دوره هجدهم شماره 64 خرداد و تير ( 71-80 ) سال 1387 پرفيوژن و جداسازي هپاتوسيت از كبد رات حميدرضا عسگري(. Ph.D ) ** مهدي رسولي(. Ph.D ) * + چكيده سابقه و هدف: پرفيوژن كبد براي مطالعه متابوليسم ويژه در اين ارگان و نيز تهيه هپاتوسيت به كار ميرود. براي تهيه هپاتوسيت از كبد رات به طور كلي سه روش مكانيكي شيميايي و آنزيمي وجود دارد. هر سه روش داراي مزايا و معايب خاص ميباشند. به نظر مي رسد تلفيقي از هر سه روش منجر به آسيب كمتر غشاء سلول و بازده بيشتر عمل ميشود. مواد و روشها : در اين مطالعه كبد در محل خود situe) (in كانوله ميشود و بر اساس روش شيميايي- آنزيمي در سه مرحله پرفيوز ميگردد. در اولين مرحله كبد توسط مسير تك مسيري باز توسط محلول كربس- رينگر فاقد كلسيم و منيزيم و حاوي شلاتور كلسيم 1 (EDTA) به مدت ده دقيقه پرفيوز گرديد. در دومين مرحله كبد توسط محلول كربس- رينگر فاقد كلسيم منيزيم و شلاتور كلسيم براي شستشوي عروق كبد از شلاتور به مدت يك دقيقه ديگر پرفيوز ميگردد. در سومين مرحله كبد توسط كربس- رينگر آنزيم كلاژناز IU/mL) 200) به مدت نه دقيقه توسط سيستم دو مسيري بسته پرفيوز گرديد. سلولهاي هپاتوسيت در غلظت 10 7-9 6 cell/ml در محيط كربس- رينگر (بافر بيكربنات) در فلاسكهاي شيشهاي مخصوص تحت جو (5 O) 2 :CO 2, 95 : انكوبه شدند. براي بررسي زنده بودن سلولهاي هپاتوسيت از تستهاي منع ورود رنگ (تريپان بلو) و از تست تراوش آنزيم سيتوزولي لاكتات دهيدروژناز (LDH) استفاده گرديد. يافتهها : سنجش فعاليت آنزيم لاكتات دهيدروژناز (LDH) به عنوان نشانگر مهم بخش سيتوزولي در سلول هپاتوسيت و محيط انكوباسيون در آغاز و پايان انكوباسيون نشان داد كه در ابتداي انكوباسيون حدود 92 درصد و در پايان انكوباسيون حدود 88 درصد آنزيم در سلول احتباس شده و به ترتيب فقط 8 درصد و 12 درصد آنزيم از سلولها به خارج تراوش شده است. بررسي ميكروسكوپي سلولهاي هپاتوسيت نيز نشان دادند كه سلولها داراي غشاء صاف بدون چروكيدگي و پارگي و بدون واكوي ل ميباشند. هنگام رنگآميزي سلولها با رنگ حياتي تريپان بلو فقط در 5 درصد سلولها رنگ وارد سلولها گرديد. استنتاج : يافتههاي اين تحقيق نشان ميدهند كه تلفيق روشهاي مكانيكي شيميايي و آنزيمي موجب بهبود كيفيت جداسازي سلولهاي هپاتوسيت از كبد رات ميگردد. به طوريكه پرفيوژن كبد توسط شلاتور كلسيم به مدت 10 دقيقه و سپس توسط آنزيمكلاژناز به مدت 9 دقيقه موجب توليد حدود 10mLسلول با زنده بودن( Viability ) بيش از 90 درصد ميگردد. واژههايكليدي: پرفيوژن هپاتوسيت كبد رات شلاتور كلسيم و كلاژناز 1. Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid + مولف مسي ول : دكتر مهدي رسولي- ساري كيلومتر 18 جاده خزرآباد دانشكده پزشكي * دانشيار گروه بيوشيمي باليني دانشكده پزشكي ساري مركز تحقيقات بيولوژي سلولي و مولكولي دانشگاه علوم پزشكي مازندران ** گروه آناتومي دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي ايران مربي گروه آناتومي دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي ايران E-mail: Mehdi.rasouli@yahoo.com تاريخ دريافت : 84/2/10 تاريخ ارجاع جهت اصلاحات : 484/4 تاريخ تصويب: 86/9/7 71
