Cytology FISH Accessory Kit Αρ. κωδικού K 5499 2η έκδοση Για in situ υβριδισµό µε φθορισµό (FISH) σε δείγµατα κυτταρολογίας. Το κιτ περιέχει αντιδραστήρια που επαρκούν για 20 εξετάσεις.
Περιεχόµενα Σελίδα Χρήση για την οποία προορίζεται...3 Εισαγωγή...3 Αντιδραστήρια...3 Παρεχόµενα υλικά...3 Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται...3 Προφυλάξεις...4 Φύλαξη...4 Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ Α. Παρασκευή αντιδραστηρίων...5 A.1 Wash Buffer...5 A.2 Φορµαλδεΰδη 3,7%...5 A.3 Stringency Buffer...5 A.4 Σειρά αιθανόλης...5 B. ιαδικασία χρώσης...5 B.1 Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία...5 B.2 Πρωτόκολλο χρώσης...6 Ποιοτικός έλεγχος...7 Ερµηνεία των αποτελεσµάτων...7 Αναφορές...8 Αντιµετώπιση προβληµάτων...9 Παράρτηµα 1...11
Χρήση για την οποία προορίζεται Για in vitro διαγνωστική χρήση. Το Cytology FISH Accessory Kit προορίζεται για χρήση στην τεχνική in situ υβριδισµού µε φθορισµό (FISH) σε δείγµατα κυτταρολογίας. Εισαγωγή Το κιτ χρησιµοποιείται σε µια διαδικασία δύο ηµερών. Την πρώτη ηµέρα, εκτελείται µια προεπεξεργασία των δειγµάτων κυτταρολογίας (που παρέχονται από το χρήστη) µε χρήση φορµαλδεΰδης 3,7% επί 2 λεπτά, πριν από την αφυδάτωση µε χρήση αιθανόλης. Μετά την προεπεξεργασία, εφαρµόζονται ανιχνευτές FISH που παρέχονται από το χρήστη και στεγανοποιούνται τα δείγµατα µε Coverslip Sealent, πριν από τη µετουσίωση και τον υβριδισµό ολονυκτίως. Τη δεύτερη ηµέρα, εκτελείται πλύση ισχύος (Stringency Wash), η οποία διασφαλίζει την αφαίρεση του µη δεσµευµένου και του µη ειδικού δεσµευµένου ανιχνευτή FISH, πριν από την αφυδάτωση µε αιθανόλη. Τέλος, τα δείγµατα στερεώνονται µε Fluorescence Mounting Medium που περιέχει κυανή αντιχρωστική φθορισµού και καλύπτονται µε καλυπτρίδα. Τα αποτελέσµατα ερµηνεύονται µε χρήση µικροσκοπίου φθορισµού που διαθέτει κατάλληλο φίλτρο (δείτε το παράρτηµα 1). Αντιδραστήρια Παρεχόµενα υλικά Τα υλικά που παρατίθενται παρακάτω επαρκούν για 20 εξετάσεις (µια εξέταση ορίζεται ως µία περιοχή στόχος διαστάσεων 18 mm x 18 mm). Φιαλίδιο 1 Wash Buffer (x 20) 500 ml, 20 x συµπυκνωµένο ρυθµιστικό διάλυµα Tris/HCl. Φιαλίδιο 2 Stringency Buffer (x 20) 150 ml, 20 x συµπυκνωµένο ρυθµιστικό διάλυµα SSC (αλατούχο διάλυµα-κιτρικό νάτριο) µε απορρυπαντικό. Φιαλίδιο 3 Στοιχείο 4 Fluorescence Mounting Medium 300 µl Έτοιµο για χρήση µέσο στερέωσης φθορισµού µε κυανή αντιχρωστική. Coverslip Sealant 1 σωληνάριο Έτοιµο για χρήση διάλυµα για αφαιρούµενο στεγανωτικό καλυπτρίδων. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Όλα τα αντιδραστήρια είναι διαµορφωµένα ειδικά για χρήση µε το κιτ αυτό. Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Εργαστηριακά αντιδραστήρια Απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό Αιθανόλη, 96% Φορµαλδεΰδη, 37% Εργαστηριακός εξοπλισµός Ρυθµιζόµενες πιπέτες
