220 «æ å ªï Ë 36 Ë 4 μÿ - π«2554 π æπ åμâπ» ª «âõ Epstein Barr Virus π Èπ π ÈÕ â ËÕß âõ Õ μ π μ â«π In Situ Hybridization å ª Ï æ.. æ å ««πμå «..» Õ π Ÿμ «.. ÿ«ª π «.. ß ÿ «êÿ«πå æ.. ÿà «πæ «Abstract Comparison Study of Epstein Barr Virus Staining Manual in Tissue Sections with Automated in Situ Hybridization Sriprasit R, Vattakavikrant S, Intarasut K, Panruksa S, Vinyuvat S. Institute of Pathology, Bangkok, Thailand Bull Dept Med Serv 2011; 36:220-7. Currently, the most sensitive method of Ebstein-Barr virus (EBV) detection is EBV-encoded RNA (EBER) in situ hybridization (ISH). This study aimed to compare the intensity and quantity of staining as well as technical time and cost between manual EBER ISH and automated EBER ISH techniques. Methods: Thirty cases of previously diagnosed as nasopharyngeal carcinoma from Institute of Pathology between 2006 to 2009 were included in this study. Manual EBER ISH and automated EBER ISH techniques were performed in the formalin-fixed paraffin-embeded tissues of each case. In the quantity staining, total 30 cases had the same staining score (29 cases with score 3 or positive nuclear staining > 50% of total tumor cells, 1 case with score 0 or negative staining). For the intensity staining, 28 cases had the same score with strong intensity of nuclear staining (score = 3), but only 1 case had the different result. Automated EBER ISH showed strong intensity staining (score = 3), whereas manual EBER ISH demonstrated moderate one (score = 2). By statistical analysis, there were no differences in staining results between the automated and manual method. Furthermore, regarding the comparison of the technical time and cost between manual and automated method, the former consumes lower laboratory time for technician as well as lower cost than the latter. Conclusions: Both manual and automated methods show similar staining results, therefore the use of these techniques in any centers should depend on the cost-benefit as well as the turnaround time of each one. Key words: Epstein-Barr virus, in situ hybridization, nasopharyngeal carcinoma ËÕß àõ π μ «À Ebstein-Barr virus (EBV) Ë ««Ÿß ÿ ªìπ çgold standardé π μ «â à EBV-encoded RNA (EBER) in situ hybridization (ISH) ßπ Èπ æ ËÕ ªìπ æ π π μ «ISH ß â» ª º âõ â««(manual) â ËÕß âõ Õ μ π μ (automated) π ßà Õß «â ª
