Κατα το θερµικό Σοκ µαζί µε τις αλλαγές πού επισυµβαινουν στην µεταγραφή παρατηρείται και µια επιλεκτική µετάφραση των µηνυµάτων εκείνων που

Transcript

1 Κατα το θερµικό Σοκ µαζί µε τις αλλαγές πού επισυµβαινουν στην µεταγραφή παρατηρείται και µια επιλεκτική µετάφραση των µηνυµάτων εκείνων που κωδικοποιούν για τις πρωτεϊνες που επάγονται από το θερµικό Σοκ

2 Ηταχύτητα της επαγωγής το µέγεθος της ανταπόκρισης και η αναπαραφωγικότητα του επιτελέσµατος συνεργάζονται στο να κάνουν το σύστηµα ιδεατό για την διερευνηση του µηχανισµού της γονιδιακής εκφρασης σε µια µεγάλη ποικιλία οργανισµών

3 Γενικά Χαρακτηριστικά του Φαινοµένου του Θερµικού Σοκ Η ανταπόκριση στο Θερµικό Σοκ φαίνεται να ρυθµίζεται ανάλογα µε την θερµοκρασία. Στην ροσόφιλα στους 29 C εµφανίζονται για πρώτη φορά οί πρωτεΐνες πού επάγονται. Στους 35 C αρχίζει να εµφανίζεται η καταστολή προϋπαρχόντων µηνυµάτων.στους 37 η µετάφραση των κανονικών κυτταρικών πρωτεινών καταστέλλεται πολύ απότοµα Λαµβάνοντας υπ οψη την ετερογένεια των µηνυµάτων που υπάρχει στο κύτταρο είναι λογικό να υποθέσουµε ότι η καταστολή της µετάφρασης κατά το θερµικό σοκ πρέπει να γίνεται µε ένα πολύ γενικό µηχανισµό εν φαίνεται να προκαλείται καµία ζηµιά στην µεταφραστική µηχανή. Η ταχύτητα έναρξης των µηνυµάτων πού επάγονται µετά το θερµικό σοκ υπολογίζεται σε θέσεις έναρξης ανά λεπτό και ανά µήνυµα τιµές πού συγκρίνονται ευνοϊκά µε τις τιµές που παρατηρούνται στα αλλά κύτταρα

4

5 Χαρακτηριστικά της επαγωγής της µετάφρασης µε Θερµικό Σοκ Η ταχύτητα και η ένταση είναι εκπληκτική.στην. ροσόφιλα π.χ παρατηρείται πλήρης αλλαγή στο πρότυπο της πρωτεινοσύνθεσης 15 λεπτά µετά την έκθεση Η Η ανταπόκριση επιτυγχάνεται µε συνδυασµένη δράση µιας σειράς ρυθµιστικών µηχανισµών που δρουν σε διάφορα επίπεδα όπως µεταγραφή ωρίµανση, µεταβολισµός RNA Υπάρχει µεγάλη ποικιλότητα ως προς την αφθονία µε την οποία οι διάφορες πρωτεΐνες του θερµικού Σοκ εκφράζονται σε διάφορους οργανισµούς.σε άλλους οργανισµούς επάγονται ισχυρά και σε άλλους λιγότερο ισχυρά Η Η ανταπόκριση στο θερµικό Σοκ φαίνεται να µπορεί να αυτορυθµίζεται και έχουν διατυπωθεί µοντέλα για το πώς οι πρωτεΐνες µπορούν να επηρεάζουν την ρύθµιση τους σε διάφορα επίπεδα π.χ προκαλώντας ελλείψεις ή και µεταλλάξεις στα γονίδια που τις κωδικοποιούν

6 Η ανταπόκριση στο Θερµικό Σοκ φαίνεται να ρυθµίζεται ανάλογα προς την θερµοκρασία Μετακίνηση των κυττάρων από τους 25 όπου συνήθως αναπτύσσονται στους 35 ή και 37 θα δώσει διαφορετική κατανοµή πρωτεινών ανάλογα και µε την θερµοκρασία ανάπτυξης Ο Ο τρόπος ρύθµισης του φαινοµένου είναι διαφορετικός ανάλογα µε το πόσο αυξάνεται η θερµοκρασία π.χ Α. Αύξηση κατά 4 C οδηγεί σε αύξηση στην βιοσύνθεση των πρωτεινών αλλά η επαγωγή ελέγχεται στο επίπεδο της µεταγραφής Β. Αύξηση της θερµοκρασίας στους 33 C οδηγεί στην καταστολή µετάφρασης προϋπαρχόντων µηνυµάτων Γ. Αύξηση στους 37 C οδηγεί σε απότοµη καταστολή της µετάφρασης κυτταρικών πρωτεινών