Βαθµονοµηµένο θερµόµετρο µερικής εµβάπτισης (εύρος 37-100 C) Βαθµονοµηµένο θερµόµετρο επιφανείας (εύρος 37-100 C) Καλυπτρίδες (18 mm x 18 mm) Λαβίδα Απαγωγός αναθυµιάσεων Θερµαντικό στοιχείο ή φούρνος υβριδισµού για µετουσίωση (82 (±2) C) Υγρός θάλαµος υβριδισµού Φούρνος υβριδισµού ή θάλαµος επώασης για ολονύκτιο υβριδισµό (45 (±2) C) Αντικειµενοφόροι πλάκες, Dako Silanized Slides, αρ. κωδικού S 3003, αντικειµενοφόροι πλάκες επιστρωµένες µε πολυ-l-λυσίνη ή αντικειµενοφόροι πλάκες υπερπαγετού οχεία ή λουτρά χρώσης Χρονόµετρο (µε ικανότητα χρονοµέτρησης διαστηµάτων 2-15 λεπτών) Υδατόλουτρο µε καπάκι (µε ικανότητα διατήρησης 65 (±2) C έως 99 C) Εξοπλισµός και παρελκόµενα µικροσκοπίου Φίλτρα για µικροσκόπιο φθορισµού: Φίλτρο DAPI και κατάλληλα φίλτρα για το φθορισµόχρωµα που χρησιµοποιείται, π.χ. διπλό φίλτρο FITC/Texas Red ή µονά φίλτρα FITC και Texas Red για ανιχνευτές Dako FISH δείτε το παράρτηµα 1 για λεπτοµέρειες Συνιστάται µικροσκόπιο φθορισµού µε λαµπτήρα υδραργύρου 100 W για ανιχνευτές Dako FISH Θήκη αντικειµενοφόρων πλακών µικροσκοπίου (χαρτονένιος δίσκος για 20 αντικειµενοφόρους πλάκες µε αρθρωτό κάλυµµα ή παρόµοιος) Προφυλάξεις 1. Για επαγγελµατίες χρήστες. 2. Φιαλίδιο 1, Wash Buffer (20x), περιέχει 10-<25% sodium chloride και 10-<20% trometamol. Φιαλίδιο 1είναι σηµασµένο: H319 H315 P280 Κίνδυνος P264 P302 + P352 + P362-2 + P363 P332 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 Προκαλεί σοβαρό οφθαλµικό ερεθισµό. Προκαλεί ερεθισµό του δέρµατος. Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτια ή το πρόσωπο. Πλύνετε τα χέρια σχολαστικά µετά το χειρισµό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΕΡΜΑ: Πλύνετε µε άφθονο νερό και σαπούνι. Βγάλτε τα µολυσµένα ρούχα. Πλύνετε τα µολυσµένα ενδύµατα πριν τα ξαναχρησιµοποιήσετε. Εάν παρατηρηθεί ερεθισµός του δέρµατος: Επισκεφθείτε γιατρό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά µε νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. Εάν δεν υποχωρεί ο οφθαλµικός ερεθισµός: Επισκεφθείτε γιατρό. 3. Φιαλίδιο 2, Stringent Wash Buffer (20x), περιέχει 10-<25% sodium chloride, και 10-<20% 2-amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Φιαλίδιο 2 είναι σηµασµένο: Κίνδυνος H319 Προκαλεί σοβαρό οφθαλµικό ερεθισµό. H315 Προκαλεί ερεθισµό του δέρµατος. P280 Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτια ή το πρόσωπο.