Vol. 36 No. 4 October-December 2011 221 Bulletin of the Department of Medical Services μ μ Õ π «ÿâ à Õßμâπ ÿπ π π «Ë â π π» π ÁÕ æ øîπ Èπ π ÈÕ Ë â μ ««π ªìπ Áß π nasopharyngeal carcinoma π«π 30 πæ «æ å «ß ÿ μ Èß μàªï æ.». 2549 - æ.». 2552 º âõ â πª μ æ «à 30 À⺠ª μ Ë À Õπ π Èß«manual ISH automated ISH (29 μ Ëπ «> âõ 50 Õߪ å Áß ÈßÀ, ππ = 3 Ë 1 À⺠àμ ππ = 0) À «â μ æ «à 28 À⺠«â Õß μ Ë À Õπ π Èß«manual ISH automated ISH Õ μ â ( ππ = 3) æ ß 1 À⺠«â Õß μ Ë μ μà ß π Õ «manual ISH æ μ ª π ß ( ππ = 2) π Ë «automated ISH æ μ â ( ππ = 3) ËÕπ «Àå ß μ æ «à à «μ μà ß π À«à ß«manual ISH automated ISH Èß π ßà Õߪ μ «â Õß μ ËÕæ Ÿ ÈπμÕπ μ ««μ «àßμ «æ «à «automated EBER ISH â «μ «Ë Èπ «à «ß à àßμ «Ë Ÿ «à «manual EBER ISH ßπ Èπ Õ â«π μ «Õß μà π «æ «ÿâ à Õßμâπ ÿπ π π «π μ «Èßπ È π ËÕß º âõ à «μ μà ß π : «Õª μπå å Õ π Ÿ Œ Ëπ ÁßÀ ß æ ß Ÿ π Epstein-Barr virus (EBV) ªìπ double stranded DNA gammaherpes virus Ëßæ «à à«π Ë «âõß π àõ Àâ infectious mononucleosis, oral hairy leukoplakia, inflammatory pseudotumor, nasopharyngeal carcinoma, Burkittûs lymphoma, Hodgkin's lymphoma, post transplant lymphoproliferative disorder (PTLD), HIVassociated B-cell lymphoma, T-cell lymphoma, nasal NK/T cell lymphoma, lymphoepitheliomalike carcinoma (LEC) smooth muscle tumors πºÿâªé«ë Ÿ ÿâ π æ àõß «Èß Áß μâ π æ Õ À ß π 1-6 ªí Ë Àâ μ ÈÕ EBV ÈπÕ Ÿà Õ ÿ æ» ÈÕ μ HIV status 7 μ «À EBV Ëπ â à EBVencoded RNA (EBER) in situ hybridization (ISH) immunohistochemical study (IHC) â antibody μàõ latent membrane protein1 (LMP1) Èßπ È» æ «à μ «À EBV â««ihc ««æ ß âõ 40 à π Èπ 1,7 π Ë μ «EBER ISH ««Ÿß «à âõ 90 π ËÕß μ ««Àâ tumor cells º μ viral protein àπ EBV nuclear antigen-1 (EBNA-1), LMP1, LMP2a, LMP2b â π π«π μà À EBER π Èπ ªìπ π«π π tumor cells ( «à 1 â π copy/cell) 7 ßπ Èπ» π π μ «À EBV «EBER ISH ß ªìπ à«π «π ßæ «Àâ «Ÿ μâõß àπ Èπ ªí ÿ π μ «â«π EBER ISH ªìπ çgold standardé π μ «À EBV 2-5,8-10 Ëß â 2 «Õ«(manual) «â ËÕßÕ μ π μ (automated) ßπ Èπ æ ËÕ ªìπ æ π π μ «ISH ß â» ª º âõ â««â ËÕß âõ Õ μ π μ π ßà Õß «â ª μ «Èß «ÿâ à Õßμâπ ÿπ π π «Ë â π π «μ ÿ «ÿà μ «Õ à ß Ë â π» â à Èπ π ÈÕºŸâªÉ«Ëß àßμ «Ë πæ «æ å «ß ÿ â μ ««π â««à ªìπ nasopharyngeal carcinoma μ Èß μàªï æ.». 2549 ß æ.». 2552 π«π 30 π ºà π «π æ Èπ π ÈÕ (fixative) π 10% neutral buffer formalin (10% NBF) «π
