EΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΣΧΟΛΗ ΧΗΜΙΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Ι. Δόγαρης, Ε. Παλαιολόγου, Δ. Μαμμά, Π. Χριστακόπουλος, Δ. Κέκος
Στόχοι Ε.Ε. : 2% μέχρι 2005, 5.75% μέχρι 2010 ~30 δις λίτρα παγκοσμίως Μειωμένες εκπομπές CO & ΝΟ x Ελάττωση φαινόμενου θερμοκηπίου Μίγματα έως 10% χωρίς μετατροπή κινητήρα Αφθονότερο ανανεώσιμο υλικό Ανακύκλωση CO 2 Σακχαρούχες σακχαροκάλαμα, σακχαρότευτλα, μελάσα Αμυλούχες αραβόσιτος, σιτάρι, ρύζι, κόνδυλοι Λιγνινοκυτταρινούχες υπολείμματα αγροτικά, υλοτομίας, βιομηχανίας χάρτου, βιομηχανίας ζάχαρης, ενεργειακές καλλιέργειες
(Sorghum bicolor (L) Moench) C 4 φυτό με υψηλή φωτοσυνθετική ικανότητα ανθεκτικό στη ξηρασία Τροπικά, υποτροπικά και εύκρατα κλίματα Ζωοτροφή (49%), διατροφή (40%, σιρόπι, Αφρική και Ασία) Υψηλή περιεκτικότητα σακχάρων Μεγάλη στρεμματική απόδοση Συστατικά Περιεκτικότητα (% β/β, νωπή βάση) Υγρασία 67.4 Γλυκόζη 1.3 Φρουκτόζη 1.4 Σακχαρόζη 12.2 Κυτταρίνη 6.3 Ημικυτταρίνη 4.9
Λιγνινοκυτταρίνη Ενζυμική υδρόλυση SHF Ζύμωση σακχάρων Separate Hydrolysis & Fermentation Χημική/Μηχανική προκατεργασία Ενζυμική υδρόλυση Ζύμωση σακχάρων Ενζυμική υδρόλυση SSF Simultaneous Saccharification & Fermentation Λιγνίνη Γλυκόζη Ξυλόζη Επεξεργασία Ζύμωση Παραγωγή ενζύμων Ενζυμική υδρόλυση Fusarium sp. Neurospora sp. Monillia sp. Clostridium sp. Ζύμωση σακχάρων Προϊόντα υψηλής προστιθέμενης αξίας Αιθανόλη DMC Direct Microbial Conversion
Ενδογλουκανάση Εξωγλουκανάση Ι Εξωγλουκανάση ΙΙ β-γλυκοζιδάση Κελλοβιόζη Γλυκόζη
Αραβινοξυλάνη α-d-γλουκουρονιδάσες Ξυλανάσες Εστεράσες ακετυλο-ξυλάνης α-l-αραβινοφουρανοζιδάσες Εστεράσες φερουλικού Εστεράσες φερουλικού Ξυλοβιόζη Αραβινοξυλάνη β-ξυλοζιδάσες
η ανάπτυξη των μικροοργανισμών (κυρίως μυκήτων) σε στερεά υποστρώματα απουσία ελεύθερου νερού ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ : Αγροτική Βιομηχανία & Βιομηχανία Τροφίμων Βιομετατροπή υπολειμμάτων Πρόσθετα τροφίμων Περιβαλλοντικός έλεγχος Βιοαποκατάσταση και βιοαποικοδόμηση τοξικών ουσιών Βιολογική αποτοξίνωση αγροτοβιομηχανικών αποβλήτων Βιομηχανικές ζυμώσεις Παραγωγή ενζύμων, οργανικών οξέων Βιοκαύσιμα Χρωστικές, βιταμίνες
Προσομοιάζει το φυσικό ενδιαίτημα των νηματοειδών μυκήτων Υψηλότερες αποδόσεις σε μικρότερη χρονική περίοδο Απλός σχεδιασμός και μικρότεροι όγκοι βιοαντιδραστήρων Μικρός όγκος αποβλήτων και χαμηλές ενεργειακές απαιτήσεις Παραγωγή αιθανόλης με υψηλότερες συγκεντρώσεις Μικρότερο ενεργειακό κόστος απόσταξης Προβλήματα στην κλιμάκωση της διεργασίας (scale-up) Δυσκολία ελέγχου παραμέτρων (ph, θερμοκρασία κ.λ.π.) Ανάδευση δύσκολη, προτιμώνται στατικές συνθήκες Μικρότερη καθαρότητα του προϊόντος, αυξάνοντας το κόστος ανάκτησης