7 Η εµφάνιση και κατανοµή των πρωτεινών του θερµικού Σοκ είναι συνάρτηση του χρόνου επώασης της Θερµοκρασίας αλλά και του πρωτοκόλλου πού ακολουθείται

8 Ο βαθµός της εξελικτικής συντηρητικότητας µεταξύ των πρωτεινών φαίνεται να ποικίλει.παρ όλα αυτά εντοπίζεται κάποια σχέση µεταξύ των πρωτεινων αυτών Για παράδειγµα Η hsp 70 είναι µία από τις πιο γνωστές συντηρητικές πρωτεΐνες που εµφανίζονται τόσο στους προκαρυωτικούς όσο και στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς. Η πρωτεΐνη που αποµονώνεται από τον άνθρωπο έχει κατά 50 % ίδια αµινοξέα µε την πρωτεΐνη πού αποµονώνεται από την E. coli H Hsp των ευκαρυωτικών φαίνεται να αντιστοιχεί µε την 83 της E.coli HspHsp Πρωτείνες µοριακού βάρους των ευκαρυωτικών φαίνεται να αντιστοιχούν µε την GroES και Gro E1 της E.coli

9 Ενδείξεις που υποστηρίζουν ότι οι πρωτεΐνες του θερµικού Σοκ παίζουν ένα κεντρικό ρόλο στην προστασία του κυττάρου από το Stress Σε καλλιέργειες σακχαροµυκητών οι οποίες επωάζοντο στους 37 C για να αναπτύξουν µια θερµοαντοχή. ιαπιστώθηκε ότι όταν η έκθεση τους γίνει στους 50 C για 10 λεπτά φαίνονται να επιβιώνουν 1000 φορές καλύτερα σε σχέση µε τις καλλιέργειες στις οποίες έχει γίνει µια µετάλλαξη στο γονίδιο που κωδικοποιεί για την πρωτεΐνη Hsp 104 Ινοβλάστες πού παρασκευάζονται από ποντικό µετασχηµατίζονται µε γονίδια τα οποία παράγουν την hsp 70 πρωτεΐνη και στην συνέχεια µετακινούνται από τις κανονικές αναπτυξιακές συνθήκες σε θερµοκρασία των 45 C. Οι µετασχηµατισµένοι ινοβλάστες παρουσιάζουν µια επιβίωση που είναι 1000 φορές µεγαλύτερη σε σχέση µε την επιβίωση που παρουσιάζει η αρχική σειρά

10 Χαρακτηριστικά των πρωτεινών του θερµικού Σοκ Hsp 70 Η οµάδα των Hsp 70 είναι από τις πλέον εξέχουσες οµάδες στους περισσότερους οργανισµούς. Στην E.coli εµφανίζεται µόνο µία πρωτεΐνη ενώ στους ευκαρυωτικούς τουλάχιστον 3 η κάθε µία από τις οποίες έχει 50% οµολογία αµινοξέων µε την E.coli Οι πρωτεΐνες της οικογενείας βρίσκονται σε κάθε διαµέρισµα του κυττάρου. ιακριτές Hsp 70 έχουν βρεθεί στο ενδοπλασµατικό δίκτυο στα µιτοχόνδρια στους χλωροπλάστες και στον πυρήνα. Άλλες από τις πρωτεΐνες της οµάδος είναι συστατικά του οργανιδίου ή του πυρήνα και άλλες κατανέµονται µεταξύ οργανιδίου και κυτταροπλάσµατος Υπάρχει ουσιώδης εξειδίκευση των διαφόρων πρωτεινών της οµάδος στους διάφορους οργανισµούς άλλες είναι ουσιώδεις στους µύκητες και άλλες σε άλλους οργανισµούς Όλα τα µέλη της οικογενείας των hsp 70 δεσµεύουν ΑΤΡ και έχουν µια ασθενή ενεργότητα ΑΤΡασης

11 Θέσεις δέσµευσης των Hsp 70 πρωτεινών Οι Hsp δεσµεύονται σε διάφορα υποστρώµατα και συµµετέχουν σε µια ποικιλία διεργασιών όπως η πτύχωση και η αποπτύχωση της πρωτεΐνης, η συγκρότηση και αποδιοργάνωση συγκροτηµάτων Έτσι έχει βρεθεί ότι οι Hsp δεσµεύονται Σε µικρά πεπτίδια Σε αρτιγενείς αλυσίδες των πολυσωµάτων Σε πρωτεΐνες οι οποίες έχουν κατευθυνθεί σε λάθος κυτταρικό διαµέρισµα Σε µεταλλαγµένες πρωτεΐνες ή υποµονάδες πρωτεινών οι οποίες εκφράζονται απουσία των λοιπών υποµονάδων

