ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΑΜΥΛΟΥ ΑΠΟ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗ ΑΜΥΛΑΣΗ ΚΑΙ ΥΓΡΟ ΑΠΟΡΡΥΠΑΝΤΙΚΟ

!Unexpected End of Formula l ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΑΜΥΛΟΥ ΑΠΟ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗ ΑΜΥΛΑΣΗ ΚΑΙ ΥΓΡΟ ΑΠΟΡΡΥΠΑΝΤΙΚΟ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Γκέκας Γιώργος Δημητριάδου Άννα Τζελέπη Λαμπρινή

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Πειράµατα Επιδείξεως Πείραμα 1: Αποσύνθεση υπεροξειδίου του υδρογόνου (H 2 O 2 ) από καταλάση Απαιτούμενα: Αντιδραστήρια- Υλικά Διάλυμα Η2Ο2 20% Νερό Ωμή πατάτα Σκεύη Δύο τρυβλία Petri Πειραματική διαδικασία Στο πρώτο τρυβλίο Petri προσθέτουμε 30 ml νερού ενώ στο δεύτερο 30 ml διαλύματος Η2Ο2 20%. Στη συνέχεια τεμαχίζουμε την πατάτα σε μικρά τετράγωνα κομμάτια, περίπου 2cmx2cm. Ένα από αυτά τοποθετείται στο τρυβλίο που περιέχει νερό ενώ ένα δεύτερο τοποθετείται στο τρυβλίο που περιέχει το διάλυμα του υπεροξειδίου του υδρογόνου. Αμέσως μετά την προσθήκη του τεμαχιδίου της πατάτας παρατηρούμε και σημειώνουμε τις αλλαγές στα δύο τρυβλία. 1

Με την προσθήκη τεμαχίου της πατάτας στο διάλυμα του υπεροξειδίου του υδρογόνου παρατηρείται έντονος αφρισμός ενώ αντίθετα στο τρυβλίο Petri που περιέχει νερό δεν παρατηρείται καμία αλλαγή. Εξήγηση: Η καταλάση και άλλες υπεροξειδάσες βρίσκονται γενικώς σε όλα τα φυτά και στα ζώα που ζουν κάτω από αερόβιες συνθήκες και είναι υπεύθυνες για την αποτοξικοποίηση, δηλαδή τη χημική τροποποίηση του μορίου με σκοπό τη μείωση της τοξικότητάς του. Ο ακριβής ρόλος τους δεν είναι απόλυτα κατανοητός καθώς επίσης δεν είναι κατανοητή και η παρουσία των οξειδωτικών στους ζωντανούς οργανισμούς. Το ένζυμο το οποίο βρίσκεται στην πατάτα ονομάζεται καταλάση και δρα ως καταλύτης έτσι ώστε να λάβει χώρα η αντίδραση ταχύτερα. Η καταλάση περιέχει την ομάδα της αίμης η οποία περιέχει άτομο σιδήρου. Το άτομο αυτό διασπά τους δεσμούς του υπεροξειδίου του υδρογόνου σε νερό και οξυγόνο και γι αυτό το λόγο παρατηρείται ο αφρισμός. 2H2O2 êáôáëüóç 2H2O + O2 Σχήµα 5.1:Προσθήκη υπεροξειδίου του µαγγανίου ή καταλάσης σε διάλυµα υπεροξειδίου του υδρογόνου 2

Πείραμα 2: Υδρόλυση πρωτεϊνών από πρωτεάση Απαιτούμενα Αντιδραστήρια- Υλικά Αντιδραστήριο διουρίας Απορρυπαντικό που περιέχει πρωτεάση Αλβουμίνη αυγού(ασπράδι αυγού) Σκεύη Δύο δοκιμαστικοί σωλήνες Πιπέτα Pasteur Πειραματική διαδικασία Σε δύο δοκιμαστικούς σωλήνες προσθέτουμε ποσότητα πρωτεΐνης αυγού (ασπράδι) ίση με 2 ml και σε ένα τρίτο διάλυμα διουρίας.. Στη συνέχεια, στον σωλήνα ένα προσθέτουμε περίπου 2 ml υγρού απορρυπαντικού που περιέχει πρωτέαση και ανακινούμε ελαφρά, ενώ ο σωλήνας τρία παραμένει ως έχει. Προσθέτουμε σταγόνες από το αντιδραστήριο της διουρίας (σωλήνας δύο- Biuret) και στους δοκιμαστικούς σωλήνες ένα και τρία και παρατηρούμε την αλλαγή του χρώματος. 1 2 3 3

