Σφαιρίδια βαθµονόµησης για την καθηµερινή παρακολούθηση του κυτταρόµετρου ροής. Το κιτ περιέχει αντιδραστήρια για 40 βαθµονοµήσεις.

Transcript

1 FluoroSpheres Αρ. κωδικού K0110 6η έκδοση Σφαιρίδια βαθµονόµησης για την καθηµερινή παρακολούθηση του κυτταρόµετρου ροής. Το κιτ περιέχει αντιδραστήρια για 40 βαθµονοµήσεις. ( ) SSK0110CE_02/GR/ p. 1/9

2 Περιεχόµενα Σελίδα Χρήση για την οποία προορίζεται...3 Περίληψη και επεξήγηση...3 Αρχή του προσδιορισµού...3 Αντιδραστήρια...4 A. Παρεχόµενα υλικά...4 B. Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται...4 Φύλαξη...4 ιαδικασία προσδιορισµού και πρόσκτηση δεδοµένων...4 Ανάλυση δεδοµένων, καµπύλη βαθµονόµησης...5 A. Ορισµοί...6 B. Μη αυτόµατη βαθµονόµηση. Για όργανα που εκφράζουν MFI σε γραµµικές τιµές...7 Γ. Μη αυτόµατη βαθµονόµηση. Για όργανα που εκφράζουν MFI σε αριθµούς καναλιών...8 ( ) SSK0110CE_02/GR/ p. 2/9

3 Χρήση για την οποία προορίζεται Για διαγνωστική χρήση in vitro. Τα FluoroSpheres προορίζονται για την παρακολούθηση της απόδοσης του κυτταρόµετρου ροής. Περίληψη και επεξήγηση Το κιτ παρέχει Τυφλά σφαιρίδια και Σφαιρίδια βαθµονόµησης µεγέθους 3,2 µm. Τα Σφαιρίδια βαθµονόµησης είναι ένα µίγµα 5 πληθυσµών σφαιριδίων µε διαφορετικές εντάσεις φθορισµού ο καθένας, καθώς και ενός πληθυσµού µη φθοριζόντων σφαιριδίων. Στα φθορίζοντα σφαιρίδια, υπάρχει παγιδευµένος ένας συνδυασµός µοναδικών φθορισµοχρωµάτων που επιτρέπει τη διέγερση από φως οποιουδήποτε µήκους κύµατος µεταξύ 365 και 650 nm. Επειδή τα φθορισµοχρώµατα των σφαιριδίων διαφέρουν από τα φθορισµοχρώµατα που χρησιµοποιούνται συνήθως στην κυτταροµετρία ροής, οι φασµατικές ιδιότητες είναι διαφορετικές. Συνεπώς, τα σφαιρίδια δεν είναι δυνατό να χρησιµοποιηθούν για τον καθορισµό αντιστάθµισης φθορισµού. Με εκχωρηµένες τιµές µορίων ισοδύναµου φθορισµοχρώµατος (Molecules of Equivalent Fluorochrome, MEF) για τους πληθυσµούς των φθοριζόντων σφαιριδίων, η χρήση των FluoroSpheres επιτρέπει το µετασχηµατισµό των αυθαίρετων µονάδων µέσης έντασης φθορισµού (Mean Fluorescence Intensity, MFI) σε απόλυτες µονάδες, για λόγους διασφάλισης ποιότητας και αναφοράς δεδοµένων κυτταροµετρίας ροής. Αρχή του προσδιορισµού 1. Αρχικά, τα Τυφλά σφαιρίδια υποβάλλονται σε ανάλυση για τον προσδιορισµό των βέλτιστων ρυθµίσεων του οργάνου για όλα τα κανάλια για τα οποία ενδιαφέρεστε. 2. Στη συνέχεια, τα Σφαιρίδια βαθµονόµησης υποβάλλονται σε ανάλυση. Τα δεδοµένα χρησιµοποιούνται για τη χάραξη της καµπύλης βαθµονόµησης, µε τη µορφή γραφικής παράστασης του MFI ως προς το MEF. Η καµπύλη βαθµονόµησης και οι σχετικές στατιστικές παράµετροι χρησιµοποιούνται για την αξιολόγηση της γραµµικότητας του οργάνου. Επιπλέον, ο ουδός ανίχνευσης και το δυναµικό εύρος του οργάνου είναι επίσης δυνατό να προσδιοριστούν από την καµπύλη βαθµονόµησης. Η βαθµονόµηση µε τα FluoroSpheres είναι δυνατό να πραγµατοποιηθεί µε δύο τρόπους: Συνεχής ρύθµιση του οργάνου. Με τη µέθοδο αυτή, όλες οι ρυθµίσεις του οργάνου παραµένουν αναλλοίωτες ως προς το χρόνο. Τα MFI των διαφόρων κορυφών παρακολουθούνται και τα αποτελέσµατα απεικονίζονται µε τη µορφή ηµεροµηνίας βαθµονόµησης ως προς MFI. Συνεχής απόκριση του οργάνου. Με τη µέθοδο αυτή, η τάση PMT προσαρµόζεται µε τρόπο ώστε το MFI µίας από τις υψηλές κορυφές φθορισµού να εµφανίζεται ακριβώς στο ίδιο κανάλι κάθε φορά. Στην περίπτωση αυτή, τα αποτελέσµατα απεικονίζονται µε τη µορφή ηµεροµηνίας βαθµονόµησης ως προς τάση PMT. ( ) SSK0110CE_02/GR/ p. 3/9