πολύ-σακχαρίτες μονο-σακχαρίτες Επίδραση της αερόβιας καλλιέργειας στην παραγωγή αιθανόλης από το μύκητα Neurospora crassa DSM 1129 Αερόβια ανάπτυξη Αλκοολική ζύμωση D-Γλυκόζη D-Ξυλόζη L-Αραβινόζη D-Γλυκόζη D-Φρουκτόζη D-Ξυλόζη L-Αραβινόζη D-Ξυλόζη L-Αραβινόζη Άξονας σπάδικα αραβόσιτου Κυτταρίνη Ξυλάνη Κυτταρίνη Κυτταρίνη Ξυλάνη Ξυλάνη
Μέγιστες τιμές απόδοσης αιθανόλης από το μύκητα Ν. crassa DSM 1129 σε διάφορους μονοσακχαρίτες, όταν ο μύκητας αναπτύχθηκε αερόβια σε γλυκόζη, ξυλόζη και αραβινόζη. Αερόβια ανάπτυξη Υπόστρωμα αλκοολικής Γλυκόζη Γλυκόζη σε Γλυκόζη γλυκόζη 51.9 Γλυκόζη σε Φρουκτόζη φρουκτόζη 50.1 Γλυκόζη Γλυκόζη σε Ξυλόζη ξυλόζη 26.0 Γλυκόζη Ξυλόζη Αραβινόζη σε ξυλόζη 18.4 Ξυλόζη Γλυκόζη σε αραβινόζη Ξυλόζη 18.1 Αραβινόζη σε Αραβινόζη αραβινόζη 2.2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Απόδοση αιθανόλης (g/100g υποστρώματος)
Μέγιστες τιμές απόδοσης αιθανόλης από το μύκητα Ν. crassa DSM 1129 σε κυτταρίνη (cellulose 123) και ξυλάνη (από ξύλο σημύδας), όταν ο μύκητας αναπτύχθηκε αερόβια σε άξονα σπάδικα αραβόσιτου (corn cobs), κυτταρίνη και ξυλάνη. Αερόβια ανάπτυξη Άξονας σπάδικα αραβόσιτου Υπόστρωμα αλκοολικής Αραβόσιτος σε Κυτταρίνη κυτταρίνη 5.5 Ενεργότητες ενζύμων Ενδογλουκανάση : 14.1 U/ml β-γλυκοζιδάση : 0.48 U/ml Κυτταρίνη σε Κυτταρίνη κυτταρίνη 6.2 Ενδογλουκανάση : 3.85 U/ml β-γλυκοζιδάση : 0.02 U/ml Άξονας σπάδικα αραβόσιτου Αραβόσιτος σε Ξυλάνη ξυλάνη 13.3 Ξυλανάση : β-ξυλοζιδάση : 2.78 U/ml 0.005 U/ml Ξυλάνη Ξυλάνη σε Ξυλάνη ξυλάνη 5.1 Ξυλανάση : β-ξυλοζιδάση : 0.92 U/ml 0.001 U/ml 0 5 10 15 20 25 30 Απόδοση αιθανόλης (g/100g υποστρώματος)
Ενεργότητα ενζύμων (U/g υποστρώματος) 300 Άχυρο σίτου Άξονας σπάδικα αραβόσιτου 250 200 150 100 50 0 ΕΝΓΛ ΕΞΓΛ x100 Β-ΓΛ x10 ΞΛ Β-ΞΛ x100 Μέγιστες τιμές ενεργότητας των κυτταρινολυτικών (EΝΓΛ: ενδογλουκανάση, ΕΞΓΛ: εξωγλουκανάση, β-γλ: β-γλυκοζιδάση) και ημικυτταρινολυτικών (ΞΛ: ξυλανάση, β- ΞΛ: β-ξυλοζιδάση) ενζύμων του μύκητα Ν. crassa DSM 1129 αναπτυχθέντος αερόβια σε άξονα σπάδικα αραβόσιτου( ) και άχυρο σίτου ( ).
Ενεργότητα ενζύμων (U/g υποστρώματος) 500 400 300 Ενδογλουκανάση Εξωγλουκανάση x100 β-γλυκοζιδάση Ξυλανάση β-ξυλοζιδάση x100 200 100 0 (ΝΗ 4 ) 2 SO 4 (ΝΗ 4 ) 2 ΗPO 4 KNO 3 Ουρία yeast extract Πεπτόνη Corn steep liquor Μέγιστες τιμές ενεργότητας των κυτταρινολυτικών ( ενδογλουκανάση, εξωγλουκανάση, β-γλυκοζιδάση) και ημικυτταρινολυτικών ( ξυλανάση, β-ξυλοζιδάση) ενζύμων του μύκητα Ν. crassa DSM 1129.