Παρατηρούμε ότι το διάλυμα του δοκιμαστικού σωλήνα ένα, στον οποίο είχαμε προσθέσει ποσότητα ενζυμικού απορρυπαντικού, χρωματίζεται πράσινο ενώ το διάλυμα του σωλήνα τρία χρωματίζεται έντονο μπλε- μωβ. Στη φωτογραφία ο μεσαίος σωλήνας (σωλήνας 2) εμφανίζει το χρώμα του αντιδραστηρίου διουρίας. Εξήγηση: Το αντιδραστήριο της διουρίας χρησιμεύει για την ανίχνευση των πρωτεϊνών. Περιέχει ιόντα χαλκού και έχει χρώμα ανοιχτό μπλε. Όταν οι πρωτεΐνες αντιδράσουν με το δισθενές ιόν του χαλκού το διάλυμα χρωματίζεται από ανοιχτό μπλε σε μπλε- μωβ. Σχήμα 5.2: Δομή διουρίας Τα αμινοξέα τα οποία προκύπτουν από την υδρόλυση των πρωτεϊνών σχηματίζουν με το δισθενές ιόν του χαλκού ένα σύμπλοκο χρώματος πρασίνου. Σχήμα 5.3: Σύμπλοκο δισθενούς χαλκού- αμινοξέος 4

Επομένως, στον πρώτο σωλήνα στον οποίο το ένζυμο του απορρυπαντικού έχει υδρολύσει την πρωτεΐνη του αυγού, σχηματίστηκαν αμινοξέα τα οποία με το αντιδραστήριο διουρίας δίνουν σύμπλοκο χρώματος πρασίνου ενώ στον τρίτο σωλήνα, όπου περιέχεται η άχρωμη αλβουμίνη του αυγού το διάλυμα εμφανίζεται μπλε- μωβ χρώμα που οφείλεται στο σύμπλοκο πρωτεΐνης και δισθενούς χαλκού ο οποίος συνυπάρχει στο διάλυμα της διουρίας.. Πείραμα 3: Υδρόλυση των λιπών από λιπάση Απαιτούμενα Αντιδραστήρια- Υλικά Ελαιόλαδο Απορρυπαντικό που περιέχει λιπάση Δείκτης φαινολοφθαλεϊνης Καυστικό νάτριο Σκεύη Δύο δοκιμαστικοί σωλήνες ή δύο κωνικές φιάλες Πιπέτα Pasteur 5

Πειραματική διαδικασία Σε δύο δοκιμαστικούς σωλήνες ή δύο μικρές κωνικές φιάλες προσθέτουμε από 2 ml ελαιολάδου και σταγόνες δείκτη φαινολοφθαλεΐνης. Αν το διάλυμα δε χρωματιστεί ροζ τότε προσθέτουμε λίγο καυστικό νάτριο έτσι ώστε να δημιουργηθεί αλκαλικό περιβάλλον. Στη συνέχεια, μόνο στο δοκιμαστικό σωλήνα ένα προσθέτουμε περίπου 2 ml του ενζυμικού απορρυπαντικού ενώ ο σωλήνας δύο παραμένει ως έχει. Ανακινούμε ελαφρώς τους δοκιμαστικούς σωλήνες και παρατηρούμε τις χρωματικές αλλαγές. Ελαιόλαδο, δείκτης φαινολοφθαλεΐνης, ενζυμικό απορρυπαντικό Ελαιόλαδο, δείκτης φαινολοφθαλεΐνης Παρατηρούμε ότι στην κωνική φιάλη ένα, στην οποία είχαμε προσθέσει ποσότητα του απορρυπαντικού που περιέχει λιπάση, το διάλυμα αποχρωματίζεται ενώ στην κωνική φιάλη δύο το διάλυμα παραμένει ροζ. Εξήγηση: Ο δείκτης φαινολοφθαλεΐνης ως γνωστόν έχει ροζ χρώμα σε αλκαλικό περιβάλλον ενώ αποχρωματίζεται σε όξινο περιβάλλον. Στην περίπτωση επομένως, της κωνικής φιάλης ένα στην οποία προσθέσαμε απορρυπαντικό που περιέχει λιπάση, το λίπος υδρολυόμενο ενζυμικά από τη λιπάση σχηματίζει ελεύθερα οξέα και έτσι το ροζ διάλυμα του αποχρωματίζεται λόγω της δημιουργίας του οξίνου περιβάλλοντος. Στην περίπτωση της κωνικής δύο όπου 6