4 Αντιδραστήρια A. Παρεχόµενα υλικά Φιαλίδιο 1 1,7 ml Σε αζίδιο του νατρίου 0,02%, NP40 0,01% Φιαλίδιο 2 1,7 ml Περιέχει Τυφλά σφαιρίδια και 5 πληθυσµούς σφαιριδίων µε διαφορετικές ποσότητες φθορισµοχρωµάτων ο καθένας, που εκφράζονται σε τιµές MEF για FITC, RPE, RPE-TxRed, Cy5 και APC, αντίστοιχα. Για τις τιµές MEF για τη συγκεκριµένη παρτίδα, ανατρέξτε στο εσωκλειόµενο ελτίο αναλυτικών τιµών. Σε αζίδιο του νατρίου 0,02%, NP40 0,01%. B. Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Γενικός εργαστηριακός εξοπλισµός για διαδικασίες κυτταροµετρίας ροής. Ηµιλογαριθµικό και λογαριθµικό χαρτί γραφικών παραστάσεων, 5 κύκλων. Αριθµοµηχανή. Προγράµµατα λογισµικού για ανάλυση δεδοµένων κυτταροµετρίας ροής. Προγράµµατα υπολογιστικών φύλλων, όπως π.χ. το Microsoft Excel. Τα προγράµµατα αυτά είναι προαιρετικά. Προφυλάξεις 1. Για επαγγελµατίες χρήστες. 2. Το προϊόν αυτό περιέχει αζίδιο του νατρίου (NaN 3 ), µια χηµική ουσία που είναι ιδιαίτερα τοξική σε καθαρή µορφή. Σε συγκεντρώσεις προϊόντος, παρότι δεν κατατάσσεται ως επικίνδυνο, το αζίδιο του νατρίου ενδέχεται να αντιδράσει µε τις υδραυλικές σωληνώσεις από µόλυβδο και χαλκό και να σχηµατίσει ιδιαίτερα εκρηκτικές συσσωρεύσεις αζιδίων µετάλλων. Κατά την απόρριψη, εκπλύνετε µε άφθονη ποσότητα νερού για την πρόληψη συσσώρευσης αζιδίων µετάλλων στις υδραυλικές σωληνώσεις. Φύλαξη Φυλάσσετε το κιτ στους 2-8 C. Μην το χρησιµοποιείτε µετά την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στα φιαλίδια. Εάν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται υπό οποιεσδήποτε συνθήκες εκτός από εκείνες που καθορίζονται, οι συνθήκες πρέπει να επαληθεύονται από το χρήστη. Εάν παρατηρηθούν µη αναµενόµενα αποτελέσµατα που δεν είναι δυνατό να επεξηγηθούν από διαφορές στις εργαστηριακές διαδικασίες και υποψιάζεστε πρόβληµα µε το κιτ, επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υπηρεσία µας. ιαδικασία προσδιορισµού και πρόσκτηση δεδοµένων 1. Αναµίξτε τα σφαιρίδια έντονα, µε αναµείκτη περιδίνησης ή µε ανακίνηση. 2. Προσθέστε από 0,5 ml κατάλληλου ρυθµιστικού διαλύµατος αραίωσης, όπως π.χ. αλατούχο διάλυµα ρυθµισµένο µε φωσφορικά, µε ph 7,2, σε δύο δοκιµαστικά σωληνάρια. Προσθέστε µία σταγόνα από το Φιαλίδιο 1, Τυφλά σφαιρίδια, στο πρώτο σωληνάριο και µία σταγόνα από το Φιαλίδιο 2, Σφαιρίδια βαθµονόµησης, στο δεύτερο σωληνάριο. Αναµείξτε µε αναµείκτη περιδίνησης, έτσι ώστε να διασφαλίσετε ότι τα σφαιρίδια είναι σε εναιώρηµα. ( ) SSK0110CE_02/GR/ p. 4/9