مهدي رسولي و همكار مقدمه اثر يك ماده شيميايي و يا دارو را ميتوان در موجود زنده vivo) (in و يا خارج از بدن موجود زنده vitro) (in مطالعه نمود. اگرچه تا ثير دارو در بدن اثر واقعي عملي و نهايي است ولي اين پاسخ نتيجه اثر بر ارگانها و سيستمهاي مختلف است و ارزيابي آن بسيار پيچيده ميباشد. از اينرو مطالعات خارج از بدن موجود زنده ويژه و سادهتر هستند و براي تحقيقات اوليه بسيار مناسب ميباشند. اين مطالعات شامل تحقيق بر روي اندام پرفيوز شده برشهاي بافت و سلولهاي جدا شده از بافت ميباشند. هم اكنون با پيشرفت روشهاي مدرن جداسازي سلول از بافت روشهاي قبلي توسط متدهاي انكوباسيون يا كشت سلولي جايگزين شدهاند. مطالعه بر روي سلول جدا شده امكان بررسي و مطالعه اثر اختصاصي دارو بر روي سلول ويژه يك بافت را فراهم مينمايد( 1 ). كبد نقش مهمي در متابوليسم بدن دارد از اينرو سيستم كبد پرفيوز شده( 3 2 ) و هپاتوسيت جدا شده از كبد( 4 تا 6 ) براي مطالعه متابوليسم بسيار حاي ز اهميت ميباشند. روشها و كاربردهاي تهيه هپاتوسيت از كبد رات توسط بري و همكارانش مرور شده است( 7 ). براي تهيه هپاتوسيت از كبد رات بهطوركلي سه روش مكانيكي شيميايي و آنزيمي وجود دارد( 8 ). در روشهاي مكانيكي بافت كبد توسط قيچي و تكه تكه نمودن پيپت كردن تكان دادن به همراه گويهاي ريز شيشهاي هموژناسيون توسط پيستون پلاستيكي نرم و قابل انعطاف و يا عبور از يك غربال سلولهاي بافت از يكديگر جدا ميشوند. اگرچه بافت كبد نرم است و امكان به كارگيري چنين روشهايي را ميسر ميسازد ولي به علت آسيب مكانيكي برگشت ناپذير سلولها بازده حصول سلولهاي زنده كم است( 8 ). از اينرو روشهاي مكانيكي به جز درمراحل انتهاييكاربرد كمي دارند. در روشهاي شيميايي بافت كبد توسط محلول پرفيوزات فاقد كلسيم و حاوي يك شلاتور كلسيم پرفيوژن ميگردد( 9 ). اين عمل سبب حذف كلسيم از بافت و تخريب دسموزوم و كاهش نيروهاي چسبندگي بين سلولي ميگردد( 10 ). مزيت اين روش آن است كه پروتي ينها و گيرندههاي غشاء سلولي آسيب نميبينند و اين سلولها همانند سلولهاي اوليه بافت به هورمونهاي مختلف پاسخ ميدهند( 5 6 ). تاكنون از شلاتورهاي مختلفكلسيم مانند سيترات( 11 ) (12) EDTA و 1 (13) EGTA استفاده شده است. در روشهاي آنزيمي سلولهاي بافت كبد توسط پرفيوژن با محلول حاوي آنزيمهاي پروتي وليزي از يكديگر جدا ميشوند( 14 تا 16 ). در روشهاي اوليه از آنزيم تريپسين ولي هم اكنون از آنزيم كلاژناز استفاده ميگردد( 16 ). مطالعه بر روي محصولات كلاژناز شركت سيگما نشان ميدهد كه نمونههاي كلاژناز خالص نيستند و حداقل حاوي بيست آنزيم ميباشند( 15 ) علاوه براين عمل اين آنزيمها غير ويژه است و بسياري از پروتي ينها و گيرندههاي سطح سلول را نيز تحت تاثير قرار ميدهد( 16 ). با توجه به اهميت كبد پرفيوز شده و هپاتوسيت جدا شده به عنوان دو سيستم و مدل براي مطالعه متابوليسم داروها در اين مطالعه با به كارگيري تلفيقي از هر سه روش مكانيكي شيميايي و آنزيمي سلولهاي هپاتوسيت از كبد جدا شدهاند و ميزان بازده سلول و زنده ماندن آنها بررسي شده است. چگونگي پرفيوژن كبد و تهيه هپاتوسيت به ويژه براي محققين ايراني كه دسترسي كمتري به آنزيم كلاژناز دارند و معمولا نمونههاي آنزيم حين انتقال به ايران به علت نگهداري خارج از يخچال بيشتر فعاليت خود را از دست ميدهند بسيار مفيد ميباشد. 1. Ethylene Glycol Tetra Acetic Acid 72