περιέχεται μόνο το έλαιο και δεν υπάρχουν ελεύθερα οξέα το περιβάλλον διατηρείται αλκαλικό και η φαινολοφθαλεΐνη διατηρείται ροζ. Φαινολοφθαλεΐνη σε όξινο διάλυμα Φαινολοφθαλεΐνη σε αλκαλικό διάλυμα Πείραμα 4: Οι κυτταρινάσες ως πρόσθετα απορρυπαντικών Απαιτούμενα Αντιδραστήρια- Υλικά Υγρό απορρυπαντικό που περιέχει κυτταρινάση Υγρό απορρυπαντικό χωρίς κυτταρινάση Κρεμμύδι (χιτών) Σκεύη Τρία ποτήρια ζέσεως των 100 ml Τρεις ύαλοι ωρολογίου 7

Πειραματική διαδικασία Προσθέτουμε 30 ml νερού και στα τρία ποτήρια ζέσεως 1, 2 και 3. Στη συνέχεια, προσθέτουμε στο ποτήρι ένα, 3 g υγρού απορρυπαντικού που δεν περιέχει το ένζυμο κυτταρινάση, στο ποτήρι τρία προσθέτουμε 3 g υγρού απορρυπαντικού που περιέχει κυτταρινάση ενώ το ποτήρι δύο περιέχει μόνο νερό. Τέλος, τοποθετούμε από ένα κομμάτι φλούδας κρεμμυδιού (χιτώνας) και κάθε ποτήρι μετά από αρκετές ώρες (περίπου 3 ώρες) παρατηρούμε τις αλλαγές που γίνονται σε κάθε ποτήρι. 1 2 3 Παρατηρούμε ότι στο ποτήρι ένα στο οποίο προσθέσαμε απορρυπαντικό που δεν περιέχει κυτταρινάση το διάλυμα χρωματίστηκε σκούρο όπως επίσης και η φλούδα του κρεμμυδιού. Το ποτήρι δύο το οποίο περιέχει μόνο νερό, χρωματίστηκε κίτρινο- καφέ και το χρώμα της φλούδας του κρεμμυδιού έμεινε αμετάβλητο. Τέλος, το ποτήρι τρία, το οποίο περιέχει απορρυπαντικό με κυτταρινάση, απέκτησε ένα κίτρινο ανοιχτό χρώμα ενώ η φλούδα του κρεμμυδιού αποχρωματίστηκε. Εξήγηση: Η κυτταρινάση «αποικοδομεί» γρήγορα τα κυτταρικά τοιχώματα υδρολύοντας τους γλυκοζιτικούς δεσμούς στην επιφάνεια του υποστρώματος. Οι λευκαντικοί παράγοντες, οι οποίοι είναι από τα βασικά συστατικά των απορρυπαντικών, προκαλούν στη συνέχεια το ξεθώριασμα της φλούδας του κρεμμυδιού. Τα απορρυπαντικά που περιέχουν κυτταρινάση προσφέρονται κυρίως για βαμβακερά υφάσματα. Το βαμβακερό ύφασμα εξαιτίας της πλύσεως αποκτά θολή και χνουδωτή όψη λόγω των μικροϊνών που δημιουργούνται. 8