12 Τρόπος δράσης των Hsp 70 πρωτεινών Οι Hsp 70 πρωτεΐνες κατά την λειτουργία τους χρησιµοποιούν ΑΤΡ εσµεύονται σε υδρόφοβες επιφάνειες και σταθεροποιούν πρωτεΐνες στόχους σε πλήρη ή σε µερικά αποπτυχωµένη µορφή Καθώς δηλαδή µε την αύξηση της θερµοκρασίας η πρωτεΐνη στόχος αποπτυχώνεται η πρωτεΐνη της οµάδος των Hsp 70 δεσµεύεται σε υδρόφοβες περιοχές της πρωτεΐνης στόχου οι οποίες λογικά θα αντεπιδρούσαν µε άλλες υδρόφοβες περιοχές και θα δηµιουργούσαν δυσδιάλυτα συσσωµατώµατα Όταν η θερµοκρασία επανέλθει στα φυσιολογικά επίπεδα οι πρωτεΐνες Hsp 70 αποµακρύνονται από την πρωτεΐνη στόχο και τις επιτρέπουν να επαναπτυχωθεί στην κανονική δοµή

13 Χαρακτηριστικά των Hsp 60 Στα βακτήρια η Hsp 60 η οποία είναι γνωστή και ως Gro EL ή κιαπερώνειο 60 είναι µία από τις πλέον άφθονες πρωτεΐνες στο κύτταρο ακόµη και υπό κανονικές συνθήκες Στα ευκαρυωτικά οι συγκεκριµένες πρωτεΐνες βρίσκονται κύρια στα Μιτοχόνδρια και τους χλωροπλάστες ενώ δεν έχουν ακόµα ξεκάθαρα προσδιορισθεί σε αλλα ευκαρυωτικά κυτταρικά διαµερίσµατα Η Hsp 60/Gro EL δεν έχουν ιδιαίτερα υψηλή συγγένεια για τα περισσότερα υποστρώµατα των hsp 70 Η Hsp 60/ Gro EL παρουσιάζει υψηλή συγγένεια για ορισµένες µετουσιωµένες πρωτεΐνες όπως πολυπεπτίδια µετουσιωµένα µε ουρία καθώς επίσης και για εξατοµικευµένες υποµονάδες ορισµένων πρωτεινών που προορίζονται για την δηµιουργία ολιγοµερών

14 Τρόπος δράσης της Hsp 60 Η λειτουργία της Gro EL εξαρτάται από µια πρωτεΐνη την hsp Gro ES H Gro EL δεσµεύεται σε µετουσιωµένες πρωτεΐνες και παρεµποδίζει την συσσωµάτωση τους Όταν η Gro ES συνδέεται µε το σύµπλεγµα της µετουσιωµένης πρωτεΐνης που εχει δεσµευθεί στο Gro EL εχωµε µία υδρόλυση του ΑΤΡ η οποία και προωθεί την πτύχωση των αποπτυχωµένων πρωτεινών που ευρίσκονται δεσµευµένες στην επιφάνεια του Gro EL και προωθεί την απελευθέρωση τους από το σύµπλεγµα In vivo οι πρωτεΐνες της τάξης των Gro EL χρησιµοποιούνται για την δηµιουργία ολιγοµερών πρωτεϊνικών δοµών όπως είναι η καρβοξυλάση της διφοσφωρικής ριβουλόζης ή της κεφαλής των βακτηριοφάγων

15 Η καρβοξυλάση της διφωσφορικήw ριβουλόζης µπορεί να συγκροτηθεί από τις υποµονάδες της σε λειτουργική πρωτεΐνη µόνο µέχρι τους 10 C Από τους 25 C και πάνω δεν µπορεί να διοργανωθεί κατάλληλα και να σχηµατίσει λειτουργικά συσσωµατώµατα εκτός αν υπάρχει παρούσα η gro EL