P264 P302 + P352 + P362-2 + P363 P332 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 Πλύνετε τα χέρια σχολαστικά µετά το χειρισµό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΕΡΜΑ: Πλύνετε µε άφθονο νερό και σαπούνι. Βγάλτε τα µολυσµένα ρούχα. Πλύνετε τα µολυσµένα ενδύµατα πριν τα ξαναχρησιµοποιήσετε. Εάν παρατηρηθεί ερεθισµός του δέρµατος: Επισκεφθείτε γιατρό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΑ ΜΑΤΙΑ: Ξεπλύνετε προσεκτικά µε νερό για αρκετά λεπτά. Εάν υπάρχουν φακοί επαφής, αφαιρέστε τους, εφόσον είναι εύκολο. Συνεχίστε να ξεπλένετε. Εάν δεν υποχωρεί ο οφθαλµικός ερεθισµός: Επισκεφθείτε γιατρό. 4. Υλικό 4. Coverslip Sealant, περιέχει 100% ελαφρά υδρογονοκατεργασµένη νάφθα (πετρέλαιο), µε τη σήµανση: Κίνδυνος H225 H304 H411 P280 P210 P241 P242 P243 P233 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P405 P403 P235 P501 Υγρό και ατµοί πολύ εύφλεκτα. Μπορεί να προκαλέσει θάνατο σε περίπτωση κατάποσης και διείσδυσης στις αναπνευστικές οδούς. Τοξικό για τους υδρόβιους οργανισµούς, µε µακροχρόνιες επιπτώσεις. Να φοράτε προστατευτικά γάντια. Να φοράτε µέσα ατοµικής προστασίας για τα µάτια ή το πρόσωπο. Μακριά από θερµότητα, θερµές επιφάνειες, σπινθήρες, γυµνές φλόγες και άλλες πηγές ανάφλεξης. Μην καπνίζετε. Να χρησιµοποιείται αντιεκρηκτικός ηλεκτρολογικός, εξαερισµού, φωτιστικός και για χειρισµό όλων των υλικών εξοπλισµός. Να χρησιµοποιούνται µόνο εργαλεία που δεν παράγουν σπινθήρες.. Λάβετε προστατευτικά µέτρα έναντι ηλεκτροστατικών εκκενώσεων. Να διατηρείται ο περιέκτης ερµητικά κλειστός. Avoid release to the environment. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΚΑΤΑΠΟΣΗΣ: Καλέστε αµέσως το ΚΕΝΤΡΟ ΗΛΗΤΗΡΙΑΣΕΩΝ/γιατρό. ΜΗΝ προκαλέσετε εµετό. ΣΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΕΠΑΦΗΣ ΜΕ ΤΟ ΕΡΜΑ (ή µε τα µαλλιά): Βγάλτε αµέσως όλα τα µολυσµένα ρούχα. Ξεπλύνετε την επιδερµίδα µε νερό/στο ντους. Φυλάσσεται κλειδωµένο. Αποθηκεύεται σε καλά αεριζόµενο χώρο. Keep cool. Να διατηρείται δροσερό. ιάθεση του περιεχοµένου και του περιέκτη σύµφωνα µε όλους τους τοπικούς, περιφερειακούς, εθνικούς και διεθνείς κανονισµούς. 5. Χρόνοι και θερµοκρασίες επώασης ή µέθοδοι διαφορετικές από εκείνες που καθορίζονται, ενδέχεται να δώσουν εσφαλµένα αποτελέσµατα. 6. Τα αντιδραστήρια έχουν αραιωθεί µε βέλτιστο τρόπο. Περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να έχει ως αποτέλεσµα απώλεια της απόδοσης. Φύλαξη Φιαλίδιο 1, Wash Buffer, φυλάσσετε στους 2-8 C. Φιαλίδιο 2, Stringency Buffer, φυλάσσετε στους 2-8 C. Φιαλίδιο 3, Fluorescence Mounting Medium, φυλάσσετε στο σκότος στους 2-8 C. Στοιχείο 4, Coverslip Sealant, φυλάσσετε στους 2-8 C.
