Ηρυθµιση της σύνθεσης της Φεριτίνης είναι το καλύτερο παράδειγµα µεταφραστικής ρύθµισης µέσω µιας πρωτεϊνης πού δεσµευεται σε συγκεκριµένη αλληλουχία του m-rna ως µεταφραστικός καταστολέας Ηφεριτίνη είναι κύρια αποθηκευτική πρωτεϊνη σιδήρου στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς Χρησιµευει ακόµη στο να διατηρεί τον σιδηρο διαλυτό σε µη τοξική µορφή και ετσι αποφευγεται η εν δυνάµει καταστροφική δράση του σιδήρου
Χαρακτηριστικά της Φεριτίνης Είναι µια µεγάλη πρωτεϊνη η οποία συνισταται από 24 οµοιες η περίπου οµοιες υποµονάδες Οι υποµονάδες διατάσσονται υπό µορφή κελύφους (αποφεριτινη) Στο πρωτεινικό τµήµα της Φεριτίνης µπορούν να δεσµευθουν περίπου 4.000 ατοµα σιδήρου Στα θηλαστικά διακρίνονται δύο ειδών υποµονάδες οι βαρειές και οι ελαφρές ενώ ενας τριτος τύπος υποµονάδων ο ενδιάµεσος απαντα στα αµφίβια Η αποφεριτίνη συγκροτείται από τον οποιονδήποτε ανασυνδυασµό αυτλων των υποµονάδων µε την σύνθεση να προσδιορίζεται από το ειδικό για κάθε ιστό πρότυπο εκφρασης υποµονάδων
Ησύνθεση των υποµονάδων της φεριτίνης και κατα συνέπεια της φεριτίνης ρυθµίζεται συναρτήσει της ποσότητος του σιδήρου πού υπάρχει στο κύτταρο Οταν ο Σίδηρος βρίσκεται σε περιωρισµένη ποσότητα η ταχύτητα σύνθεσης της φεριτίνης είναι χαµηλή. Οταν ο σίδηρος βρίσκεται σε περίσσεια η ταχύτητα σύνθεσης της Φεριτίνης αυξάνεται και µπορεί να φθάσει 50-100 φορές πάνω από το οριο του σιδήρου
Ηρύθµιση της σύνθεσης της φεριτίνης ως ανταπόκριση στην µεταβολή στην συγκέντρωση του σιδήρου ελέγχεται στο επίπεδο της µετάφρασης Σε κύτταρα φτωχά σε σίδηρο το mrna της φεριτίνης βρίσκεται κυρίως στην µη µεταφραστική δεξαµενή Πρόσθεση σιδήρου στα κύτταρα επάγει Μετακίνηση του mrna της φεριτίνης από τα ελευθερα mrna στα πολυσώµατα. Αποτελεσµα που δείχνει οτι η εναρξη της µετάφρασης του mrna αυξάνει συναρτήσει της αυξησης της ποσοτητος του σιδήρου
M-RNA για την φεριτίνη πού αποµονώθηκαν από κύτταρα πλήρη σε σίδηρο δείχνουν οµοια ενεργότητα µε τα µηνύµατα που αποµονώνονται από κυτταρα φτωχά σε σίδηρο οταν µεταφρασθούν σε in vitro συστηµα από αρχέφυτρο σιταριού Τό πείραµα αυτό σαφώς δείχνει οτι ο σίδηρος δεν µπορεί να επηρεάσει αµεσα την ενεργότητα του mrna της φεριτίνης αλλά δρα δια µεσου trans acting µηχανισµού
Χαρακτηριστικά της Επαγωγής της Φεριτίνης Η Επαγωγή της σύνθεσης της Φεριτίνης από τον σίδηρο είναι πάρα πολύ γρήγορη. Ανιχνευεται µέσα σε 10 λεπτά από την πρόσθεση του σιδήρου στην κυτταροκαλλιέργεια Η επαγωγή δεν είναι ευαίσθητη σε αναστολείς της µεταγραφής.το αποτέλεσµα αυτό υποστηρίζει την αποψη οτι στο επίπεδο της µεταγραφής δεν υπάρχει ρυθµιση της σύνθεσης της φεριτίνης από σίδηρο