16 Χαρακτηριστικά της Hsp 90 Τα µέλη της οικογενείας των Hsp 90 βρίσκονται τόσο σε προκαρυωτικούς όσο και σε ευκαρυωτικούς οργανισµούς Στα προκαρυωτικά η πρωτεΐνη υπάρχει διαθέσιµη κατά την ανάπτυξη του οργανισµού σε χαµηλή θερµοκρασία και παρουσιάζει µικρή µόνο αύξηση κατά την ανάπτυξη σε υψηλές θερµοκρασίες Στους σακχαροµύκητες και στους περισσότερους ευκαρυωτικούς οργανισµούς η Hsp 90 φαίνεται να παρουσιάζει ρόλο και δείχνει µια εντυπωσιακή αύξηση της σύνθεσης µε την θερµοκρασία Στους υψηλότερους ευκαρυωτικούς οργανισµούς η οικογένεια των Hsp 90 εµπλουτίζεται µε µια πρωτεΐνη η οποία διαπλέκεται µε το ενδοπλασµατικό δίκτυο

17 Μέλη της οµάδος των hsp 90 στους υψηλότερους ευκαρυωτικούς οργανισµούς αντεπιδρούν µε διάφορες κυτταρικές πρωτεΐνες µεταξύ των οποίων περιλαµβάνονται οι υποδοχείς των στεροειδών ορµονών,η ογκογόνος κινάση της τυροσίνης οι κινάσες οι οποίες ελέγχονται από την αίµη Ο Ο τρόπος αντεπίδραση των hsp 90 µε τις πρωτεΐνες αυτές εξακολουθούν να παραµένουν άγνωστες Τα συµπλέγµατα των hsp 90 µε τις πρωτεΐνες που ενώνονται In vivo παραµένουν σταθερά για µεγάλα χρονικά διαστήµατα

18 Χαρακτηριστικά της αντεπίδρασης των hsp90 µε τους υποδοχείς των στεροειδών ορµονών Η αντεπίδραση των hsp 90 µε τους υποδοχείς των στεροειδών ορµονών εχει χαρακτηριστικά τόσο ενεργοποίησης οσο και καταστολής της ενεργότητος των υποδοχέων. Η παρουσία πάντως των συγκεκριµένων πρωτεινών κρίνεται εντελώς αναγκαία για να παρατηρηθεί η οποια ενεργοποίηση της λειτουργίας του υποδοχεως

19 Χαρακτηριστικά των Hsp 100 πρωτεινών Οι πρωτεΐνες πού ανήκουν στην οµάδα αυτή έχουν ευρεθεί σε εξελικτικά αποµεµακρυσµένους οργανισµούς µεταξύ των οποίων περιλαµβάνονται βακτήρια µύκητες τρυπανοσώµατα θηλαστικά και φυτά Ενώ στα κύτταρα της ροσόφιλας µια τέτοια οµάδα πρωτεινών δεν φαίνεται να εκφράζεται όταν αυξηθούν οι θερµοκρασίες.στους σακχαροµύκητες και στην Ε.Coli Coli οι πρωτεΐνες αυτές φαίνεται να παίζουν πολύ σηµαντικό ρόλο στο να προστατεύουν τα κύτταρα από ακραίες θερµοκρασίες και άλλες µορφές Stress Περιέχουν δύο περιοχές πολύ υψηλής οµολογίας οι οποίες φαίνεται να είναι απαραίτητες για να ασκηθεί ο προστατευτικός ρόλος στους σακχαροµύκητες Φαίνεται να υπάρχει ουσιαστική λειτουργική συγγένεια µε τις πρωτεΐνες της οικογενείας των Hsp 70

20 Χαρακτηριστικά και δράση της Ουµπικιτίνης Η ουµπικιτίνη είναι µια πολύ µικρή συντηρητική πρωτεΐνη η οποία υπάρχει σε αφθονία σε όλα τα ευκαρυωτικά όχι όµως και στα προκαρυωτικά κύτταρα Η ουµπικιτίνη εµπλέκεται σε µια σειρά χαρακτηριστικές λειτουργίες µεταξύ των οποίων περιλαµβάνεται η ρύθµιση της πρωτεόλυσης µέσω του κυρίου συµπλέγµατος του κυττάρου το οποίο εξαρτάται από ΑΤΡ Τόσο η ουµπικιτίνη όσο και ορισµένα ένζυµα τα οποία διασυνδέουν την ουµπικιτίνη µε άλλες πρωτεΐνες επάγονται από την θερµοκρασία Η λειτουργία της ουµπικιτίνης σε συνδυασµό και µε την επαγωγή που υφίσταται από την αύξηση της θερµοκρασίας σχετίζεται µε την αποικοδόµηση των πρωτεινών που έχουν αποδιαταχθεί µε την αύξηση της θερµοκρασίας και δεν είναι δυνατόν να επισκευασθούν µε άλλες πρωτεΐνες θερµικού σοκ