Το Fluorescence Mounting Medium (φιαλίδιο 3) ενδέχεται να επηρεαστεί δυσµενώς εάν εκτεθεί σε υπερβολικά επίπεδα φωτός. Μη φυλάσσετε το συστατικό αυτό και µην εκτελείτε ανάλυση σε έντονο φως, όπως το άµεσο ηλιακό φως. Μη χρησιµοποιείτε το κιτ µετά την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στο κουτί του κιτ. Εάν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται υπό συνθήκες διαφορετικές από εκείνες που καθορίζονται σε αυτό το ένθετο συσκευασίας, ο χρήστης πρέπει να επικυρώσει την απόδοση του αντιδραστηρίου (1). εν υπάρχουν εµφανή σηµεία που να υποδεικνύουν αστάθεια του προϊόντος αυτού. Εποµένως, είναι σηµαντικό να αξιολογείτε τα φυσιολογικά κύτταρα στο δείγµα που αναλύεται. Εάν παρατηρηθεί µη αναµενόµενη µορφολογία φθορισµού που δεν είναι δυνατό να επεξηγηθεί από διαφορές στις εργαστηριακές διαδικασίες και υποψιάζεστε πρόβληµα µε το κιτ Cytology FISH Accessory Kit, επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υπηρεσία µας. Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ A. Παρασκευή αντιδραστηρίων Είναι βολικό να παρασκευάζονται τα ακόλουθα αντιδραστήρια πριν από τη χρώση: A.1 Wash Buffer Αραιώστε επαρκή ποσότητα του φιαλιδίου 1 (Wash Buffer x 20) µε αραίωση του συµπυκνώµατος σε αναλογία 1:20 σε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό. Το µη χρησιµοποιηµένο αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα µπορεί να φυλάσσεται στους 2-8 C επί ένα µήνα. Απορρίψτε το αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα εάν έχει νεφελώδη εµφάνιση. A.2 Φορµαλδεΰδη 3,7% Παρασκευάστε επαρκή ποσότητα φορµαλδεΰδης 3,7% µε αραίωση φορµαλδεΰδης 37% σε αναλογία 1:10 σε αραιωµένο Wash Buffer (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.1). Φυλάσσετε τα καλυµµένα δοχεία σε θερµοκρασία δωµατίου και χρησιµοποιήστε τα για 100 αντικειµενοφόρους πλάκες το πολύ. Απορρίψτε το αραιωµένο διάλυµα εάν έχει νεφελώδη εµφάνιση. A.3 Σειρά αιθανόλης Από ένα διάλυµα αιθανόλης 96%, παρασκευάστε 3 δοχεία µε αιθανόλη 70%, 85% και 96%, αντίστοιχα. Φυλάσσετε τα καλυµµένα δοχεία σε θερµοκρασία δωµατίου ή στους 2-8 C και χρησιµοποιήστε για 200 αντικειµενοφόρους πλάκες το πολύ. Απορρίψτε τα διαλύµατα εάν έχουν νεφελώδη εµφάνιση. A.4 Stringency Buffer Αραιώστε επαρκή ποσότητα του φιαλιδίου 2 (Stringency Buffer x 20) µε αραίωση του συµπυκνώµατος σε αναλογία 1:20 σε απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό. Το µη χρησιµοποιηµένο αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα µπορεί να φυλάσσεται στους 2-8 C επί ένα µήνα. Απορρίψτε το αραιωµένο ρυθµιστικό διάλυµα εάν έχει νεφελώδη εµφάνιση. B. ιαδικασία χρώσης B.1 Σηµειώσεις που αφορούν τη διαδικασία Ο χρήστης πρέπει να διαβάσει τις οδηγίες αυτές προσεκτικά και να εξοικειωθεί µε όλα τα συστατικά πριν από τη χρήση (δείτε την ενότητα Προφυλάξεις ). Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να ισορροπούν στη σχετική θερµοκρασία πριν από τη χρήση. Φιαλίδιο 1: Το αραιωµένο Wash Buffer πρέπει να ισορροπείται σε θερµοκρασία δωµατίου 20-25 C. Φιαλίδιο 2: Το αραιωµένο Stringency Buffer. Ένα δοχείο πρέπει να ισορροπείται σε θερµοκρασία δωµατίου, ένα άλλο στους 65 (±2) C πριν από τη χρήση. Φιαλίδιο 3: Το Fluorescence Mounting Medium µπορεί να εφαρµοστεί σε οποιαδήποτε