5 3. Πριν από την πρόσκτηση δεδοµένων, επιλέξτε λογαριθµική ενίσχυση των ανιχνευτών φθορισµού που σας ενδιαφέρουν και µηδενίστε την αντιστάθµιση φθορισµού για όλες τις παραµέτρους. 4. Τοποθετήστε το σωληνάριο µε τα Τυφλά σφαιρίδια στο κυτταρόµετρο ροής. 5. Προσαρµόστε τις τάσεις PMT για να επιτρέψετε στην κορυφή των Τυφλών σφαιριδίων να εµφανιστεί στην πρώτη δεκάδα του ιστογράµµατος. 6. Με τη βοήθεια της πρόσθιας σκέδασης ως προς την πλευρική σκέδαση, ορίστε µια ζωντανή πύλη στα µονόπολα σφαιρίδια (βλ. Σχήµα 1). 7. Προσκτήστε τουλάχιστον συµβάντα µέσω πύλης για τα Τυφλά σφαιρίδια. 8. Τοποθετήστε το σωληνάριο µε τα Σφαιρίδια βαθµονόµησης στο κυτταρόµετρο ροής και προσκτήστε δεδοµένα για τουλάχιστον 5,000 συµβάντα µέσω πύλης. 9. Θα πρέπει να διακρίνετε έξι διαφορετικές κορυφές έντασης φθορισµού στο κανάλι φθορισµού που σας ενδιαφέρει (βλ. Σχήµα 2). Ανάλυση δεδοµένων, καµπύλη βαθµονόµησης Η ανάλυση των αποτελεσµάτων περιορίζεται στα µονόπολα σφαιρίδια µέσω πύλης χωρίς υπολείµµατα, όπως καθορίζεται στο διάγραµµα κουκκίδων της πρόσθιας σκέδασης ως προς την πλευρική σκέδαση (βλ. Σχήµα 1). Επιµέρους δείκτες ή περιοχές χρησιµοποιούνται για τον καθορισµό καθενός από τους 6 πληθυσµούς των Σφαιριδίων βαθµονόµησης (βλ. Σχήµα 2). Οι περιοχές αυτές χρησιµοποιούνται για τον προσδιορισµό του MFI κάθε πληθυσµού σφαιριδίων. Σχήµα 1. Γραφική παράσταση πρόσθιας σκέδασης ως προς πλευρική σκέδαση για τα Τυφλά σφαιρίδια. Η πύλη έχει οριστεί για τη συλλογή µονόπολων σφαιριδίων. ( ) SSK0110CE_02/GR/ p. 5/9