Χαρακτηριστικά του mrna για την Φερριτινη Γονίδια και cdnas που κωδικοποιούν για τις υποµονάδες της φεριτίνης εχουν κλωνοποιηθεί και εχει προσδιορισθεί η αλληλουχία τους Τα mrna για φεριτίνη εχουν ολα µέγεθος περίπου χιλιες βάσεις µε σχετικά µεγάλη µη µεταφραζόµενη περιοχή Σύγκριση των 5-UTRs σε mrna για την φεριτίνη σε διάφορους οργανισµούς εδειξε οτι υπάρχουν συντηρητικές αλληλουχίες To IRE (Iron response element) αναγνωρίζεται ως η µόνη συντηρητική αλληλοχία στην 5- µη µεταφραζό µενη περιοχή
Ενδειξεις που υποστηρίζουν οτι το IRE παίζει σηµαντικό ρόλο στην µεταφραστική ρυθµιση του mrna της Φεριτίνης Ηπαρουσία του και µόνο σε ολα τα mrna της Φεριτίνης υποδηλώνει οτι πρεπει να παίζει ενα σηµαντικό ρόλο Απαλειφη του IRE οδηγεί σε mrna για την Φεριτίνη τα οποία δεν ανταποκρίνονται στις µεταβολές των συγκεντρωσεων του σιδήρου Προσθήκη του IRE σε ετερόλογα µηνύµατα καταλήγει στην δηµιουργία µηνυµάτων των οποιων η µετάφραση ελέγχεται από σίδηρο Σηµειακές µεταλλάξεις µεσα στην περιοχή του IRE καταργούν την ρύθµιση
οµή του στοιχείου IRE (Iron response Element) Συνίσταται από βραχίονα και θηλειά,αυτο εχει προσδιορισθεί τοσο µε Η.Υ αλλά και µε χηµικά αντιδραστηρια και ενζυµα Η θηλειά αποτελείται από CAGUG (UC) Ο βραχίονας συνίσταται από ενα πενταµελές ανω στελεχος ενα µη συνεζευγµενο καταλοιπο C που βρισκεται 6 νουκλεοτιδια µακρυά από το 5 ακρο της θηλειάς και από ενα ενδεκαµελές κατω στελεχος Η σηµασία του νουκλεοτιδίου C αν υπάρχει είναι αγνωστη Μεταλλάξεις οι οποίες διασπούν το πάνω στελεχος και ελαττώνουν το µέγεθος της θηλειάς ή εξαφανίζουν το κύρτωµα στο C εξαφανίζουν και την ρυθµιστική ικανότητα του IRE Το κάτω τµήµα του στελέχους φαίνεται να µην εχει καποιο σηµαντικό ρόλο πλήν του δοµικού
Τριτοταγής δοµή του IRE Το IRE συγκροτείται από ένα στέλεχος µε µορφή α- έλικας µια εσωτερική διόγκωση µια περιοχή µε µεταξύ του πρώτου και του πέµπτου ολιγονουκλεοτιδίου της θηλιάς στην οποία παρατηρείται ζευγάρωµα κατά Watson-Crick ιάφορα παράγωγα περιλαµβανοµένου του συντηρηµένου C και των παραγώγων 3,4, 6 στην θηλιά έχουν ιδιαίτερη σηµασία