θερµοκρασία από 2-25 C. Στοιχείο 4: Το Coverslip Sealant µπορεί να εφαρµοστεί σε θερµοκρασία δωµατίου. Όλα τα βήµατα πρέπει να εκτελούνται στη θερµοκρασία που καθορίζεται. Η διαδικασία περιλαµβάνει αφυδατώσεις ακολουθούµενες από στέγνωµα των δειγµάτων. Βεβαιωθείτε ότι τα δείγµατα είναι εντελώς στεγνά πριν προχωρήσετε στο επόµενο βήµα. Μην αφήνετε τα δείγµατα να στεγνώσουν κατά τη διάρκεια των άλλων βηµάτων της διαδικασίας. B.2 Πρωτόκολλο χρώσης ΗΜΕΡΑ 1 Βήµα 1: Παρασκευή αντικειµενοφόρων πλακών Ισορροπήστε την αντικειµενοφόρο πλάκα του δείγµατος κυτταρολογίας σε θερµοκρασία δωµατίου. Επωάστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε φορµαλδεΰδη 3,7% (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.2) επί 2 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Αφαιρέστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες από τη φορµαλδεΰδη 3,7% και εµποτίστε στο αραιωµένο Wash Buffer (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.1) επί 5 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Αντικαταστήστε το αραιωµένο Wash Buffer και εµποτίστε επί 5 λεπτά ακόµα. Αφυδατώστε την αντικειµενοφόρο πλάκα του δείγµατος κυτταρολογίας µέσω της διαβαθµισµένης σειράς αιθανόλης: 2 λεπτά σε αιθανόλη 70%, 2 λεπτά σε αιθανόλη 85% και 2 λεπτά σε αιθανόλη 96% (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.3). Αφήστε την αντικειµενοφόρο πλάκα να στεγνώσει στον αέρα εντελώς. Βήµα 2: Ανιχνευτής FISH (παρέχεται από το χρήστη) Το ακόλουθο βήµα πρέπει να εκτελείται σε απαγωγό αναθυµιάσεων. Εφαρµόστε µια κατάλληλη ποσότητα σηµασµένου µε φθορισµόχρωµα ανιχνευτή, π.χ. 10 µl ενός ανιχνευτή Dako FISH στο κέντρο του δείγµατος. Τοποθετήστε αµέσως µια γυάλινη καλυπτρίδα 18 mm x 18 mm πάνω από τον ανιχνευτή και αφήστε τον να εξαπλωθεί οµοιόµορφα κάτω από την καλυπτρίδα. Αποφύγετε το σχηµατισµό φυσαλίδων αέρα. Εάν παρατηρηθούν φυσαλίδες αέρα, κτυπήστε απαλά για να τις αποµακρύνετε µε χρήση λαβίδας. Στεγανοποιήστε την καλυπτρίδα µε το Coverslip Sealant εξωθώντας το Coverslip Sealant γύρω από την περιφέρεια της καλυπτρίδας. Αφήστε το Coverslip Sealant να επικαλύψει την καλυπτρίδα και την αντικειµενοφόρο πλάκα, σχηµατίζοντας έτσι στεγανοποίηση γύρω από την καλυπτρίδα. Βεβαιωθείτε ότι το Coverslip Sealant καλύπτει ολόκληρη την άκρη της καλυπτρίδας. Τοποθετήστε την αντικειµενοφόρο πλάκα πάνω σε επίπεδη µεταλλική ή λίθινη επιφάνεια (θερµαντικό στοιχείο ή σε πλάκα φούρνου υβριδισµού) προθερµασµένη στους 82 (±2) C. Μετουσιώστε επί 5 λεπτά διασφαλίζοντας ότι η θερµοκρασία του στοιχείου δε µειώνεται κάτω από τους 80 C οποιαδήποτε στιγµή. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε προθερµασµένο υγροποιηµένο θάλαµο υβριδισµού. Καλύψτε το θάλαµο µε καπάκι και επωάστε ολονυκτίως (14-20 ώρες) στους 45 (±2) C όταν χρησιµοποιείτε ανιχνευτές Dako FISH. Για τη µετουσίωση και τον υβριδισµό είναι δυνατό να χρησιµοποιηθεί σύστηµα οργάνων, όπως το Dako Hybridizer (αρ. κωδικού S 2450 και S 2451), που επιτρέπει συνθήκες παρόµοιες µε εκείνες που περιγράφονται παραπάνω. ΗΜΕΡΑ 2 Βήµα 3: Stringent Wash Γεµίστε δύο δοχεία χρώσης, π.χ. δοχεία Coplin, µε το αραιωµένο Stringency Buffer (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.4). Για 1-6 αντικειµενοφόρους πλάκες σε ένα δοχείο απαιτείται ελάχιστος όγκος 100 ml αραιωµένου Stringency Buffer. Για περισσότερες από 6 αντικειµενοφόρους πλάκες χρησιµοποιείτε τουλάχιστον 15 ml ρυθµιστικού διαλύµατος ανά αντικειµενοφόρο πλάκα.