Η κυτταρινάση απομακρύνει τις μικροΐνες με αποτέλεσμα το ύφασμα να αποκτά πιο λαμπερή και λεία όψη. Πείραμα 5: Η αμυλάση κάνει τα απορρυπαντικά να δρουν πιο αποτελεσματικά Απαιτούμενα Αντιδραστήρια- Υλικά Υγρό απορρυπαντικό με αμυλάση Κορν φλάουρ Σκεύη Ένα ποτήρι ζέσεως των 250mL Δύο ποτήρια ζέσεως των 100mL Δύο ύαλοι ωρολογίου Πειραματική διαδικασία Σε ένα ποτήρι ζέσεως των 250 ml θερμαίνονται μέχρι βρασμού 100 ml νερού και στη συνέχεια προσθέτουμε το αιώρημα του κορν φλαόυρ (9 g κορν φλάουρ σε 2 κουταλιές νερού). Το μίγμα θερμαίνεται για λίγο και έπειτα χωρίζεται σε ίσες ποσότητες σε δύο ποτήρια ζέσεως των 100 ml. Στο πρώτο ποτήρι προσθέτουμε 2 g απορρυπαντικού που περιέχει αμυλάση ενώ το δεύτερο παραμένει ως έχει. Αφήνουμε τα ποτήρια να κρυώσουν και παρατηρούμε τις αλλαγές. 9

Παρατηρούμε ότι στο ποτήρι που είχαμε προσθέσει το απορρυπαντικό με την αμυλάση το περιεχόμενο είναι ρευστό ενώ στο δεύτερο ποτήρι το περιεχόμενο έχει πήξει. Εξήγηση: Όταν το κορν φλάουρ διαλυθεί σε νερό και θερμανθεί σε θερμοκρασία μεγαλύτερη των 60 ο C τότε το άμυλο απορροφά νερό και σχηματίζει κατά την ψύξη μία πηχτή. Με την προσθήκη όμως ποσότητας αμυλάσης υδρολύεται το άμυλο σε μικρότερες δομικές μονάδες με αποτέλεσμα να μην πήζει. Πείραμα για μαθητές- φοιτητές: Υδρόλυση αμύλου από βακτηριακή αμυλάση και από υγρό απορρυπαντικό Σκοπός του πειράµατος Σκοπός του πειράματος είναι η ποιοτική μελέτη της επίδρασης του ph, της θερμοκρασίας και της συγκεντρώσεως της αμυλάσης στην ενζυματική δράση και κατ επέκταση στην ταχύτητα της αντιδράσεως διασπάσεως του αμύλου. Απαιτούµενα σκεύη Ποτήρι ζέσεως Σιφώνια Ογκομετρικός κύλινδρος Δοκιμαστικοί σωλήνες Υδρόλουτρο Παγόλουτρο Θερμόμετρο Ζυγαριά Χρονόμετρο ή ρολόι 10

Απαιτούµενα αντιδραστήρια Διάλυμα βακτηριακής αμυλάσης 3000SKB units/ml Άμυλο υδατοδιαλυτό Διάλυμα HCl 0.1N Διάλυμα ιωδίου, I2: 5g/l και KI: 50g/l Ρυθμιστικά διαλύματα: KH2PO4 και NaOH Απορρυπαντικό πλυντηρίου σε υγρή μορφή που περιέχει ένζυμα Αντιδραστήριο Benedict: κιτρικό νάτριο (Na3C6H5O7.11H2O), άνυδρο ανθρακικό νάτριο, ένυδρος δισθενής θειικός χαλκός Απιονισμένο νερό Πειραματική διαδικασία: Μελέτη της επιδράσεως του ph Εξετάζουμε την επίδραση του ph στην αντίδραση της υδρόλυσης. Σε ένα ποτήρι ζέσεως των 100mL βάζουμε 50mL από το διάλυμα του HCl 0,1Ν. Το διάλυμα αυτό θα χρειαστεί και για τα υπόλοιπα πειράματα. Παίρνουμε τρεις καθαρούς δοκιμαστικούς σωλήνες και τους αριθμούμε 1, 2 και 3. Στον πρώτο βάζουμε με τη βοήθεια σιφωνίου 5mL από το ρυθμιστικό διάλυμα με ph 3, στο δεύτερο 5mL από το ρυθμιστικό διάλυμα με ph 7 και στον τρίτο 5mL από το ρυθμιστικό διάλυμα με ph 8. Και στους τρεις προσθέτουμε 5mL από το διάλυμα αμύλου περιεκτικότητας 20g/L. Στη συνέχεια προσθέτουμε 0,5mL διαλύματος βακτηριακής αμυλάσης. Με την προσθήκη του ενζύμου ξεκινά η χρονομέτρηση. Αφήνουμε την αντίδραση να πραγματοποιηθεί για 10λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ενώ περιμένουμε, ετοιμάζουμε τρεις δοκιμαστικούς σωλήνες που περιέχουν ο καθένας από 10 ml υδροχλωρικού οξέος, HCl. 11