پرفيوزن و جداسازي هپاتوسيت از كبد رات مواد و روش ها مواد و وسايل: سديم كلريد پتاسيم كلريد دي سديم هيدروژن فسفات پتاسيم دي هيدروژن فسفات منيزيم سولفات منيزيم كلريد گلوگز سديم بيكربنات كلسيم كلريد اتيلن دي آمين تترا استيك اسيد (EDTA) و كلاژناز از Merck تهيه شدند. محلولهاي هانگ و كربس- رينگر در آزمايشگاه تهيه شدند و براي انكوباسيون 3-1 ساعت قابل استفاده هستند ولي در كشت سلولي محلولها بايد در زير هود تهيه و توسط صافي ويژه (سيگما) سترون شوند( 17 ). كبد توسط دستگاه پرفيوژن داراي سيستم باز تك مسيري و بسته دو مسيري و مجهز به -ph سنج ورودي گازهاي اكسيژن و دي اكسيد كربن, الكترود دما ترموكوپل و پمپ پريستالتيك پرفيوز گرديد. سلولهاي هپاتوسيت توسط ميكروسكوپ مجهز به دوربين عكاسي و فاز معكوس Japan) (Olympus-AH2, عكسبرداري شدند. اتصال كبد به دستگاه پرفيوژن: در اين روش كبد در محل خود situe) (in كانوله و پرفيوز ميگردد( 3 2 ). رات نر توسط دي اتيل اتر بيهوش گشته و حفره شكمي به صورت I باز ميگردد. وريد اجوف تحتاني در بالاي كليه يك ليگاتور وريد باب دو ليگاتور يكي در فاصله سه ميليمتري كبد بين ناف كبد و وريد دودنال (به طوريكه مجاري صفراوي را در بر نگيرد) و ليگاتور ديگر در انتهاي وريد مزانتريك زده و كانوله ميشوند( 14 ). سپس ليگاتورها را محكم نموده و جريان پرفيوزات با سرعت 10 ml/min.liver وارد وريد باب ميگردد. ديافراگم را باز و اطراف وريد اجوف تحتاني بالاي ديافراگم نيز يك ليگاتور زده و دهليز راست باز و توسط آنژيوكت- 18 كانوله ميگردد و ليگاتور آن محكم ميگردد. هم اكنون مسير فوق باز ميگردد زمان بين شروع پرفيوژن و باز كردن يكي از وريدهاي اجوف پايين يا بالاي ديافراگم حداكثر يك دقيقه ميباشد. پس از باز شدن مسير جريان پرفيوزات به 30 ml/min.liver افزايش مييابد( 2 ). با مالش دادن لوب هاي كبد به خروج خون و جريان پرفيوزات كمك ميشود( 11 ). در يك پرفيوژن موفق طي سي ثانيه كبد كاملا سفيد ميگردد كه بيانگر خروج خون و عبور پرفيوزات از تمام لوب هاي كبد ميباشد. به طور خلاصه وريدهاي پورتال و اجوف تحتاني پايين و بالاي ديافراگم كانوله ميشوند و پرفيوزات از طريق وريد باب وارد و از يكي از وريدهاي اجوف پايين يا بالاي ديافراگم خارج ميشود در اين شرايط همواره بايد يكي از وريدهاي اجوف بسته باشد. توجه نماي يد كه كانوله كردن وريدهاي اجوف فقط جنبه دورنگري دارد زيرا غالبا وريد پورتال با موفقيت كانوله نميشود در اينصورت ميتوان وريد باب را بست و پرفيوزات را از يكي از وريدهاي اجوف از بالاي كليه و يا از بالاي ديافراگم وارد كبد نمود روش اخير را جريان معكوس perfusion) (retrograde مينامند بعضي از محققين اين روش را موفقيت آميزتر ميدانند( 19 18 ). پرفيوژن كبد جداسازي سلولهاي هپاتوسيت: كبد در سه مرحله بر اساس روش شيميايي- آنزيمي پرفيوز ميگردد. در اولين مرحله كبد توسط مسير تك مسيري باز توسط محلول كربس- رينگر فاقد كلسيم و منيزيم و حاوي شلاتور كلسيم (EDTA) به مدت ده دقيقه پرفيوز ميگردد( 20 21 ). در اين مرحله كلسيم بافت شلات و از بافت كبد حذف ميشود اين عمل موجب سست و تخريب دسموزين ميگردد. در دومين مرحله از آنجاي يكه EDTA باقيمانده در عروق كبد آنزيم 73
مهدي رسولي و همكار كلاژناز را در مرحله بعدي مهار ميكند كبد توسط محلول كربس- رينگر فاقد كلسيم منيزيم و شلاتور كلسيم به مدت يك دقيقه ديگر پرفيوز ميگردد( 16 ). در مرحله سوم كبد توسط كربس- رينگر حاوي كلسيم mm) 1-4/5) و كلاژناز IU/mL) 200) بمدت ده دقيقه توسط سيستم دو مسيري بسته پرفيوز ميگردد. در پايان كبد از محل خود جدا و در پتريديش حاوي محلول آخري چندين بار تكان داده شده شسته و در لوله هموژنيزه كننده صاف با يك پيستون لاستيكي نرم و قابل انعطاف با كليرانس دو ميليمتر فقط با چند ضربه ملايم پراكنده ميشود. سوسپانسيون حاصل از مش 100 عبور و كپسول گيلسون كه