Τοποθετήστε ένα από τα δοχεία χρώσης που περιέχουν αραιωµένο Stringency Buffer σε θερµοκρασία δωµατίου σε απαγωγό αναθυµιάσεων και το άλλο σε υδατόλουτρο. Θερµάνετε το υδατόλουτρο και το αραιωµένο Stringency Buffer στους 65 (±2) C. Βεβαιωθείτε ότι η θερµοκρασία έχει σταθεροποιηθεί. Καλύψτε το δοχείο µε καπάκι προκειµένου να σταθεροποιηθεί η θερµοκρασία και να αποφύγετε την εξάτµιση. Μετρήστε τη θερµοκρασία εντός του δοχείου υδατόλουτρου µε ένα βαθµονοµηµένο θερµόµετρο για τη διασφάλιση της σωστής θερµοκρασίας. Με χρήση λαβίδας ή γαντιών, πάρετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες από το θάλαµο υβριδισµού και αφαιρέστε απαλά το Coverslip Sealant, καθώς και την καλυπτρίδα και τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες στο δοχείο πρόπλυσης, σε θερµοκρασία δωµατίου, µία κάθε φορά. Μόλις αφαιρεθούν όλες οι καλυπτρίδες, µεταφέρετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες από το δοχείο πρόπλυσης σε θερµοκρασία δωµατίου, στο δοχείο 65 (±2) C στο υδατόλουτρο. Εκτελέστε ισχυρή πλύση επί 10 λεπτά ακριβώς στους 65 (±2) C. Αφαιρέστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες από το αραιωµένο Stringency Buffer και εµποτίστε τις τοµές σε αραιωµένο Wash Buffer επί 3 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Αλλάξτε το αραιωµένο Wash Buffer και εµποτίστε τις τοµές επί 3 λεπτά ακόµα. Αφυδατώστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες µε εφαρµογή µιας σειράς αιθανόλης: 2 λεπτά σε αιθανόλη 70%, 2 λεπτά σε αιθανόλη 85% και 2 λεπτά σε αιθανόλη 96% (δείτε τις Ο ΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ, ενότητα A.3). Αφήστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες να στεγνώσουν στον αέρα εντελώς. Βήµα 4: Στερέωση Εφαρµόστε 15 µl του Fluorescence Mounting Medium που περιέχει κυανή αντιχρώση φθορισµού (φιαλίδιο 3) στην περιοχή-στόχο της αντικειµενοφόρου πλάκας και εφαρµόστε µια γυάλινη καλυπτρίδα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Οι αντικειµενοφόροι πλάκες είναι δυνατό να αναγνωστούν µετά από 15 λεπτά ή εντός 7 ηµερών µετά τη στερέωση. Ωστόσο, εάν οι αντικειµενοφόροι πλάκες εκτεθούν σε φως ή σε υψηλές θερµοκρασίες, θα παρουσιαστεί εξασθένηση. Για την ελαχιστοποίηση της εξασθένησης, φυλάσσετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες στο σκοτάδι στους 2-8 C. Ποιοτικός έλεγχος 1. Τα σήµατα πρέπει να είναι έντονα, διακριτά και εύκολα στην αξιολόγηση. 2. Τα φυσιολογικά κύτταρα ιστών επιτρέπουν τον εσωτερικό έλεγχο της εκτέλεσης του προσδιορισµού. 3. Τα φυσιολογικά κύτταρα πρέπει να έχουν σαφώς ορατά σήµατα φθορισµού, τα οποία υποδεικνύουν ότι οι ανιχνευτές FISH έχουν υβριδοποιηθεί µε επιτυχία στις περιοχές-στόχους. 4. Αποτυχία ανίχνευσης σηµάτων σε φυσιολογικά κύτταρα, υποδηλώνει αποτυχία του προσδιορισµού και τα αποτελέσµατα πρέπει να θεωρούνται άκυρα. 5. Κατά την αξιολόγηση µε χρήση φίλτρου DAPI, η πυρηνική µορφολογία πρέπει να είναι άθικτη. Πολυάριθµα κύτταρα που µοιάζουν µε φαντάσµατα και µια γενική πενιχρή πυρηνική µορφολογία υποδηλώνουν υπερβολική µετουσίωση του δείγµατος, µε αποτέλεσµα απώλεια ή κατατεµαχισµό των σηµάτων. Τέτοια δείγµατα πρέπει να θεωρούνται άκυρα. Ερµηνεία των αποτελεσµάτων Σαρώστε αρκετές περιοχές των κυττάρων έτσι ώστε να λάβετε υπόψη πιθανή ετερογένεια. Επιλέξτε µια περιοχή που έχει καλή κατανοµή των πυρήνων. Αρχίστε την ανάλυση στο άνω αριστερό τεταρτηµόριο της επιλεγµένης περιοχής και, σαρώνοντας από αριστερά προς τα δεξιά, καταµετρήστε τον αριθµό των σηµάτων εντός των ορίων κάθε πυρήνα που αξιολογείται σύµφωνα µε τις κατευθυντήριες οδηγίες παρακάτω. Εστιάστε προς τα πάνω και προς τα κάτω ώστε να εντοπίσετε όλα τα σήµατα στον µεµονωµένο πυρήνα. Καταµετρήστε δύο σήµατα που έχουν το ίδιο µέγεθος και διαχωρίζονται από απόσταση ίση µε ή µικρότερη από το διπλάσιο της διαµέτρου ενός σήµατος, ως µόνον ένα σήµα.
Μη βαθµολογείτε πυρήνες χωρίς σήµατα. Ο αριθµός των πυρήνων που πρέπει να µετρηθούν για κάθε ανιχνευτή πρέπει να προσδιορίζεται από το χρήστη. Αναφορές 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR 7163, February 28, 1992.
