali chloramphe piroxicam amobarbita hydrochlor acetylsali benzoic phenobarbi ac -9-8 -7-6 -5-4 -3-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 t[1] Σχήμα 8.19 Διάγραμμα t1/u1 για την πρώτη συνιστώσα του μοντέλου PLS μετά την απομάκρυνση των ουσιών που διατάρασσαν την ομοιογένεια 8.3 Ερμηνεία του μοντέλου PLS Η υπόθεση ότι: εάν η τεχνική του ηλεκτροψεκασμού μεταφέρει απλώς τα ιόντα που προϋπάρχουν στο διάλυμα στην αέρια φάση, τότε θα πρέπει τα λαμβανόμενα σήματα να αντικατοπτρίζουν τις ισορροπίες διάστασης των ουσιών στο διάλυμα, έχει μελετηθεί από αρκετούς ερευνητές. (51 54) Στο επιλεχθέν αλκαλικό περιβάλλον (ph 10) ο ιονισμός των βασικών ομάδων των υπό μελέτη ουσιών περιορίζεται σημαντικά. Για παράδειγμα, η ομάδα των ουσιών που έχουν μόνο βασικές ομάδες στο μόριό τους (με εύρος τιμών pka 1.9-10.5) 122

αναμένεται να εμφανίζει μειωμένο σήμα και ανάλογο με το ποσοστό ιονισμού των ουσιών στο διάλυμα. Ωστόσο, αυτό δεν ισχύει. Τόσο η νιφεδιπίνη (η ασθενέστερη βασική ουσία της ομάδας αυτής, με pka 1,9 και ποσοστό ιονισμού 10-6 %) όσο και η ναφαζολίνη (η ισχυρότερη βασική ουσία της ομάδας, με pka 10,5 και ποσοστό ιονισμού 76%) έδωσαν ισχυρά σήματα, με αυτό της ναφαζολίνης να υπερισχύει. Σε ανάλογο συμπέρασμα κατέληξαν και οι Peng και Farkas (55), οι οποίοι μελέτησαν τη συμπεριφορά 47 βασικών φαρμάκων και διαπίστωσαν ότι η κινητή φάση υψηλού ph δεν επηρεάζει αρνητικά την απόκριση βασικών ουσιών, κατά την ανάλυση με ESI-MS σε θετικό ιονισμό, αντίθετα με ό,τι αναμενόταν. Protonation.M4 (PLS), PLS classes t[1]/u[1] Colored according to classes in M4 No Class Class 1 Class 2 Class 3 Class 4 u[1] 10 8 6 4 2 0-2 -4-6 -8-10 cefuroxime zipeprol trifluprom biperiden naphazolin chlorpheni triamteren neostigmin trimethopr cimetidine trimiprami metoclopra benzethoni clonidine ticlopidin haloperido ketoconazo amitriptyl atenolol atropine cinchonidi propranolo ramipril antazoline triprolidi desipramin carbamazep diazepam lidocaine hydroxyzin terbutalin tetracaine imipramine salbutamol apomorphin diphenhydr promethazi clomiphene meloxicam norfloxaci colchicine dipyridamo gabapentin fluoxetine phenylephr carisoprod clobazam bromphenir captopril sulfametho nifedipine ephedrine amiodarone tolbutamid ranitidine reserpine w arfarin acetaminop isoprenali sulfasalaz sulfisoxaz epinephrin caffeine mefenamic ambroxol nortriptyl glipizide lorazepam dibucaine clotrimazo theophylli ketoprofen metronidaz nicotinic lisinopril diclofenac carbidopa prazepam riboflavin thiocolchi aminophyll indomethac spironolac allopurino naproxen diltiazem chlorthali noscapine chloramphe piroxicam amobarbita