شامل شبكه عروق و بافت همبند كبد است توسط مش غربال ميگردد( 22 ). سلولهاي هپاتوسيت چندين بار توسط محلول كربس- رينگر تازه شسته ميشود و چند دقيقه در 500g سانتريفوژ و دكانته ميگردد. با اين روش بازده حصول سلول وابسته به سن حيوان و اندازه كبد حدود 10 ml خواهد بود. Thermometer The electrode of ph- meter O 2 and CO 2 inlet Krebs-Ringer with EDTA Krebs-Ringer with collagenase Prestaltic pomp Pump Inferior vena cava above diafragm Two-side directed valve Open- system Recirculatory-closed system Inferior vena cava after kidney Portal vein 0 Heating system, 37C 37 C شكل شماره 1: پرفيوژن كبد. وريد باب و وريد اجوف تحتاني بالا يا پايين ديافراگم در محل خود ليگاتور زده و كانوله مي گردند. در پرفيوژن جريان مستقيم محلول پرفيوزات از وريد باب وارد و از يكي از وريدهاي اجوف تحتاني خارج مي شود. ولي در پرفيوژن جريان معكوس محلول پرفيوزات از يكي از وريدهاي اجوف تحتاني وارد و از وريد باب خارج مي گردد. توجه نماي يد كه در پرفيوژن جريان معكوس يكي از وريدهاي اجوف تحتاني بايد باز (كانوله) و ديگري بسته شده باشد در غير اينصورت محلول پرفيوزات از داخل كبد عبور نمي كند و از وريد ديگر اجوف خارج مي شود. محفظه حاوي محلول كربس- رينگر در سمت چپ حاوي EDTA است و براي پرفيوژن يكطرفه (مسير باز) و در طرف راست حاوي كلاژناز است و براي پرفيوژن سيستم بسته بكار مي رود. قبل از شروع پرفيوژن دماي محلولها به 37 C رسيده ولي حين عمل نيز دما نزديك تنظيم مي گردد. پمپ پريستالتيك فقط در سيستم بسته براي گردش محلول به دستگاه و كبد بكار مي رود. 74
پرفيوزن و جداسازي هپاتوسيت از كبد رات انكوباسيون سلولهاي هپاتوسيت: سلولهاي هپاتوسيت را ميتوان در محيطهاي مختلف مانند كربس- رينگر يا محيط حداقل ضروري 1 ايگل (EMEM) انكوبه نمود( 23 ). خصيصه مشترك محيطهاي مختلف تشابه غلظت مواد معدني اصلي اسمولاليته و تونيسيته آنها با پلاسماي خون ميباشد. غالبا انكوباسيون كوتاه مدت (كمتر از چهار ساعت) نياز به حضور اسيدهاي آمينه ويتامينها و عوامل رشد ندارد ولي در انكوباسيون طولانيتر و كشت سلولي حضور عوامل فوق ضروري است( 16 ). در اين تحقيق سلولها در محيط كربس- رينگر (بافر بيكربنات) در فلاسكهاي شيشهاي مخصوص كه به سيستم مركزي توليد تحت جو :5) O 2 :CO 2 (95 متصل بودند انكوبه شدند. انكوباسيون در لولههاي پلاستيكي يا پلياستيرني اولتراسانتريفوژ نيز ميسر است( 24 20 ). براي انكوباسيون سلولها 1 ml از سوسپانسيون استوك هپاتوسيت توسط محلول كربس- رينگر به حجم كلي 4 ml رسيد. بدين ترتيب غلظت هپاتوسيت در محيط انكوباسيون حدود 7-9 10 6 cell/ml معادل 8/0±0/5 protein/ml بود. تست هاي بيوشيميايي : براي بررسي زنده بودن (viability) سلولهاي هپاتوسيت از تستهاي منع ورود رنگ (dye exclusion test) از تريپان بلو و از تست تراوش آنزيم سيتوزولي لاكتات دهيدروژناز (LDH) استفاده گرديد. فعاليت آنزيم LDH در هموژنه سلولي و نيز در محلول مورد استفاده براي پراكنده كردن سلولها و در محيط انكوباسيون نيز تعيين گرديد زيرا ممكن است آسيب و تخريب غشاء سلولي و در نتيجه تراوش آنزيم در مرحله ديسپرسيون كم ولي در مرحله انكوباسيون افزايش يابد. براي تعيين فعاليت LDH از كيت آنزيمي شركت سيگما استفاده گرديد و به علت فعاليت زياد آنزيم در داخل سلول 10 µl از هموژنه سلولي و 100 µl از محيط انكوباسيون به محيط سنجش آنزيم اضافه شد. يافته ها تعيين ويابيليتي سلولي