222 «æ å ªï Ë 36 Ë 4 μÿ - π«2554 μ Èπ π ÈÕ ªìπ ÁÕ æ øîπ Èπ π ÈÕ À«à ß Õπμÿ æ.». 2549 ß Õπ π π æ.». 2552 ËÕß Õ Ë â π» ËÕß âõ å Èπ π ÈÕÕ μ π μ (autostainer) ËÕßªî ºàπ â«π å (coverslipper) ËÕß Ÿ à (micropipette) ËÕßμ Èπ π ÈÕ (microtome) μÿâõ «âõπ (hot air oven) μÿâ Ÿ «π (fume Hood) âõß ÿ»πå (microscope) «π π» Õ Èπ π ÈÕºŸâªÉ«nasopharyngeal carcinoma ÁÕ æ øîπ Èπ π ÈÕ Ë àß μ «Ë πæ «μ Èß μàªï æ.». 2549 - æ.». 2552 Ëßæ æ å â «π â«π«π 30 ÁÕ æ øîπ Èπ π ÈÕ ß π Á (tissue microarray) μ ÁÕ æ øîπ Èπ π ÈÕ â«microtome «Àπ 3 Õπ ßæ øîπ Èπ π ÈÕ ß π å å 3 π«π 2 ÿ π å Èπ π ÈÕ ªÕ πμÿâõ âõπ ËÕÿ À Ÿ 65 Õß» ªìπ «20 π âõ å Èπ π ÈÕ â««â ËÕß âõ Õ μ π μ âπè Õπμ Õ π EBV â«π ISH À ß âõ å Èπ π ÈÕ Á â«π å ª mount â«ëõß coverslipper μ «Õ ÿ æ å âõ Èπ π ÈÕ â«âõß ÿ»πå æ æ å æ âõ «Àå ÿªº Õß À μ «âõ EBER â«π ISH «Deparaffinization â«xylene 10 π Rehydration â 95% ethanol μ â«â ßπÈ ª à â «20 π Pretreatment â«proteinase K æ ËÕ àõ Èπ π ÈÕ Àâ probe RNA ªÑ À âßà Èπ ÈπμÕπ ßπ È - À proteinase K (dilution 1:10 π Tris-buffered saline (TBS) ß π Èπ π ÈÕ π ª â μÿâõ ËÕÿ À Ÿ ÀâÕß ªìπ «20 π - â ß â«πè Ëπ 5 ÈßÊ 1 π - Dehydrate â«95% ethanol ªìπ «10 π æ ËÕ Àâ Èπ π ÈÕ Àâß Hybridization - À fluorescein (FITC)-conjugated PNA probe 1-2 À ªî â«coverslip â«π ª â μÿâõ ËÕÿ À Ÿ 55 Õß» ªìπ «90 π - Õ coverslip ÕÕ å - π å à ß π Stringent wash solution (dilution 1:60) «ß π waterbath ËÕÿ À Ÿ 55 Õß» ªìπ «25 π - π å«ß πõÿ À Ÿ ÀâÕß π Èπ â ß å â«tbs 10 «π detection and staining - À anti-fitc-alkaline phosphatase antibody 2-5 À π â μÿâõ ËÕÿ À Ÿ ÀâÕß ªìπ «30 π - â ß â«tbs 2 ÈßÊ 3 π μ â«πè Ëπ 2 ÈßÊ 1 π - À substrate (alkaline phosphatase BCIP/NBT/levamisole) 2-3 À π â μÿâõ ªìπ «30-60 π - â ß â«πè ª à 5 π counterstain â«nuclear fast red â ß πè Ëπ
Vol. 36 No. 4 October-December 2011 223 Bulletin of the Department of Medical Services dehydrate â««air-dry 3 ÈßÊ 30 «π mount slides â«permount À μ «âõ EBV â«π ISH â ËÕß âõ Õ μ π μ deparaffinization and rehydration - ÿà å ß π Bond dewax solution ËÕÿ À Ÿ 70 Õß» 3 Èß ªìπ «2 π - â ß â«alcohol 3 Èß ªìπ «2 π - â ß â«bond wash solution 3 Èß ªìπ «30 π pretreatment - Õ â«enzyme 1 ËÕÿ À Ÿ 37 Õß» ªìπ «15 π - Bond wash solution 3 Èß ªìπ «1 π hybridization - À EBER probe â«π ª â μÿâõ Ë Õÿ À Ÿ 37 Õß» ªìπ «1 Ë«ß - â ß probe â«bond wash solution ªìπ «12 π ISH detection â ÿ protocol A Bond kit - Peroxide Block 5 π - Bond wash solution 3 ÈßÊ 2 π - Anti-fluorescein antibody incubate 7-8 π - bond wash solution 3 Èß Ê 3 π - post primary 5 π - bond wash solution 3 Èß Ê 2 π - polymer 5 π - bond wash solution 2 Èß Ê 2-3 π - deionized water 1 Èß ªìπ «3 