amoxycilli hydrochlor acetylsalibenzoic phenobarbi ac flurbiprof diethylsti diethylsti -8-7 -6-5 -4-3 -2-1 0 1 2 3 4 5 6 7 t[1] Σχήμα 8.20 Διάγραμμα t1/u1 για την πρώτη συνιστώσα του μοντέλου PLS, όπου έχουν χρωματιστεί οι ουσίες των διαφορετικών ομάδων (ουσίες με βασικές ομάδες: μπλε χρώμα, ουσίες με όξινες ομάδες: κόκκινο χρώμα, ουσίες με βασικές και όξινες ομάδες: γαλάζιο χρώμα) Από την άλλη πλευρά, οι ουσίες που φέρουν μόνο όξινες ομάδες στο μόριό τους (κόκκινο χρώμα) έδωσαν σήματα χαμηλότερης έντασης από αυτά των ουσιών που φέρουν μόνο βασικές ομάδες (μπλε χρώμα) όπως φαίνεται στο Σχήμα 8.20. Ωστόσο, η ανίχνευση των ουσιών που έχουν μόνο όξινες ομάδες δεν αναμενόταν καθόλου στην ανάλυση με θετικό ιονισμό, αφού παρόλο που στο συγκεκριμένο ph ευνοείται η διάσταση των όξινων ομάδων, τα προκύπτοντα αποπρωτονιωμένα ιόντα είναι αρνητικά φορτισμένα και δεν μπορούν να ανιχνευτούν σε θετικό ιονισμό. Προφανώς, και κάποια άλλα άτομα ή ομάδες έχουν την 123

ικανότητα να «κουβαλούν» το πρωτόνιο, αλλά σε μικρότερο βαθμό. Αυτό έρχεται σε συμφωνία με τους Leito και συνεργάτες (32), οι οποίοι ανέφεραν στην έρευνά τους ότι οι διεστέρες μπορούσαν να δεσμεύουν πρωτόνια με χηλίωση. Ανάλογα, οι Bahrami και συνεργάτες (56) στην έρευνά τους, αναφερόμενοι σε μόρια με πολλές λειτουργικές ομάδες, όπως η καφεΐνη, διατύπωσαν την υπόθεση ότι πιθανόν να υπάρχουν αρκετές διαφορετικές θέσεις για πρωτονίωση (διαφορετικής σταθερότητας), εκτός από αυτές που αντιστοιχούν στα πιο βασικά σημεία του μορίου. Έτσι, στην περίπτωση της καφεΐνης (σχ.8.21) θεώρησαν ως πιθανή θέση για πρωτονίωση εκτός από το άτομο αζώτου (Ν8) της ιμινικής ομάδας και τα άτομα οξυγόνου των καρβονυλικών ομάδων (Ο11 και Ο12). Σχήμα 8.21 Μοριακή δομή της καφεΐνης Το ESI-MS σε θετικό ιονισμό θεωρείται ότι δουλεύει καλύτερα με ουσίες που έχουν βασικές ομάδες και μπορούν να προϋπάρχουν στο διάλυμα ως πρωτονιωμένα ιόντα. Ωστόσο, φαίνεται πως η ύπαρξη βασικών ομάδων στο μόριο δεν είναι καθοριστική, αφού και άλλες ομάδες δύναται να πρωτονιωθούν και να συμβάλλουν στο λαμβανόμενο σήμα, πιθανώς ανεξαρτήτως ph. Η προσπάθεια εφαρμογής του PLS μοντέλου στις διαφορετικές ομάδες των ουσιών απέτυχε (βλ.8.2.1), είτε επειδή ο βασικός χαρακτήρας των ομάδων των ουσιών δεν καθορίζει αποκλειστικά την ικανότητα των ουσιών να αποκτούν φορτίο μέσω πρωτονίωσης στο διάλυμα, είτε γιατί οι ουσίες μπορούν να πρωτονιωθούν και στη συνέχεια, στην αέρια φάση. Βέβαια, η βασικότητα των υπό μελέτη ουσιών στην αέρια φάση δεν ήταν διαθέσιμη, οπότε και δεν ήταν εφικτή η εκτίμηση της συνεισφοράς της μεταφοράς πρωτονίου στην αέρια φάση στη φόρτιση (πρωτονίωση) των ουσιών. 124