Σταματάμε την αντίδραση. Παίρνουμε με σιφώνιο, 1mL από τον κάθε δοκιμαστικό σωλήνα και το προσθέτουμε στους δοκιμαστικούς σωλήνες που περιέχουν από 10mL HCl. Με μαρκαδόρο σημειώνουμε την προέλευση του κάθε διαλύματος. Από κάθε σωλήνα που περιέχει το μίγμα της αντίδρασης και το HCl, παίρνουμε με σιφώνιο 0,5mL, τα βάζουμε σε ένα νέο δοκιμαστικό σωλήνα και προσθέτουμε από μία σταγόνα διαλύματος ιωδίου. Το διάλυμα πρέπει να έχει χρώμα βαθύ μπλε, αν υπάρχει άμυλο στο διάλυμα, καφέ- κόκκινο αν το άμυλο είναι μερικώς διασπασμένο και διαφανές, αν το άμυλο διασπάστηκε πλήρως. Με άλλα 0,5mL από το μίγμα της αντίδρασης και το HCl τα οποία βάζουμε σε νέο δοκιμαστικό σωλήνα, κάνουμε το τεστ Benedict Προσθέτουμε αρκετές σταγόνες αντιδραστηρίου Benedict και θερμαίνουμε το δοκιμαστικό σωλήνα για δύο λεπτά περίπου. Μελέτη της επιδράσεως της θερμοκρασίας Εξετάζουμε την επίδραση της θερμοκρασίας στην ταχύτητα της αντίδρασης για τρεις διαφορετικές τιμές θερμοκρασίας. Σε ένα ποτήρι ζέσεως των 100mL βάζουμε 50mL από το διάλυμα του HCl 0,1Ν. Το διάλυμα αυτό θα χρειαστεί και για τα υπόλοιπα πειράματα. Προσθέτουμε με τη βοήθεια σιφωνίου σε τρεις δοκιμαστικούς σωλήνες από 5mL αραιωμένου διαλύματος αμύλου (10g/L). Τους αριθμούμε. Τοποθετούμε τον πρώτο δοκιμαστικό σωλήνα σε παγόλουτρο (0 ο C), το δεύτερο σε υδρόλουτρο των 40 ο C και τον τρίτο σε υδρόλουτρο των 80 o C και περιμένουμε 10λεπτά έτσι ώστε να αποκτήσουν τη θερμοκρασία. Κάθε λουτρού. Μέσα σε ποτήρια ζέσεως για κάθε θερμοκρασία βρίσκεται ορισμένη ποσότητα αμυλάσης, η οποία θερμοστατείται ταυτόχρονα με το διάλυμα του αμύλου. Αφού περάσουν τα 10 λεπτά και χωρίς να απομακρύνουμε τους δοκιμαστικούς σωλήνες από το υδρόλουτρο, προσθέτουμε στον καθένα 12