Με πειράµατα µετακίνησης της ζώνης RNA κατα την ηλεκτροφόρηση συναρτησει των διαφόρων πρωτεινικών κλασµατων που προσετιθεντο βρεθηκε IRE BP η οποία εχει ωρισµένα χαρακτηριστικά Είναι ενας κυτταροπλασµατικός παραγοντας ο οποίος δεσµευεται µε υψηλή εξειδικευση στο IRE Είναι ευαίσθητος στις πρωτεάσες και κατα συνέπεια θα πρεπει να θεωρείται οτι είναι πρωτείνη Εχει ενα µοριακό βάρος 84-87 Κda και προστατευει ενα κλάσµα 40-50 νουκλεοτιδίων από την αποικοδόµηση µε την ριβονουκλεάση
Χαρακτηριστικά της Ρυθµιστικής Πρωτείνης Από την ανάλυση τα αλληλουχίας κλώνου cdna που κωδικοποιεί για την συγκεκριµένη πρωτεΐνη βγαίνει το συµπέρασµα ότι η πρωτεΐνη παρουσιάζει υψηλή οµολογία µε την µιτοχονδριακή ακονιταση Στην πρωτεΐνη υπάρχει ένα ευαίσθητο σύµπλεγµα {Fe-S} που είναι πιθανόν να διαπλέκεται σε µηχανισµό µε την βοήθεια του οποίου η IRE-Bp αντιλαµβάνεται τα επίπεδα του σιδήρου Η αντιστρεπτή δέσµευση στο mrna της πρωτεΐνης φαίνεται να σχετίζεται µε την αναστρεπτή οξείδωση µιας σηµαντικής σουλφυδρυλοµάδος Όταν ο σίδηρος είναι σπάνιος η ανηγµένη µορφή της πρωτεΐνης {Fe-S } δεσµεύεται στο IRE. Όταν ο σίδηρος είναι άφθονος η οξειδωµένη µορφή της πρωτεΐνης {Fe-S} αποµακρύνεται από το IRE
ιερευνηση της αλληλουχίας των αµινοξέων στην IRE-Bp δεν απεκαλυψε προφανείς διαµορφώσεις για δεσµευση στο RNA Ηκρατούσα αποψη είναι οτι τα στοιχεία αναγνωρισης εντοπίζονται στην βασική δοµή.ετσι στοιχεία που ευθύνονται για την δεσµευση µπορούν να υπάρχουν σε διάφορα τµήµατα του µορίου τα οποια ερχονται κοντά δια µέσου τριτοταγών αντεπιδράσεων
ιαπιστωσεις από την µελέτη των αντεπιδράσεων της ρυθµιστικής πρωτείνης µε IRE Οι αντεπιδράσεις είναι ιδιαίτερα ισχυρές οι σταθερές διάστασης Kd κυµαίνονται από 20-100 µμ Η οξειδωτική κατάσταση της πρωτεϊνης εϊναι ιδιαίτερα σηµαντική για την ικανότητα δέσµευσης In vitro αριστη δεσµευση παρατηρείται µόνο παρουσία παραγόντων οι οποίοι ανάγουν τις σουλφυδρυλοµάδες Η διαδικασία οξείδωσης αναγωγής των σουλφυδρυλοµάδων πιστευεται οτι αποτελεί τµηµα του µηχανισµού ρυθµισης µε σιδηρο της ενεργότητος της πρωτείνης καταστολέα
Με µοντέλα στα οποία δηµιουργούνται µεταλλάξεις στις θέσεις στις οποίες δεσµεύεται η πρωτεΐνη βγαίνουν τα εξής συµπεράσµατα ως προς τον τρόπο δράσεως Ηέκταση της µεταβολής στα πειραµατικά συστήµατα είναι σηµαντικά µικρότερη από εκείνη που παρατηρείται In vivo. εδοµένο το οποίο υποδηλώνει ότι είναι πιθανόν να λειτουργούν και άλλοι µηχανισµοί εκτός εκείνου της δέσµευσης της πρωτεΐνης Η δοµή του IRE δεν φαίνεται να είναι καθοριστικής σηµασίας διότι αλλιώς η αναστολή θα γινόταν και χωρίς την δέσµευση της πρωτεΐνης. Η πρωτεΐνη πιθανόν να είναι αναγκαία για να σταθεροποιεί τις δοµές τoυ IRE Στο mrna που κωδικοποιεί για φεριτίνη τα IRE είναι τοποθετηµένα στα 30 νουκλεοτίδια από το τελικό άκρο. Η περιοχή αυτή φαίνεται να είναι ιδιαίτερα σηµαντική Σε πειράµατα που τα IRE µετακινήθηκαν στα 67 νουκλεοτίδια από το 5 άκρο παρατηρείται έλλειψη της καταστολής