توسط سنجش درصد احتباس لاكتات دهيدروژناز. آنزيم لاكتات دهيدروژناز (LDH) يك نشانگر مهم بخش سيتوزول سلول است( 25 ). ميزان فعاليت نسبي و مطلق فعاليت LDH در سلول هپاتوسيت و محيط انكوباسيون در آغاز و پايان انكوباسيون در جدول شماره 1 نشان داده شده است. اين نتايج نشان ميدهند كه در ابتداي انكوباسيون حدود 92 درصد و در پايان انكوباسيون حدود 88 درصد آنزيم در سلول احتباس شده و به ترتيب 8 درصد و 12 درصد آنزيم از سلولها به خارج تراوش شده است. جدول شماره : 1 دهيدروژناز (LDH) تعيين درصد احتباس آنزيم سيتوزولي لاكتات در آغاز و پايان انكوباسيون. نسبت فعاليت كل LDH درحالت الف به ب و الف به ج به ترتيب برابر درصد احتباس آنزيم در آغاز و پايان انكوباسيون در نظر گرفته شده است. واحد Berger-Broida در كيت سيگما به واحد بين المللي تبديل شده است. فعاليت LDH (IU/L) الف) پليت سلولي ب) مجموعه محلول ديسپرسيون و شستشو ج) مجموعه محلول شستشو و محيط انكوباسيون فعاليتLDH (IU/L) 118 ± 11 حجم (ml) 80 فعاليت كلLDH (IU) 9/4± 0/9 درصداحتباس LDH - %92 ± 2 %88 ± 2 0/9±2/4 1/0±0/1 50 28 +50 18 ± 5 13 ± 2 1. Eagle Minimal Essential Medium 75
مهدي رسولي و همكار الف) ب) شكل شماره : 2 عكس ميكروسكوپي سلولهاي هپاتوسيت پس از سه ساعت انكوباسيون در محيط كربس- رينگر با بزرگنماي ي الف) 100 و ب) 400. هپاتوسيتها براساس روش پرفيوژن سه مرحلهاي تهيه شده او در محيط كربس- رينگر انكوبه شدهاند. تعيين ويابيليتي سلولي توسط ارزيابي مورفولوژي و تعيين درصد منع درج تريپان بلو. شكل شماره 2 نشان ميدهدكه سلولهاي هپاتوسيت داراي غشاء صاف بدون چروكيدگي و پارگي و عدم وجود واكوي ل ميباشند. چسبندگي سلولها به يكديگر و نيز به جدار ظرف از شاخصهاي مهم زنده بودن سلولها ميباشد. سلولهاي مرده از يكديگر و از جدار ظرف جدا و معلق ميشوند و ميتوان آنها را توسط محلول پركول (percoll) شسته سانتريفوژ و جدا نمود (26). رنگآميزي سلولها با رنگ حياتي تريپان بلو نشان ميدهد كه فقط در حدود 5 درصد سلولها رنگ وارد سلولها ميگردد كه بيانگر مرگ سلولي است. بحث روشهاي مختلفي براي جداسازي سلولهاي پارانشيم از كبد گزارش شده است. در روشهاي قديمي كه بيشتر مكانيكي بودند اعمال نيروي فيزيكي سبب آسيب شديد و برگشتناپذير سلولها و كاهش راندمان حصول سلولهاي زنده ميشد. يكي از مهمترين يافتههاي متابوليسم يعني سيكل اوره توسط كربس و دانشجوي پزشكي آن هنسليت بر روي برشهاي كبد به دست آمد( 27 ). در آن زمان متدهاي مدرن جداسازي سلول زنده از بافت شناخته نشده بود. به هرحال هم اكنون اين روشها فقط در مراحل نهايي براي پراكنده كردن سلولها به كار ميروند. در روشهاي شيميايي كبد توسط محلول پرفيوزات فاقد كلسيم و حاوي يك شلاتور كلسيم مانند سيترات EDTA وEGTA پرفيوژن ميگردد( 11 تا 13 ). اين عمل سبب حذف كلسيم از بافت و تخريب دسموزوم و كاهش نيروهاي چسبندگي بين سلولي ميگردد( 10 ). مزيت اين روش آن است كه پروتي ينها و گيرندههاي غشاء سلولي آسيب نميبينند و اين سلولها همانند سلولهاي اوليه بافت به هورمونهاي مختلف پاسخ ميدهند( 4 تا 6 ). ولي عيب مهم اين روش آسيب شديد فيزيكي سلولها و زنده بودن (ويابيليتي) كم سلولي است به طوريكه ميزان احتباس آنزيم لاكتات دهيدروژناز در روش سوزنگر (Susangar) 27 درصد و در روش وانگ (Wang) 50 درصد گزارش 76