0,5mL βακτηριακής αμυλάσης που τη διατηρούμε στην αντίστοιχη θερμοκρασία. Αφήνουμε την αντίδραση να προχωρήσει για 10 λεπτά. Κατά τη διάρκεια της αντιδράσεως ο δοκιμαστικός σωλήνας παραμένει μέσα στο υδρόλουτρο. Ενώ περιμένουμε, γεμίζουμε τρεις δοκιμαστικούς σωλήνες με 10mL HCl. Στη συνέχεια απομακρύνουμε τους δοκιμαστικούς σωλήνες από τον πάγο και τα υδρόλουτρα λαμβάνουμε με σιφώνιο 1mL από τον κάθε ένα και το προσθέτουμε στους δοκιμαστικούς σωλήνες που περιέχουν το HCl. Από κάθε σωλήνα που περιέχει το μίγμα της αντιδράσεως και το HCl, παίρνουμε με σιφώνιο 0,5mL, τα βάζουμε σε ένα νέο δοκιμαστικό σωλήνα και προσθέτουμε μία σταγόνα διαλύματος ιωδίου. Το διάλυμα πρέπει να έχει χρώμα βαθύ μπλε, αν υπάρχει άμυλο στο διάλυμα, καφέ- κόκκινο αν το άμυλο είναι μερικώς διασπασμένο και διαφανές, αν το άμυλο διασπάστηκε πλήρως. Με άλλα 0,5mL που βάζουμε πάλι σε δοκιμαστικό σωλήνα, κάνουμε το τεστ Benedict. Προσθέτουμε μερικές σταγόνες αντιδραστηρίου Benedict και θερμαίνουμε το δοκιμαστικό σωλήνα για δύο λεπτά. Μελέτη της επιδράσεως της συγκεντρώσεως του ενζύμου Παίρνουμε τρεις δοκιμαστικούς σωλήνες και τους αριθμούμε, 1, 2 και 3. Στον πρώτο δε βάζουμε καθόλου αμυλάση, στον δεύτερο προσθέτουμε 0,5mL και στον τρίτο 1,5mL αυτής. Προσθέτουμε από 5mL διαλύματος αμύλου στον κάθε δοκιμαστικό σωλήνα και περιμένουμε 10 λεπτά. Η αντίδραση λαμβάνει χώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Κατά τη διάρκεια της αναμονής γεμίζουμε τρεις δοκιμαστικούς σωλήνες με 10mL HCl. Μετά από 10λεπτά λαμβάνουμε με σιφώνιο 1mL από τον κάθε ένα και το προσθέτουμε στους δοκιμαστικούς σωλήνες που περιέχουν το HCl. 13

Από κάθε σωλήνα που περιέχει το μίγμα της αντίδρασης και το HCl, παίρνουμε με σιφώνιο 0,5mL, τα βάζουμε σε ένα νέο δοκιμαστικό σωλήνα και προσθέτουμε μία σταγόνα διαλύματος ιωδίου. Το διάλυμα πρέπει να έχει χρώμα βαθύ μπλε, αν υπάρχει άμυλο στο διάλυμα, καφέ- κόκκινο αν το άμυλο είναι μερικώς διασπασμένο και διαφανές, αν το άμυλο διασπάστηκε πλήρως. Με άλλα 0,5mL που βάζουμε πάλι σε δοκιμαστικό σωλήνα, κάνουμε το τεστ Benedict. Προσθέτουμε μερικές σταγόνες αντιδραστηρίου Benedict και θερμαίνουμε το δοκιμαστικό σωλήνα για δύο λεπτά. Υδρόλυση αµύλου από υγρό απορρυπαντικό Σκοπός: στο προτεινόμενο πείραμα Αντικαθιστούμε το διάλυμα του ενζύμου από υγρό απορρυπαντικό του εμπορίου που περιέχει ένζυμα (αμυλάση) και διερευνούμε τη δραστικότητά του. Σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα προσθέτουμε 5mL από το αραιωμένο διάλυμα του αμύλου (10g/L). Προσθέτουμε 5mL από το διάλυμα του απορρυπαντικού. Η αντίδραση γίνεται σε θερμοκρασία δωματίου. Περιμένουμε 10 λεπτά. Αφού περάσουν 10 λεπτά, σταματάμε την αντίδραση με HCl και κάνουμε τα τεστ ιωδίου και Benedict, όπως προαναφέρθηκαν. 14