Αντιµετώπιση προβληµάτων Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 1. εν παρουσιάζονται σήµατα ή είναι ασθενή 1α. Το µικροσκόπιο δε λειτουργεί σωστά - Ακατάλληλο σετ φίλτρου - Εσφαλµένος λαµπτήρας - Ο λαµπτήρας υδραργύρου είναι πάρα πολύ παλιός - Ακάθαρτοι ή/και ραγισµένοι φακοί συλλέκτες - Ακατάλληλο έλαιο κατάδυσης 1β. Εξασθενηµένα σήµατα 1γ. Εξάτµιση του ανιχνευτή κατά τη διάρκεια του υβριδισµού 1δ. Εσφαλµένες συνθήκες µετουσίωσης 1ε. Εσφαλµένες συνθήκες ισχυρής πλύσης 1α. Ελέγξτε το µικροσκόπιο και βεβαιωθείτε ότι τα χρησιµοποιηµένα φίλτρα είναι κατάλληλα για χρήση µε τα φθορισµοχρώµατα του κιτ και ότι ο λαµπτήρας υδραργύρου είναι σωστός και δεν έχει χρησιµοποιηθεί πέρα από την αναµενόµενη διάρκεια ζωής του. ( είτε το παράρτηµα 1). Σε περίπτωση αµφιβολίας, παρακαλούµε επικοινωνήστε µε τον τοπικό προµηθευτή του µικροσκοπίου σας. 1β. Αποφύγετε τη µικροσκοπική εξέταση µακράς διαρκείας και ελαχιστοποιήστε την έκθεση σε ισχυρές πηγές φωτός. 1γ. ιασφαλίστε επαρκή υγρασία στο θάλαµο υβριδισµού 1δ. Βεβαιωθείτε ότι θερµοκρασία µετουσίωσης είναι 82 (±2) C 1ε. Βεβαιωθείτε ότι χρησιµοποιούνται οι συνιστώµενες τιµές θερµοκρασίας και χρόνου ισχυρής πλύσης και ότι οι καλυπτρίδες αφαιρούνται πριν από την εκτέλεση της ισχυρής πλύσης 2. Περιοχές χωρίς σήµα 2α. Ο όγκος του ανιχνευτή είναι πάρα πολύ µικρός 2β. Έχουν παγιδευτεί φυσαλίδες αέρα κατά τη διάρκεια της εφαρµογής ή της στερέωσης του ανιχνευτή 2α. Βεβαιωθείτε ότι ο όγκος του ανιχνευτή είναι αρκετά µεγάλος για την κάλυψη της περιοχής κάτω από την καλυπτρίδα 2β. Αποφύγετε το σχηµατισµό φυσαλίδων αέρα. Εάν παρατηρηθούν, κτυπήστε ελαφρά µε χρήση λαβίδας για να τις αφαιρέσετε.
Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 3. Υπερβολική χρώση υποβάθρου 4. Πενιχρή µορφολογία πυρήνων ή ασθενής χρώση πυρήνων 3α. Η θερµοκρασία ισχυρής πλύσης είναι πάρα πολύ χαµηλή 3β. Παρατεταµένη έκθεση της υβριδιωµένης τοµής σε ισχυρό φως 4α. Θερµοκρασία µετουσίωσης πάρα πολύ υψηλή 3α. Βεβαιωθείτε ότι θερµοκρασία ισχυρής πλύσης είναι 65 (±2) C 3β. Αποφύγετε τη µικροσκοπική εξέταση µακράς διαρκείας και ελαχιστοποιήστε την έκθεση σε ισχυρό φως. 4α. Βεβαιωθείτε ότι θερµοκρασία µετουσίωσης είναι 82 (±2) C ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εάν το πρόβληµα δεν είναι δυνατό να αποδοθεί σε οποιαδήποτε από τις παραπάνω αιτίες ή εάν η προτεινόµενη διορθωτική ενέργεια δεν επιτυγχάνει την επίλυση του προβλήµατος, παρακαλούµε επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υπηρεσία µας για περαιτέρω βοήθεια.