پرفيوزن و جداسازي هپاتوسيت از كبد رات شده است( 12 11 ). در تمام اين روشها پرفيوژن در دماي 37 C و ph 7/4 انجام ميشود. محلولهاي مختلفي نيز براي پرفيوژن كبد پراكنده كردن سلولها و انكوباسيون سلول جدا شده به كار ميرود. دي ساكاريدهاي هيپرتونيك مانند ساكاروز 0/5 M اگرچه سبب تجزيه اتصالات محكم junction) (gap بين سلولها و تسهيل جدا شدن سلولها ميگردند ولي از آنجاييكه عمل آنها برگشتپذير است و سبب پلاسموليز نيز ميگردند توصيه نميشوند (26). از اينرو بيشتر محققين از محلول نمكي هانگ و يا كربس- رينگر استفاده ميكنند( 13 تا 16 ). غلظت گلوكز نيز چندان مهم نبوده و در حيطه غلظت فيزيولوژي يعني حدود 5/0 mm انتخاب ميگردد( 16 ). به هرحال اگر در مطالعهاي لازم باشد به پرفيوزات يا محيط انكوباسيون هپاتوسيت عوامل محرك گليكوژنوليز مانند كاتكولامينها اضافه شود به منظور ممانعت از تحليل گليكوژن كبد و افزايش ويابيليتي سلولي لازم است غلظت گلوكز تا 20 mm افزايش يابد( 28 ). كشف اين نكته كه كلاژن و لامينين در اتصال سلولها به يكديگر نقش دارند منجر به پيشرفت روشهاي تفكيك سلولها با استفاده از آنزيمهاي پروتي وليزي گرديد( 8 ). از آنجاييكه آنزيم كلاژناز داراي ويژهگي عمل بيشتري است غالبا براي جداسازي سلولها به كار ميرود. شركت سيگما براي پرفيوژن بافتهاي مختلف انواع مختلف كلاژناز اراي ه نموده است ولي متخصصين تهيه هپاتوسيت هيچ ارجحيتي بين آنها پيدا نكردند( 15 ). نمونههاي آنزيم كلاژناز خود حاوي بيست آنزيم ميباشند وپروتي ينهاي ديگر حاوي رديف- -Pro را نيز هيدروليز ميكنند( 15 ). اگرچه غالبا گزارش شده كه كلاژناز بر روي پروتي ينهاي غشاء سلول از جمله گيرندههاي هورمونها اثري ندارد ولي پاسخ سلولهاي تهيه شده از روشهاي شيميايي (شلاتورهاي كلسيم) و روشهاي آنزيمي متفاوت است( 4 تا 29 6 ). بنابراين به نظر ميرسد كلاژناز بر روي اين گيرندهها اثر و پاسخ سلول را تغيير ميدهد. در تكنيكهاي فعلي روشهاي شيميايي و آنزيمي با يكديگر تلفيق شدهاند. به طوريكه در ابتدا كبد حدود 1-10 دقيقه با محلول فاقد كلسيم و حاوي شلاتور كلسيم پرفيوز ميشود سپس حدود 10 دقيقه ديگر توسط محلول حاوي كلاژناز پرفيوز ميگردد( 14 تا 16 ). از آنجاي يكه در ايران معمولا دسترسي به آنزيم كلاژناز محدود است و يا كلاژناز موجود به علت شرايط نگهداري و انتقال نادرست بيشتر فعاليت خود را از دست داده است زمان جداسازي شيميايي توسط شلاتور كلسيم طولاني تر انتخاب شده است. به علاوه در اين روش به علت محدود بودن كلاژناز موجود از سيستم بسته دو مسيري به جاي سيستم بازتك مسيري استفاده شده است. بدين طريق با استفاده از مقدار كم كلاژناز كيفيت جداسازي سلولها افزايش مييابد. در برخي از مطالعات نياز به انكوباسيون طولاني سلولها(بيشتر ازسه ساعت) ميباشد. بدين منظور سلولهاي جدا شده از بافت در محيط مناسبكشت ميگردند( 16 ). هنگام كشت سلولي برخي خصايص سلول مانند تعداد رسپتورهاي سطح سلول و متعاقبا پاسخ سلول به دارو تغيير ميكند( 30 ). از اينرو نتايج حاصل از كشت سلول با نتايج انكوباسيون سلول تازه تهيه شده الزاما يكسان نيستند( 29 ). سلولهاي نرمال در محيط كشت داراي طول عمر محدود (چند روز) ميباشند. از اينرو براي كشت سلولي هر بار بايد سلول زنده را از بافت جدا نمود اين عمل مشكل و وقت گير است. هم اكنون از سلولهاي نرمال انسان يا حيوان سلولهاي سرطاني ناميرا (immortalized) تهيه شده است( 31 ). سلولهاي ناميرا مكررا قابل تكثير و كشت ميباشند از اينرو ذخيره تكثير و آزمايش بر روي آنها بسيار ساده است. متابوليسم سلولهاي ناميرا تقريبا مشابه سلولهاي نرمال است ولي داراي تفاوتهايي نيز ميباشند( 31 ). سلولهاي مك 77