Με πειράµατα µε In vitro συστήµατα πρωτεινοσύνθεσης βρεθηκε οτι η FRP (Feritin Repressor Protein) αναστελλει την µετάφραση Μετάφραση ενός µείγµατος mrna στο οποίο συµπεριλαµβάνεται και το mrna Φεριτίνης σε δικτυοκύτταρα οδηγεί σε ειδική καταστολή του mrna της φεριτίνης Μεταφραση του ιδίου µείγµατος σε συστηµα από αρχεφυτρα σιταριού οδηγεί σε κανονική µεταφραση ολων των mrna περιλαµβανοµένου και εκείνου της φεριτίνης Προσθηκγ κλασµάτων από το σύστηµα των δικτυοκυτταρων στο σύστηµα από αρχεφυτρα αραβοσίτου οδηγεί σε ειδική αναστολή του µηνύµατος της φεριτίνης
ιαπιστώσεις οσον αφορά την αναστολή της µετάφρασης του mrna της φεριτίνης µεσω των αντεπιδράσεων µεταξύ IRE-FRP Κατα την µετάφραση του mrna της φεριτίνης σε σύστηµα δικτυοκυττάρων δεν σχηµατίζονται πολυσώµατα ενώ οταν µεταφραζεται σε wheat germ σχηµατίζονται γεγονος που υποδηλώνει οτι η ενδογενής στο συστηµα των δικτυοκυ τταρων FRP παίζει σηµαντικό ρόλο στην συγκροτηση των πολυσωµατων Με καλλιεργούµενους ινοβλάστες ποντικού βρέθηκε οτι ο καταστολέας της φεριτίνης ανταγωνίζεται τον παραγοντα εναρξης eif-4f για πρόσδεση στο m-rna.η δεσµευση του ενός αποκλείει την δεσµευση του αλλου. Αυξηση της συγκεντρωσης του eif-4f στο in vitro σύστηµα ανατασσει την ανασταλτική ικανότητα του FRP Με In vitro πειράµατα βρέθηκε οτι η δράση της FRP µπορεί να διαπλέκεται µε την δεσµευση της 40S υποµονάδος στο m-rna Ανάλογα µε την απόσταση που το σύµπλεγµα IRE-FRP ευρίσκεται down stream από το 5 ακρο διαµορφώνεται και η ανασταλτική του ικανότητα
Είναι αναγκαίο να τονισθεί οτι σύµφωνα µε το µοντέλλο αυτό η αυξηµένη σύνθεση της φεριτίνης η οποία θα προκύψει παρουσία υψηλών ποσοτήτων σιδήρου θα οδηγήσει σε ελάττωση των επιπέδων του σιδήρου τα οποία βέβαια µε την σειρά τους θα οδηγήσουν στην εκ νεου καταστολή της µεταφρασης του mrna της φεριτίνης. Κατ αυτό τον τρόπο η φεριτίνη µπορεί να θεωρηθεί ως ανάδροµος καταστολέας της δικής της σύνθεσης