Παράρτηµα 1 Cytology FISH Accessory Kit, αρ. κωδικού K 5499 Προδιαγραφές µικροσκοπίου φθορισµού Η Dako συνιστά τον ακόλουθο εξοπλισµό για χρήση µε το Cytology FISH Accessory Kit, όταν χρησιµοποιούνται ανιχνευτές Dako FISH: 1. Τύπος µικροσκοπίου Μικροσκόπιο επιφθορισµού. 2. Λαµπτήρας Λαµπτήρας υδραργύρου 100 W (διατηρείτε αρχείο του χρόνου λειτουργίας του λαµπτήρα). 3. Αντικειµενικοί φακοί Για διερεύνηση του ιστού, είναι δυνατό να χρησιµοποιηθούν ξηροί αντικειµενικοί φακοί φθορισµού 10X ή ελαιοκαταδυτικοί φακοί φθορισµού 16X. Για µεγέθυνση υψηλής ισχύος και βαθµολόγηση των σηµάτων, συνιστώνται µόνον ελαιοκαταδυτικοί αντικειµενικοί φακοί φθορισµού, π.χ. 100X. 4. Φίλτρα Τα φίλτρα έχουν σχεδιαστεί ατοµικά για ειδικά φθορισµοχρώµατα και πρέπει να επιλέγονται αναλόγως. Η Dako συνιστά τη χρήση ειδικού φίλτρου DAPI σε συνδυασµό µε διπλό φίλτρο Texas Red/FITC υψηλής ποιότητας, όταν χρησιµοποιούνται ανιχνευτές Dako FISH DNA. Φίλτρο DAPI, π.χ. φίλτρο Chroma αρ. 31000. ιπλό φίλτρο Texas Red/FITC, π.χ. φίλτρο Chroma αρ. 51006. Για επιβεβαίωση είναι δυνατό να χρησιµοποιηθούν µονά φίλτρα Texas Red και FITC. Φθορισµόχρωµα Μήκος κύµατος διέγερσης Μήκος κύµατος εκποµπής FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm Τα φίλτρα είναι ειδικά για κάθε τύπο µικροσκοπίου και η χρήση κατάλληλων φίλτρων είναι κρίσιµης σηµασίας για την ερµηνεία. Εάν θέλετε λεπτοµερείς πληροφορίες, παρακαλούµε επικοινωνήστε µε τον προµηθευτή του µικροσκοπίου σας ή µε τον αντιπρόσωπο της Dako. 5. Έλαιο Μη φθορίζον έλαιο. Προφυλάξεις Ειδικά φθορισµοχρώµατα απαιτούν διαφορετικό εξοπλισµό και πρέπει να επιλέγονται ανάλογα. Για ανιχνευτές Dako FISH, δε συνιστάται λαµπτήρας υδραργύρου 50 W, δεν είναι δυνατή η χρήση φίλτρων ροδαµίνης και δε συνιστώνται τριπλά φίλτρα. Ένα µη βελτιστοποιηµένο µικροσκόπιο είναι δυνατό να προκαλέσει προβλήµατα κατά την ανάγνωση των σηµάτων φθορισµού. Είναι σηµαντικό να µην έχει λήξει η φωτεινή πηγή και να έχει ευθυγραµµιστεί και εστιαστεί σωστά. Οι πελάτες πρέπει να παρακολουθούν και να ακολουθούν τις συστάσεις του κατασκευαστή για το λαµπτήρα υδραργύρου. Το µικροσκόπιο πρέπει να συντηρείται και ο λαµπτήρας υδραργύρου πρέπει να είναι σε ευθυγράµµιση πριν από την ερµηνεία των αποτελεσµάτων.
Πρέπει να καταβάλλεται προσπάθεια έκθεσης του δείγµατος σε όσο το δυνατόν λιγότερο φως διέγερσης προκειµένου να ελαχιστοποιηθεί η εξασθένηση του φθορισµού. Συνιστούµε τη συζήτηση της εγκατάστασης του συγκεκριµένου µικροσκοπίου σας µε τον κατασκευαστή πριν από την έναρξη του in situ υβριδισµού µε φθορισµό ή να ανατρέξετε στη βιβλιογραφία. Παράγεται από την: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Denmark Tel: +45 44 85 95 00 Fax: +45 44 85 95 95 Υπόµνηµα συµβόλων Αριθµός καταλόγου Περιορισµοί θερµοκρασίας Αριθµός παρτίδας In vitro διαγνωστικό ιατροτεχνολογικό προϊόν Μακριά από το ηλιακό φως (Συµβουλευτείτε την ενότητα Φύλαξη ) Ηµεροµηνία λήξης Συµβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης Περιεχόµενο επαρκές για «ν» εξετάσεις Κατασκευαστής Εικονοσύµβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Εικονοσύµβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Εικονοσύµβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις) Εικονοσύµβολο GHS (ανατρέξτε στην ενότητα για τις προφυλάξεις)