π staining and counterstain - mix DAB refine 3 π - deionized water 3 Èß ªìπ «5 π - counterstain â«hematoxylin 6 π - bond wash solution 2 Èß Ê 2 π - deionized water 1 π dehydrate â«95% alcohol, isopropyl alcohol xylene mount slides â«permount «ÿ ÿ æ μ ««Àå - μ «Õ à ß «ÿ º «(positive control) Õ Ÿà π å «μ «Õ à ß unknown - ËÕß ÕÕÿª å ß æ åºà π Õß μ π ª Õ ÿ ªï ªï 1 Èß ª º Àâ ππ μ âõ æ ª μ âõ 0 = àμ Ëπ «1 = μ πâõ «à âõ 10 Õߪ å Áß ÈßÀ 2 = μ âõ 10-50 Õߪ å Áß ÈßÀ 3 = μ «à âõ 50 Õߪ å Áß ÈßÀ «â μ âõ 1 = μ ß 2 = μ ª π ß 3 = μ â À Àμÿ: æ μ Àâ Ÿ Ëπ ««μ πè ß πà Õ à«ß «â ËÕß Õ μ π μ μ πè μ À Õ Á «««Àå âõ Ÿ Á âõ Ÿ ª «μ º μ «âõ ««âõ Ÿ Ë â ß ËÕß Õ æ «μõ å æ ËÕ𠪫ÀåμàÕ â ª SPSS 13.0 «Àå âõ Ÿ â μ marginal homogeneity test ª º âõ À«à ß«manual EBER ISH automated EBER ISH
224 «æ å ªï Ë 36 Ë 4 μÿ - π«2554 μ ß Ë 1 º ππ âõ ª À«à ß manual automated Epstein-Barr-virus encoded RNA (EBER) in situ hybridization (ISH) μ «Õ à ß Manual ISH Automated ISH ª μ «â μ ª μ «â μ 1 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 3 3 3 3 5 3 3 3 3 6 3 3 3 3 7 3 3 3 3 8 3 3 3 3 9 3 3 3 3 10 3 3 3 3 11 3 3 3 3 12 3 3 3 3 13 3 3 3 3 14 3 3 3 3 15 3 3 3 3 16 3 3 3 3 17 3 3 3 3 18 3 3 3 3 19 3 3 3 3 20 3 3 3 3 21 3 3 3 3 22 3 3 3 3 23 3 3 3 3 24 3 3 3 3 25 3 2 3 3 26 3 3 3 3 27 0 * 0 * 28 3 3 3 3 29 3 3 3 3 30 3 3 3 3 À Àμÿ: * Õ à ª π â π ËÕß àμ ª μ âõ : 0 = àμ Ëπ «3 = μ «à âõ 50 Õߪ å Áß ÈßÀ «â μ âõ : 2 = μ ª π ß 3 = μ â
Vol. 36 No. 4 October-December 2011 225 Bulletin of the Department of Medical Services º» ÁÕ æ øîπ Èπ π ÈÕºŸâªÉ«nasopharyngeal carcinoma À«à ߪï æ.». 2549-æ.». 2552 π«π 30 «Àå âõ Ÿ â μ marginal homogeneity test ª º âõ À«à ß «manual ISH automated ISH ⺻ ßπ È º μ «âõ (μ ß Ë 1) º âõ Èπ π ÈÕ πºÿâªé«ÿà μ «Õ à ß π«π 30 ª À«à ß«manual automated ISH π ßà Õߪ μ «â Õß μ μ ß Ë 1 π ßઠμ æ «à 30 À⺠μ Ë À Õπ π Èß«manual ISH automated ISH (29 μ Ëπ «> âõ 50 Õߪ å Áß ÈßÀ, ππ = 3 1 À⺠àμ, ππ=0) À «â μ æ «à 28 À⺠«â Õß μ Ë À Õπ π Èß«manual ISH automated ISH Õ μ â ( ππ = 3) æ ß 1 À⺠«â Õß μ Ë μ μà ß π Õ «manual ISH æ μ ª π ß ( ππ = 2) π Ë «automated ISH æ μ â ( ππ = 3) à«π Ÿª Ë 1 2 æμ «Õ à ߺ âõ â««automated manual ISH μ π ËÕß æ ß 1 Ë À⺠âõ π ßà «â Õß μ Ë μ μà ß π ( Ÿª Ë 2C) Ëß ËÕπ «Àå ß μ æ «à à «μ μà ß π À«à ß«manual ISH automated ISH π ßà Ÿª Ë 1 μ «Õ à ߺ âõ Epstein-Barr virus-encoded RNA (EBER) in situ hybridization (ISH) â«ëõß âõ Õ μ π μ (automated) A. μ πè μ â Ëπ «( ππ = 3) B. àæ μ Ëπ «( ππ = 0) Ÿª Ë 2 μ «Õ à ߺ âõ Epstein-Barr virus-encoded RNA (EBER) in situ hybridization (ISH) â««(manual) A. μ πè ß π â Ëπ «( ππ = 3) B. àæ μ Ëπ «( ππ = 0) C. μ πè ß πª π ß Ëπ «( ππ = 2)