مهدي رسولي و همكار آردل( McArdle ) سلولهاي ناميراي كبد رات و HepG2 سلولهاي ناميراي كبد انسان هستند اين سلولها مانند سلولهاي نرمال هپاتوسيت قادر به سنتز و ترشح ليپوپروتي ينها ميباشند( 32 ). عليرغم پيشرفتهاي روز افزون روشهاي تهيه و كشت سلولي متد پرفيوژن بافت و انكوباسيون سلولهاي تازه تهيه شده از آن جهت كه داراي متابوليسم بسيار مشابه سلولهاي اوليه و اصلي هستند براي مطالعه ارجح ميباشند. نتايج اين تحقيق نشان ميدهند كه پرفيوژن كبد با محلول كربس- رينگر حاوي شلاتور كلسيم و سپس با كلاژناز به مدت ده دقيقه منجر به توليد سلول هپاتوسيت با بازده و ويابيليتي زياد ميگردد. References 1. Nelson DL, Michael MC. Lehninger Principles of Biochemistry. Worth Publisher, NY 2000: 485-526. 2. Brunengraber H, Boutry M, Daikuhara Y et al. Use of the perfused liver for the study of lipogertesis. Method Enzymol 1975; 35: 597-606. 3. Sies H. The use of perfusion of liver and other organs for the study of microsomal electron-transport and cytochrome P-450 systems. Method Enzymol 1978; 52: 48-59. 4. Haghighi B, Rasouli M, Suzangar M. Inhibitory effect of epinephrine on phosphatidate phosphohyrolase activity on isolated rat hepatocytes. Endocrinology 1990; 28: 149-154. 5. Rasouli M, Zahraei M. Suppression of VLDL-triacylglycerol secretion by both alpha- and beta- adrenoceptor agonists in isolated rat hepatocytes. Eur J Pharmacol 2006; 545: 109-114. 6. Rasouli M, Zahraei M. Epinephrine supresses secretion of VLDL-triacylglycerol and increases triacylglycerol and phospholipids contents in isolated rat hepatocytes. MJIRI 2000; 14: 61-68. 7. Berry MN, Grivell AR, Grivell MB, Phillips JW. Isolated hepatocytes: past, present and future. Cell Biol Toxicol 1997; 13: 223-233. 8. Bashor MM. Dispersion and Disruption of tissues. Method Enzymol 1979; 119-129. 9. Waymouth C. Methods for obtaining cells in suspension from animal tissues. In Pretlow TG and Pretlow TP eds. Cell separation methods and selected applications. Orando 1987; 4: 1-21. 10. Cholhia C, Jones EY. The molecular structure of cell adhesion molecules. Annu Rev Biochem 1997: 66: 823-862. 11. Susangar M, Dickson JA. Biochemical studies on cells isolated from adult rat liver. Exp Cell Res 1970; 63: 353-364. 12. Wang S, Renaud C, Infante J, et al. Isolation of rat hepatocytes with EDTA and their metabolic functions in primary culture. In Vitro Cell Dev Biol 1985; 21: 526-530. 78
پرفيوزن و جداسازي هپاتوسيت از كبد رات 13. Berry MN, Edwards AM, Barritt GJ. Isolated hepatocytes preparation: properties and applications. In Burdon RH, Knippenberg V eds. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Elsevior, Amesterdam 1991: 1-460. 14. Lindros KO. Separation of functionally different liver cell types. In Thurman RG eds. Regulation of hepatic metabolism (intra- and intercellular compartmentation) NY 1986: 137-157. 15. Pertof H, Smedsrφd B. Separation and characterization of liver cells. In: cell separation: Methods and selected application 1987; 4: 1-23. 