(Α) Μονοκαλλιέργεια N. crassa DSM 1129 (Β) Μικτή καλλιέργεια με τη ζύμη S. cerevisiae 2541 2.5 140 2.5 140 Συγκέντρωση αιθανόλης % (β/ο) 2.0 1.5 1.0 0.5 120 100 80 60 40 20 Απόδοση αιθανόλης % Συγκέντρωση αιθανόλης % (β/ο) 2.0 1.5 1.0 0.5 120 100 80 60 40 20 Απόδοση αιθανόλης % 0.0 0 1 2 3 4 5 6 Χρόνος ζύμωσης (ημέρες) 0 0 1 2 3 4 5 6 Χρόνος ζύμωσης (ημέρες) Χρονική μεταβολή της συγκέντρωσης αιθανόλης (, % β/ο) και απόδοσης αιθανόλης (, % με βάση τα σάκχαρα του σόργου) κατά τη βιομετατροπή γλυκού σόργου (αναλογία 1/1) από (Α) μονοκαλλιέργεια του μύκητα Ν. crassa DSM 1129 και (Β) μικτή καλλιέργεια αυτού με τη ζύμη S. cerevisiae 2541. 0.0 0
(Α) Μονοκαλλιέργεια N. crassa DSM 1129 (Β) Μικτή καλλιέργεια με τη ζύμη S. cerevisiae 2541 2.5 140 2.5 140 Συγκέντρωση αιθανόλης % (β/ο) 2.0 1.5 1.0 0.5 120 100 80 60 40 20 Απόδοση αιθανόλης % Συγκέντρωση αιθανόλης % (β/ο) 2.0 1.5 1.0 0.5 120 100 80 60 40 20 Απόδοση αιθανόλης % 0.0 0 1 2 3 4 5 6 Χρόνος ζύμωσης (ημέρες) 0 0 1 2 3 4 Χρόνος ζύμωσης (ημέρες) Χρονική μεταβολή της συγκέντρωσης αιθανόλης (, % β/ο) και απόδοσης αιθανόλης (, % με βάση τα σάκχαρα του σόργου) κατά τη βιομετατροπή γλυκού σόργου (αναλογία 1/2) από (Α) μονοκαλλιέργεια του μύκητα Ν. crassa DSM 1129 και (Β) μικτή καλλιέργεια αυτού με τη ζύμη S. cerevisiae 2541. 0.0 0
Απόδοση αιθανόλης % 30 25 20 15.9 25.2 17.5 23.1 22.8 15 10 5 0 1/1 1/2 Αναλογία άχυρου σίτου / γλυκό σόργο Μέγιστες αποδόσεις αιθανόλης (g/100g σόργου, ξηρή βάση) κατά τη βιομετατροπή γλυκού σόργου από ( ) μονοκαλλιέργεια του μύκητα Ν. crassa DSM 1129 και ( ) μικτή καλλιέργεια αυτού με τη ζύμη S. cerevisiae 2541.
Αύξηση απόδοσης βιομετατροπής % 20 10 0 10.2 1.5-10 -20-30 -40 1/1 1/2 Αναλογία άχυρου σίτου / γλυκό σόργο Αύξηση απόδοσης βιομετατροπής με βάση τα ζυμώσιμα σάκχαρα του γλυκού σόργου κατά τη βιομετατροπή γλυκού σόργου από το μύκητα ( ) Ν. crassa DSM 1129 και ( ) τη μικτή καλλιέργεια αυτού με τη ζύμη S. cerevisiae 2541
Παραγωγή αιθανόλης από N. crassa DSM 1129 από: Καθαρούς μονοσακχαρίτες (D-γλυκόζη, D-φρουκτόζη, D-ξυλόζη, L-αραβινόζη ) Καθαρούς πολυσακχαρίτες (Κυτταρίνη [cellulose 123], Ξυλάνη [από ξύλο σημύδας]) Σημαντική επίδραση της αερόβιας καλλιέργειας στην παραγωγή αιθανόλης Μονοσακχαρίτες : γλυκόζη Πολυσακχαρίτες : άξονας σπάδικα αραβόσιτου (corn cobs) Η βιομετατροπή πολυσακχαριτών απαιτεί την παραγωγή υδρολυτικών ενζύμων Βέλτιστη παραγωγή κυτταρινολυτικών και ημικυτταρινολυτικών ενζύμων: Πηγή άνθρακα : άχυρο σίτου (wheat straw) Πηγή αζώτου : θειικό αμμώνιο
Παραγωγή αιθανόλης από N. crassa DSM 1129 : Γλυκό σόργο Ζύμωση στερεάς κατάστασης Μέγιστη απόδοση αιθανόλης : 25.2 % (g/100 g ξηρού σόργου) σε μικτή καλλιέργεια Μικτή καλλιέργεια με τη ζύμη S. cerevisiae 2541 Μείωση χρόνου μέγιστης απόδοσης αιθανόλης 2-3 ημέρες Αύξηση της απόδοσης αιθανόλης έως και 45% Αύξηση της απόδοσης βιομετατροπής με βάση τα ζυμώσιμα σάκχαρα έως και 10.2 % Μεταβολίζει ταχύτατα τις εξόζες σε αιθανόλη : άρση παρεμπόδισης της υδρολυτικής δράσης των ενζύμων από τα τελικά προϊόντα (σάκχαρα) άρση καταβολικής ρύθμισης των γονιδίων του μύκητα λόγω ύπαρξης υψηλής αρχικής συγκέντρωσης σακχάρων
Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας, Σχολή Χημικών Μηχανικών, Ε.Μ.Π. ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ ΤΟΥ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΟΥ ΔΥΝΑΜΙΚΟΥ (ΠΕΝΕΔ) - 2003 Γενική Γραμματεία Έρευνας και Τεχνολογίας