6 855 R5 R6 R3 R4 641 R2 R1 Counts FL1-H Σχήµα 2. Ιστόγραµµα πληθυσµών σφαιριδίων FluoroSpheres. A. Ορισµοί Λογαριθµική απόκλιση Η λογαριθµική απόκλιση αντιπροσωπεύει την τιµή φθορισµού στο κανάλι 0. Το κανάλι 0 συνήθως αντιπροσωπεύεται στο λογισµικό των κατασκευαστών από αυθαίρετες τιµές π.χ. 1 για τα περισσότερα λογισµικά της Becton Dickinson και 0,1 για τα περισσότερα λογισµικά της Coulter. AvgRes% Το µέσο υπολειµµατικό ποσοστό επί τοις εκατό (AvgRes%) είναι ένα µη σταθµισµένο µέτρο της γραµµικότητας απόκρισης του οργάνου. Υπολογίζεται µέσω του προσδιορισµού της µέσης απόλυτης ποσοστιαίας επί της εκατό διακύµανσης της γραµµής παλινδρόµησης από τα πραγµατικά σηµεία. r 2 Ο συντελεστής συσχέτισης (r 2 ) είναι ένα σταθµισµένο µέτρο της γραµµικότητας. Είναι ιδιαίτερα χρήσιµος στην ανάλυση λογαριθµικών δεδοµένων. Ουδός ανίχνευσης Αν και τα Τυφλά σφαιρίδια δεν περιέχουν φθορισµοχρώµατα παγιδευµένα στο εσωτερικό τους, είναι δυνατό να προκαλέσουν εµφάνιση ενός σήµατος. Το σήµα αυτό αντιπροσωπεύει το θόρυβο υποβάθρου και κατά συνέπεια το επίπεδο ανίχνευσης του οργάνου. MEF Τα µόρια ισοδύναµου φθορισµοχρώµατος είναι η ποσότητα φθορισµοχρώµατος ανά σφαιρίδιο. Λογαριθµική δεκάδα Η λογαριθµική δεκάδα είναι το βαθµονοµηµένο εύρος πλήρους κλίµακας ή αλλιώς το δυναµικό εύρος τιµών της παραµέτρου φθορισµού που βαθµονοµείται. Γενικά, τα κυτταρόµετρα ροής διαθέτουν ενισχυτές µε δυναµικό εύρος 3,5 ή 4 λογαριθµικών δεκάδων, ανάλογα µε τον κατασκευαστή. Τυχόν µειωµένη απόδοση του κυτταρόµετρου ροής θα επηρεάσει τη λογαριθµική δεκάδα. ( ) SSK0110CE_02/GR/ p. 6/9

7 B. Μη αυτόµατη βαθµονόµηση. Για όργανα που εκφράζουν MFI σε γραµµικές τιµές Κατασκευή της καµπύλης βαθµονόµησης: 1. Προσδιορίστε το MFI για καθέναν από τους 6 πληθυσµούς των Σφαιριδίων βαθµονόµησης FluoroSpheres. 2. Χαράξτε την καµπύλη των log MFI ως προς τα αντίστοιχα log MEF για τις διάφορες κορυφές. Υπολογίστε την ευθεία "βέλτιστης προσαρµογής" σύµφωνα µε τον παρακάτω µαθηµατικό τύπο: log (MEF) = a x log (MFI) + b όπου το a είναι η κλίση και το b είναι το σηµείο τοµής της ευθείας µε τον άξονα των y, γνωστό επίσης και ως λογαριθµική απόκλιση ή τιµή µηδενικού καναλιού. 3. Υπολογίστε τις σχετικές στατιστικές παραµέτρους AvgRes% και r 2 της καµπύλης βαθµονόµησης. 4. Το δυναµικό εύρος του ενισχυτή εκφράζεται σε λογαριθµικές δεκάδες. Οι λογαριθµικές δεκάδες είναι δυνατό να υπολογιστούν από την ευθεία παλινδρόµησης, µε αφαίρεση του log (MEF min ) από το log (MEF max ). Τα log (MEF min ) και log (MEF max ) προκύπτουν από την ελάχιστη και τη µέγιστη τιµή MFI, αντίστοιχα. Στη συγκεκριµένη περίπτωση, οι τιµές MFI για το MEF min και το MEF max είναι 10 0 και 10 4, αντίστοιχα. MEF (λογαριθµική Ουδός ανίχνευσης (MEF σφαιριδίου 1) 1 (τυφλό) λογαριθµική απόκλιση (τιµή µηδενικού καναλιού) MFI (γραµµικές τιµές) Σχήµα 3. Καµπύλη βαθµονόµησης (ευθεία παλινδρόµησης) µε βάση τα FluoroSpheres. Παράδειγµα υπολογισµού: λογαριθµικές δεκάδες = log (MEF max ) - log (MEF min ) λογαριθµικές δεκάδες = log ( ) - log (30,8) λογαριθµικές δεκάδες = 5,28-1,49 λογαριθµικές δεκάδες = 3,79 Κανάλια ανά δεκάδα: Επειδή ο αριθµός των καναλιών είναι 1024, ο αριθµός των καναλιών ανά δεκάδα είναι: 1024/3,79 = 270 ( ) SSK0110CE_02/GR/ p. 7/9