16. Bayliss MK, Skett P. Isolation and culture of human hepatocytes. In Careth F Jones. ed. Human cell culture protocols, NY 1996: 369-389. 17. Johnson MM, Das NM, Bucher FR, Fain JN. The reglation of gluconeogenesis in isolated rat liver cells by glucagons, insulin, dibutyryl camp and fatty acids. J Biol Chem 1972; 147: 3229-3235. 18. Cascale CE, Mangiapane H, Brindley DN. Oleic acid promotes the activation and translocation of phosphatidate phosphohydrolase from the cytosol to particulate fractions of isolated rat hepatocytes. Biochem J 1984; 219: 916-919. 19. Martin-Sanz P, Hopewell R, Brindley DN. Long chain fatty acids and their CoA sters causes the translocation of phosphatidate phosphohydrolase from the cytosol to the microsomal fraction of rat liver. FEBS 1984; 175: 284-288. 20. Seglen PO. Incorporation of radioactive amin oacids into protein in isolated tat hepatocytes. BBA 1976; 442: 391-404. 21. Seglen PO. Disaggregation and separation of rat liver cells. In: Reid E ed. Cell preparations. Ellis Horwood, Chichester, England. 1979: 25-46. 22. Steinberg P, Seihert B, Oesch F. Separation and biochemical characterization of rat liver parenchymal cell subpopulations. In. Robertfroid MB and Prear V eds. Experimental hepatocarcinogenesis. NY l988; 257-265. 23. Berry MN, Friend DS. High-yield preparation of isolated rat liver parencyhmal cells. J Cell Biol 1969; 43: 507-519. 24. Kosugi K, Harano Y, Nakano T, et al. Mechanism of adrenergic stimulation of hepatic ketogenesis. Metab 1983; 32: 1081-1087. 25. Cook JA, Mitchell JB. Viability measurements in mammalian cell systems. Anal Biochem 1989; 179: 1-7. 26. Goodenough DA, Gilula NB. The splitting of hepatocyte GAP junctions and zonulae occludetes, with hypertonic disaccharides. J Biol Chem 1974; 61: 575-590. 27. Holmes FL. Hans Krebs and discovery of the ornithine cycle. Fed Proc 1980; 39: 216-225. 79
مهدي رسولي و همكار 28. Brindle NPJ, Ontko JA. α1-adrenergic suppression of VLDL triacylglycerol secretion by isolated rat hepatocytes. Biochem J 1988; 250: 363-368. 29. Rasouli M, Trischuk T, Lehner R. Calmodulin antagonist W-7 inhibits de novo synthesis of cholesterol and suppresses secretion of de novo synthesized and preformed lipids from cultured hepatocytes. Mol Cell Biol Lipid (BBA) 2004; 1682: 92-101. 30. Tsujimoto A, Tsujimoto G, Azhar S, et al. Altered responsiveness to alpha-and beta- adrenoceptor stimulation in hepatocytes cultured in defined medium. Biochem Pharmacol 1986; 35: 1400-1404. 31. Leichtling BH, Su YF, Wimalasena J, Harden TK, Wolfe BB and wicks WD. Studies of camp metabolism in cultured hepatoma cells: presence of functional adenylate cyclase despite low camp content and lack of hormonal responsiveness. J Cell Physiol 1978; 96: 215-223. 32. Rasouli M, Lehner R. Hepatomas McArdle-RH7777 cells have the same response as normal rat hepatocytes to dibutyryl-camp and anticalmodulin W-7. MJIRI 2002; 15: 209-217. 80