Σήµερα πιστευεται οτι τό σύστηµα της Αιµης παιζει ιδιαίτερα σηµαντικό ρόλο στην διαµόρφωση της ενεργοτητος της FRP Ετσι εχει βρεθει οτι Κατεργασία της FRP µε αιµη οδηγεί στην απώλεια της ενεργότητος της FRP Να δεσµευεται στο IRE H αναστολή της δεσµευσης της FRP στο RNA από την αίµη είναι συνάρτηση της ποσότητος της αίµης η οποία χρησιµοποιείται Η αίµη µπορεί και προκαλεί διασπαση του προσχηµατισµένου συµπλέγµατος FRP-IRE κατα τρόπο πού επίσης εξαρταται από την δόση της αίµης Παρόµοια δραση µε την Αίµη εχουν και αλλα ανάλογα της Co-πρωτοπορφυρίνης ενώ αλλες µεταλοπρωτοπορφυρίνες δεν παρουσιάζουν καµµιά τέτοια δράση
Ηδραση της Αιµης στη FRP εµφανίζεται να γίνεται σε δύο επίπεδα Σε µια ειδική θέση δεσµευσης στο FRP προσδένεται η αίµη και αυτή η αντεπίδραση είναι εκείνη πού παρεµποδίζει την δεσµευση του συµπλέγµατος στο IRE Η αίµη επάγει την γρήγορη αποικοδόµηση του FRP στα κύτταρα
Τα IRE σε συνεργασία µε τις πρωτείνες πού δεσµευονται σ αυτά είναι πιθανα να παίζουν κεντρικό ρόλο στην ρυθµιση της σύνθεσης µιας ποικιλίας πρωτεινών οι οποίες σχετίζονται µε σίδηρο Οµοιες IRE δοµές εχουν βρεθεί Στην 3 µη µεταφραζόµενη περιοχή του mrna για τον υποδοχέα της τρανσφερίνης ως τµήµα µεγαλυτερου ρυθµιστικού στοιχείου χρησιµοποιείται στον ελεγχο της σταθεροτητος του mrna σε σχεση µε σίδηρο Στην 5-UTR του mrna για την δ-αµινολεβουλινική συνθετάση. Ρυθµίζει την µετάφραση του ενζυµου ανάλογα µε την συγκεντρωση του σιδήρου Στην 5-UTR του mrna της µιτοχονδριακής ακονιτάσης,εάν η µεταφραση του mrna της ακονιτάσης επίσης ρυθµίζεται από σιδηρο είναι αγνωστο.οµως η πρωτείνη που δεσµευεται στο IRE είναι και αυτή ακονιτάση
Χαρακτηριστικά IRE-Bp και FRP Με πειράµατα κλωνοποίησης του cdna για την IRE-Bp και την FRP βρεθηκε οτι είναι ιδιες πρωτεϊνες Συγκριση των αλληλουχιών πού οι πρωτεϊνες αυτές εχουν σε ανθρωπό, ποντίκι και κουνέλι εδειξε οτι υπάρχει µια υψηλή συντηρητικότητα Η IRE-Bp εµφανίζεται να εχει υψηλή οµολογία µε το ενζυµο του κύκλου των τρικαρβοξυλικών οξέων ακονιτάση Υπάρχει οµολογία µε την ακονιτάση που αποµονώνεται από την E.coli πάνω από 60% οµως υπάρχει οµολογία και µε την µιτοχονδριακή ακονιτάση Η ακονιτάση είναι µια θειο-σιδηρο πρωτεϊνη της οποίας η ενεργοτητα ελέγχεται εάν στο σύµπλεγµα εχωµε 3 ή 4 Fe. Είναι πολύ πιθανον και η IRE-Bp να ρυθµιζεται οµοια
Μηχανισµός Ελέγχου της µετάφρασης του mrna της Φεριτίνης Σε χαµηλή συγκέντρωση σιδήρου ενας πρωτεινικός καταστολέας Μ.Β. 98 Kda δεσµευεται κοντά στο 5 ακρο του mrna της φεριτίνης σε µια δοµή 28 νουκλεοτιδίων που συγκροτούν ενα βραχίονα µε µια θηλειά Μέσω της δεσµευσης αυτής παρεµποδίζεται η µετάφραση του mrna της φεριτίνης Παρουσία σιδήρου η δοµή του καταστολέα µεταβάλλεται ουτως ωστε να απελευθερώνεται από το mrna της φεριτίνης και αυτό να µπορεί να µεταφράζεται