8 Γ. Μη αυτόµατη βαθµονόµηση. Για όργανα που εκφράζουν MFI σε αριθµούς καναλιών Κατασκευή της καµπύλης βαθµονόµησης: 1. Προσδιορίστε το MFI για καθέναν από τους 6 πληθυσµούς των Σφαιριδίων βαθµονόµησης FluoroSpheres. 2. Χαράξτε την καµπύλη MFI ως προς log (MEF) και υπολογίστε την ευθεία "βέλτιστης προσαρµογής" σύµφωνα µε τον παρακάτω µαθηµατικό τύπο: log (MEF) = a x MFI + b όπου το a είναι η κλίση και το b είναι το σηµείο τοµής της ευθείας µε τον άξονα των y. 3. Υπολογίστε τις σχετικές στατιστικές παραµέτρους AvgRes% και r 2 της καµπύλης βαθµονόµησης. 4. Το δυναµικό εύρος του ενισχυτή εκφράζεται σε λογαριθµικές δεκάδες. Οι λογαριθµικές δεκάδες είναι δυνατό να υπολογιστούν από την ευθεία παλινδρόµησης, µε αφαίρεση του log (MEF min ) από το log (MEF max ). Τα log (MEF min ) και log (MEF max ) προκύπτουν από την ελάχιστη και τη µέγιστη τιµή MFI, αντίστοιχα. Στη συγκεκριµένη περίπτωση, οι τιµές MFI για το MEF min και το MEF max είναι 0 και 1023, αντίστοιχα. MEF (λογαριθµική Ουδός ανίχνευσης (MEF σφαιριδίου 1) 1 (τυφλό) λογαριθµική απόκλιση (τιµή µηδενικού καναλιού) MFI (γραµµικές τιµές) Σχήµα 4. Καµπύλη βαθµονόµησης (ευθεία παλινδρόµησης) µε βάση τα FluoroSpheres. Παράδειγµα υπολογισµού: λογαριθµικές δεκάδες = log (MEF max ) - log (MEF min ) λογαριθµικές δεκάδες = log ( ) - log (30,8) λογαριθµικές δεκάδες = 5,28-1,49 λογαριθµικές δεκάδες = 3,79 Κανάλια ανά δεκάδα: Επειδή ο αριθµός των καναλιών είναι 1024, ο αριθµός των καναλιών ανά δεκάδα είναι: 1024/3,79 = 270 ( ) SSK0110CE_02/GR/ p. 8/9

9 Επεξήγηση συµβόλων Αριθµός καταλόγου Περιορισµοί θερµοκρασίας Ηµεροµηνία λήξης In vitro διαγνωστικό ιατροτεχνολογικό προϊόν Συµβουλευτείτε τις οδηγίες χρήσης Περιεχόµενο επαρκές για «ν» εξετάσεις Κωδικός παρτίδας Κατασκευαστής Παρασκευάζεται από την: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup ανία Τηλ.: Φαξ: ( ) SSK0110CE_02/GR/ p. 9/9