226 «æ å ªï Ë 36 Ë 4 μÿ - π«2554 μ ß Ë 2 ª «μ âõ å μâπ ÿπ Ë â À«à ß«manual automated Epstein-Barr virus-encoded RNA (EBER) in situ hybridization (ISH) Manual ISH Automated ISH «μ «âõ å 4 Ë«ß 30 π 3 Ë«ß 30 π μâπ ÿπ (μàõ å 1 ºàπ) 3,151 900 À Àμÿ: «μ «âõ å μ Èß μà ÈπμÕπ deparaffinization π ß ÈπμÕπ mount slides Õߪ μ «â Õß μ º «ÿâ à Õßμâπ ÿπ «π π (μ ß Ë 2) º ª «μ âõ å μâπ ÿπ Ë â À«à ß«manual automated EBER ISH μ ß Ë 2 æ «à «automated EBER ISH â «μ «Ë Èπ «à «ß à àßμ «Ÿ «à «manual EBER ISH «å πªí ÿ π π μ «EBER ISH ªìπ çgold standardé π μ «À EBV π ËÕß ««Ÿß π μ «ßà μàõ â «πâõ π μ «2-5,8-10 μ «â«π π È â 2 «Õ««â ËÕßÕ μ π μ ÈπμÕπ μ «Èß 2 «ÈπμÕπ Ë â π μ Èß μà deparaffinization, antigen retrieval, hybridization indirect fluorescent detection μà â Ë Àπâ Ë ªìπ substrate, chromogen counterstain μ μà ß π Õ «manual â alkaline phosphatase (BCIP), NBT nuclear fast red μ μà â ªìπ«automated â peroxidase, diaminobenzidine (DAB) hematoxylin μ 2 πª» ß àæ «à «æ àà π» μ «EBV â«π EBER ISH ß π π μ «EBER ISH πºÿâªé«π«π 300 Ë â «π ªìπ lymphoma π Èπ π ÈÕ μàõ πè À Õß àß ªìπ classical Hodgkin's lymphoma (chl) π«π 100, non-hodgkin's lymphoma π B cell (NHL- B) π«π 100 non-hodgkin's lymphoma π T cell (NHL-T) π«π 100 º» æ «à μ ÈÕ EBV π âõ 64 Õß chl, âõ 13 Õß NHL-B âõ 51 Õß NHL-T 11 πõ π Èπ ß Õ Àπ Ëßß π «Ë» μ «non-hodgkin's lymphoma π sinonasal tract 18 π nasopharynx 42 º» æ «à μ ÈÕ EBV ß âõ 100 π NHL-T 12 Èßπ È «πº» ß àæ» ª «âõ À«à ß manual automated EBER ISH ß à» π ÿà μ «Õ à ß Ë ªìπ nasophayngeal carcinoma 𪻠Ëßæ «à EBV ªìπ Àμÿ à«π À à π àõ â àπ π ßπ Èπ æ ËÕ ªìπ æ π μ «â«π EBER ISH π à««π ß æ «Àâ «Ÿ μâõß àπ Èπ ß â» ª À«à ß«manual automated EBER ISH â ÿà μ «Õ à ß Ë«π ªìπ Áß π nasopharyngeal carcinoma π«π 30 μ Èß μàªï æ.». 2549 - æ.». 2552 π ßà «â μ ª μ «Èß «ÿâ à Õß μâπ ÿπ π π «Ë â π π ÿª º» π ßà «â μ ª μ àæ «à «μ μà ß π ËÕæ
Vol. 36 No. 4 October-December 2011 227 Bulletin of the Department of Medical Services «μ «àßμ «æ «à «automated EBER ISH â «μ «Ë Èπ «à «ß à àßμ «Ë Ÿ «à «manual EBER ISH Ëß «μ ««æ «à π ÈπμÕπ Ë â Àπâ ËμâÕß ß ÕªØ μ ÕßμâÕß â «ª 2 Ë«ß π Ë«â ËÕßÕ μ π μ â «æ ß 15 π à π Èπ ßπ Èπ Õ â«π μ «Õß μà π «æ «ÿâ ÿπ «π μ «Èßπ È π ËÕß º âõ à «μ μà ß π μμ ª»» π È â ÿπ π πÿπ æ å «ß ÿ â«ß π ÿß πæ «ª ªïß ª æ.».2553 Õ Õ ÿ â Àπâ Ë ÀâÕßªØ μ Õ Ÿ πœ μ ÿà ß π π Ÿμ æ» πæ «ÿ à π π Á μ «Õ à ß μ ÁÕ æ øîπ Èπ π ÈÕ μ «âõ å Èπ π ÈÕ æ åà ß æ ÿ π ÿ æ π «ß»å Õ μºÿâõ π«πæ «π æ åõÿ Ÿà«ºŸâÕ π«πæ «Ë ÿ Àâ ª π π π πÿπ Õπÿ μ Àâ πõ ß π» π È Õ Õâ ßÕ ß 1. Perez-Ordonez B. An update on Epstein-Barr virus and nasopharyngeal carcinogenesis. Head Neck Pathol 2007; 1:141-5. 2. Fanaian NK, Cohen C, Waldrop S, Wang J, Shehata BM. Epstein-Barr virus (EBV)-encoded RNA: automated in-situ hybridization (ISH) compared with manual ISH and immunohistochemistry for detection of EBV in pediatric lymphoproliferative disorders. Pediatr Dev Pathol 2009; 12:195-9. 3. Gulley ML. Molecular diagnosis of Epstein-Barr virusrelated diseases. J Mol Diagn 2001;3:1-10. 4. Gulley ML, Tang W. Laboratory assays for Epstein-Barr virus-related disease. J Mol Diagn 2008;10:279-92. 5. Loughrey M, Trivett M, Lade S, Murray W, Turner H, Waring P. Diagnostic application of Epstein - Barr virus - encoded RNA in situ hybridisation. Pathology 2004;36: 301-8. 6. Tsuchiya S. Diagnosis of Epstein-Barr virus-associated disease. Crit Rev Oncol Hematol 2002;44:227-38. 7. Gulley ML, Glaser SL, Craig FE, Borowitz M, Mann RB, Shema SJ, et al. Guidelines for interpreting EBER in situ hybridization and LMP1 immunohistochemical tests for detecting Epstein-Barr virus in Hodgkin lymphoma. Am J Clin Pathol 2002;117:259-67. 8. Delecluse HJ, Feederle R, O'Sullivan B, Taniere P. Epstein Barr virus-associated tumours: an update for the attention of the working pathologist. J Clin Pathol 2007;60:1358-64. 9. Gulley ML, Amin MB, Nicholls JM, Banks PM, Ayala AG, Srigley JR, et al. Epstein-Barr virus is detected in undifferentiated nasopharyngeal carcinoma but not in lymphoepithelioma-like carcinoma of the urinary bladder. Hum Pathol 1995;26:1207-14. 10. Lauritzen AF, Hording U, Nielsen HW. Epstein-Barr virus and Hodgkin's disease: a comparative immunological, in situ hybridization, and polymerase chain reaction study. APMIS 1994;102:495-500. 11. Mitarnun W, Pradutkanchana J, Ishida T. Epstein-Barr virus-associated nodal malignant lymphoma in Thailand. Asian Pac J Cancer Prev 2004;5:268-72. 12. Mitarnun W, Suwiwat S, Pradutkanchana J. Epstein-Barr virus-associated extranodal non-hodgkin's lymphoma of the sinonasal tract and nasopharynx in Thailand. Asian Pac J Cancer Prev 2006;7:91-4.